CN110777140A - 硫酸软骨素酶ac突变体、编码基因、载体、工程菌及其制备方法 - Google Patents

硫酸软骨素酶ac突变体、编码基因、载体、工程菌及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种硫酸软骨素酶AC突变体，该突变体具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明提供了一种所述硫酸软骨素酶AC突变体的编码基因，该编码基因具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。本发明还分别提供一种上述硫酸软骨素酶AC突变体的重组载体及工程菌。本发明同时还通过一种上述硫酸软骨素酶AC突变体的制备方法。本发明通过将野生型硫酸软骨素酶AC氨基酸序列SEQ ID NO:1中的第170位突变为甘氨酸构建硫酸软骨素酶AC突变体，如此，减小了该硫酸软骨素酶AC突变体与多糖底物结合空间位阻，扩大了其与多糖的结合口袋，使其更容易结合多糖底物，从而提高硫酸软骨素酶AC的活性。

Description

硫酸软骨素酶AC突变体、编码基因、载体、工程菌及其制备 方法
技术领域
本发明属于基因工程，具体地，涉及一种硫酸软骨素酶AC突变体、编码基因、重组载体、工程菌及其制备方法。
背景技术
硫酸软骨素酶(chondroitinase或chondroitin sulfate lyase)是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖(ΔDi及寡糖)的裂解酶。根据其作用底物的差异主要分为硫酸软骨素酶ABC、硫酸软骨素酶AC、硫酸软骨素酶B及硫酸软骨素酶C等类型。
目前国际上对硫酸软骨素酶AC的关注越来越多，而且研究显示硫酸软骨素酶AC有多种重要用途，在基础研究中它用来构建二糖和寡糖的基因文库；研究糖胺多糖结构和性质；在临床领域，用来治疗一些疾病。另外有两项新增应用非常重要： 1）在酶法生产低分子量硫酸软骨素CS中作为催化剂应用；2）在类肝素酶法精制中的应用。以上所有硫酸软骨素酶AC推广及应用关键在于获得大量、廉价的硫酸软骨素酶。目前硫酸软骨素酶AC获取的途径是通过Arthrobacter aurescens发酵提纯获得，但是Arthrobacter aurescens来源的硫酸软骨素酶AC对硫酸软骨素或透明质酸等多糖的裂解反应存在催化活性有限，效率低等问题。
因此，突变出新型的高活性的硫酸软骨素酶AC基因，并通过基因工程技术构建高表达的重组载体和工程菌对多糖的裂解具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明确有必要提供一种硫酸软骨素酶AC突变体、编码基因、重组载体及其制备方法，以解决上述问题。
为此，本发明提供一种硫酸软骨素酶AC突变体，该突变体具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。具体地，将具有SEQ ID NO:1所示的硫酸软骨素酶AC原始氨基酸序列中的第170位突变为甘氨酸。
本发明还提供一种上述硫酸软骨素酶AC突变体编码基因，该基因具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
本发明还提供一种由上述硫酸软骨素酶AC突变体编码基因构建的重组载体。
优选地，所述硫酸软骨素酶AC突变体重组载体命名为pET-15b-AachAC(170G)。
本发明还提供一种由上述重组载体转化制备的工程菌。
本发明还提供一种上述硫酸软骨素酶AC突变体的制备方法，包括步骤：
原始基团表达载体构建 以SEQ ID NO:1所示的野生型硫酸软骨素酶AC为模板设计引物进行PCR扩增，并引入NdeI和BamHI限制性酶切点，然后分别连接到pET15b载体上进行基因重组构建得到野生型硫酸软骨素酶AC重组载体，命名为pET-15b-AachAC；
突变体构建及重组 以所述野生型硫酸软骨素酶AC重组载体pET-15b-AachAC为模板，将所述野生型硫酸软骨素酶AC的氨基酸突变位点第170位突变为甘氨酸，并进行PCR扩增获得PCR产物，然后用FD DpnI内切酶进行消化，制得硫酸软骨素酶AC突变体重组载体，命名为pET-15b-AachAC(170G)；
突变体表达及纯化 将所述硫酸软骨素酶AC突变体重组载体pET-15b-AachAC(170G)用化学法转化至宿主菌E.coli DH5α或E.coli BL21(DE3)中，先采用TB培养基进行发酵培养，再采用IPTG进行诱导处理，然后依次进行破碎处理和纯化处理，收集得到纯酶液，即为硫酸软骨素酶AC突变体的工程菌。
其中，所述采用IPTG进行诱导处理的步骤包括：采用浓度为0～1 mM的IPTG在10℃～42℃的温度下诱导培养15～28 h。
