KR102653146B1 - 외분비 인간 표피성장인자의 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 외분비 인간 표피성장인자의 생산방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 생산 단백질이 세포 밖으로 분비되도록 제작된 hEGF 발현 벡터를 P. pastoris에 도입하여 재조합 P. pastoris를 제조하고, 상기 재조합 P. pastoris를 세포 성장을 위한 생장용 배지와, hEGF 생산용 배지에서 순차적으로 배양하며, 상기 생장용 배지에 사용되는 탄소원, 및 hEGF 생산용 배지를 이용한 배양에서 세포 밀도, 메탄올 농도 및 메탄올 주입간격을 최적화하여, hEGF 생산량을 향상시킬 수 있는 외분비 인간 표피선장인자의 생산방법에 대한 것이다.
Description
본 발명은 외분비 인간 표피성장인자의 생산방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 생산 단백질이 세포 밖으로 분비되도록 제작된 hEGF 발현 벡터를 P. pastoris에 도입하여 재조합 P. pastoris를 제조하고, 상기 재조합 P. pastoris를 세포 성장을 위한 생장용 배지와, hEGF 생산용 배지에서 순차적으로 배양하며, 상기 생장용 배지에 사용되는 탄소원, 및 hEGF 생산용 배지를 이용한 배양에서 세포 밀도, 메탄올 농도 및 메탄올 주입간격을 최적화하여, hEGF 생산량을 향상시킬 수 있는 외분비 인간 표피선장인자의 생산방법에 대한 것이다.
인간 표피성장인자(Human epidermal growth factor, hEGF)는 53개의 아미노산들로 이루어져 있으며 6.2kDa의 몰질량을 가진 단일 사슬 폴리펩타이드로, 상처 치유 및 안티 에이징 등의 생물학적 기능을 가져, 제약, 화장품 분야에 널리 사용되고 있다.
상기 hEGF는 하기의 특허문헌에 기재된 바와 같이, 일반적으로 가격이 저렴하고 유전자 조작이 쉬운 E. coli를 이용하여 생산되고 있다.
<특허문헌>
특허 제10-0102993호(1996. 08. 02. 등록) "인간 상피세포 성장인자 발현벡터 및 그를 이용한 hEGF의 제조방법"
하지만, 종래의 E. coli를 이용한 인간 표피성장인자의 생산방법은 인간 표피성장인자가 세포 내에서 생성되기 때문에 세포 파괴 및 리폴딩 단계가 필요로 하여, 생산효율이 떨어지고 생산비용이 많이 드는 문제가 있다. 이에, P. pastoris를 이용하여 인간 표피성장인자를 생산하기 위한 연구가 진행되고 있으나, P. pastoris를 이용한 방법 역시 만족할만한 hEGF의 생산량을 얻을 수 없는 문제가 있다.
따라서, hEGF 생산에 영향을 미치는 다양한 변수의 최적화를 통하여, hEGF 생산량을 향상시킬 수 있는 제조방법의 필요성이 증대되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,
본 발명은 생산 단백질이 세포 밖으로 분비되도록 제작된 hEGF 발현 벡터를 P. pastoris에 도입하여 재조합 P. pastoris를 제조하고, 상기 재조합 P. pastoris를 세포 성장을 위한 생장용 배지와, hEGF 생산용 배지에서 순차적으로 배양하여, hEGF를 생산할 수 있는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 생장용 배지에 사용되는 탄소원, 및 hEGF 생산용 배지를 이용한 배양에서 세포 밀도, 메탄올 농도 및 메탄올 주입간격을 최적화하여, hEGF 생산량을 향상시킬 수 있는 hEGF 생산방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 앞서 본 목적을 달성하기 위해서 다음과 같은 구성을 가진 실시예에 의해서 구현된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 인간 표피성장인자의 생산방법은 생산 단백질이 세포 밖으로 분비되도록 제작된 hEGF 발현 벡터를 피키아 파스토리스에 도입하여 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 제조하는 재조합단계와, 세포 성장을 위해 상기 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 