CN115141763B

CN115141763B - 一株高效外泌蛋白的酵母工程菌及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN115141763B
Application number: CN202210642012.9A
Authority: CN
Inventors: 黄明涛; 薛松绿; 肖楚凡; 潘雨阳; 刘秀妨
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2022-06-08
Filing date: 2022-06-08
Publication date: 2023-11-17
Anticipated expiration: 2042-06-08
Also published as: CN115141763A

Abstract

本发明公开了一株高效外泌蛋白的酵母工程菌及其构建方法和应用，该酵母基因工程菌是敲除酵母菌株中的SEC72基因后得到的；所述的酵母基因工程菌还含有携带信号肽的重组蛋白分泌表达质粒；所述信号肽是NCW2、MID2、SWP1、FET3、FLO10或α‑factor中的一种。本发明构建了一株高效外泌蛋白的酿酒酵母工程菌，可使多种信号肽介导重组蛋白分泌的产量得到明显提高。该酵母基因工程菌针对介导分泌相关的分子伴侣复合体进行改造，蛋白分泌能力提升对于多种信号肽具有普适性，为高效分泌表达目标蛋白提供奠定了基础。该酵母基因工程菌在重组蛋白分泌生产上展现出较大的应用潜力。

Description

一株高效外泌蛋白的酵母工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一株高效外泌蛋白的酵母工程菌及其构建方法和应用，属于微生物及基因工程领域。

背景技术

酿酒酵母是单细胞真核生物，兼具真核生物及微生物的优势。其生长繁殖快、易于进行基因工程改造、能进行蛋白翻译后修饰、具有较强环境耐受性及底物利用谱广等特点，已被广泛地应用在重组蛋白工业生产上。如胰岛素、病毒疫苗生产等。基于酿酒酵母应用的普适性，对酿酒酵母的基因信息和蛋白质表达等展开了大量研究，如酿酒酵母是首个实现基因组测序的真核生物，其多年前便用于胰岛素的生产。目前，全球近一半的胰岛素仍以酿酒酵母为生产平台进行供应。

利用真核生物进行重组蛋白制备时，宿主细胞以分泌形式进行蛋白表达是较受欢迎的一种方式。因为这可促使目标蛋白在经过分泌途径而外泌至胞外的过程中，得到适当的翻译后修饰，保证重组蛋白具有生理活性。同时，外泌至胞外的重组蛋白也有利于进行下游纯化，极大地减轻了纯化环节的压力，有利于提升经济效益。目前，对于重组蛋白在酵母中的分泌表达，通常在目标蛋白的N端添加信号肽来实现介导分泌。尽管添加信号肽可实现外源蛋白的分泌，然而，部分外源蛋白在酵母系统中表达时分泌效率较低，这会限制酵母在大规模生产上的应用。通过基因改造手段，可以提升酵母的重组蛋白分泌能力。但目前很多改造的靶点，提升幅度较小，且有时只对特定的信号肽有效，导致适用性较为有限。目前在改造靶点及手段上，都有待进一步拓展完善。

发明内容

本发明的目的在于提供一株高效外泌蛋白的酵母工程菌及其构建方法和应用，来解决现有改造靶点提升幅度小、对不同信号肽的普适性较窄的不足。本发明针对与介导分泌相关的分子伴侣复合体上的一个蛋白Sec72进行敲除，克服了现有技术的缺陷，实现了多种信号肽在酵母中介导蛋白分泌的能力都得到了较大提升。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一株酵母基因工程菌，是敲除酵母菌株中的SEC72基因后得到；

所述SEC72基因的序列如SEQ ID NO:2所示；

SEC72基因编码的Sec72蛋白，是介导分泌转运相关的一种分子伴侣复合体上的亚基之一；该分子伴侣复合体为内质网上的转运通道，可通过识别新生蛋白质的信号肽序列，将新生蛋白质从胞质中介导转运至内质网中，随后新生蛋白质可在内质网中继续完成蛋白分泌后续步骤。Sec72蛋白参与信号肽序列识别过程。基于本发明，发现对其进行改造(敲除)，有助于完成新生蛋白质的内质网转运，从而提升了蛋白外泌的效率。

