CN113025599B - 一种重组溶组织梭菌i型胶原酶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种重组溶组织梭菌i型胶原酶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组溶组织梭菌I型胶原酶的融合蛋白，包含溶组织梭菌I型胶原酶和连接到所述溶组织梭菌I型胶原酶N端的标签蛋白；所述标签蛋白包含串联的钙调蛋白结合肽(CBP)与链球菌抗生物素蛋白结合肽(SBP)。本发明还提供了上述重组溶组织梭菌I型胶原酶的融合蛋白的制备方法和应用。本发明利用CBP‑SBP作为融合标签，可高效促进溶组织梭菌I型胶原酶(ColG)可溶表达，避免了包涵体复性，有利于纯化降低生产成本，能够满足工业化生产的需求。

Description

一种重组溶组织梭菌I型胶原酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种高纯度重组溶组织梭菌I型胶原酶及其制备方法和应用。
背景技术
溶组织梭菌型胶原酶(Collagenase Clostridium Histolyticum)为BioSpecifics Technologies集团原研的药物，其于2010年2月2日获得美国食品药品管理局(FDA)批准，2011年2月28日获得欧洲药物管理局(EMA)批准，2015年7月3日获得日本医药品医疗器械综合机构(PMDA)批准上市。商品名为的产品由Auxilium制药(现在的远藤制药，Endo International)在美国市场销售，由旭化成(Aasahi Kasei)在日本市场销售。商品名为/>的产品由Swedish Orphan Biovitrum(SOBI)在欧洲市场销售。此外，商品名为/>和/>的产品由BioSpecifics Technologies集团销售。
批准的适应症有杜普征氏掌挛缩(Dupuytren’s contracture)、佩罗尼病(Peyronie’s disease)以及橘皮组织(Cellulite)。/>是第一个获FDA批准用于佩罗尼病男性患者的非手术治疗选择。/>由梭菌属I型胶原酶(AUX-I)和梭菌属II型胶原酶(AUX-II)，按1:1的质量比混合而成。AUX-I和AUX-II均为单一肽链，分别由溶组织梭菌的ColG和ColH编码，二者都是锌离子、钙离子结合的金属酶。
生理学条件下胶原酶的作用是水解天然三重螺旋构象的胶原，可使沉积胶原溶解。注射到杜普征氏掌挛缩患者的可触摸结缔中或佩罗尼病患者的阴茎硬结中(二者主要成分就是沉积的胶原)使之破坏。体外研究表明AUX-I和AUX-II依据各自不同的底物亲和性、水解效率以及选择性切割位点而发挥协同作用。
原研公司BioSpecifics是通过培养溶组织梭菌，从发酵上清液中纯化AUX-I和AUX-II。但是溶组织梭菌本身是一种气性坏疽的致病菌，从其发酵上清液常常混杂各种毒素，成分复杂，如果没有原研公司的菌株以及生产和纯化工艺，很难保证得到达到药用标准的精制品。用基因重组技术生产溶组织梭菌I型胶原酶是解决这个问题的可能途径，但由于AUX-II分子量较大(113kD)，常规大肠杆菌表达难以实现。即使表达大都在胞内积累，易形成包涵体。包涵体复性过程复杂、技术难度大、得率低、生产成本高，当前尚不能应用于工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于制备重组溶组织梭菌I型胶原酶的易于高效表达的标签蛋白，该融合标签蛋白包括来源于钙调蛋白结合肽与链球菌抗生物素蛋白结合肽的串联组合(CBP-SBP)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。该融合标签蛋白还包括：转录终止抗终止因子(NusA)，或者大肠杆菌硫氧还蛋白A(TrxA)，或者二硫键氧化还原酶(DsbA、DsbC)，或者谷胱甘肽S-转移酶(GST)。所述融合标签蛋白能促进重组溶组织梭菌I型胶原酶的可溶高效表达，且不影响重组溶组织梭菌I型胶原酶的生物活性。
本发明首先提供了一种重组溶组织梭菌I型胶原酶的融合蛋白，包含溶组织梭菌I型胶原酶和连接到所述溶组织梭菌I型胶原酶N端的标签蛋白；所述标签蛋白包含串联的钙调蛋白结合肽(CBP)与链球菌抗生物素蛋白结合肽(SBP)；
优选地，所述钙调蛋白结合肽(CBP)的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，所述链球菌抗生物素蛋白结合肽(SBP)的氨基酸序列为SEQ ID NO:7；
更优选地，所述标签蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
在根据本发明的一个实施方案中，标签蛋白的钙调蛋白结合肽(CBP)序列通过融合连接肽连接至链球菌抗生物素蛋白结合肽(SBP)N端；优选地，所述融合连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:11 GSGSGHMHHHHHHSSGPDL；更优选地，所述标签蛋白还包含转录终止抗终止因子(NusA)、大肠杆菌硫氧还蛋白A (TrxA)、二硫键氧化还原酶(DsbA、DsbC)或者谷胱甘肽S-转移酶(GST)中的一种。
在根据本发明的一个实施方案中，所述标签蛋白通过柔性连接肽连接至溶组织梭菌I型胶原酶的N端；优选地，所述柔性连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:13GSGSGGTAMADIGSDDDDK；优选地，重组溶组织梭菌I型胶原酶融合蛋白所述氨基酸序列为SEQ ID NO:9。
本发明还提供了一种用于编码上述的重组溶组织梭菌I型胶原酶融合蛋白的重组基因，包含溶组织梭菌I型胶原酶编码基因SEQ ID NO:2和位于所述溶组织梭菌I型胶原酶编码基因上游的标签蛋白编码基因，所述标签蛋白编码基因中包含编码串联的钙调蛋白结合肽(CBP)与链球菌抗生物素蛋白结合肽(SBP)的重组基因。
在根据本发明的一个实施方案中，所述标签蛋白的编码基因为SEQ ID NO:4。
在根据本发明的一个实施方案中，所述重组基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:10。
本发明进一步提供了一种用于表达重组溶组织梭菌I型胶原酶的重组载体，包含上述的重组基因；优选地，所述重组载体的骨架质粒选自pET-28a-c(+)、pET29a、pET-30a-c(+)、pET39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)或pET-43.1a(+)中的任一种。
本发明还提供了一种用于表达重组溶组织梭菌I型胶原酶的重组工程菌，包含上述的重组载体；优选地，所述重组工程菌的宿主菌为细菌或真菌；优选地，所述宿主菌为大肠杆菌，进一步优选为BL21(DE3)、BL21(DE3)P1ysS或TB1中的任一种。
本发明进一步提供了一种重组溶组织梭菌I型胶原酶的融合蛋白制备方法，其特征在于，包括：
1)将标签蛋白的编码基因连接至溶组织梭菌I型胶原酶编码基因的上游，获得编码如重组溶组织梭菌I型胶原酶的重组基因；
2)将所述重组基因连接至骨架质粒中得到重组载体；
3)将所述重组载体转化到宿主菌中，得到重组工程菌；
4)将所述重组工程菌接种于发酵罐中，诱导表达；
5)当菌体和蛋白浓度达到预设阈值后，从培养物中分离纯化得到重组溶组织梭菌I型胶原酶；
6)将所述重组溶组织梭菌I型胶原酶酶解，去除标签蛋白；
7)将酶解后的样品依次经过CBP亲和层析、Ni2+螯合层析、QFF层析、Butyl-Impres层析，获得重组溶组织梭菌I型胶原酶的目的蛋白纯品。
本发明还提供了上述的重组溶组织梭菌I型胶原酶在制备用于治疗杜普征氏掌挛缩(Dupuytren’s contracture)、佩罗尼病(Peyronie’s disease)或橘皮组织(Cellulite)的药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明利用CBP-SBP作为融合标签，可高效促进溶组织梭菌I型胶原酶(ColG)可溶表达，避免了包涵体复性，有利于纯化降低生产成本，能够满足工业化生产的需求。
