KR20020066482A - 단백질 분비 항진자와 메탄자화 효모균의 프로모터를포함하는 재조합 단백질의 분비 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 단백질의 분비 시스템에 관한 것으로, 구체적으로 분비 단백질인 인터루킨-1β(interleukin-1β)의 아미노 말단 24 잔기 또는 그의 돌연변이 잔기를 분비 항진자 (secretion enhancer)로 사용하고 메탄올을 탄소원으로 사용하는 메탄자화 (methylotropic) 효모균에 의해 작동되는 프로모터를 이용하는 재조합 단백질의 분비 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 단백질의 분비 시스템은 상기 분비 항진자를 이용하여 목적 단백질을 세포외로 분비시킴으로써 목적 단백질의 회수가 보다 용이하고 메탄자화 효모균인 한세눌라 폴리몰파 (Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 등을 숙주로 사용하여 기존의 사카로마이세스 세레비재 (Saccharomyces cerevisiae) 발현 시스템에서 발현된 목적 단백질의 과당화 (overglycosylation)로 인해 의약 단백질로 사용시 면역 반응의 유발 및 산업적으로 대량 생산하는데 있어서의 문제점을 해결함으로써 유용한 목적 단백질을 보다 효과적이면서 용이하게 대량생산할 수 있다.

Description

단백질 분비 항진자와 메탄자화 효모균의 프로모터를 포함하는 재조합 단백질의 분비 시스템{Secretion system of recombinant protein containing sequence enhancer and the promoter of methylotropic yeast}
본 발명은 재조합 단백질의 분비 시스템에 관한 것으로, 구체적으로 분비 단백질인 인터루킨-1β(interleukin-1β)의 아미노 말단 24 잔기 또는 그의 돌연변이 잔기를 분비 항진자 (secretion enhancer)로 사용하고 메탄올을 탄소원으로 사용하는 메탄자화 (methylotropic) 효모균에 의해 작동되는 프로모터를 이용하는 재조합 단백질의 분비 시스템에 관한 것이다.
유전자 재조합 기술이 발전하면서 세균 또는 동·식물들을 숙주세포로 이용한 목적 단백질의 대량생산에 관한 연구가 많이 이루어지고 있으며 현재까지 대장균은 여러 종류의 유용 단백질을 대량 생산하는데 가장 널리 이용되고 있는 숙주세포이다.
그러나, 목적 단백질이 대장균의 세포질 내에서 생산되는 경우에 있어서 많은 문제점들이 지적되고 있다. 즉, 세포질 내에서 생산된 단백질은 상당히 복잡하고 고비용의 분리·정제 과정을 거쳐야 하고, 세포질 내에서 생산된 단백질은 세포질 내에 존재하는 여러 가지 프로티아제 (protease)에 의해 쉽게 분해되기 때문에 그의 수율이 낮아지며, 세포질 내에서 과다 발현된 단백질은 완전한 접힘 (folding)을 이루지 못하고 단백질의 활성을 잃은 상태의 불용성 봉입체 (inclusion body)를 형성하는 경우가 대부분이기 때문에 상기 불용성 단백질로부터 생물학적 활성을 가진 수용성 단백질을 얻기 위하여서는 복잡하고도 비용이 많이 소요되는 변성 (denaturation)과 재접힘 (refolding) 과정이 필요하다 (Kanes and Hartley,Trends Biotechnol., 6:95-1014, 1988). 또한, 목적 단백질이 진핵세포(Eukaryotic cell)에서 유래한 경우 단백질 아미노 말단의 메타이오닌 (methionine)의 제거, 당화 (glycosylation) 및 다이설파이드 결합 (disulfide bond)과 같은 번역 후 변환 (post-transcriptional modification) 시스템이 없어 천연 단백질과 성질이 다를 수 있으며 의약 단백질로 사용하는 경우에 원하지 않는 면역반응을 유발할 수 있다.
이러한 문제점을 극복하기 위하여, 여러 가지 강한 프로모터와 터미네이터, 구조 유전자의 재조합을 통하여 의약품이나 효소 등 목적하는 단백질의 생산성을 높이고 있을 뿐만 아니라 신호 서열을 구조 유전자에 연결한 재조합 벡터를 미생물에 도입하여 자연적으로 세포막 내에 존재하는 단백질을 세포막 외부로 분비시켜 원하는 단백질이 배양액에서 보다 고농도로 축적됨으로써 정제과정을 줄이고 회수율을 향상시키고 생산비를 절감하고 있다.