所述的酵母菌株优选酿酒酵母IMX581、CEN.PK2-1C、CEN.PK2-1D、BY4741、BY4742、CEN.PK 530.1C、CEN.PK 113.5D、B184M。

所述的酵母基因工程菌还含有携带信号肽的重组蛋白分泌表达质粒；

所述信号肽可以是NCW2、MID2、SWP1、FET3、FLO10或α-factor中的一种；

所述的重组蛋白可以是α-淀粉酶、脂肪酶、β-淀粉酶、蛋白酶、乳糖酶、α-葡萄糖苷酶、葡糖异构酶、转化酶、纤维素酶、纤维二糖酶、人血清白蛋白、病毒表面抗原、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子、人血管抑制素、抗体等。

优选地，所述的重组蛋白分泌表达质粒带有POT1筛选标记；这种情况下，还应当敲除酵母菌株中的TPI1基因，使重组蛋白分泌表达质粒在酵母菌稳定存在；

所述TPI1基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

上述酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

敲除酵母菌株上的SEC72基因，构建携带信号肽的重组蛋白分泌表达质粒，将携带信号肽的重组蛋白分泌表达质粒转化至敲除SEC72基因的酵母菌株中，得到所述酵母基因工程菌。

上述的酵母基因工程菌在表达重组蛋白中的应用；将上述酵母基因工程菌接种于发酵培养基中进行发酵培养，收集发酵培养产物即可得相应的重组蛋白。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明构建了一株高效外泌蛋白的酿酒酵母工程菌，可使包括NCW2、MID2、SWP1、FET3、FLO10和α-factor等在内的多种信号肽介导重组蛋白分泌的产量得到明显提高(1.7～2.5倍)。该酵母基因工程菌针对介导分泌相关的分子伴侣复合体进行改造，蛋白分泌能力提升对于多种信号肽具有普适性，为高效分泌表达目标蛋白提供奠定了基础。该酵母基因工程菌在重组蛋白分泌生产上展现出较大的应用潜力。

附图说明

图1为PCR扩增pROS10载体框架，TPI1靶向片段A和SEC72靶向片段B的凝胶电泳条带图。

图2为TPI1修复片段A和SEC72修复片段B的凝胶电泳条带图。

图3为TPI1基因敲除验证片段A和SEC72敲除验证片段B的凝胶电泳条带图。

图4为带不同信号肽的分泌表达α-淀粉酶的质粒示意图。

图5为pAlphaAmyCPOT酶切条带凝胶电泳图。

图6为对照菌株S1和改造菌株S1ΔSEC72的分泌生产淀粉酶的产量。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下述实施例中所用的PCR试剂、限制性内切酶、质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒等采用商业产品多已注明商业来源，具体操作按照试剂盒说明书进行。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，则通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2017)、《酵母遗传学方法实验指南》(北京：科学出版社，2016)中所述的条件进行。

下述实施例中应用到的CRISPR技术参见现有技术(FEMS Yeast Research，2015，15(2):fov004.)。

为更好地理解本发明的内容，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)IMX581(可由EUROSCARF获得，序号Y40593)为出发菌株，为具体实施例作进一步说明。

下列实施例中涉及到的培养基成分如下：

LB：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl。用于筛选转化质粒时，添加100μg/mL氨苄青霉素。

Se-Ura：0.77g/L CSM-Ura，6.9g/L YNB，0.5g/L葡萄糖，10ml乙醇。

YPE：20g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，0.5g/L葡萄糖，10ml乙醇。

YPD：20g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖。

SD-2×SCAA：6.9g/L YNB；1g/L BSA；13.62g/L Na₂HPO₄·12H₂O；9.68g/LNaH₂PO₄·2H₂O；190mg/L Arg；400mg/L Asp；1260mg/L Glu；130mg/L Gly；140mg/L His；290mg/L Ile；400mg/L Leu；440mg/L Lys；108mg/L Met；200mg/L Phe；220mg/L Thr；40mg/L Trp；52mg/L Tyr；380mg/L Val；20g/L葡萄糖。