基于上述，所述突变体构建及重组的步骤包括：以所述野生型硫酸软骨素酶AC重组载体pET-15b-AachAC为模板，将所述突变位点第170位的DNA序列设计到上游引物和下游引物中，进行反向PCR扩增获得所述PCR产物，其中，所述上游引物具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，所述下游引物具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
与现有技术相比，本发明提供的硫酸软骨素酶AC突变体主要是将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列第170位突变为甘氨酸获得的，该突变体保留了5个氨基酸残基：183位的天冬酰胺（Asn183）、233位的组氨酸（His233）、242位的酪氨酸（Tyr242）、296位的精氨酸（Arg296）和407位的谷氨酸（Glu407），该5个氨基酸残基为硫酸软骨素酶AC酶对硫酸软骨素或透明质酸等多糖大分子的催化位点，且涉及多糖大分子的识别与糖苷键断裂反应，该裂解反应为β消除反应，即该突变体保留了其对多糖的催化活性；同时由于氨基酸序列中第170位位于硫酸软骨素酶AC与多糖底物的结合口袋附近，且该第170位突变为更小的氨基酸残基甘氨酸，减小了其与多糖底物结合空间位阻，扩大了其与多糖的结合口袋，使得硫酸软骨素酶AC更容易结合多糖底物，从而提高硫酸软骨素酶AC的活性。
附图说明
图1是野生型硫酸软骨素酶AC重组载体pET-15b-AachAC的质粒图谱；
图2为表达可溶的野生型硫酸软骨素酶AC及其突变体的电泳图谱，其中，该图中的“AC”代表野生型硫酸软骨素酶AC，“170G”代表硫酸软骨素酶AC突变体。
序列表中：
SEQ ID NO.1为野生型硫酸软骨素酶AC的氨基酸序列；
SEQ ID NO.2为硫酸软骨素酶AC突变体的氨基酸序列；
SEQ ID NO.3为硫酸软骨素酶AC突变体的核苷酸序列；
SEQ ID NO.4为PCR扩增硫酸软骨素酶AC突变体的上游引物核苷酸序列；
SEQ ID NO.5为PCR扩增硫酸软骨素酶AC突变体的下游引物核苷酸序列。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
本文涉及的硫酸软骨素酶AC选自金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)，特别地，硫酸软骨素酶AC是去除了编码信号肽碱基的金黄节杆菌硫酸软骨素酶AC。本文野生型硫酸软骨素酶AC具有SEQ ID NO ：1 所示的核苷酸序列。
实施例1 硫酸软骨素酶AC突变体蛋白
本实施例提供一种硫酸软骨素酶AC突变体，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
本实施例还提供一种上述硫酸软骨素酶AC突变体编码基因，该基因具有SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列。
实施例2 野生型硫酸软骨素酶AC重组载体的构建
以SEQ ID NO:1所示的野生型硫酸软骨素酶AC为模板设计原始引物进行PCR扩增，并引入NdeI和BamHI限制性酶切点，然后分别连接到质粒载体上进行基因重组构建得到野生型硫酸软骨素酶AC重组载体，且其N端链接上his标签以便后续硫酸软骨素酶AC突变体的分离及纯化。所述质粒载体可以为pET15b载体、PMAL-C2X或pGEX-4T1。本实施例中，所述质粒载体为pET15b载体，所述野生型硫酸软骨素酶AC重组载体命名为pET-15b-AachAC，其简图参见图1。
其中，所述原始上游引物F：5’-gggaaacatatgGAAGCTGAGCCAGGTGCAGCTG-3’（其中，小写字母部分主要用于修饰，大写字母部分主要用于互补）；
所述原始下游引物R：5’-gggaaaggatccGCGTTTCAGTTTGATCAGTTTC-3’（其中，小写字母部分主要用于修饰，大写字母部分主要用于互补）。
实施例3 硫酸软骨素酶AC突变体及其重组载体的构建
以实施例2提供的所述野生型硫酸软骨素酶AC重组载体pET-15b-AachAC为模板，将SEQID NO:1所示的氨基酸序列中的第170位的DNA序列设计到上游引物中，使得第170位突变为甘氨酸，然后进行反向PCR扩增获得所述PCR产物，PCR产物不需要胶回收，用FD DpnI内切酶在37℃消化1 h，制得硫酸软骨素酶AC突变体重组载体，命名为pET-15b-AachAC(170G)。
其中，所述上游引物F-170G：5’-GATCCGTGGCTGCAAGGTCCGCCTAAACGT-3’（SEQ IDNO：4）；
所述下游引物R-170G：5’-TTGCAGCCACGGATCTGGGACGAAG-3’（SEQ ID NO：5）。
实施例4 硫酸软骨素酶AC突变体表达及纯化
将实施例3得到的所述硫酸软骨素酶AC突变体重组载体pET-15b-AachAC(170G)用化学法转化至宿主菌大肠杆菌感受态细胞中，先采用50mL TB培养基在37℃、以220 rpm的转速进行发酵培养2 h，待OD600为0.6-0.8时，再采用0.5 mM IPTG在20℃诱导20 h，得到诱导菌体。所述宿主菌可以为E.coli DH5α或E.coli BL21(DE3)，本实施例中，所述宿主菌可以为E.coli DH5α。