생장용 배지에서 배양하는 세포성장단계와, 상기 세포성장단계에서 세포 성장을 위한 배양이 완료된 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 hEGF 생산용 배지에서 배양하여 hEGF를 생성하는 단백질생산단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 인간 표피성장인자의 생산방법에 있어서 상기 생장용 배지는 탄소원으로 포도당을 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 인간 표피성장인자의 생산방법에 있어서 상기 hEGF 생성용 재조합 배지는 메탄올을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 인간 표피성장인자의 생산방법에 있어서 상기 단백질생산단계는 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 8 내지 12OD600의 세포 밀도로 hEGF 생산용 배지에 공급하고, 상기 hEGF 생산용 배지에 0.65 내지 0.75% 농도의 메탄올을 7 내지 8시간 간격으로 추가적으로 주입하여 배양하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 인간 표피성장인자의 생산방법에 있어서 상기 재조합단계는 hEGF 발현을 위한 프로모터, hEGF 발현 후 세포 밖 분비를 위한 신호 서열 및 hEGF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 hEGF 생산용 DNA 카세트를 제조하는 카세트제조단계와, 상기 hEGF 생산용 DNA 카세트를 발현 벡터에 삽입하여 hEGF 발현 벡터를 제조하는 발현벡터제조단계와, hEGF 발현 벡터를 피키아 파스토리스에 도입하여 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 제조하는 형질전환단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 인간 표피성장인자의 생산방법에 있어서 상기 hEGF 발현을 위한 프로모터는 메탄올에 의해 유도되고 포도당에 의해 억제되는 프로모터가 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 앞서 본 실시예와 하기에 설명할 구성과 결합, 사용관계에 의해 다음과 같은 효과를 얻을 수 있다.
본 발명은 생산 단백질이 세포 밖으로 분비되도록 제작된 hEGF 발현 벡터를 P. pastoris에 도입하여 재조합 P. pastoris를 제조하고, 상기 재조합 P. pastoris를 세포 성장을 위한 생장용 배지와, hEGF 생산용 배지에서 순차적으로 배양하여, hEGF를 생산할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 생장용 배지에 사용되는 탄소원, 및 hEGF 생산용 배지를 이용한 배양에서 세포 밀도, 메탄올 농도 및 메탄올 주입간격을 최적화하여, hEGF 생산량을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 hEGF 생산용 DNA 카세트의 개략적인 모식도.
도 2는 hEGF 생산용 DNA 카세트가 도입된 hEGF 발현 벡터 맵의 모식도.
도 3은 생장용 배지에 공급되는 탄소원에 따른 hEGF의 생산량을 나타내는 도면.
도 4는 hEGF 생산용 배지에 공급되는 초기 세포 밀도에 따른 hEGF의 생산량을 나타내는 도면.
도 5는 hEGF 생산용 배지에 공급되는 메탄올 농도에 따른 hEGF의 생산량을 나타내는 도면.
도 6은 hEGF 생산용 배지에 공급되는 메탄올 주입간격에 따른 hEGF의 생산량을 나타내는 도면.
도 2는 hEGF 생산용 DNA 카세트가 도입된 hEGF 발현 벡터 맵의 모식도.
도 3은 생장용 배지에 공급되는 탄소원에 따른 hEGF의 생산량을 나타내는 도면.
도 4는 hEGF 생산용 배지에 공급되는 초기 세포 밀도에 따른 hEGF의 생산량을 나타내는 도면.
도 5는 hEGF 생산용 배지에 공급되는 메탄올 농도에 따른 hEGF의 생산량을 나타내는 도면.
도 6은 hEGF 생산용 배지에 공급되는 메탄올 주입간격에 따른 hEGF의 생산량을 나타내는 도면.