固体培养基添加2％琼脂粉。

实施例1高效外泌蛋白的酿酒酵母工程菌的构建

酿酒酵母IMX581(基因型：MATa ura3-52 can1::cas9-natNT2 TRP1 LEU2 HIS3)是本实施例中的酵母基因工程菌出发菌。IMX581基因组中整合有CRISPR-Cas9系统中的Cas9蛋白表达基因盒。该出发菌株带有Ura营养型缺陷筛选标记。对该菌株进行基因敲除等遗传操作时，可将带有20bp gRNA识别序列以靶向目标基因的gRNA表达质粒(pROS10(可由EUROSCARF获得，序号P30787)，带有Ura筛选标记)及其修复片段转化至菌体内，在相应的平板上筛选后，即可得到所需的阳性转化子。

1.1构建可转入表达质粒的酵母工程菌

带有POT1筛选标记的质粒CPOTud(Biotechnology and bioengineering,2012,109(5):1259-1268.)(裂殖酵母糖酵解途径中的关键酶磷酸丙糖异构酶)在本发明中用于重组蛋白的分泌表达，该质粒在敲除TPI1基因(SEQ ID NO:1)的酵母菌可稳定存在。因此，首先对出发菌株IMX581进行TPI1基因敲除，过程如下：

(1)以pROS10为模板，利用引物对tpi1P1和RP2，进行PCR扩增，得到靶向片段A(图1)。通过引物对vfP1和vfP2扩增出pROS10载体框架片段(图1)，PCR反应体系和条件由表1和表2。

表1 PCR反应体系

表2 PCR条件

靶向片段A、靶向片段B延伸时间50s，载体框架片段延伸时间3min

利用引物对tpi1RS1，tpi11RS2，通过PCR反应进行自身互补扩增，得到80bp的修复片段A(tpi1-RS)(图2)。反应体系见表3，PCR条件见表4。

表3修复片段PCR反应体系

表4修复片段PCR条件

(2)通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收PCR产物，电泳图如图1所示。将得到的靶向片段A和载体框架以Gibson连接技术，进行带有TPI1基因gRNA靶向序列的pROS10-tpi1质粒的构建。连接体系如表5所示，配制好的连接液50℃孵育20min。转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化步骤如下：

a)连接液加入50μl感受态细胞，冰置30min。

b)42℃水浴75s，冰置5min。

c)加入500μl LB在37℃，100rpm复苏45min。

d)涂布于含有氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养筛选。

第二天挑取单克隆接种于3ml带氨苄青霉素的LB液体培养基于37℃，200rpm培养12-16h，提取质粒，酶切及测序验证正确。

表5 Gibson连接体系

(3)将提取得到的TPI1靶向质粒(pROS10-tpi1)及tpi1修复片段A(tpi1-RS)一同转入酵母感受态细胞IMX581，具体流程为：

a)取50μl的感受态细胞，离心(1min,6000rpm)弃上清液。

b)按顺序加入表6系列化合物，混匀。

c)30℃孵育30min，42℃水浴45min。

d)涂布于Se-Ura固体平板。

e)30℃倒置培养3-4天，并回收转化子。

表6酵母转化混合体系

挑取转化子转移至YPE平板，30℃倒置培养2-3天，并挑取单克隆于25μlNaOH溶液(20mM)，99℃破壁处理15min，使基因组渗透出细胞外。通过设计好的TPI1基因上下游匹配的引物对(tpi1Y1，tpi1Y2)，以上述NaOH溶液作为模板，利用PCR确认染色体上的TPI1基因已被敲除。反应体系见表7，PCR条件见表8。扩增得到的验证片段A凝胶电泳条带见图3，并将切胶回收产物送至生工测序，确认TPI1敲除成功。

