CN117925430A - 一种抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株及其构建方法和应用。该酿酒酵母工程菌株具有如下特点：基因BIO5被敲除，基因HMO1过表达。本发明的酵母基因工程菌具有显著提升的抗氧化胁迫能力和产重组蛋白能力。这有利于提高工业中利用酿酒酵母生产重组蛋白的效率，并带来更高的经济效益。此外，该工程菌株在设计构建对其它胁迫下的抗逆菌株以及高产蛋白菌株具有一定参考意义，甚至对相关疾病的治疗、预防和药物筛选平台搭建等其他研究具有一定的借鉴意义。该发明具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株及其构建方法和应用。
背景技术
酿酒酵母被广泛用于生产燃料、化学品以及各种具有医疗或工业应用价值的蛋白。在重组蛋白生产领域，酿酒酵母占据了重要地位。目前，研究人员已对酿酒酵母的蛋白质合成和分泌途径进行了大量研究。在蛋白质的合成过程中，内质网折叠环境和折叠需求的改变可能引起内质网应激和氧化应激。研究表明，这两种应激会对细胞的正常生理代谢活动造成重大影响。在无法满足重组蛋白的表达需求时，严重的应激甚至可能导致细胞凋亡。因此，提升菌株的抗氧化胁迫能力，有助于提升其表达重组蛋白的能力。此外，内质网应激和氧化应激还与许多人类疾病密切相关。
衣霉素(Tm)和二硫苏糖醇(DTT)是两种常用的内质网应激诱导试剂。Tm可抑制蛋白质的糖基化过程，而DTT则会干扰二硫键的形成，对细胞有一定的毒害作用。在诱导细胞产生内质网应激时，通常伴随着氧化应激的发生，从而破坏细胞内质网的氧化还原平衡状态。通过使用Tm和DTT诱导酵母细胞产生氧化应激，测试改造菌株的抗氧化应激能力，可确认抗氧化胁迫的关键基因靶点。这对优化重组蛋白的生产策略具有重要意义。此外，本发明对相关疾病的治疗、预防和药物筛选平台搭建等研究，也具有一定的参考意义。
发明内容
本发明旨在解决在利用酿酒酵母生产重组蛋白时，对细胞产生的氧化胁迫导致蛋白产量受限的问题。为此，提供了一种改进酿酒酵母工程菌株及其构建方法，以提高其抗氧化胁迫能力提升并帮助优化重组蛋白生产。本发明确定了BIO5和HMO1两个基因为关键基因，并将它们进行组合叠加。具体地，通过基因编辑技术敲除基因BIO5并过表达基因HMO1，经过氧化胁迫测试，结果表明所述酿酒酵母菌株的氧化压力耐受性显著提升，并且重组蛋白产量也有显著提高。本发明为构建高蛋白分泌型的抗逆酿酒酵母菌株提供了应用潜能。
本发明的首要目的在于提供一种抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株。
本发明的另一目的在于提供上述抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株的构建方法。
本发明的再一目的在于提供上述抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株，具有如下特点：基因BIO5被敲除，基因HMO1过表达。
所述的酿酒酵母工程菌株的出发菌株为CEN.PK背景酿酒酵母，该菌株是常用的酵母菌株，在工业界和学术界的代谢工程和系统生物学研究广泛应用(Microb Cell Fact,2012,11,36)，代表性及普适性较好。
所述的出发菌株优选为将表达重组蛋白的质粒导入CEN.PK背景酿酒酵母，得到可表达重组蛋白的酿酒酵母菌株，从而可通过检测重组蛋白的表达量，确定抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株在氧化胁迫环境下表达外源蛋白的性能。
所述的表达重组蛋白的质粒优选为质粒pAlphaAmyCPOT(PNAS2018,115,E11025-E11032)。
所述的重组蛋白优选为α-淀粉酶。
所述的CEN.PK背景优选为菌株MSBP003。
所述的过表达优选通过同源重组的方法进行染色体整合过表达基因。
所述的染色体整合的位点优选为X3中性位点。
所述的敲除优选通过同源重组的方法或CRISPR/Cas9基因编辑技术进行无痕敲除。
所述的基因BIO5和所述的基因HMO1均为酿酒酵母自身基因组中的成分，可以通过以酿酒酵母自身基因组为模板，PCR扩增来获得。
所述的氧化胁迫通过给予酿酒酵母一定量的衣霉素(Tm)或二硫苏糖醇(DTT)两种压力诱导剂进行处理实现相应的胁迫诱导。
上述抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株的构建方法，包括如下步骤：敲除基因BIO5，过表达基因HMO1；优选包括如下步骤：
(1)以质粒pROS13作为模板，使用引物对KBIO5P1/KBIO5P2扩增含BIO5位点同源臂的卡那霉素抗性基因表达框(kanMX)，卡那霉素抗性基因表达框的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)获取酵母出发菌株的基因组DNA；