将所述诱导菌体于4℃和6000 rpm的条件下离心收集，用50 mM且pH 7.4的Tris-HCl缓冲液进行重悬，重悬后的菌体进行超声破碎，破碎功率为180 W，破碎时间为10 min。破碎后缓冲液4℃ 6000 rpm离心30 min，取上清进行镍柱亲和分离纯化，用300 mM咪唑进行洗脱，收集纯酶液，为硫酸软骨素酶AC突变体工程菌E.coli DH5α/pET-15b-AachAC(170G)。
其中，在其它实施例中，所述硫酸软骨素酶AC突变体工程菌可以为E.coli BL21(DE3)/pET-15b-AachAC(170G)。
性能验证试验
以本发明实施4例提供的硫酸软骨素酶AC突变体工程菌E.coli DH5α/pET-15b-AachAC(170G)与野生型硫酸软骨素酶AC工程菌E.coli DH5α/pET-15b-AachAC为样品进行SDS电泳及酶活性性能测试。
野生型硫酸软骨素酶AC工程菌 将实施例2提供的所述野生型硫酸软骨素酶AC重组载体命名为pET-15b-AachAC，采用实施例3提供的方法对所述野生型硫酸软骨素酶AC重组载体pET-15b-AachAC进行表达和纯化处理，得到所述野生型硫酸软骨素酶AC工程菌E.coli DH5α/pET-15b-AachAC。
1）SDS-PAGE电泳验证 将实施例4提供的所述硫酸软骨素酶AC突变体工程菌与所述野生型硫酸软骨素酶AC工程菌分别用40%甘油按照1:1的体积比混合，并于-80℃保存；然后进行SDS-PAGE分析验证，验证结果参见图2，硫酸软骨素酶AC突变体及野生型硫酸软骨素酶AC的蛋白分子量约为80.6kDa，并成功纯化。
2）酶活性测试 分别以1 mg/mL的硫酸软骨素A、1 mg/mL的硫酸软骨素C及1 mg/mL的硫酸软骨素AC为底物，在pH为6.0和反应温度为37℃的条件下，于232 nm采用分光光度法监测单位时间的对应硫酸软骨素二糖（简称“CS二糖”）的生成量，测量结果如表1所示。其中，蛋白浓度监测采用常规的Bradford法。
表1 酶活性测试结果表
Figure DEST_PATH_IMAGE002
从表1中可以看出：本发明提供的硫酸软骨素酶AC突变体无论对硫酸软骨素AC、A或C的比酶活都有一定幅度的提升，说明本发明提供的硫酸软骨素酶AC突变体的空间位阻减小使得硫酸软骨素底物更容易与其进行结合，从而提高了其比酶活；与野生型硫酸软骨素酶AC相比，本发明提供的硫酸软骨素酶AC突变体的比酶活提高了15.6%。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京电子科技职业学院
<120> 硫酸软骨素酶AC突变体、编码基因、载体、工程菌及其制备方法
<130> 2019
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 757
<212> PRT
<213> 野生型硫酸软骨素酶AC
<400> 1
Glu Ala Glu Pro Gly Ala Ala Glu Phe Ala Ala Leu Arg Asn Arg Trp Val Asp Gln Ile
Thr Gly Arg Asn Val Ile Gln Ala Gly Asp Pro Asp Phe Ala Lys Ala Ile Thr Ala Leu
Asn Asn Lys Ala Ala Asp Ser Leu Ala Lys Leu Asp Ala Ala Ala Gly Arg Thr Ser Val
Phe Thr Asp Leu Ser Leu Ala Lys Asp Ala Glu Met Val Thr Thr Tyr Thr Arg Leu Ser
Gln Leu Ala Thr Ala Trp Ala Thr Pro Thr Ala Ala Val Phe Gly Asp Ala Ala Val Leu
Ala Ala Ile Lys Ala Gly Leu Ala Asp Ala Asn Thr Leu Cys Tyr Asn Asp Arg Lys Glu
Glu Val Gly Asn Trp Trp Ser Trp Glu Ile Gly Val Pro Arg Ala Leu Ala Asp Ala Met
Val Leu Leu His Ala Glu Leu Ser Ala Ala Glu Arg Thr Ala Tyr Cys Ala Ala Ile Asp
His Phe Va lPro Asp Pro Trp Leu Gln Phe Pro Pro Lys Arg Gly Lys Ile Thr Ser Val
Gly Ala Asn Arg Val Asp Leu Cys Gln Gly Ile Ile Ile Arg Ser Leu Ala Gly Glu Asp