表7单克隆敲除验证PCR反应体系

表8单克隆敲除验证PCR条件

(4)挑取TPI1敲除成功的单克隆接种于3ml液体YPE培养基，培养4天(30℃，200rpm)进行pROS10-tpi1的质粒脱除，后划线于YPE固体培养基，30℃倒置培养2-3天。分别转移单克隆至Se-Ura固体平板、YPD固体平板和YPE固体平板上。30℃倒置培养2-3天，脱除敲除转入的辅助质粒pROS10-tpi1(在YPE平板生长，但不在Se-Ura平板和YPD平板生长的单克隆则为质粒脱除成功)，得到的菌株命名为S1(即菌株IMX581ΔTPI1)。

1.2敲除SEC72基因

在1.1构建的菌株S1基础上，对SEC72基因(SEQ ID NO:2)进行敲除。

(1)以pROS10为模板，利用引物对sec72P1和RP2进行PCR扩增，得到靶向片段B(图1)。通过引物对vfP1和vfP2扩增出pROS10载体框架片段(图1)，PCR反应体系和条件见表1和表2。

通过PCR反应进行自身互补扩增，得到80bp的修复片段B(sec72-RS)(图2)。反应体系见表3，PCR条件见表4。

(2)通过琼脂糖凝胶电泳及切胶回收PCR产物，电泳图如图1所示。将得到的靶向片段B和载体框架以Gibson连接技术，进行带有SEC72基因gRNA靶向序列的pROS10-sec72质粒的构建，连接体系如表5所示。详细操作过程同1.1(2)，最终构建得到用于敲除SEC72的靶向质粒pROS10-sec72。

(3)将靶向质粒pROS10-sec72及SEC72修复片段B(sec72-RS)一同转入1.1中构建得到的酵母菌株S1感受态细胞，参照1.1步骤(3)(4)流程进行基因敲除。SEC72基因的敲除验证片段B的凝胶电泳条带见图3。酵母基工程菌S1ΔSEC72构建成功。

实施例2构建含不同信号肽的重组蛋白表达质粒

在进行重组蛋白表达时，可通过在目标蛋白前添加信号肽，以实现其在宿主细胞中的分泌表达。α-factor信号肽是酵母细胞中最为常用的信号肽。在本发明中，重组蛋白为α-淀粉酶，编码序列见SEQ ID NO.3。质粒pAlphaAmyCPOT(Biotechnology andbioengineering,2012,109(5):1259-1268.)为含有α-factor信号肽及α-淀粉酶基因的表达载体。在质粒pAlphaAmyCPOT的基础上，通过将α-factor信号肽(SEQ ID No.4)替换为NCW2信号肽(SEQ ID No.5)、MID2信号肽(SEQ ID No.6)、SWP1信号肽(SEQ ID No.7)、FET3信号肽(SEQ ID No.8)、FLO10信号肽(SEQ ID No.9)，得到相应的质粒pNCW2AmyCPOT、pMID2AmyCPOT、pSWP1AmyCPOT、pFET3AmyCPOT、pFLO10AmyCPOT(图4)。详细构建过程如下：

(1)以质粒pAlphaAmyCPOT为模板，利用普通PCR扩增，利用引物对BP1和P2，CP1和P2，DP1和P2，EP1和P2以及FP1和P2进行PCR扩增，得到片段B、C、D、E、F。PCR体系和条件见表1和表2，延伸时间为50s。使用内切酶KpnI和NheI对PCR产物片段进行酶切，酶切体系见表8。同时对质粒pAlphaAmyCPOT进行酶切，以制备载体框架，酶切体系见表9。酶切体系37℃放置5-20min。使用胶回收试剂盒(美基)纯化回收得到酶切后的片段B～F，凝胶电泳、切胶回收获取酶切后的载体框架。载体框架酶切后凝胶电泳见图5。