본 발명에 따른 외분비 인간 표피성장인자의 생산방법을 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 정의에 따른다. 또한, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대해 상세한 설명은 생략한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 외분비 인간 표피성장인자의 생산방법을 도 1 내지 6을 참조하여 설명하면, 상기 생산방법은 생산 단백질이 세포 밖으로 분비되도록 제작된 hEGF 발현 벡터를 피키아 파스토리스에 도입하여 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 제조하는 재조합단계와, 세포 성장을 위해 상기 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 생장용 배지에서 배양하는 세포성장단계와, 상기 세포성장단계에서 세포 성장을 위한 배양이 완료된 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 hEGF 생산용 배지에서 배양하여 hEGF를 생성하는 단백질생산단계 등을 포함한다. 앞서 본 바와 같이, P. pastoris를 이용하여 hEGF를 생산하는 종래의 방법은 hEGF의 생산 효율이 떨어지는 바, 본 발명은 생산 단백질이 세포 밖으로 분비되도록 제작된 hEGF 발현 벡터를 P. pastoris에 도입하여 재조합 P. pastoris를 제조하고, 상기 재조합 P. pastoris를 세포 성장을 위한 생장용 배지와, hEGF 생산용 배지에서 순차적으로 배양하며, 생장용 배지의 탄소원에 대해 영향, hEGF 생산용 배지를 이용한 배양에서 세포 밀도, 메탄올 농도 및 메탄올 주입간격에 대한 영향을 분석하여 생산 조건을 최적화하여, hEGF 생산량을 극대화하였다.
상기 재조합단계는 생산 단백질이 세포 밖으로 분비되도록 제작된 hEGF 발현 벡터를 피키아 파스토리스에 도입하여 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 제조하는 단계로, hEGF 발현을 위한 프로모터, hEGF 발현 후 세포 밖 분비를 위한 신호 서열 및 hEGF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 hEGF 생산용 DNA 카세트를 제조하는 카세트제조단계와, 상기 hEGF 생산용 DNA 카세트를 발현 벡터에 삽입하여 hEGF 발현 벡터를 제조하는 발현벡터제조단계와, hEGF 발현 벡터를 피키아 파스토리스에 도입하여 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 제조하는 형질전환단계 등을 포함한다. 상기 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)는 GRAS(Generally recognized as safe) 균주로, 펩타이드 및 단백질을 발현시키고 분비시키며, 글루코스, 글리세롤 등 이외에도 메탄올을 이용하여 생장한다.
상기 카세트제조단계는 hEGF 발현을 위한 프로모터, hEGF 발현 후 세포 밖 분비를 위한 신호 서열 및 hEGF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 hEGF 생산용 DNA 카세트를 제조하는 단계이다. 상기 hEGF 발현을 위한 프로모터는 피키아 파스토리스에서 발현하기에 적합한 공지의 프로모터가 사용될 수 있으나, 예컨대 메탄올에 의해 유도되고 포도당에 의해 억제되는 AOX1 프로모터가 사용될 수 있으며, AOX1 프로모터 뒤에 hEGF 서열을 삽입하여 메탄올을 공급함으로써 hEGF를 생산할 수 있게 된다. 상기 신호 서열은 hEGF 발현 후 세포 밖으로 분비시킬 수 있는 공지의 신호 서열이 사용될 수 있으나, 예컨대 S. cerevisiae 유래 α-접합인자 신호 서열(α-mating factor signal sequence)이 사용될 수 있다. 상기 hEGF 생산용 DNA 카세트는 최종 hEGF 분리정제를 위해 절단효소(Enterokinase)가 인식하는 서열 DDDDK(절단효소는 서열 DDDDK를 인식하여 K뒤를 절단함), 고효율 분리정제를 위한 affinity tag인 His-tag 및 종결 서열(Terminator)을 추가로 포함할 수 있다.
상기 발현벡터제조단계는 상기 hEGF 생산용 DNA 카세트를 발현 벡터에 삽입하여 hEGF 발현 벡터를 제조하는 단계로, 상기 hEGF 생산용 DNA 카세트가 삽입되는 발현 벡터는 공지의 발현 백터가 사용될 수 있으나, 예컨대 pPinkα-HC가 사용될 수 있다.
상기 형질전환단계는 상기 hEGF 발현 벡터를 피키아 파스토리스에 도입하여 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 제조하는 단계이다.