(3)以步骤(2)的基因组DNA为模板，使用引物对PHMO1P1/PHMO1P2扩增HMO1基因片段，HMO1的编码核酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(4)构建pROS10-X3敲除质粒，以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10FraP1/pROS10FraP2扩增得到质粒框架；由引物对pROS10-N20-up/pROS10-N20-X3扩增得到含X3位点20bp靶向序列gRNA的基因片段；利用Gibson组装技术将质粒框架和基因片段连接得到pROS10-X3敲除质粒；
(5)以质粒p426GPD为模板，由引物对p426FraP1/p426FraP2扩增得到质粒框架，利用Gibson组装技术将质粒框架和步骤(3)得到的HMO1基因片段连接，得到p426-HMO1质粒；
(6)以p426-HMO1质粒为模板，用引物对X3-up-GPD/X3-down-CYC1扩增含有同源臂的GPDp-HMO1-CYC1t基因修复片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(7)将步骤(4)得到pROS10-X3敲除质粒和步骤(6)得到的GPDp-HMO1-CYC1t基因修复片段转化至出发菌株，得到菌株R2；
(8)将步骤(1)得到的卡那霉素抗性基因表达框转化至菌株R2感受态细胞，得到抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株。
上述抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株在氧化胁迫环境中的应用。
上述抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株在重组蛋白生产中的应用。
一种测试上述抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株的抗氧化胁迫性能的方法，包括如下步骤：
1)将上述抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株分别接种于不含Tm/DTT、含0.2μg/mL、0.4μg/mLTm浓度的发酵培养基，以及含有3mM、5mM浓度DTT的发酵培养基中培养，检测细胞生长情况；
2)将发酵后的菌液离心取上清，用于重组蛋白的含量测定；
3)通过对细胞生长情况和重组蛋白的分析，得到上述抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株的抗氧化胁迫性能。
步骤1)中所述的发酵培养基优选为SD-2×SCAA培养基。
步骤1)中所述的培养的条件优选为于28～32℃、150～250rpm培养90～100h；更优选为于30℃、200rpm培养96h。
步骤2)中所述的将菌液离心的条件优选为1,0000～1,3000×g离心0～2min；更优选为12,000×g离心1min。
步骤2)中所述的重组蛋白的含量测定，通过使用α-淀粉酶测定试剂盒(K-CERA，Megazyme)来进行α-淀粉酶的酶活测定，同时采用米曲霉α-淀粉酶(Sigma-Aldrich)作为标准品作为对照。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明对表达重组蛋白的酵母工程菌进行了改造，成功构建了一种工程菌株，其抗氧化胁迫能力与产重组蛋白的能力同时提升。本发明确定了两个有效靶点BIO5和HMO1，并将它们进行组合叠加，最终构建得到抗逆能力提升幅度最大的菌株R3。在0.4μg/mLTm和5mMDTT所致的氧化胁迫下，R3菌株的细胞密度和α-淀粉酶产量均高于出发菌株R0。具体地，在DTT处理下，R3菌株的细胞密度提高显著，为对照菌株的2倍；在Tm和DTT的处理下R3菌株的重组蛋白产量分别提升2.14倍和1.85倍。我们所发现的关键靶点可能有助于设计和构建高蛋白分泌型抗逆菌株，在工业上提高利用酿酒酵母生产重组蛋白的效率和带来更高的经济效益。
附图说明
图1是重组质粒示意图；其中，(A)为p426-HMO1，(B)为pROS10-X3。
图2是PCR鉴定敲除BIO5的菌株R1琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M为DNA分子量marker。
图3是R2菌株在X3位点成功整合基因HMO1的PCR鉴定凝胶电泳图；其中，泳道M为DNA分子量marker。
图4是R3菌株在X3位点成功整合基因HMO1的PCR鉴定凝胶电泳图；其中，泳道M为DNA分子量Marker。
图5是实施例5中R1、R2、R3酵母工程菌株试管在不含有Tm/DTT的培养基中发酵4天后的数据图；其中，R0(AMP003)作为对照。
图6是实施例6中R1、R2、R3酵母工程菌株试管在分别含有0.2μg/mLTm(A)和3mMDTT(B)的培养基中发酵4天后的数据图；其中，R0(AMP003)作为对照。
图7是实施例7中R3酵母工程菌株试管在分别含有0.4μg/mLTm和5mMDTT的培养基中发酵4天后的数据图；其中，R0作为对照。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，则通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2017)、《酵母遗传学方法实验指南》(北京：科学出版社，2016)中所述的条件进行。
下述实施例中应用到的CRISPR技术参见现有技术(Nat Commun 2019,10(1):1053)。