利用本发明的方法制备重组溶组织梭菌I型胶原酶融合蛋白为可溶表达，表达量大于菌体总蛋白的20％。最终重组溶组织梭菌I型胶原酶得率为大于250mg纯品/100g菌体，纯度大于99％，生物活性达到53651U/mg，内毒素小于5EU/mg。
通过接头将标签蛋白融合至溶组织梭菌I型胶原酶N端形成融合蛋白，进行融合表达，利用纯化手段将产物完全分离，实现了溶组织梭菌I型胶原酶的可溶、高效表达。
通过接头序列-GSGSGGTAMADIGSDDDDK-实现融合表达，其包含柔性连接肽，使得融合标签未对目的蛋白结构产生影响，产物具有生物活性；包含组氨酸标签，利于纯化，提高收率；包含肠激酶位点-DDDDK-，使得融合标签被有效去除，最终获得的重组溶组织梭菌I型胶原酶的N端序列与天然序列完全一致。
本发明在对编码溶组织梭菌I型胶原酶的核苷酸序列进行优化的同时选择CBP-SBP作为融合标签，使得重组溶组织梭菌I型胶原酶在大肠杆菌中实现高效、可溶表达。利用针对CBP或则SBP特异亲合纯化介质，有利于提高纯化效率，降低成本。CBP亲合层析是一种简单、温和、有效的方法，CBP标记的蛋白在低浓度钙缓冲液中能够特异性的被钙调蛋白树脂捕捉吸附，并且在中性环境中能够被2mM EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)洗脱。大肠杆菌没有可与钙调蛋白相互作用的内源蛋白，在纯化大肠杆菌表达重组蛋白时具有很高的专一性，融合蛋白的回收率在80-90％。可耐受还原剂和高达0.1％的去污剂。
附图说明
图1为本发明构建的表达质粒pET30-a(+)-ColG的结构图；
图2为本发明构建的pET30-a(+)-ColG/BL21(DE3)工程菌摇瓶诱导筛选结果；
图3为RP-HPLC检测结果，纯度大于99％；
图4为重组ColG质谱分子量检测结果；
图5为重组ColG酶学活性测定结果；其中，图5a为亮氨酸标准曲线图；图5b为ColG样品不同浓度下荧光值拟合线性；图5c为ColG比活计算与统计图谱。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1重组溶组织梭菌I型胶原酶融合蛋白工程菌构建
1、pET30-a(+)-ColG/BL21(DE3)工程菌构建
溶组织梭菌I型胶原酶成熟蛋白含有1008个氨基酸，溶组织梭菌I型胶原酶基因序列如SEQ ID NO:2所示。
标签蛋白选取来源于钙调蛋白结合肽与链球菌抗生物素蛋白结合肽的串联组合；所述融合标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
设计接头序列为-GSGSGGTAMADIGSDDDDK-，通过接头将上述CBP-SBP标签蛋白C端与溶组织梭菌I型胶原酶成熟蛋白序列N端连接，所获融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，该融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:10所示。
将设计的融合蛋白核酸序列(SEQ ID NO:10)委托通用生物系统(安徽)有限公司进行全基因合成，并通过NdeI/NotI位点亚克隆至表达载体，其载体选自商业化载体pET-28a-c(+)，或者pET29a，或者pET-30a-c(+)，或者pET39b(+)，或者pET-40b(+)，或者pET-41a(+)，或者pET-43.1a(+)，载体的宿主细胞为细菌或真菌，所述宿主细胞为大肠杆菌，选自商业化菌株BL21(DE3)，或者BL21(DE3)PlysS，或者TB1。本实施例采用大肠杆菌表达载体pET30-a(+)，构建获得表达载体pET30-a(+)-ColG，构建示意图如图1所示。
将构建的表达载体用化学转染法，转入大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)，利用LB+kan固体平板筛选，获得重组表达工程菌pET30-a(+)-ColG/BL21(DE3)。
2、工程菌诱导筛选
随机挑取上述pET30-a(+)-ColG/BL21(DE3)工程菌接种至10 ml LB培养基(100ug/ml kan)，100ml锥形瓶培养，37℃220rpm摇床培养过夜。第二天取过夜培养的母液按1％比例转接于40ml LB液体培养基(100ug/ml kan)，在250ml锥形瓶中，37℃，220rpm培养2.5h，至OD600值约0.6-1.0。加入终浓度1mM IPTG，30℃诱导4h。
SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示。对照:未诱导总蛋白；泳道1-4:pET30-a(+)-ColG/BL21(DE3)1-4号诱导4h总蛋白；泳道M:蛋白质分子量Marker；泳道6、8：破菌上清；泳道7；破菌沉淀。与对照比较，在116-200kD位置处实现特异表达，与理论分子量相当，表达量占菌体总蛋白20％以上。对诱导表达菌体进行破菌分析，表明全部实现可溶表达。
实施例2重组溶组织梭菌I型胶原酶工程菌发酵
种子液体活化：将液体LB培养基分装至500ml的摇瓶中，每瓶100ml，kan+160ul，共1瓶，然后吸取甘油种40ul，接种于LB液体培养基中27℃、180rpm摇床过夜培养。
发酵过程：采用5L保兴发酵罐发酵，设置温度37℃，通气1.5vvm，接入4ml微量元素，kan+0.06g无菌过滤后接入发酵罐pH7.0；取4℃保存的LB培养基下制取的种子，按照比例5％(100ml)接种于装有2L的发酵培养基(M9改良培养基)；起始转速200rpm，设置溶氧转速联动，溶氧不低于30％(设备有3-5％的误差，需设置参数35％)校正溶氧100％；当培养OD值为4-7时(培养时间约3-4h)，设置温度20℃，当温度达到21℃以下使用IPTG进行诱导，诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，鼎国生物)，诱导4h，诱导后每隔1h取样并测定OD值，观察菌体生长及蛋白表达情况。
实施例3重组溶组织梭菌I型胶原酶分离纯化
1、菌体破碎与澄清
菌体高速冷冻离心收集菌体，按照1：10的比例(1g：10ml缓冲液:25mM Tris-HClpH8.0)，混悬菌体，在700～800Bar、冰浴控制温度10～15℃下，破菌3次，然后高速冷冻离心，收集上清，丢弃沉淀；用0.65μm中空纤维柱，超滤澄清破菌液。
2、CBP亲和层析
取澄清后上清，用低浓度钙缓冲液稀释2倍。用CalmodulinSepharose 4B亲和填料捕获目的蛋白。用pH7.0，2mM EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)洗脱。
3、肠激酶酶解
在上述融合蛋白溶液中，按每毫克蛋白加入重组肠激酶0.5U，酶解融合蛋白，酶解时间12小时，酶解温度4-8℃。
4、Ni2+螯合层析
用平衡缓冲液25mMTris-HCl pH8.0，平衡层析柱，负载上一步酶解样品，收集目标组分流穿，然后用洗脱缓冲25mM Tris-HClpH8.0 200mM咪唑洗脱杂蛋白。
5、QFF层析
用平衡缓冲液(25mMTris-HCl，pH8.0)平衡层析柱，然后进样，进样为上一步螯合层析的流穿，用洗脱缓冲：150mM NaCl洗脱杂蛋白；用200mMNaCl洗脱目的蛋白。
6、Butyl-Impres纯化
用平衡buffer 25mM Tris-HCl，0.5M硫酸铵(pH8.0)，平衡层析柱，进样，然后用线性梯度洗脱(平衡缓冲由100％降低至0，用时150min)，收集最大峰高以下的洗脱组分。用超滤膜包浓缩纯化样品5倍，50mM Tris-HCl稀释5倍，再浓缩5倍。
实施例4重组溶组织梭菌I型胶原酶质谱分子量测定