表8信号肽-淀粉酶片段B～F酶切体系

表9载体pAlphaAmyCPOT酶切体系

(2)将酶切片段和载体框架进行连接，连接体系见表10。22℃孵育30min后，转化至大肠杆菌DH5α。对在含氨苄青霉素的LB平板上长出的阳性克隆进行培养，提取质粒，酶切及测序验证正确，确认质粒pNCW2AmyCPOT、pMID2AmyCPOT、pSWP1AmyCPOT、pFET3AmyCPOT、pFLO10AmyCPOT构建成功。

(3)采用常规的酵母转化法，将6种含不同信号肽的质粒pAlphaAmyCPOT、pNCW2AmyCPOT、pMID2AmyCPOT、pSWP1AmyCPOT、pFET3AmyCPOT、pFLO10AmyCPOT分别转化至酵母工程菌株S1和S1ΔSEC72中。转化流程同上，转化液涂布于YPD固体培养基，30℃培养2～3天，得到阳性克隆。最终共得到12株酵母菌株，分别为：pAlphaAmyCPOT/S1、pNCW2AmyCPOT/S1、pMID2AmyCPOT/S1、pSWP1AmyCPOT/S1、pFET3AmyCPOT/S1、pFLO10AmyCPOT/S1、pAlphaAmyCPOT/S1ΔSEC72、pNCW2AmyCPOT/S1ΔSEC72、pMID2AmyCPOT/S1ΔSEC72、pSWP1AmyCPOT/S1ΔSEC72、pFET3AmyCPOT/S1ΔSEC72、pFLO10AmyCPOT/S1ΔSEC72。

表10连接体系

上述过程所使用的全部引物序列见表11。

表11引物序列(下划线为gRNA序列)

实施例3利用敲除SEC72的酵母工程菌高效外泌重组蛋白

将实施例2构建得到的12株酿酒酵母工程菌接种于2.5ml SD-2×SCAA液体培养基中，在30℃，200rpm培养条件下发酵96h，得到上清液中即含有目标重组蛋白α-淀粉酶。将发酵液离心(3min，12000rpm)以分离上清，用于重组蛋白含量测定。测定方法依照α-淀粉酶试剂盒(Megazyme K-CERA)操作说明进行。同时采用以米曲霉来源淀粉酶(Sigma-Aldrich)作淀粉酶活力标准曲线并进行换算。质量-酶活力换算单位为69.6U/mg。最终淀粉酶产量结果见图6。由结果可知，在SEC72敲除后的酵母工程菌中，不同信号肽介导下的重组蛋白分泌产量均有了较大提升。其中，菌株pNCW2AmyCPOT/S1ΔSEC72(对应NCW2信号肽)，产量达425mg/L，是未敲除SEC72对照菌的2.5倍。说明本发明构建得到的酵母工程菌株具有高效分泌重组蛋白的能力，靶点SEC72对于不同信号肽具有普适性。在分泌生产重组蛋白上，具有较好的应用潜力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一株高效外泌蛋白的酵母工程菌及其构建方法和应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1377