下列实施例中所使用的质粒p426GPD已在文献“Yeast vectors for thecontrolled expression of heterologous proteins in different geneticbackgrounds.Gene 1995,156:119-122.”中公开；质粒pAlphaAmyCPOT已在文献“Engineering the protein secretory pathway of Saccharomyces cerevisiaeenables improved protein production.PNAS2018,115:E11025-E11032”中公开；质粒pROS10、pROS13已在文献“CRISPR/Cas9:a molecular Swiss army knife forsimultaneous introduction of multiple genetic modifications in Saccharomycescerevisiae.FEMS Yeast Research,2015,15,fov004”中公开，并可由EUROSCARF获取。
为更好地理解本发明的内容，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK背景菌株MSBP003[Comprehensive analysis of signal peptides in Saccharomycescerevisiae reveals features for efficient secretion.Advanced Science 10,2203433(2023)]为基础(可由EUROSCARF获取)，为具体实施例作进一步说明。
下列实施例中所涉及的培养基如下：
LB液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，溶剂为去离子水；固体培养基添加2％琼脂粉。
LB/AMP培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，溶剂为去离子水；固体培养基添加2％琼脂粉；以上灭菌后冷却至40℃左右，加入100μg/mL氨苄青霉素(过滤除菌)。
YPD培养基：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖(单独灭菌后再加入)，溶剂为去离子水；固体培养基添加2％琼脂粉。
YPD+G418固体培养基：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖(单独灭菌后再加入)，溶剂为去离子水；固体培养基添加2％琼脂粉；以上灭菌后冷却至40℃左右，加入200μg/mLG418(过滤除菌)。
SC-Ura营养缺陷培养基：0.77g/L CSM-Ura，1.7g/L YNB w/o AA&w/o(NH4)2SO4(Yeast Nitrogen Base without Amino acids and without Ammonium sulphate)，5.0g/L(NH4)2SO4，20g/L葡萄糖(注：葡萄糖分开灭菌)，调节pH值至5.5-6.0；固体培养基添加2％琼脂粉；溶剂为去离子水。
SD-2×SCAA(addUra)培养基：13.6g/L Na2HPO4·12H2O、11.1g/L NaH2PO4·2H2O、1.7g/L YNB(w/oAA,w/o ammonia sulfate)、5g/L(NH4)2SO4、40mg/LUra、190mg/L Arg、400mg/L Asp、1260mg/L Glu、130mg/L Gly、140mg/L His、290mg/L Ile、400mg/L Leu、440mg/L Lys、108mg/L Met、200mg/L Phe、220mg/L Thr、40mg/L Trp、52mg/L Tyr、380mg/LVal、20g/L葡萄糖(注：葡萄糖分开灭菌)，调节pH值至6.0。
下述实施例中所涉及的方法如下：
质粒构建：
(1)Gibson组装方法，具体操作依照NEB Gibson Assembly Cloning kit(货号E2611，NEB)说明书操作；
(2)将10μL组装体系转化至50μL大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，涂布至LB/AMP固体培养基过夜培养；
(3)筛选获得阳性克隆，扩增培养后提取质粒，具体提取过程依照HiPure PlasmidMicro Kit(货号P1001-03，Magen)说明书操作。
酵母菌株转化：
如无特殊说明，均采用醋酸锂转化法，具体操作见相关标准规范。
重组酿酒酵母菌株OD600nm的检测方法：
接种酿酒酵母单菌落于2mL发酵培养基，置于30℃、200rpm摇床培养。取发酵液按适当比例稀释后使用紫外分光光度计测量OD600nm。
下述实施例中所涉及的引物序列如表1所示：
表1：引物序列(5’-3’)
实施例1出发菌株R0的构建
通过醋酸锂转化法，将质粒pAlphaAmyCPOT转化至CEN.PK背景起始菌株MSBP003，涂布至YPD固体培养基于30℃培养3～4天，长出阳性转化子，得到酿酒酵母菌株AMP003，并命名为R0。