将上述方法制备得到的ColG进行质谱分析，委托北京青莲百奥生物科技有限公司测定，结果如图4所示，ColG的分子量为113949Da，与理论分子量一致。
实施例5重组溶组织梭菌I型胶原酶生物活性测定
1、实验原理
采用SRC-荧光胺法检测ColG的生物学活性，其原理是乙酰化的鼠尾胶原蛋白在中碱性溶液中可溶，与样品酶反应一段时间后，酶作用于胶原蛋白的三螺旋区域，降解胶原蛋白，该降解产物变性温度低于胶原蛋白的变性温度，在一定温度下，降解产物发生变性，而未降解的胶原不会变性，50％二恶烷可以沉淀未变性胶原，利用二恶烷分离二者后，再通过荧光胺标记未被沉淀的变性降解产物中的α-氨基，测定荧光强度进行酶活定量。
2、活性定义
酶活性单位定义为：ColG胶原酶在30℃，PH7.5条件下作用胶原蛋白，每分钟释放出的降解产物相当于荧光胺标记1nmol亮氨酸的量为1个活性单位。
将样品管检测值减去对照管检测值，根据标准曲线得到亮氨酸的μg数。ColG胶原酶活性单位U＝亮氨酸μg×103×5×1.2/(131.2×t)；5为荧光胺反应体积1mL是检测体积0.2mL的5倍；1.2为用于荧光胺反应的ColG水解产物是，为水解反应体系的5/6；131.2为亮氨酸的相对分子质量，t为酶蛋白反应时间。
比活力(U/mg)＝计算所得的活性单位U/参加反应的酶量mg。
3、检测结果
亮氨酸标准曲线见图5a，ColG样品不同浓度下荧光值拟合线性见图5b。ColG比活计算与统计见图5c。根据统计结果，计算3个平行组平均比活为53651 U/mg，即为ColG活性。
上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。本发明的保护范围以所附权利要求书为准。
序列表
SEQID NO :1:溶组织梭菌I型胶原酶成熟蛋白氨基酸序列
SEQID NO :2:溶组织梭菌I型胶原酶成熟蛋白核苷酸序列
SEQID NO:3:融合标签蛋白的氨基酸序列
SEQID NO :4:融合标签蛋白的核苷酸序列
SEQID NO :5:钙调蛋白结合肽氨基酸序列
SEQID NO :6:钙调蛋白结合肽核苷酸序列
SEQID NO :7:链球菌抗生物素蛋白结合肽氨基酸序列
SEQID NO :8:链球菌抗生物素蛋白结合肽核苷酸序列
SEQID NO :9:重组溶组织梭菌I型胶原酶融合蛋白的氨基酸序列
SEQID NO :10：重组溶组织梭菌I型胶原酶融合蛋白的核苷酸序列
/>
/>
SEQID NO:11：融合接头氨基酸序列
/>
SEQID NO:12：融合接头核苷酸酸序列
SEQID NO:13：柔性接头的氨基酸序列
SEQID NO:14：柔性接头的核苷酸序列
/>
序列表
<110> 重庆科润生物医药研发有限公司
<120> 一种重组溶组织梭菌I型胶原酶及其制备方法和应用
<141> 2021-04-01
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1008
<212> PRT
<213> 溶组织梭菌(Collagenase Clostridium Histolyticum)
<400> 1
Ile Ala Asn Thr Asn Ser Glu Lys Tyr Asp Phe Glu Tyr Leu Asn Gly
1 5 10 15
Leu Ser Tyr Thr Glu Leu Thr Asn Leu Ile Lys Asn Ile Lys Trp Asn
20 25 30
Gln Ile Asn Gly Leu Phe Asn Tyr Ser Thr Gly Ser Gln Lys Phe Phe
35 40 45
Gly Asp Lys Asn Arg Val Gln Ala Ile Ile Asn Ala Leu Gln Glu Ser
50 55 60
Gly Arg Thr Tyr Thr Ala Asn Asp Met Lys Gly Ile Glu Thr Phe Thr
65 70 75 80
Glu Val Leu Arg Ala Gly Phe Tyr Leu Gly Tyr Tyr Asn Asp Gly Leu
85 90 95
Ser Tyr Leu Asn Asp Arg Asn Phe Gln Asp Lys Cys Ile Pro Ala Met
100 105 110
Ile Ala Ile Gln Lys Asn Pro Asn Phe Lys Leu Gly Thr Ala Val Gln
115 120 125
Asp Glu Val Ile Thr Ser Leu Gly Lys Leu Ile Gly Asn Ala Ser Ala
130 135 140
Asn Ala Glu Val Val Asn Asn Cys Val Pro Val Leu Lys Gln Phe Arg
145 150 155 160
Glu Asn Leu Asn Gln Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Lys Gly Thr Ala Val
165 170 175
Asn Glu Leu Ile Lys Gly Ile Glu Phe Asp Phe Ser Gly Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Lys Asp Val Lys Thr Met Pro Trp Tyr Gly Lys Ile Asp Pro Phe
195 200 205
Ile Asn Glu Leu Lys Ala Leu Gly Leu Tyr Gly Asn Ile Thr Ser Ala
210 215 220
Thr Glu Trp Ala Ser Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Leu Ser Lys Phe Gly
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Thr Asn Arg Asn Asp Ile Val Gln Ser Leu Glu Lys Ala
245 250 255
Val Asp Met Tyr Lys Tyr Gly Lys Ile Ala Phe Val Ala Met Glu Arg
260 265 270
Ile Thr Trp Asp Tyr Asp Gly Ile Gly Ser Asn Gly Lys Lys Val Asp
275 280 285
His Asp Lys Phe Leu Asp Asp Ala Glu Lys His Tyr Leu Pro Lys Thr
290 295 300
Tyr Thr Phe Asp Asn Gly Thr Phe Ile Ile Arg Ala Gly Glu Lys Val
305 310 315 320
Ser Glu Glu Lys Ile Lys Arg Leu Tyr Trp Ala Ser Arg Glu Val Lys
325 330 335
Ser Gln Phe His Arg Val Val Gly Asn Asp Lys Ala Leu Glu Val Gly
340 345 350
Asn Ala Asp Asp Val Leu Thr Met Lys Ile Phe Asn Ser Pro Glu Glu
355 360 365
Tyr Lys Phe Asn Thr Asn Ile Asn Gly Val Ser Thr Asp Asn Gly Gly
370 375 380
Leu Tyr Ile Glu Pro Arg Gly Thr Phe Tyr Thr Tyr Glu Arg Thr Pro
385 390 395 400
Gln Gln Ser Ile Phe Ser Leu Glu Glu Leu Phe Arg His Glu Tyr Thr
405 410 415
His Tyr Leu Gln Ala Arg Tyr Leu Val Asp Gly Leu Trp Gly Gln Gly
420 425 430