상기 세포성장단계는 세포 성장을 위해 상기 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 생장용 배지에서 배양하는 단계로, 상기 생장용 배지는 효모의 세포 성장을 위해 사용되는 종래의 배지가 사용될 수 있으나, 바람직하게는 탄소원으로 포도당을 이용하는 배지가 사용될 수 있다. 포도당, 글리세롤 등은 AOX1 프로모터를 포함하는 메탄올 경로를 억제하기 때문에, 생장용 배지에서 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 배양하여 세포 밀도를 높인 다음, 메탄올이 주입된 hEGF 생산용 배지에서 배양하여 hEGF의 생산을 향상시킬 수 있게 된다.
상기 단백질생산단계는 상기 세포성장단계에서 세포 성장을 위한 배양이 완료된 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 hEGF 생산용 배지에서 배양하여 hEGF를 생성하는 단계로, 예컨대 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 8 내지 12OD600의 세포 밀도로 hEGF 생산용 배지에 공급하고, 0.65 내지 0.75%(v/v) 농도의 메탄올을 7 내지 8시간 간격으로 추가적으로 주입하고 배양하여 hEGF를 생성한다. 상기 hEGF 생성용 재조합 배지는 효모에서 단백질 생산을 위해 사용되는 메탄올을 포함하는 종래의 다양한 배지가 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> hEGF 생산용 재조합 P. pastoris의 제조
1. hEGF 생산용 DNA 카세트의 제조
hEGF 발현을 위한 프로모터(Promoter), hEGF 발현 후 세포 밖 분비를 위한 신호 서열(Signal sequence), 고효율 분리정제를 위한 affinity tag인 His-tag, 최종 hEGF 분리정제를 위해 절단효소(Enterokinase)가 인식하는 서열 DDDDK, hEGF(서열번호 1)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(hEGF sequence) 및 종결 서열(Terminator)을 포함하는, 도 1에 도시된 바와 같은 hEGF 생산용 DNA 카세트를 준비하였다. 상기 프로모터는 메탄올 인덕션(methanol induction)을 이용하는 AOX1 프로모터를 사용하고, 상기 신호 서열은 S. cerevisiae 유래 α-접합인자 신호 서열(α-mating factor signal sequence)을 사용하였다.
2. hEGF 발현 벡터의 제조 및 P. pastoris의 형질전환
(1) 상기 hEGF 생산용 카세트를 발현 벡터 pPinkα-HC(Invitrogen)에 삽입하여 도 2에 도시된 바와 같은 hEGF 발현 벡터(pBJY_hEGF)를 제조하였다.
(2) 상기 hEGF 발현 벡터를 AflⅡ로 절단하여 선형화시키고, 절단된 hEGF 발현 벡터 5μg을 P. pastoris competent cell(Pichia EasyComp Kit(K1730-01), Invitrogen)에 혼합한 후 형질전환시켜, hEGF 생산용 재조합 P. pastoris 균주를 얻었다.
(3) hEGF 생산용 재조합 P. pastoris 균주는 PAD(-Adenine) plate에서 선별되었다. 한편, hEGF 생산용 재조합 P. pastoris 균주의 genome 내에 hEGF 발현 벡터의 삽입을 확인하기 위해, Colony PCR(Colony PCR에 사용된 프라이머는 forward:5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'[서열변호:2] 및 reverse:5'-CCAAAACCTTCTCAAGCAAGGTTTTCA-3'[서열번호:3]임)을 수행였으며, 그 결과 Agarose gel 상에서 negative control인 P. pastoris 균주는 band가 확인되지 않았으나, hEGF 발현 벡터가 삽입된 P. pastoris 균주는 band가 확인되어, hEGF 발현 벡터가 P. pastoris 균주에 도입되었음을 확인할 수 있었다.
<실시예 2> hEGF 생산용 재조합 P. pastoris를 이용한 hEGF의 생산
1. hEGF 생산용 재조합 P. pastoris의 배양
(1) 상기 hEGF 생산용 재조합 P. pastoris 균주 1 colony를 250mL baffled flask의 80mL 생장용 배지에 접종한 다음, shaking incubator에서 30℃, 250rpm으로 24h 동안 종균배양(seed culture)을 진행하였다.