实施例2p426-HMO1质粒的构建
质粒p426-HMO1的结构如图1中的(A)所示，具体构建过程如下：
(1)使用引物对P426FraP1/P426FraP2，以p426GPD质粒为模板扩增质粒框架；PCR扩增包括常规的变性、退火以及延伸步骤；其中退火温度为56℃，于72℃延伸200s，扩增30个循环。
(2)使用引物对PHMO1P1/PHMO1P2，以出发菌株R0裂解后的基因组为模板扩增出带有同源臂的HMO1基因的CDS片段；PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸25s，扩增30个循环。
(3)利用Gibson组装技术，将以上两个片段拼接起来，转化至大肠杆菌DH5α，构建所得质粒命名为p426-HMO1。
实施例3敲除基因BIO5的工程菌株R1的构建
(1)使用引物对KBIO5P1/KBIO5P2，以质粒pROS13为模板扩增含BIO5位点同源臂的卡那霉素抗性基因表达框(kanMX)；PCR扩增包括常规的变性、退火以及延伸步骤；其中退火温度为56℃，于72℃延伸44s，扩增30个循环。
(2)通过醋酸锂转化法，将kanMX片段转化至出发菌株R0，涂布至YPD+G418固体培养基于30℃培养3～4天，使用引物对kanIP-up/KBIO5IP进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子(结果图2所示)，得到的酿酒酵母菌株命名为R1。
实施例4过表达基因HMO1的工程菌株R2的构建
(1)pROS10-X3的构建
以质粒pROS10为模板，由引物对PSNR52/PSNR53扩增得到带有筛选标记URA3的质粒框架，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸108s，扩增30个循环；以质粒pROS10为模板，由引物对PX3N20-up/PX3N20-down扩增得到带有20bp靶向到X3位点(gRNA序列)的片段，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸37s，扩增30个循环；利用Gibson组装技术，将以上两个片段拼接起来，转化至大肠杆菌DH5α，构建所得质粒命名为pROS10-X3(结构如图1中的(B)所示)。
(2)PCR扩增HMO1修复片段
使用引物X3-up-GPD/X3-down-CYC1，以p426-HMO1质粒为模板扩增带有X3位点同源臂的GPDp-HMO1-CYC1t基因片段，该片段作为修复片段；PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸52s，扩增30个循环。
(3)通过醋酸锂转化法，将pROS10-X3质粒和HMO1修复片段转化至菌株R0，涂布至SC-Ura固体培养基于30℃培养3～4天，使用引物对X3-up-IP/OEHMO1进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子(结果图3所示)，得到的酿酒酵母菌株命名为R2。
实施例5酿酒酵母工程菌R3的构建
将酿酒酵母工程菌株R2制备成感受态细胞，通过醋酸锂转化法，将kanMX片段转化至R2感受态细胞，涂布至YPD+G418固体培养基于30℃培养3～4天，使用引物对kanIP-up/KBIO5IP进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子(结果图4所示)，得到组合改造的酿酒酵母菌株，并命名为R3。
实施例6工程菌株在无外源添加压力下发酵测试
(1)分别将上述酿酒酵母菌株R0(对照)、R1、R2和R3从平板接种至2mL的SD-2×SCAA发酵培养基，在30℃、200rpm条件下培养96h。
(2)取发酵液稀释30倍后使用紫外分光光度计测量OD600nm。
(3)取1mL发酵液离心后取上清液稀释适当倍数后测定重组蛋白的产量。
根据图5所示的结果，不含Tm和DTT的培养基中发酵4d后，构建的R1、R2、R3菌株生长正常。此外，这些菌株的重组蛋白分泌量均有显著提升，分别为35％、59％、88％。
实施例7工程菌株的抗氧化胁迫测试
(1)分别将上述酿酒酵母菌株R0(对照)、R1、R2和R3从平板分别接种至2mL的SD-2×SCAA+0.2μg/mL Tm和SD-2×SCAA+3mMDTT培养基，在30℃、200rpm条件下培养96h。
(2)取发酵液稀释30倍后使用紫外分光光度计测量OD600nm。
(3)取1mL发酵液离心后取上清液稀释适当倍数后测重组蛋白的产量。
构建的R1、R2、R3菌株在SD-2×SCAA+0.2μg/mL Tm培养基中发酵4d后的结果如图6中的(A)所示，在SD-2×SCAA+3mMDTT培养基中发酵4d后的结果如图6中的(B)所示，可知敲除基因BIO5、过表达基因HMO1以及两者的叠加后都不影响菌株生长(体现在菌体密度上)。在Tm的氧化胁迫下，R3菌株的产重组蛋白的能力达到对照菌株的2倍。
实施例8工程菌株的抗氧化胁迫测试(更高剂量Tm/DTT)
(1)分别将上述酿酒酵母菌株R0(对照)以及R3从平板分别接种至2mL的SD-2×SCAA+0.4μg/mL Tm和SD-2×SCAA+5mMDTT培养基，在30℃、200rpm条件下培养96h。