Pro Phe Tyr Glu Lys Asn Arg Leu Thr Trp Phe Asp Glu Gly Thr Ala
435 440 445
Glu Phe Phe Ala Gly Ser Thr Arg Thr Ser Gly Val Leu Pro Arg Lys
450 455 460
Ser Ile Leu Gly Tyr Leu Ala Lys Asp Lys Val Asp His Arg Tyr Ser
465 470 475 480
Leu Lys Lys Thr Leu Asn Ser Gly Tyr Asp Asp Ser Asp Trp Met Phe
485 490 495
Tyr Asn Tyr Gly Phe Ala Val Ala His Tyr Leu Tyr Glu Lys Asp Met
500 505 510
Pro Thr Phe Ile Lys Met Asn Lys Ala Ile Leu Asn Thr Asp Val Lys
515 520 525
Ser Tyr Asp Glu Ile Ile Lys Lys Leu Ser Asp Asp Ala Asn Lys Asn
530 535 540
Thr Glu Tyr Gln Asn His Ile Gln Glu Leu Ala Asp Lys Tyr Gln Gly
545 550 555 560
Ala Gly Ile Pro Leu Val Ser Asp Asp Tyr Leu Lys Asp His Gly Tyr
565 570 575
Lys Lys Ala Ser Glu Val Tyr Ser Glu Ile Ser Lys Ala Ala Ser Leu
580 585 590
Thr Asn Thr Ser Val Thr Ala Glu Lys Ser Gln Tyr Phe Asn Thr Phe
595 600 605
Thr Leu Arg Gly Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Ser Lys Gly Glu Phe Lys
610 615 620
Asp Trp Asp Glu Met Ser Lys Lys Leu Asp Gly Thr Leu Glu Ser Leu
625 630 635 640
Ala Lys Asn Ser Trp Ser Gly Tyr Lys Thr Leu Thr Ala Tyr Phe Thr
645 650 655
Asn Tyr Arg Val Thr Ser Asp Asn Lys Val Gln Tyr Asp Val Val Phe
660 665 670
His Gly Val Leu Thr Asp Asn Ala Asp Ile Ser Asn Asn Lys Ala Pro
675 680 685
Ile Ala Lys Val Thr Gly Pro Ser Thr Gly Ala Val Gly Arg Asn Ile
690 695 700
Glu Phe Ser Gly Lys Asp Ser Lys Asp Glu Asp Gly Lys Ile Val Ser
705 710 715 720
Tyr Asp Trp Asp Phe Gly Asp Gly Ala Thr Ser Arg Gly Lys Asn Ser
725 730 735
Val His Ala Tyr Lys Lys Thr Gly Thr Tyr Asn Val Thr Leu Lys Val
740 745 750
Thr Asp Asp Lys Gly Ala Thr Ala Thr Glu Ser Phe Thr Ile Glu Ile
755 760 765
Lys Asn Glu Asp Thr Thr Thr Pro Ile Thr Lys Glu Met Glu Pro Asn
770 775 780
Asp Asp Ile Lys Glu Ala Asn Gly Pro Ile Val Glu Gly Val Thr Val
785 790 795 800
Lys Gly Asp Leu Asn Gly Ser Asp Asp Ala Asp Thr Phe Tyr Phe Asp
805 810 815
Val Lys Glu Asp Gly Asp Val Thr Ile Glu Leu Pro Tyr Ser Gly Ser
820 825 830
Ser Asn Phe Thr Trp Leu Val Tyr Lys Glu Gly Asp Asp Gln Asn His
835 840 845
Ile Ala Ser Gly Ile Asp Lys Asn Asn Ser Lys Val Gly Thr Phe Lys
850 855 860
Ala Thr Lys Gly Arg His Tyr Val Phe Ile Tyr Lys His Asp Ser Ala
865 870 875 880
Ser Asn Ile Ser Tyr Ser Leu Asn Ile Lys Gly Leu Gly Asn Glu Lys
885 890 895
Leu Lys Glu Lys Glu Asn Asn Asp Ser Ser Asp Lys Ala Thr Val Ile
900 905 910
Pro Asn Phe Asn Thr Thr Met Gln Gly Ser Leu Leu Gly Asp Asp Ser
915 920 925
Arg Asp Tyr Tyr Ser Phe Glu Val Lys Glu Glu Gly Glu Val Asn Ile
930 935 940
Glu Leu Asp Lys Lys Asp Glu Phe Gly Val Thr Trp Thr Leu His Pro
945 950 955 960
Glu Ser Asn Ile Asn Asp Arg Ile Thr Tyr Gly Gln Val Asp Gly Asn
965 970 975
Lys Val Ser Asn Lys Val Lys Leu Arg Pro Gly Lys Tyr Tyr Leu Leu
980 985 990
Val Tyr Lys Tyr Ser Gly Ser Gly Asn Tyr Glu Leu Arg Val Asn Lys
995 1000 1005
<210> 2
<211> 3024
<212> DNA
<213> 溶组织梭菌(Collagenase Clostridium Histolyticum)
<400> 2
attgcaaata ccaatagtga aaaatacgac tttgagtatc tgaatggcct gagctatacc 60
gaactgacca atctgattaa gaatattaag tggaaccaga ttaacggtct gtttaattat 120
agtaccggta gtcagaaatt ctttggtgac aaaaatcgtg tgcaggcaat tattaatgca 180
ctgcaggaaa gtggccgcac ctataccgca aatgatatga aaggtattga aacctttacc 240
gaagtgctgc gtgccggctt ttatctgggc tattataatg atggtctgag ttatctgaac 300
gatcgtaatt ttcaggataa atgcattccg gccatgattg ccattcagaa aaatccgaat 360
tttaagctgg gcaccgcagt tcaggatgaa gttattacca gtctgggtaa actgattggc 420
aatgccagcg caaatgccga agttgtgaat aattgtgtgc cggtgctgaa acagtttcgc 480
gaaaatctga atcagtatgc cccggattat gtgaaaggta cagccgttaa tgaactgatt 540