(2) 종균배양된 P. pastoris를 250mL baffled flask의 80mL 생장용 배지에 5%(v/v) 농도로 접종하고, shaking incubator에서 30℃, 250rpm으로 24h 동안 세포 성장을 위한 배양을 진행하였다. 상기 생장용 배지는 증류수 1L 당, yeast extract 10g, peptone 20g, YNB 13.4g, 100mM potassium phosphate at pH 6.0, biotin 0.0004g 및 탄소원 10g을 포함한다.
(3) 세포 성장을 위한 배양이 완료된 hEGF 생산용 재조합 P. pastoris의 세포 밀도를 각각 일정 optical density(OD600)로 맞추고, 원심분리기에서 3,000×g로 5분 동안 원심분리하여 얻어진 세포 펠릿(cell pellet)을 250mL baffled flask의 30mL hEGF 생산용 배지에 재부유시키고, shaking incubator에서 30℃, 250rpm으로 96h 동안 배양하였고, 일정 농도의 메탄올을 일정 시간 간격으로 추가적으로 주입하여 hEGF를 생성하였다. 상기 hEGF 생산용 배지는 증류수 1L 당, yeast extract 10g, peptone 20g, YNB 13.4g, 100mM potassium phosphate at pH 6.0, biotin 0.0004g 및 methanol 5g을 포함한다. 즉, hEGF 생산용 재조합 P. pastoris의 배양에서, 탄소원, 세포 밀도, 메탄올 농도 및 주입 간격이 변수로 설정되었다
2. hEGF 생산용 재조합 P. pastoris의 배양물로부터 hEGF 정제 및 분석
(1) 생산된 hEGF는 his-tag이 부착되어 있기 때문에 dynabeads(Dynabeads His-Tag Isolation & Pulldown, Invitrogen)로 정제가 가능하므로, 2X Binding/Wash buffer(100mM sodium phosphate pH 8.0, 600mM NaCl, 0.02% tween-20)와 His elution buffer(300mM imidazole, 50mM sodium phosphate pH 8.0, 300mM NaCl, 0.01% tween-20)를 제조하고, 2X Binding/Wash buffer를 1X로 희석한 후, 50μL dynabead를 1.5mL microtube로 옮긴 다음 magnet으로 2분 동안 분리하고, Magnet으로 분리된 상등액을 피펫을 이용하여 제거하고, 실시예 2의 1에서 최종적으로 얻은 샘플 350μL와 350μL 1X Binding/Wash Buffer를 microtube에 넣고 roller를 이용하여 5분 동안 실온 상태로 섞고, magnet으로 혼합용액을 2분 동안 분리하고 상등액을 제거하였다. 300μL 1X Binding/Wash Buffer를 이용하여 microtube에 있는 beads를 magnet에 2분 동안 두고 상등액을 버리는 과정을 4번 반복하여 세척하고, Beads가 들어있는 microtube에 100μL His-Elution Buffer를 넣어준 후에 실온에서 5분 동안 roller를 이용하여 microtube를 잘 섞고, microtube를 magnet에 2분 동안 두어 beads를 분리하고 상등액을 통해 최종적으로 hEGF를 정제하였다.
(2) hEGF 정제 후, SDS-page를 이용하여 정성분석을 진행하여 배양된 hEGF 생산용 재조합 P. pastoris로부터 hEGF가 생산되었음을 확인하였고, HPLC 분석을 통해 생산된 hEGF의 양을 확인하였다. HPLC 분석은 HPLC용 물에 0.1%(v/v)의 trifluoroacetic acid(TFA)를 녹인 이동상 A와 HPLC용 acetonitrile에 0.1%(v/v)의 TFA를 녹인 이동상 B를 제조한 후 Agilent 1260 infinityⅡ HPLC system을 이용하여 Zorbax 300SB-C18 column(300A 5μ, agilent)에서 분석을 진행하였다.