이러한 노력의 일환으로 숙주균의 개발이 이루어지고 있는데, 대장균처럼 생육 속도가 빠르면서 번역 후 변환 시스템을 갖추고 있는 효모균인 사카로마이세스 세레비재 (Saccharomyces cerevisiae)가 발현 균주로 개발되어 많은 재조합 단백질이 생산되고 있다. 효모는 미국 FDA에서 인체에 대한 안정성이 인정되었고 유전자 발현 조절의 원리도 대부분 밝혀져 있으며 (Strathern et al.,The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces,Metabolism and Gene Expression, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., 1982), 효모를 숙주균으로 사용하는 경우 고농도로 배양이 가능하여 대량생산을 할 수 있으며 신호 펩타이드 (signal peptide)를 이용하여 가용성 형태의 단백질을 세포 밖으로 분비시킬 수 있기 때문에 정제 방법이 용이한 장점이 있다. 최근 B형 간염 바이러스 인터페론 (interferon), 송아지 카이모신 (calf chymosin), 상피세포 성장인자 (epidermal growth factor)와 같은 목적 단백질을 효모에서 발현시키는 방법이 계속 보고되고 있다 (Valensuela 등,Nature, 298:347-350, 1982; Hitzeman 등,NAR, 11:2745-2763, 1983; McAleer 등,Gene, 24;1-14, 1983; URDEA 등,PNAS, 80:7561-7465, 1983).
그러나, 효모에서 목적 단백질을 발현시키면 정상의 동종 유전자 발현물의 생산과 비교해 볼 때 아주 적은 양이 생산된다는 문제점이 있기 때문에, 많은 연구자들이 여러 종류의 발현 벡터를 개발하여 효모에서 목적 단백질의 발현을 증가시키고자 노력하였다 (Chen 등,NAR, 12:8951-8970, 1984). 예를 들면 외부 유전자와 효모의 GAL1 프로모터를 포함한 발현 벡터를 이용하여 효모에서 갈락토카이나제-보바인-프로카이모신 (galactokinase-bovine prochymosin) 융합 단백질을 생산하는 방법이 제시되어 있고 (유럽 특허출원 제 84303833호), 효모의 α-인자 (α-mating factor)의 프로모터와 분비 시그날을 사용하여 인간 인터페론 γ (interferon γ), 인간 혈청 알부민, 송아지 인터페론 α-1, α-2, 조직 플라즈미노겐 활성인자 (tissue plasminogen activator), 레닌 (rennin), 인간 인슐린 유사 성장인자 (human insulin-like growth factor) 등을 발현시키는 방법이 제시되어 있다 (유럽 특허출원 제 84,302,723호).
이러한 연구의 일환으로 본 발명자들은 사카로마이세스 세레비재에서 목적하는 재조합 단백질의 분비량을 높이기 위하여 인터루킨-1β(interleukin 1β)가 특별한 신호 서열이 없이도 분비가 잘 되는 점에 착안하여, 인터루킨-1β의 아미노 말단 24 잔기를 분비 항진자 (secretion enhancer)로 이용하고 신호 서열과 함께 외래 유전자 앞에 삽입함으로써 hGCSF와 hGH의 분비효율을 크게 증가시킨 바 있다 (PCT/KR 97-00097;Biotechnol. Prog., 15:884-890, 1999). 그러나, 사카로마이세스 세레비재의 발현 시스템은 발현된 재조합 단백질이 과당화 (overglycosylation)되어 의약 단백질로 사용하는 경우 면역 반응을 유발할 뿐만 아니라 산업적으로 대량 생산하는데 어려움이 있다는 문제점이 지적되고 있다.