aagggtattg aattcgattt tagcggcgca gcatacgaaa aagatgtgaa aaccatgccg 600
tggtatggta aaattgatcc gtttattaac gagctgaaag ccctgggtct gtatggtaat 660
attaccagtg caaccgaatg ggccagcgat gtgggcatct attatctgag caaatttggc 720
ctgtatagca ccaatcgcaa tgatattgtg cagagcctgg aaaaagcagt ggatatgtat 780
aaatatggta aaatcgcctt cgtggccatg gaacgcatta cctgggatta tgatggcatt 840
ggtagtaatg gcaaaaaagt tgatcatgat aagttcctgg atgatgcaga aaaacattat 900
ctgccgaaaa cctatacctt tgataatggt acattcatta tccgcgccgg cgaaaaagtt 960
agtgaagaaa aaattaagcg cctgtattgg gcaagccgtg aagttaaatc acagtttcat 1020
cgtgttgttg gcaatgataa agccctggaa gttggcaatg ccgatgatgt gctgaccatg 1080
aaaattttta atagcccgga agaatacaag tttaatacca atattaacgg cgttagcacc 1140
gataatggtg gtctgtatat tgaaccgcgt ggtacatttt atacctatga acgcaccccg 1200
cagcagagca tttttagtct ggaagaactg tttcgccatg aatataccca ttatctgcag 1260
gcccgttatc tggttgatgg tctgtggggc cagggcccgt tttatgaaaa gaatcgtctg 1320
acctggtttg atgaaggtac agcagaattt ttcgccggca gtacccgcac cagcggtgtg 1380
ctgccgcgta aaagtattct gggttatctg gcaaaagata aagtggatca tcgctatagc 1440
ctgaaaaaga ctctgaatag tggctatgat gatagtgatt ggatgtttta taactacggt 1500
tttgcagtgg cacattatct gtatgaaaaa gatatgccga cctttattaa gatgaataag 1560
gccattctga acaccgatgt gaaaagctat gatgaaatta ttaagaagct gagtgacgat 1620
gccaataaga ataccgaata tcagaatcat atccaggaac tggcagataa atatcagggc 1680
gccggcattc cgctggtgag cgatgattat ctgaaagatc atggttataa gaaggcaagc 1740
gaagtttata gtgaaattag caaagccgcc agtctgacca ataccagcgt gaccgccgaa 1800
aaaagtcagt attttaatac ctttaccctg cgcggtacat ataccggcga aaccagtaaa 1860
ggcgaattca aagattggga tgaaatgagc aaaaaactgg atggcaccct ggaaagtctg 1920
gccaaaaata gttggagcgg ttataaaacc ctgaccgcat attttaccaa ttatcgtgtt 1980
accagcgata ataaggtgca gtatgatgtt gtttttcatg gcgtgctgac cgataatgcc 2040
gatattagta ataataaggc accgattgcc aaagtgaccg gtccgagtac cggcgccgtg 2100
ggtcgtaata ttgaattttc tggtaaagat agcaaggatg aagatggtaa aattgttagc 2160
tatgattggg attttggtga cggtgcaacc agccgtggca aaaatagtgt gcatgcatat 2220
aaaaaaacag gtacatataa tgttaccctg aaagttaccg atgataaagg tgcaaccgcc 2280
accgaaagct ttaccattga aattaagaat gaggatacca ccaccccgat taccaaagaa 2340
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aaaggtgacc tgaatggtag tgatgatgca gatacctttt attttgatgt gaaagaagac 2460
ggcgatgtta ccattgaact gccgtatagc ggcagtagca attttacctg gctggtgtat 2520
aaagaaggtg acgatcagaa tcatattgca agtggcattg ataaaaacaa tagcaaagtt 2580
ggcaccttta aagcaaccaa aggccgccat tatgtgttta tctataaaca tgatagcgcc 2640
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aattatgaac tgcgtgtgaa taag 3024
<210> 3
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Met Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn
1 5 10 15
Arg Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu Gly Ser Gly Ser Gly
20 25 30
His Met His His His His His His Ser Ser Gly Pro Asp Leu Met Asp
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Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly Leu Ala
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Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro Gln Gly
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Gln Arg Glu Pro
<210> 4
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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attagtagta gcggtgcact gggttctggt tctggccaca tgcaccatca tcatcatcat 120
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gaaggtctgg ccggtgaact ggaacagctg cgtgcacgcc tggaacatca tccgcagggc 240