3. 탄소원에 따른 hEGF의 생산량 검토
(1) 탄소원으로 각각 glycerol, glucose, sucrose, sorbitol을 사용하고, 세포 밀도를 10OD600, 메탄올 농도를 0.5%(v/v), 메탄올 주입간격을 12시간으로 하여, 실시예 2의 1 및 2의 과정을 진행하고, hEGF 생산을 위한 배양 후 세포 밀도를 측정하고, HPLC를 이용하여 생산된 hEGF의 양을 분석하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.
(2) 글리세롤 등은 AOX1 프로모터를 포함하는 메탄올 경로를 억제하기 때문에, 생장용 배지에서 P. pastoris를 배양하여 세포 밀도를 높인 다음, 메탄올이 주입된 hEGF 생산용 배지에서 배양하여 hEGF의 생산을 향상시킬 수 있는데, 즉 생장용 배지의 최적화를 통해 세포 밀도를 높여 hEGF의 생산량을 향상시킬 수 있다.
(3) 도 3을 보면, glucose에서 가장 많은 hEGF(33.32mg/L)가 생산되고, 세포 밀도(30.63OD600)가 높음을 확인할 수 있어, glucose가 hEGF를 생산하는 P. pastoris의 생장에 가장 효과적임을 알 수 있다.
4. 초기 세포 밀도에 따른 hEGF의 생산량 검토
(1) 초기 세포 밀도가 각각 2, 6, 10, 14, 18OD600가 되도록 하고, 탄소원으로 glucose를 사용하고, 메탄올 농도를 0.5%(v/v), 메탄올 주입간격을 12시간으로 하여, 실시예 2의 1 및 2의 과정을 진행하고, hEGF 생산을 위한 배양 후 세포 밀도를 측정하고, HPLC를 이용하여 생산된 hEGF의 양을 분석하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.
(2) 도 4를 보면, 초기 주입된 세포 밀도가 점차 증가함에 따라, hEGF 생산을 위한 배양 후 세포 밀도는 증가하지만, hEGF 생산량은 초기 주입된 세포밀도가 10OD600 이후로부터는 거의 변화가 없는 것을 확인할 수 있어, 10OD600가 최적의 hEGF를 생산할 수 있는 초기 세포 밀도임을 알 수 있다.
5. 메탄올 농도에 따른 hEGF의 생산량 검토
(1) 메탄올 농도가 각각 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 0.9, 1.1%(v/v)가 되도록 하고, 탄소원으로 glucose를 사용하고, 세포 밀도를 10OD600, 메탄올 주입간격을 12시간으로 하여, 실시예 2의 1 및 2의 과정을 진행하고, hEGF 생산을 위한 배양 후 세포 밀도를 측정하고, HPLC를 이용하여 생산된 hEGF의 양을 분석하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
(2) 도 5를 보면, 세포 밀도와 hEGF 생산량이 모두 0.7%(v/v)의 메탄올 농도에서 최대값을 가지며, 0.7%(v/v) 이후에는 세포 밀도와 hEGF 생산량이 억제됨을 확인할 수 있었다. 이는, 유도물질인 메탄올의 양이 증가할수록 hEGF 생산 유전자의 과발현으로 생산량이 증가하나, 과도한 메탄올은 세포 생장과 단백질 생산에 부정적인 영향을 주는 hydrogen peroxide와 formaldehyde 등과 같은 독성물질을 생산하기 때문인 것으로 판단된다.
6. 메탄올 주입간격에 따른 hEGF의 생산량 검토
(1) 메탄올 주입간격을 4, 8, 12, 16, 20h가 되도록 하고, 탄소원으로 glucose를 사용하고, 세포 밀도를 10OD600, 메탄올 농도를 0.7%(v/v)으로 하여, 실시예 2의 1 및 2의 과정을 진행하고, hEGF 생산을 위한 배양 후 세포 밀도를 측정하고, HPLC를 이용하여 생산된 hEGF의 양을 분석하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.