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Gly Asp Gly Ile Phe Arg Asp Gly Ser Phe Ile Gln His Ser Thr Thr Pro Tyr Thr Gly
Ser Tyr Gly Val Val Leu Leu Thr Gly Leu Ser Lys Leu Phe Ser Leu Leu Gly Gly Thr
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Ala Pro Val Met Ile Asn Gly Ala Met Ala Asp Ala Val Arg Gly Arg Ser Ile Ser Arg
Glu Ala Asn Thr Gly Tyr Asp Leu Gly Ala Ser Ala Ile Glu Ala Ile Leu Leu Leu Ala
Arg Ala Met Asp Pro Ala Thr Ala Ala Arg Trp Arg Gly Leu Cys Ala Gly Trp Ile Ala
Arg Asp Thr Tyr Arg Pro Ile Leu Asn Ser Ala Ser Val Pro Arg Thr Ala Leu Val Lys
Gln Leu Glu Ala Thr Gly Val Ala Pro Val Ala Glu Ala Thr Gly His Lys Leu Phe Pro
Ala Met Asp Arg Thr Met His Arg Gly Pro Gly Trp Ala Leu Ser Leu Ala Leu Ser Ser
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Ser Gly Met Thr Tyr Phe Tyr Thr Ser Asp Leu Gly Gln Tyr Asp Asp Ala Phe Trp Ala
Thr Ala Asn Tyr Asn Arg Leu Pro Gly Ile Thr Val Asp Thr Thr Pro Leu Pro Asp Lys
Val Glu Gly Gln Trp Gly Ala Ala Val Pro Ala Asp Glu Trp Ser Gly Ala Thr Ala Leu
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Arg Lys Ser Trp Phe Val Ser Gly Asp Val Thr Val Cys Leu Gly Ala Asp Ile Ser Thr
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Thr Leu Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ile Ala Gly Thr Ala Gly Thr Val Glu Val Leu Gly
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Leu His Val Leu Arg Glu Thr Arg Ser Gly Ser Trp Ser Gly Val Asn Ile Asn Gly Ser
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Ser Glu Pro Thr Gln Lys Ala Ala Gly Leu Thr Leu Thr Leu Pro Glu Gly Thr Trp Ser
Ser Val Leu Glu Gly Ala Gly Thr Leu Gly Thr Asp Ala Asp Gly Arg Ser Thr Leu Thr
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<210> 2
<211> 757
<212> PRT
<213> 硫酸软骨素酶AC突变体
<400> 2
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Asn Asn Lys Ala Ala Asp Ser Leu Ala Lys Leu Asp Ala Ala Ala Gly Arg Thr Ser Val
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Ala Met Asp Arg Thr Met His Arg Gly Pro Gly Trp Ala Leu Ser Leu Ala Leu Ser Ser
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Ser Gly Met Thr Tyr Phe Tyr Thr Ser Asp Leu Gly Gln Tyr Asp Asp Ala Phe Trp Ala