cagcgcgaac cg 252
<210> 5
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn Arg
1 5 10 15
Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu
20 25
<210> 6
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly
1 5 10 15
Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro
20 25 30
Gln Gly Gln Arg Glu Pro
35
<210> 8
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<211> 1111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn
1 5 10 15
Arg Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu Gly Ser Gly Ser Gly
20 25 30
His Met His His His His His His Ser Ser Gly Pro Asp Leu Met Asp
35 40 45
Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly Leu Ala
50 55 60
Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro Gln Gly
65 70 75 80
Gln Arg Glu Pro Gly Ser Gly Ser Gly Gly Thr Ala Met Ala Asp Ile
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Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys Ile Ala Asn Thr Asn Ser Glu Lys Tyr
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130 135 140
Thr Gly Ser Gln Lys Phe Phe Gly Asp Lys Asn Arg Val Gln Ala Ile
145 150 155 160
Ile Asn Ala Leu Gln Glu Ser Gly Arg Thr Tyr Thr Ala Asn Asp Met
165 170 175
Lys Gly Ile Glu Thr Phe Thr Glu Val Leu Arg Ala Gly Phe Tyr Leu
180 185 190
Gly Tyr Tyr Asn Asp Gly Leu Ser Tyr Leu Asn Asp Arg Asn Phe Gln
195 200 205
Asp Lys Cys Ile Pro Ala Met Ile Ala Ile Gln Lys Asn Pro Asn Phe
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Lys Leu Gly Thr Ala Val Gln Asp Glu Val Ile Thr Ser Leu Gly Lys
225 230 235 240
Leu Ile Gly Asn Ala Ser Ala Asn Ala Glu Val Val Asn Asn Cys Val
245 250 255
Pro Val Leu Lys Gln Phe Arg Glu Asn Leu Asn Gln Tyr Ala Pro Asp
260 265 270
Tyr Val Lys Gly Thr Ala Val Asn Glu Leu Ile Lys Gly Ile Glu Phe
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Asp Phe Ser Gly Ala Ala Tyr Glu Lys Asp Val Lys Thr Met Pro Trp
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Tyr Gly Lys Ile Asp Pro Phe Ile Asn Glu Leu Lys Ala Leu Gly Leu
305 310 315 320
Tyr Gly Asn Ile Thr Ser Ala Thr Glu Trp Ala Ser Asp Val Gly Ile
325 330 335
Tyr Tyr Leu Ser Lys Phe Gly Leu Tyr Ser Thr Asn Arg Asn Asp Ile
340 345 350
Val Gln Ser Leu Glu Lys Ala Val Asp Met Tyr Lys Tyr Gly Lys Ile
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Lys His Tyr Leu Pro Lys Thr Tyr Thr Phe Asp Asn Gly Thr Phe Ile
405 410 415
Ile Arg Ala Gly Glu Lys Val Ser Glu Glu Lys Ile Lys Arg Leu Tyr
420 425 430
Trp Ala Ser Arg Glu Val Lys Ser Gln Phe His Arg Val Val Gly Asn
435 440 445
Asp Lys Ala Leu Glu Val Gly Asn Ala Asp Asp Val Leu Thr Met Lys
450 455 460
Ile Phe Asn Ser Pro Glu Glu Tyr Lys Phe Asn Thr Asn Ile Asn Gly
465 470 475 480
Val Ser Thr Asp Asn Gly Gly Leu Tyr Ile Glu Pro Arg Gly Thr Phe
485 490 495
Tyr Thr Tyr Glu Arg Thr Pro Gln Gln Ser Ile Phe Ser Leu Glu Glu
500 505 510
Leu Phe Arg His Glu Tyr Thr His Tyr Leu Gln Ala Arg Tyr Leu Val
515 520 525
Asp Gly Leu Trp Gly Gln Gly Pro Phe Tyr Glu Lys Asn Arg Leu Thr
530 535 540
Trp Phe Asp Glu Gly Thr Ala Glu Phe Phe Ala Gly Ser Thr Arg Thr
545 550 555 560
Ser Gly Val Leu Pro Arg Lys Ser Ile Leu Gly Tyr Leu Ala Lys Asp
565 570 575
Lys Val Asp His Arg Tyr Ser Leu Lys Lys Thr Leu Asn Ser Gly Tyr
580 585 590
Asp Asp Ser Asp Trp Met Phe Tyr Asn Tyr Gly Phe Ala Val Ala His
595 600 605
Tyr Leu Tyr Glu Lys Asp Met Pro Thr Phe Ile Lys Met Asn Lys Ala
610 615 620
Ile Leu Asn Thr Asp Val Lys Ser Tyr Asp Glu Ile Ile Lys Lys Leu
625 630 635 640
Ser Asp Asp Ala Asn Lys Asn Thr Glu Tyr Gln Asn His Ile Gln Glu