이러한 문제점을 극복하기 위하여, 최근에는 메탄올 (methanol)을 탄소원으로 사용할 수 있는 메탄자화 효모 (methylotrophic yeast)인 피키아 (Pichia), 한세눌라 (Hansenular), 칸디다 (Candida) 및 토룰롭시스 (Torulopsis) 등이 새로운 발현 숙주로 이용되고 있다. 이들 메탄자화 효모의 유전자 조작과 발현 방식은 상당 부분이 사카로마이세스 세레비재와 공통점을 가지고 있어서 사카로마이세스 세레비재에 적용된 기술이 마찬가지로 적용되는 예가 많아 쉽게 유전자 조작과 발현을 유도할 수 있다. 그러나, 메탄자화 효모에서도 많은 단백질이 세포외로 분비가 이루어지지 않아 세포 내에서 목적 단백질의 발현을 유도하고 있는 실정이다 (FEMS Microbiology Reviews, 24:45-66, 2000).
이에 본 발명자들은 기존에 사카로마이세스 세레비재에서 분비 항진자로 개발된 인터루킨-1β의 아미노 말단 펩타이드와 그의 돌연변이 잔기를 신호 서열과 목적 단백질 사이에 삽입하고 메탄자화 효모균에 의해 작동되는 프로모터를 포함하는 발현벡터; 상기 발현벡터를 메탄자화 효모에서 발현시킨 형질전환체; 상기 형질전환체를 이용하여 목적 단백질의 분비량을 증진시키고 과당화를 일으키지 않으면서 번역 후 변환시스템에 의해 보다 효과적으로 목적 단백질을 생산할 수 있는 재조합 단백질의 분비 시스템을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 재조합 단백질의 분비량을 증진시키고 과당화를 유발하지 않으면서 번역 후 변환시스템에 의해 보다 효과적으로 목적 단백질을 생산 및 회수할 수 있도록 분비 항진자와 비-사카로마이세스 세레비재 (non-Saccharomycescerevisiae) 숙주를 이용하는 재조합 단백질의 분비 시스템을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 분비 항진자로 인터루킨- 1β의 아미노말단 유래 펩타이드와 메탄자화 효모균에 의해 작동되는 프로모터를 포함하는 재조합 단백질의 발현시스템을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질의 발현시스템을 이용한 목적 단백질의 대량생산 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 분비 항진자로 인터루킨-1β의 아미노말단 잔기와 메탄자화 효모균에 의해 작동되는 프로모터를 포함하는 재조합 단백질의 발현시스템을 제공한다.
본 발명자들은 효모에서 hGCSF (human granulocyte colony-stimulating factor)를 다량으로 발현시키면서 발현된 단백질을 세포 외로 분비시키기 위하여 hGCSF의 아미노 말단에 여러 종류의 분비서열 (signal sequence)을 접합하여 분비를 유도하였으나 세포 밖으로의 분비가 용이하지 않았다. 한편, 인터루킨-1β (interleukin-1β, 이하 "IL-1β"라 약칭함)는 효모에서 분비서열에 의해 매우 효율적으로 세포외로 분비되는 것이 보고된 바 있다 (EMBO J., 6:229-234, 1987). 이에 본 발명자들은 분비서열 외에 IL-1β의 아미노 말단이 효모로부터 발현된 hGCSF를 세포 외로 분비시킬 수 있을 가능성에 착안하여 hGCSF 유전자 앞에 살상독소 분비 서열과서열번호 1로 기재되는 인간 IL-1β의 아미노 말단 24 잔기 (S5-A28)를 삽입하여 hGCSF를 발현시키고 세포 외로 분비시킴으로써 발명을 완성한 바 있다(PCT/KR/97-00097). 상기에서 분비 증진자 서열은서열번호 1로 기재되는 인간 IL-1β의 아미노 말단 뿐 아니라 이 서열의 일부분만을 포함하거나 몇몇 서열이 변형된 서열 모두를 포함한다. 그러나, 상기 발명은 사카로마이세스 세래비재를 숙주균으로 사용한 경우에 한정되어 있고, 이와 같이 사카로마이세스 세래비재를 숙주균으로 사용하는 경우 발현된 단백질의 과당화 (glycosylation) 및 대량생산의 문제점들이 지적되고 있다. 따라서, 본 발명자들은 이러한 문제점들을 극복하기 위하여, 숙주균으로 비-사카로마이세스 세레비재 효모균을 이용한 재조합 단백질의 분비시스템을 개발하였다.
본 발명의 재조합 단백질의 분비시스템은 비-싸카로마이세스 효모균으로 메탄올을 탄소원으로 이용하는 메탄자화 효모균을 숙주균으로 사용하였다.