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Gly Glu Val Ala Ala Val Gly Gln His Leu Val Gly Pro Gly Arg Thr Gly Leu Thr Ala
Arg Lys Ser Trp Phe Val Ser Gly Asp Val Thr Val Cys Leu Gly Ala Asp Ile Ser Thr
Ala Ser Gly Ala Lys Val Glu Thr Ile Val Asp His Arg Asn Leu His Gln Gly Ser Asn
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Asp Gly Arg Trp Val His Leu Glu Gly Phe Gly Gly Tyr Ala Met Leu Asp Asp Ser Pro
Leu His Val Leu Arg Glu Thr Arg Ser Gly Ser Trp Ser Gly Val Asn Ile Asn Gly Ser
Ala Thr Val Gln Gln Arg Asn Phe Ala Thr Leu Tyr Val Asn His Gly Val Gly Pro Val
Ala Gly Ser Tyr Ala Tyr Met Val Ala Pro Gly Ala Ser Val Asp Leu Thr Arg Lys Leu
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Ala Ser Gly Pro Ala Cys Val Val Phe Ser Arg His Gly Asn Glu Leu Ser Leu Ala Val
Ser Glu Pro Thr Gln Lys Ala Ala Gly Leu Thr Leu Thr Leu Pro Glu Gly Thr Trp Ser
Ser Val Leu Glu Gly Ala Gly Thr Leu Gly Thr Asp Ala Asp Gly Arg Ser Thr Leu Thr
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<210> 3
<211> 2271
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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CGACGTACAC CCGTCTGAGC CAACTGGCAA CCGCTTGGGC
TACGCCAACT GCTGCGGTAT TCGGTGATGC GGCAGTACTG
GCAGCTATCA AAGCGGGTCT GGCAGACGCA AACACTCTGT
GCTACAACGA CCGTAAAGAG GAAGTGGGTA ACTGGTGGAG
CTGGGAAATC GGTGTCCCGC GTGCCCTGGC AGATGCAATG
GTCCTGCTG CATGCGGAAC TGAGCGCAGC TGAACGTACCG
CTTACTGCGC AGCAATCGAC CACTTCGTCC CAGATCCGTG
GCTGCAAGGT CCGCCTAAAC GTGGTAAGAT CACCTCCGTA
GGTGCGAAC CGCGTGGACC TGTGCCAGGG TATCATTATTC
GTAGCCTGGC TGGTGAGGAC CCGACTAAAC TGAACCATGC
GGTGGCAGGC CTGTCCCAAG TGTGGCAGTA CGTCACCAGC
GGTGATGGTA TCTTCCGCGA CGGTAGCTTC ATTCAGCACA
GCACCACCCC GTACACCGGT TCCTACGGTG TCGTGCTGCT
GACGGGTCTG TCTAAGCTGT TCAGCCTGCT GGGTGGTACT
GCATTCGAAG TGTCCGACCC GACCCGTAGC ATCTTCTTCG
ACGCTGTGGA AGGTTCCTTC GCGCCGGTGA TGATCAATGG
CGCAATGGCC GACGCAGTGC GTGGTCGTTC TATCTCCCGT
GAAGCAAACA CCGGCTATGA TCTGGGCGCA TCCGCAATCG
AAGCGATTCT GCTGCTGGCC CGTGCAATGG ACCCGGCTAC
TGCGGCACGT TGGCGTGGTC TGTGTGCTGG TTGGATCGCT
CGTGATACTT ACCGTCCGAT CCTGAACTCC GCATCCGTGC
CGCGTACCGC ACTGGTTAAA CAGCTGGAAG CCACTGGTGT
GGCTCCTGTA GCTGAAGCGA CTGGTCACAA ACTGTTCCCG