645 650 655
Leu Ala Asp Lys Tyr Gln Gly Ala Gly Ile Pro Leu Val Ser Asp Asp
660 665 670
Tyr Leu Lys Asp His Gly Tyr Lys Lys Ala Ser Glu Val Tyr Ser Glu
675 680 685
Ile Ser Lys Ala Ala Ser Leu Thr Asn Thr Ser Val Thr Ala Glu Lys
690 695 700
Ser Gln Tyr Phe Asn Thr Phe Thr Leu Arg Gly Thr Tyr Thr Gly Glu
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Thr Ser Lys Gly Glu Phe Lys Asp Trp Asp Glu Met Ser Lys Lys Leu
725 730 735
Asp Gly Thr Leu Glu Ser Leu Ala Lys Asn Ser Trp Ser Gly Tyr Lys
740 745 750
Thr Leu Thr Ala Tyr Phe Thr Asn Tyr Arg Val Thr Ser Asp Asn Lys
755 760 765
Val Gln Tyr Asp Val Val Phe His Gly Val Leu Thr Asp Asn Ala Asp
770 775 780
Ile Ser Asn Asn Lys Ala Pro Ile Ala Lys Val Thr Gly Pro Ser Thr
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Gly Ala Val Gly Arg Asn Ile Glu Phe Ser Gly Lys Asp Ser Lys Asp
805 810 815
Glu Asp Gly Lys Ile Val Ser Tyr Asp Trp Asp Phe Gly Asp Gly Ala
820 825 830
Thr Ser Arg Gly Lys Asn Ser Val His Ala Tyr Lys Lys Thr Gly Thr
835 840 845
Tyr Asn Val Thr Leu Lys Val Thr Asp Asp Lys Gly Ala Thr Ala Thr
850 855 860
Glu Ser Phe Thr Ile Glu Ile Lys Asn Glu Asp Thr Thr Thr Pro Ile
865 870 875 880
Thr Lys Glu Met Glu Pro Asn Asp Asp Ile Lys Glu Ala Asn Gly Pro
885 890 895
Ile Val Glu Gly Val Thr Val Lys Gly Asp Leu Asn Gly Ser Asp Asp
900 905 910
Ala Asp Thr Phe Tyr Phe Asp Val Lys Glu Asp Gly Asp Val Thr Ile
915 920 925
Glu Leu Pro Tyr Ser Gly Ser Ser Asn Phe Thr Trp Leu Val Tyr Lys
930 935 940
Glu Gly Asp Asp Gln Asn His Ile Ala Ser Gly Ile Asp Lys Asn Asn
945 950 955 960
Ser Lys Val Gly Thr Phe Lys Ala Thr Lys Gly Arg His Tyr Val Phe
965 970 975
Ile Tyr Lys His Asp Ser Ala Ser Asn Ile Ser Tyr Ser Leu Asn Ile
980 985 990
Lys Gly Leu Gly Asn Glu Lys Leu Lys Glu Lys Glu Asn Asn Asp Ser
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Pro Gly Lys Tyr Tyr Leu Leu Val Tyr Lys Tyr Ser Gly Ser Gly Asn
1090 1095 1100
Tyr Glu Leu Arg Val Asn Lys
1105 1110
<210> 10
<211> 3333
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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attagtagta gcggtgcact gggttctggt tctggccaca tgcaccatca tcatcatcat 120
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acctttaccg aagtgctgcg tgccggcttt tatctgggct attataatga tggtctgagt 600
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ctgattggca atgccagcgc aaatgccgaa gttgtgaata attgtgtgcc ggtgctgaaa 780
cagtttcgcg aaaatctgaa tcagtatgcc ccggattatg tgaaaggtac agccgttaat 840
gaactgatta agggtattga attcgatttt agcggcgcag catacgaaaa agatgtgaaa 900
accatgccgt ggtatggtaa aattgatccg tttattaacg agctgaaagc cctgggtctg 960
tatggtaata ttaccagtgc aaccgaatgg gccagcgatg tgggcatcta ttatctgagc 1020
aaatttggcc tgtatagcac caatcgcaat gatattgtgc agagcctgga aaaagcagtg 1080
gatatgtata aatatggtaa aatcgccttc gtggccatgg aacgcattac ctgggattat 1140
gatggcattg gtagtaatgg caaaaaagtt gatcatgata agttcctgga tgatgcagaa 1200
aaacattatc tgccgaaaac ctataccttt gataatggta cattcattat ccgcgccggc 1260
gaaaaagtta gtgaagaaaa aattaagcgc ctgtattggg caagccgtga agttaaatca 1320
cagtttcatc gtgttgttgg caatgataaa gccctggaag ttggcaatgc cgatgatgtg 1380
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gttagcaccg ataatggtgg tctgtatatt gaaccgcgtg gtacatttta tacctatgaa 1500
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aatcgtctga cctggtttga tgaaggtaca gcagaatttt tcgccggcag tacccgcacc 1680
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cgctatagcc tgaaaaagac tctgaatagt ggctatgatg atagtgattg gatgttttat 1800