이러한 메탄자화 효모의 일종인 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)는 메탄올을 유일한 탄소원으로 사용할 수 있는데, 메탄올 분해의 처음을 담당하는 알콜 옥시다아제 (alcohol oxidase, AOX)를 포함하고 있다. 알코올 옥시다제는 메탄올을 포름알데하이드 (formaldehyde)와 하이드로겐 퍼옥사이드 (hydrogen peroxide)로 산화시키는 효소로써, AOX 유전자의 발현은 메탄올에 의해 전사 수준 (transcription level)에서 발현이 조절되고 AOX mRNA는 전체 폴리A RNA (polyA RNA)의 5%를 차지하며 발현 단백질은 전체 수용성 단백질의 30%를 차지한다. AOX1유전자의 프로모터는 싸카로마이세스 유래의 GAL1유전자의 프로모터와 유사한 조절방식을 가지고 있어 포도당의 존재에 의해 전사억제가 일어나는 반면, 포도당의 제거로 전사억제가 해제되지는 못하여 AOX1 유전자의 발현에는 메탄올이 발현 유도제로서 필수적임을 알 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 이러한 특성을 갖는 AOX 프로모터를 사용하거나 산성 인산화 효소 (acid phosphatase)의 프로모터 (PHO1)를 이용하였다. 본 발명에서 사용한 벡터는 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나 직접 제조하여 '프로모터-신호 서열-분비 항진자-목적 단백질'로 구성된 융합 유전자 컨스트럭트 1 또는 '프로모터-신호 서열-목적 단백질'로 구성된 융합 유전자 컨스트럭트 2를 포함하도록 제조되었다.
상기 융합 유전자 컨스트럭트에서 프로모터는 피키아 파스토리스의 유전자 발현을 조절하는 모든 프로모터가 사용될 수 있으며 AOX, PHO1, AUG1 등을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 신호 서열은 가용성 형태의 단백질을 분비시키도록 하여 정제과정을 용이하게 하기 위한 것으로 α-인자 신호 서열 (α-factor signal sequence), 살상 독소 리더 서열 (killer toxin leader sequence) 및 글루코아밀라아제 신호 서열 (glucoamylase [STA1] signal sequence) 등이 사용될 수 있다.
상기 분비 항진자는서열번호 1로 기재되는 IL-1β의 아미노 말단 24 잔기를 포함하거나 아미노산 잔기를 하나 또는 그 이상을 변환한 IL-1β의 아미노 말단 24 잔기를 포함하는 폴리펩타이드 (polypeptide)를 의미하며, 상기의 융합 유전자 컨스트럭트 2는 분비 항진자를 포함하지 않는 발현벡터의 구조로 목적 단백질 발현의대조군으로 사용할 수 있다.
또한, 상기 분비 항진자에 돌연변이를 유발하여 목적 단백질의 분비량을 증가시킬 수 있다.서열번호 1로 기재되는 IL-1β의 아미노 말단 24 잔기를 포함하거나 아미노산 잔기를 하나 또는 그 이상을 변환시킨 IL-1β의 아미노 말단 24 잔기를 포함하고 있는 폴리펩타이드 (polypeptide)로 구성된 상기 분비 항진자 내부에는 당화되는 부위가 존재하는데, 상기 당화 부위가 목적 단백질의 분비에 어떠한 역할을 하는지 확인하기 위하여 이 부위를 변조함으로써 목적 단백질이 당화되지 않는 발현벡터를 제조할 수 있다. 상기 발현벡터로부터 발현되는 목적 단백질의 분비량을 당화 부위를 변조하지 않은 발현벡터와 비교함으로써 당화 부위의 역할을 확인할 수 있다.
이로부터 당화 부위가 분비 항진에 있어서 필수적인 역할을 수행함이 확인되면, 돌연변이에 의해 당화 부위를 더 첨가한 분비 항진자를 포함하는 발현벡터를 제조함으로써 목적 단백질의 분비량을 더욱 증가시킬 수 있다.