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TPI1基因

<400> 1

atgggtaaag agaagtctca cattaacgtt gtcgttatcg gtcatgtcga ttctggtaag 60

tctaccacta ccggtcattt gatttacaag tgtggtggta ttgacaagag aaccatcgaa 120

aagttcgaaa aggaagccgc tgaattaggt aagggttctt tcaagtacgc ttgggttttg 180

gacaagttaa aggctgaaag agaaagaggt atcactatcg atattgcttt gtggaagttc 240

gaaactccaa agtaccaagt taccgttatt gatgctccag gtcacagaga tttcatcaag 300

aacatgatta ctggtacttc tcaagctgac tgtgctatct tgattattgc tggtggtgtc 360

ggtgaattcg aagccggtat ctctaaggat ggtcaaacca gagaacacgc tttgttggct 420

ttcaccttgg gtgttagaca attgattgtt gctgtcaaca agatggactc cgtcaaatgg 480

gacgaatcca gattccaaga aattgtcaag gaaacctcca actttatcaa gaaggttggt 540

tacaacccaa agactgttcc attcgtccca atctctggtt ggaacggtga caacatgatt 600

gaagctacca ccaacgctcc atggtacaag ggttgggaaa aggaaaccaa ggccggtgtc 660

gtcaagggta agactttgtt ggaagccatt gacgccattg aacaaccatc tagaccaact 720

gacaagccat tgagattgcc attgcaagat gtttacaaga ttggtggtat tggtactgtg 780

ccagtcggta gagttgaaac cggtgtcatc aagccaggta tggttgttac ttttgcccca 840

gctggtgtta ccactgaagt caagtccgtt gaaatgcatc acgaacaatt ggaacaaggt 900

gttccaggtg acaacgttgg tttcaacgtc aagaacgttt ccgttaagga aatcagaaga 960

ggtaacgtct gtggtgacgc taagaacgat ccaccaaagg gttgcgcttc tttcaacgct 1020

accgtcattg ttttgaacca tccaggtcaa atctctgctg gttactctcc agttttggat 1080

tgtcacactg ctcacattgc ttgtagattc gacgaattgt tggaaaagaa cgacagaaga 1140

tctggtaaga agttggaaga ccatccaaag ttcttgaagt ccggtgacgc tgctttggtc 1200

aagttcgttc catctaagcc aatgtgtgtt gaagctttca gtgaataccc accattaggt 1260

agattcgctg tcagagacat gagacaaact gtcgctgtcg gtgttatcaa gtctgttgac 1320

aagactgaaa aggccgctaa ggttaccaag gctgctcaaa aggctgctaa gaaataa 1377

<210> 2

<211> 582

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SEC72基因

<400> 2

atggttaccc ttgaatacaa tgcaaacagt aaactgatca ctgcgagtga tgctgttgtt 60

gcactatcta ccgaaactaa tatcgatcaa ataaatgttc tcactacatc tttgattgga 120

gaaaccaacc caaattttac accacaaccg aatgaagctc taagcaaaat gatcaagggt 180

ttatttgaaa gtggtatgaa gaatttacaa caaaaaaaat tgaatgaggc attgaagaat 240

gtttctttag caatcgaaat ggcacaaaga aaaagagcgc cttgggaagc ttttgctatt 300

cagctaccag agctacactt tatgcttcgt agtaaaatag atttatgttt aatactcgga 360

aagcatttag aggcgttgca agacttggat ttcttacttg gtacgggact tatccaacca 420

gacgtatttg tcaggaaggc ggactgtttg ctaaaattga gacagtggga agaggctagg 480

gcaacatgcg agagaggttt agctttagcc ccagaggata tgaaacttag agccctttta 540

atagaaactg caagaaatct ggccgaatat aacggtgaat aa 582

<210> 3

<211> 1437

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> α-淀粉酶

<400> 3

gcaacgcctg cggactggcg atcgcaatcc atttatttcc ttctcacgga tcgatttgca 60

aggacggatg ggtcgacgac tgcgacttgt aatactgcgg atcggaaata ctgtggtgga 120

acatggcagg gcatcatcga caagttggac tatatccagg gaatgggctt cacagccatc 180

tggatcaccc ccgttacagc ccagctgccc cagaccaccg catatggaga tgcctaccat 240

ggctactggc agcaggatat atactctctg aacgaaaact acggcactgc agatgacttg 300

aaggcgctct cttcggccct tcatgagagg gggatgtatc ttatggtcga tgtggttgct 360

aaccatatgg gctatgatgg agcgggtagc tcagtcgatt acagtgtgtt taaaccgttc 420