aactacggtt ttgcagtggc acattatctg tatgaaaaag atatgccgac ctttattaag 1860
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agtgacgatg ccaataagaa taccgaatat cagaatcata tccaggaact ggcagataaa 1980
tatcagggcg ccggcattcc gctggtgagc gatgattatc tgaaagatca tggttataag 2040
aaggcaagcg aagtttatag tgaaattagc aaagccgcca gtctgaccaa taccagcgtg 2100
accgccgaaa aaagtcagta ttttaatacc tttaccctgc gcggtacata taccggcgaa 2160
accagtaaag gcgaattcaa agattgggat gaaatgagca aaaaactgga tggcaccctg 2220
gaaagtctgg ccaaaaatag ttggagcggt tataaaaccc tgaccgcata ttttaccaat 2280
tatcgtgtta ccagcgataa taaggtgcag tatgatgttg tttttcatgg cgtgctgacc 2340
gataatgccg atattagtaa taataaggca ccgattgcca aagtgaccgg tccgagtacc 2400
ggcgccgtgg gtcgtaatat tgaattttct ggtaaagata gcaaggatga agatggtaaa 2460
attgttagct atgattggga ttttggtgac ggtgcaacca gccgtggcaa aaatagtgtg 2520
catgcatata aaaaaacagg tacatataat gttaccctga aagttaccga tgataaaggt 2580
gcaaccgcca ccgaaagctt taccattgaa attaagaatg aggataccac caccccgatt 2640
accaaagaaa tggaaccgaa tgatgatatt aaggaagcaa atggcccgat tgttgaaggt 2700
gttaccgtta aaggtgacct gaatggtagt gatgatgcag atacctttta ttttgatgtg 2760
aaagaagacg gcgatgttac cattgaactg ccgtatagcg gcagtagcaa ttttacctgg 2820
ctggtgtata aagaaggtga cgatcagaat catattgcaa gtggcattga taaaaacaat 2880
agcaaagttg gcacctttaa agcaaccaaa ggccgccatt atgtgtttat ctataaacat 2940
gatagcgcca gtaatattag ctatagtctg aatattaagg gcctgggcaa tgaaaaactg 3000
aaagaaaaag aaaacaacga cagcagtgat aaagcaaccg tgattccgaa ttttaatacc 3060
accatgcagg gtagcctgct gggcgatgat agccgtgatt attatagttt tgaagttaag 3120
gaggagggtg aagttaatat tgaactggat aaaaaggacg aattcggcgt gacctggacc 3180
ctgcatccgg aaagtaatat taatgatcgc attacctacg gccaggttga tggcaataag 3240
gtgagtaata aggtgaaact gcgtccgggc aaatattatc tgctggtgta taagtatagc 3300
ggctcaggta attatgaact gcgtgtgaat aag 3333
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gly Ser Gly Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly
1 5 10 15
Pro Asp Leu
<210> 12
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggttctggtt ctggccacat gcaccatcat catcatcatt cttctggtcc agatctg 57
<210> 13
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Ser Gly Ser Gly Gly Thr Ala Met Ala Asp Ile Gly Ser Asp Asp
1 5 10 15
Asp Asp Lys
<210> 14
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggttctggtt ctggcggtac cgccatggct gatatcggat ccgatgatga tgataaa 57

Claims (6)

1.一种重组溶组织梭菌I型胶原酶的融合蛋白，其特征在于，包含溶组织梭菌I型胶原酶和连接到所述溶组织梭菌I型胶原酶N端的标签蛋白；所述标签蛋白包含串联的钙调蛋白结合肽(CBP)与链球菌抗生物素蛋白结合肽(SBP)；所述标签蛋白通过柔性连接肽连接至溶组织梭菌I型胶原酶的N端；所述柔性连接肽氨基酸序列为SEQ ID NO:13GSGSGGTAMADIGSDDDDK；所述钙调蛋白结合肽(CBP)的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，所述链球菌抗生物素蛋白结合肽(SBP)的氨基酸序列为SEQ ID NO:7；所述标签蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
2.如权利要求1所述的重组溶组织梭菌I型胶原酶的融合蛋白，其特征在于，所述重组溶组织梭菌I型胶原酶融合蛋白所述氨基酸序列为SEQ ID NO:9。
3.一种编码如权利要求1所述的重组溶组织梭菌I型胶原酶的融合蛋白的重组基因，其特征在于，包含溶组织梭菌I型胶原酶编码基因和位于所述溶组织梭菌I型胶原酶编码基因上游的标签蛋白编码基因，所述标签蛋白编码基因中包含编码串联的钙调蛋白结合肽(CBP)与链球菌抗生物素蛋白结合肽(SBP)的重组基因；所述标签蛋白的编码基因为SEQ IDNO:4。
4.如权利要求3所述的编码重组溶组织梭菌I型胶原酶的融合蛋白的重组基因，其特征在于，所述重组基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:10。
5.一种重组溶组织梭菌I型胶原酶的制备方法，其特征在于，包括：
1)将标签蛋白的编码基因连接至溶组织梭菌I型胶原酶编码基因的上游，获得编码如权利要求1-2中任一项所述的重组溶组织梭菌I型胶原酶的重组基因；
2)将所述重组基因连接至骨架质粒中得到重组载体；
3)将所述重组载体转化到宿主菌中，得到重组工程菌；
4)将所述重组工程菌接种于发酵罐中，诱导表达；
5)当菌体和蛋白浓度达到预设阈值后，从培养物中分离纯化得到重组溶组织梭菌I型胶原酶；
6)利用蛋白酶将所述重组溶组织梭菌I型胶原酶酶解，去除标签蛋白；
7)将酶解后的样品依次经过Ni2+螯合层析、QFF层析、Butyl-Impres层析，获得重组溶组织梭菌I型胶原酶目的蛋白纯品。
6.权利要求1或2所述的重组溶组织梭菌I型胶原酶在制备用于治疗杜普征氏掌挛缩、佩罗尼病或橘皮组织的药物中的应用。
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