(2) 도 6을 보면, 주입간격이 8시간일 때 hEFG 최대 생산량(46mg/L)를 얻을 수 있었고, 주입간격이 4시간일 때는 세포 밀도가 낮았지만 주입간격이 16시간인 경우에 비해 hEGF 생산량은 높았고, 주입간격이 8시간 이후로는 세포 밀도와 hEGF 생산량은 감소하는 것을 확인할 수 있어, 메탄올이 균주 생장을 저해하지 않고 유도물질로써 hEGF 생산에 가장 긍정적인 영향을 끼치게 되는 적절한 주입간격이 8시간임을 알 수 있다.
이상에서, 출원인은 본 발명의 다양한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며, 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Kwangwoon University Industry-Academic Collaboration Foundation
<120> Method for producing excreted human epidermal growth factor
<130> PDAHJ-20220
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 53
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hEGF
<400> 1
Asn Ser Tyr Pro Gly Cys Pro Ser Ser Tyr Asp Gly Tyr Cys Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gly Val Cys Met His Ile Glu Ser Leu Asp Ser Tyr Thr Cys Asn
20 25 30
Cys Val Ile Gly Tyr Ser Gly Asp Arg Cys Gln Thr Arg Asp Leu Arg
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 2
gactggttcc aattgacaag c 21
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 3
ccaaaacctt ctcaagcaag gttttca 27
Claims (6)
- 생산 단백질이 세포 밖으로 분비되도록 제작된 hEGF 발현 벡터를 피키아 파스토리스에 도입하여 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 제조하는 재조합단계와, 세포 성장을 위해 상기 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 생장용 배지에서 배양하는 세포성장단계와, 상기 세포성장단계에서 세포 성장을 위한 배양이 완료된 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 hEGF 생산용 배지에서 배양하여 hEGF를 생성하는 단백질생산단계를 포함하며,
상기 재조합단계는 hEGF 발현을 위한 프로모터, hEGF 발현 후 세포 밖 분비를 위한 신호 서열, His-tag, 절단효소가 인식하는 서열 DDDDK, hEGF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 종결 서열이 연이어 형성된 hEGF 생산용 DNA 카세트를 제조하는 카세트제조단계와, 상기 hEGF 생산용 DNA 카세트를 발현 벡터에 삽입하여 hEGF 발현 벡터를 제조하는 발현벡터제조단계와, 상기 hEGF 발현 벡터를 피키아 파스토리스에 도입하여 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 제조하는 형질전환단계를 포함하고,
상기 세포성장단계에서는 상기 형질전환단계에서 얻은 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스의 1 콜로니를 배지에 접종한 다음 종균배양을 수행하고, 종균 배양된 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 생장용 배지에 5%(v/v) 농도로 접종하고, 쉐이킹 인규베이터에서 30℃ 및 250rpm 조건으로 24시간 동안 세포 성장을 위한 배양이 수행되며, 상기 생장용 배지는 증류수 1L 당, 효모 추출물 10g, 펩톤 20g, YNB 13.4g, 100mM 포타슘 포스페이트, 바이오틴 0.0004g 및 포도당 10g을 포함하고,
상기 단백질생산단계는 상기 세포성장단계에서 세포 성장을 위한 배양이 완료된 hEGF 생산용 재조합 피키아 파스토리스를 10OD600의 세포 밀도로 hEGF 생산용 배지에 공급하고, 상기 hEGF 생산용 배지에 0.7% 농도의 메탄올을 8시간 간격으로 추가적으로 주입하여 배양하는 것을 특징으로 하는 인간 표피성장인자의 생산방법. - 삭제
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| KR1020210004247A KR102653146B1 (ko) | 2021-01-12 | 2021-01-12 | 외분비 인간 표피성장인자의 생산방법 |
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| WO2012060666A2 (ko) * | 2010-11-04 | 2012-05-10 | 한국생명공학연구원 | 효모에서 인체 상피세포 성장인자를 대량 생산하는 방법 |
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2021
- 2021-01-12 KR KR1020210004247A patent/KR102653146B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
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