또한, 상기 분비 항진자를 일렬반복 (tandem repeat)으로 여러번 삽입한 발현벡터를 제조하여 목적 단백질의 분비량을 비교함으로써 발현율을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 발현벡터를 이용하여 대량발현 될 수 있는 목적 단백질로는 칼시토닌 (Calcitonin), CGRP, ANF 및 hGH 등을 포함하는 호르몬류; hGCSF, hGM-CSF, hM-CSF, TGF, EGF 및 PDGF 등을 포함하는 싸이토카인 (cytokine)과 성장인자류; 인터페론 (Interferon)류; 인터루킨 (Interleukin)류, 엔테로키나제 (Enterokinase)등의 효소; 또는 HBV S 항원 (HBV S Antigen), 프리 S1/S2 (preS1/S2) 등을 포함하는 각종 바이러스 항원 등이 있다.
또한, 본 발명의 재조합 단백질의 분비 시스템은 메탄자화 효모의 일종인 한세눌라 폴리몰파 (Hansenula polymorpha)를 숙주균으로 사용할 수 있으며, 이 때에는 이화대사성 억제 (catabolite suppression)가 없고 메탄올의 존재하에 발현이 유도되며 전체 수용성 단백질의 30% 정도로 발현되는 메탄올 옥시다아제 (methanol oxidase, MOX) 유전자의 프로모터 (promoter)를 사용하였다. 본 발명에서 사용한 벡터는 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나 직접 제조하여 AOX 프로모터 대신 MOX 프로모터를 포함하는 상기와 동일한 융합 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제조하였다.
이외에도, 본 발명에서는 다른 메탄자화 효모인 칸디다 (Candida), 토룰롭시스 (Torulopsis)와 현재 발현 균주로 이용되고 있는 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 스키조사카로마이세스 팜비 (Schizosaccharomyces pombe) 등에서 일반적으로 사용되는 분비 벡터에 분비 항진자나 돌연변이 분비 항진자를 신호 서열과 목적 단백질의 사이에 삽입하여 발현벡터를 제조하고 이들을 상기 메탄자화 효모균에 형질전환시켜 형질전환체를 얻고 목적 단백질의 대량생산과 회수가 용이한 재조합 단백질의 분비 시스템을 개발하였다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질의 분비 시스템을 이용한 목적 단백질의 대량생산 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 목적 단백질을 대량생산하는 방법은,
1) 비-사카로마이세스 세레비재 효모균에 의해 작동되는 프로모터, 분비 항진자 및 신호 서열을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 발현벡터에 목적 단백질의 유전자를 삽입하여 융합 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
3) 상기 융합 유전자 컨스트럭트로 비-사카로마이세스 세레비재 효모균을 형질전환시켜 형질전환체를 얻는 단계;
4) 상기 형질전환체로부터 목적 단백질의 발현을 유도하는 단계; 및
5) 상기 발현된 목적 단백질을 분리·정제하는 단계로 구성된다.
단계 1)은 발현벡터를 제조하는 단계로, 비-사카로마이세스 세레비재 효모균에 의해 작동되는 프로모터, 분비 항진자 및 신호 서열을 분리하여 상업적으로 판매되는 벡터나 직접 제조한 벡터에 연결함으로써 발현벡터를 제조한다. 상기 비-사카로마이세스 세레비재 효모균은 메탄자화 (methylotropic) 효모균을 사용하고 분비 항진자로는 인터루킨-1β의 아미노 말단 24 잔기 또는 그의 돌연변이 잔기를 사용하며 신호서열로는 α-인자 신호 서열 (α-factor signal sequence), 살상 독소 리더 서열 (Killer Toxin Leader) 및 글루코아밀라아제 신호 서열(glucoamylase [STA1] signal sequence) 등을 사용한다.
단계 2)는 융합 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계로, 단계 1)의 발현벡터에 발현시키고자 하는 목적 단백질의 유전자를 분비 항진자 뒤에 삽입하여 융합 유전자 컨스트럭트를 제조한다.