GCCATGGATC GTACTATGCA CCGCGGTCCA GGTTGGGCTC
TGAGCCTGGC GCTGTCTTCT AACCGTATCG CTTGGTACGA
ATGCGGTAAC GGTGAGAACA ACCGCGGCTA CCACACTGGT
AGCGGTATGA CCTACTTCTA CACCAGCGAT CTGGGTCAGT
ATGACGACGC CTTTTGGGCG ACGGCGAACT ACAACCGCCT
GCCGGGTATC ACCGTTGACA CCACTCCGCT GCCGGACAAA
GTGGAAGGCC AGTGGGGTGC GGCTGTTCCG GCTGATGAAT
GGAGCGGTGC AATGCGCTG GGTGAAGTAG CTGCTGTTGG
TCAGCACCTG GTTGGCCCTG GCCGTACTGG TCTGACTGCT
CGTAAATCCT GGTTCGTGTC CGGCGATGTA ACCGTTTGTC
TGGGTGCCGA TATCTCCACC GCTTCCGGTG CTAAAGTTGA
AACCATTGTT GACCACCGCA ACCTGCACCA GGGCTCCAAC
ACGCTGACTA CCGCGGCCGG CACCATTGCC GGCACTGCGG
GCACTGTTGA AGTTCTGGGC GATGGCCGTT GGGTTCATCT
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CTGCATGTTC TGCGTGAAAC CCGCTCTGGC TCTTGGTCTG
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TCTGAACCGA CCCAGAAAGC CGCGGGCCTG ACGCTGACCC
TGCCGGAAGG CACTTGGTCT TCTGTTCTGG AGGGCGCGGG
CACCCTGGGC ACTGATGCGG ATGGCCGCTC TACCCTGACT
CTGGATACCA CCGGCCTGTC TGGCAAAACG AAACTGATCA
AACTGAAACG C
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
GATCCGTGGCTGCAAGGTCCGCCTAAACGT
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
TTGCAGCCACGGATCTGGGACGAAG

Claims (6)

1. 一种硫酸软骨素酶AC突变体，其特征在于：该突变体具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
2. 一种权利要求1所述的硫酸软骨素酶AC突变体编码基因，其特征在于：该编码基因具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
3.一种由权利要求2所述的硫酸软骨素酶AC突变体编码基因构建的重组载体。
4.一种由根据权利要求3所述的重组载体转化制备的工程菌。
5.一种权利要求1所述的硫酸软骨素酶AC突变体的制备方法，包括步骤：
原始基团表达载体构建 以SEQ ID NO:1所示的野生型硫酸软骨素酶AC为模板设计引物进行PCR扩增，并引入NdeI和BamHI限制性酶切点，然后分别连接到pET15b载体上进行基因重组构建得到野生型硫酸软骨素酶AC重组载体，命名为pET-15b-AachAC；
突变体构建及重组 以所述野生型硫酸软骨素酶AC重组载体pET-15b-AachAC为模板，将所述野生型硫酸软骨素酶AC的氨基酸突变位点第170位突变为甘氨酸，并进行PCR扩增获得PCR产物，然后用FD DpnI内切酶进行消化，制得硫酸软骨素酶AC突变体重组载体，命名为pET-15b-AachAC(170G)；
突变体表达及纯化 将所述硫酸软骨素酶AC突变体重组载体pET-15b-AachAC(170G)用化学法转化至宿主菌E.coli DH5α或E.coli BL21(DE3)中，先采用TB培养基进行发酵培养，再采用IPTG进行诱导处理，然后依次进行破碎处理和纯化处理，收集得到纯酶液，即为硫酸软骨素酶AC突变体的工程菌。
6.根据权利要求5所述的硫酸软骨素酶AC突变体的制备方法，其特征在于：所述突变体构建及重组的步骤包括以所述野生型硫酸软骨素酶AC重组载体pET-15b-AachAC为模板，将所述突变位点第170位的DNA序列设计到上游引物和下游引物中，进行反向PCR扩增获得所述PCR产物，其中，所述上游引物具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，所述下游引物具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
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