agttcccaag actacttcca cccgttctgt ctcattcaaa actatgaaga tcagactcag 480

gttgaggatt gctggctagg agataacact gtctccttgc ctgatctcga taccaccaag 540

gatgtggtca agaatgaatg gtacgactgg gtgggatcat tggtatcgaa ctactccatt 600

gacggcctcc gtatcgacac agtaaaacac gtccagaagg acttctggcc cgggtacaac 660

aaagccgcag gcgtgtactg tatcggcgag gtgctcgacg gtgatccggc ctacacttgt 720

ccctaccaga acgtcatgga cggcgtactg aactatccca tttactatcc actcctcaac 780

gccttcaagt caacctccgg cagcatggac gacctctaca acatgatcaa caccgtcaaa 840

tccgactgtc cagactcaac actcctgggc acattcgtcg agaaccacga caacccacgg 900

ttcgcttctt acaccaacga catagccctc gccaagaacg tcgcagcatt catcatcctc 960

aacgacggaa tccccatcat ctacgccggc caagaacagc actacgccgg cggaaacgac 1020

cccgcgaacc gcgaagcaac ctggctctcg ggctacccga ccgacagcga gctgtacaag 1080

ttaattgcct ccgcgaacgc aatccggaac tatgccatta gcaaagatac aggattcgtg 1140

acctacaaga actggcccat ctacaaagac gacacaacga tcgccatgcg caagggcaca 1200

gatgggtcgc agatcgtgac tatcttgtcc aacaagggtg cttcgggtga ttcgtatacc 1260

ctctccttga gtggtgcggg ttacacagcc ggccagcaat tgacggaggt cattggctgc 1320

acgaccgtga cggttggttc ggatggaaat gtgcctgttc ctatggcagg tgggctacct 1380

agggtattgt atccgactga gaagttggca ggtagcaaga tctgtagtag ctcgtga 1437

<210> 4

<211> 89

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> α-factor信号肽

<400> 4

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala

85

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NCW2信号肽

<400> 5

Met Lys Ala Cys Ser Ile Leu Phe Thr Thr Leu Ile Thr Leu Ala Ala

1 5 10 15

Ala

<210> 6

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> MID2信号肽

<400> 6

Met Leu Ser Phe Thr Thr Lys Asn Ser Phe Arg Leu Leu Leu Leu Ile

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ile Ser Thr Ile Arg Ala

20 25

<210> 7

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SWP1信号肽

<400> 7

Met Gln Phe Phe Lys Thr Leu Ala Ala Leu Val Ser Cys Ile Ser Phe

1 5 10 15

Val Leu Ala

<210> 8

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FET3信号肽

<400> 8

Met Thr Asn Ala Leu Leu Ser Ile Ala Val Leu Leu Phe Ser Met Leu

1 5 10 15

Ser Leu Ala Gln Ala

20

<210> 9

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FLO10信号肽

<400> 9

Met Pro Val Ala Ala Arg Tyr Ile Phe Leu Thr Gly Leu Phe Leu Leu

1 5 10 15

Ser Val Ala Asn Val Ala Leu Gly

20

Claims

1.一株酵母基因工程菌，其特征在于：

是敲除酵母菌株中的TPI1基因和SEC72基因后得到；

所述的酵母菌株为酿酒酵母IMX581；

所述信号肽为NCW2、MID2、SWP1、FET3、FLO10中的至少一种；

所述的NCW2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述的MID2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述的SWP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述的FET3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述的FLO10的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述的重组蛋白是α-淀粉酶；

所述SEC72基因的序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的重组蛋白分泌表达质粒带有POT1筛选标记；

所述TPI1基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

敲除酵母菌株上的TPI1基因和SEC72基因，构建携带POT1筛选标记和信号肽的重组蛋白分泌表达质粒，将携带POT1筛选标记和信号肽的重组蛋白分泌表达质粒转化至敲除SEC72基因的酵母菌株中，得到所述酵母基因工程菌。

3.权利要求1所述的酵母基因工程菌在表达α-淀粉酶中的应用。