단계 3)은 형질전환체를 얻는 단계로, 단계 2)에서 제조한 융합 유전자 컨스트럭트로 비-사카로마이세스 세레비재 효모균을 형질전환시켜 형질전환체를 제조한다. 메탄자화 효모균을 형질전환시키는 방법은 구체적으로, YEPD (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 포도당) 배지에 메탄자화 효모균을 접종하여 배양한 후 원심분리로 균체를 회수하고, 알칼리 양이온-효모 형질전환 키트 (Bio 101) 방법 (Alcali Cation-Yeast transform kit protocol)에 따라 형질전환 가능한 (competent) 메탄자화 효모균을 제조한다. 형질 가능한 메탄자화 효모균을 TE 완충용액으로 세척 후 리튬-아세테이트에 현탁하여 배양한 후 균체를 회수하고 TE 완충용액으로 다시 현탁한다. 형질전환시킬 융합 유전자 컨스트럭트, 운반체 DNA, 히스타민을 섞고 PEG 용액을 가하여 42℃에서 5분간 열충격 방법으로 형질전환시킨다. 상기 형질전환체를 SOS 배지에 현탁하여 SD 한천 배지 (0.8 g/ℓ complete supplement medium-URA [Bio 101], 6.7 g/ℓyeast nitrogen base without amino acid [DIFCO], 2% 포도당, 1.5% 아가)에 도말하여 URA+콜로니를 선별함으로써 형질전환체를 선별한다.
단계 4)는 상기 형질전환체로부터 목적 단백질의 발현을 유도하는 단계로 구체적으로, 단계 3)에서 선별한 형질전환체 URA+콜로니를 SD 배지에 배양한 후 원심분리로 분리한 형질전환체 세포를 YEPGal (1% 효모 추출액, 2% 펩톤, 2% 갈락토즈) 배지에 현탁하여 18시간 배양함으로써 목적 단백질의 발현을 유도한다.
상기와 같이 발현된 목적 단백질은 웨스턴 블럿 (Western-blot) 방법으로 단백질을 확인한다. 목적 단백질이 발현된 배양액을 원심분리하여 배양액과 세포 침전물 (cell pellet)로 분리하고, 배양액과 세포 침전물로 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)와 웨스턴 블럿 (Western-blot)을 수행하여 배양액으로 분비된 목적 단백질의 밴드를 확인한다.
단계 5)는 단계 4)에서 융합 유전자 컨스트럭트로 형질전환시킨 형질전환체로부터 발현된 목적 단백질을 분리·정제하는 단계로 구체적으로, 상기 형질전환체를 YEPGal (1% 효모 추출액, 2% 펩톤, 2% 갈락토즈) 배지에 현탁하여 18시간 배양한 후 원심분리하여 효모 세포를 제거하고 분비된 목적 단백질을 포함하는 상층액만을 분리한다. 분리한 상층액에 (NH4)2SO4를 포화 용해시켜 단백질을 침전시킨 후 침전물을 회수하고, 50 mM Tris (pH 7.8), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT 완충용액에 녹여 원심분리로 불용성 물질을 제거한다. 불용성 물질을 제거한 후 적당한 크로마토그래피를 사용하여 목적 단백질을 분리하며, 이때 사용 가능한 크로마토그래피로는 젤-침투 크로마토그래피 (gel-permiation chromatography), C4 역상 HPLC (C4 reverse high performance liquid chromatography), 히스티딘 표지-킬레이팅 (Histidine tag-chelating) 흡착 크로마토그래피, FLAG 표지 친화 크로마토그래피 (FLAG tag affinity chromatography) 및 이온 교환 (ion exchange) 크로마토그래피등이 있다.
상기와 같이 정제된 목적 단백질을 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿 방법으로 분석하여 순수하게 정제되었음을 확인할 수 있으며 또한, 상기와 같이 정제된 목적 단백질을 PVDF 막에 블럿하여 N-말단 아미노산 시퀀싱 (N-terminal amino acid sequencing)과 폴리머 커플링 (polymer coupling) 방법으로 아미노산 서열을 결정함으로써 목적 단백질이 순수하게 정제되었음을 확인할 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 인터루킨-1β(interleukin-1β)의 아미노 말단 24 잔기 또는 그의 돌연변이 잔기를 분비 항진자 (sequence enhancer)로 사용하고 메탄올을 탄소원으로 사용하는 메탄자화 효모균에 의해 작동되는 프로모터를 이용하는 재조합 단백질의 분비 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 상기 분비 항진자를 포함하는 발현벡터를 사용함으로써 배지로 분비된 목적 단백질을 보다 용이하게 회수할 수 있을 뿐만 아니라, 메탄올을 탄소원으로 사용할 수 있는 메탄자화 효모균을 숙주균으로 사용함으로써 기존의 사카로마이세스 세레비재 (Saccharomyces cerevisiae) 발현 시스템 이용시 과당화로 인한 문제 특히, 의약 단백질에 대해 면역 반응을 야기하고 산업적으로 대량 생산하는데 있어서의 문제점을 해결하여 보다 효과적으로 목적 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다.

Claims (11)

  1. 신호 서열과 분비 항진자 (secretion enhancer)를 포함하고 비-사카로마이세스 세레비재 (non-Saccharomyces cerevisiae) 효모균에 의해 작동되는 프로모터를 이용하여 목적 단백질을 대량 발현시키는 재조합 단백질의 분비 시스템.
  2. 제 1항에 있어서, 분비 항진자로서열번호 1로 기재되는 분비 단백질인 인터루킨-1β(interleukin-1β)의 아미노 말단 펩타이드 잔기 또는 그의 돌연변이 잔기를 이용하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 분비 시스템.
  3. 제 1항에 있어서, 분비 항진자는 인터루킨-1β의 당화 부위를 제거하거나 첨가하여 이용하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 분비 시스템.
  4. 제 1항에 있어서, 비-사카로마이세스 세레비재는 메탄올을 탄소원으로 이용하는 메탄자화 (methylotropic) 효모균인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 분비 시스템.
  5. 제 4항에 있어서, 메탄자화 효모균은 피키아 파스톨리스 (Pichia pastoris), 한세눌라 폴리몰파 (Hansenula polymorpha), 칸디다 (Candida), 토룰롭시스 (Torulopsis), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis), 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 및 스키조사카로마이세스 팜비 (Schizosaccharomyces pombe)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 분비 시스템.
  6. 제 1항에 있어서, 프로모터는 피키아 파스토리스 유래 AOX, PHO1, AUG1으로 구성된 군으로부터 선택되는 비것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 분비 시스템.
  7. 제 1항에 있어서, 프로모터는 한세눌라 폴리몰파 유래 MOX와 PMA1으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 분비 시스템.
  8. 제 1항에 있어서, 프로모터는 칸디다 (Candida), 토룰롭시스 (Torulopsis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis),야로위카 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 및 스키조사카로마이세스 팜비 (Schizosaccharomycespombe)로 구성된 군으로부터 선택되는 비-사카로마이세스 세레비재 효모균에 의해 작동되는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 분비 시스템.
  9. 제 1항에 있어서, 신호 서열은 α-인자 신호 서열 (α-factor signal sequence), 살상 독소 리더 서열 (killer toxin leader sequence) 및 글루코아밀라아제 신호 서열 (glucoamylase [STA1] signal sequence)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 분비 시스템.
  10. 제 1항에 있어서, 목적 단백질은 칼시토닌 (Calcitonin), CGRP, ANF 및 hGH를 포함하는 호르몬류; hGCSF, hGM-CSF, hM-CSF, TGF, EGF 및 PDGF를 포함하는 싸이토카인 (cytokine)과 성장인자류; 인터페론 (Interferon)류; 인터루킨 (Interleukin)류, 엔테로키나제 (Enterokinase)를 포함하는 효소; 및 HBV S 항원 (HBV S Antigen), 프리 S1/S2 (preS1/S2)를 포함하는 각종 바이러스 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 분비 시스템.
  11. 1) 비-사카로마이세스 세레비재 효모균에 의해 작동되는 프로모터, 분비 항진자 및 신호서열을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
    2) 상기 발현벡터에 목적 단백질의 유전자를 삽입하여 융합 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    3) 상기 융합 유전자 컨스트럭트로 비-사카로마이세스 세레비재 효모균을 형질전환시켜 형질전환체를 얻는 단계;
    4) 상기 형질전환체로부터 목적 단백질의 발현을 유도하는 단계; 및
    5) 상기 발현된 목적 단백질을 분리·정제하는 단계로 구성되는 제 1항의 재조합 단백질의 분비 시스템을 이용한 목적 단백질의 대량 생산방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20030062854A (ko) * 2002-01-21 2003-07-28 주식회사 엘지생명과학 분비형 벡터를 이용한 효모에서의 재조합 단백질의 제조방법
KR100832364B1 (ko) * 2007-01-30 2008-05-26 학교법인 한림대학교 단백질 분비 유도용 조성물
KR20220102046A (ko) * 2021-01-12 2022-07-19 광운대학교 산학협력단 외분비 인간 표피성장인자의 생산방법

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