(2)取发酵液稀释30倍后使用紫外分光光度计测量OD600nm。
(3)取1mL发酵液离心后取上清液稀释适当倍数后测重组蛋白的产量。
构建的R3菌株在SD-2×SCAA+0.4μg/mL Tm和SD-2×SCAA+5mMDTT培养基中发酵4d后的结果如图7所示，R3工程菌株生长更好，在DTT处理组下的优势更为明显，与对照菌株相比，细胞密度提高了2倍。在更高剂量的Tm的氧化胁迫下，R3菌株产蛋白能力达到对照菌株的2.14倍。
工程菌株R3具备显著增强的抗氧化胁迫能力以及显著提高的产重组蛋白能力，该抗逆菌株具有广阔的应用前景和借鉴意义。
本发明提供了抗氧化胁迫酿酒酵母基因工程菌及其构建方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株，其特征在于具有如下特点：基因BIO5被敲除，基因HMO1过表达。
2.根据权利要求1所述的抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述的酿酒酵母工程菌株的出发菌株为CEN.PK背景酿酒酵母。
3.根据权利要求2所述的抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述的出发菌株为将表达重组蛋白的质粒导入CEN.PK背景酿酒酵母，得到表达重组蛋白的酿酒酵母菌株。
4.根据权利要求3所述的抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株，其特征在于：
所述的重组蛋白为α-淀粉酶；
所述的CEN.PK背景为菌株MSBP003。
5.根据权利要求1所述的抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株，其特征在于：
所述的过表达为通过同源重组的方法进行染色体整合过表达基因；
所述的敲除为通过同源重组的方法或CRISPR/Cas9基因编辑技术进行无痕敲除。
6.权利要求1～5任一项所述的抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：敲除基因BIO5，过表达基因HMO1。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)以质粒pROS13作为模板，使用引物对KBIO5P1/KBIO5P2扩增含BIO5位点同源臂的卡那霉素抗性基因表达框，卡那霉素抗性基因表达框的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)获取酵母出发菌株的基因组DNA；
(3)以步骤(2)的基因组DNA为模板，使用引物对PHMO1P1/PHMO1P2扩增HMO1基因片段，HMO1的编码核酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(4)构建pROS10-X3敲除质粒，以质粒pROS10为模板，由引物对pROS10FraP1/pROS10FraP2扩增得到质粒框架；由引物对pROS10-N20-up/pROS10-N20-X3扩增得到含X3位点20bp靶向序列gRNA的基因片段；利用Gibson组装技术将质粒框架和基因片段连接得到pROS10-X3敲除质粒；
(5)以质粒p426GPD为模板，由引物对p426FraP1/p426FraP2扩增得到质粒框架，利用Gibson组装技术将质粒框架和步骤(3)得到的HMO1基因片段连接，得到p426-HMO1质粒；
(6)以p426-HMO1质粒为模板，用引物对X3-up-GPD/X3-down-CYC1扩增含有同源臂的GPDp-HMO1-CYC1t基因修复片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
(7)将步骤(4)得到pROS10-X3敲除质粒和步骤(6)得到的GPDp-HMO1-CYC1t基因修复片段转化至出发菌株，得到菌株R2；
(8)将步骤(1)得到的卡那霉素抗性基因表达框转化至菌株R2感受态细胞，得到抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株。
8.权利要求1～5任一项所述的抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株在氧化胁迫环境中的应用。
9.权利要求1～5任一项所述的抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株在重组蛋白生产中的应用。
10.一种测试权利要求1～5任一项所述的抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株的抗氧化胁迫性能的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将权利要求1～5任一项所述的抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株分别接种于不含Tm/DTT、含0.2μg/mL、0.4μg/mLTm浓度的发酵培养基，以及含有3mM、5mM浓度DTT的发酵培养基中培养，检测细胞生长情况；
2)将发酵后的菌液离心取上清，用于重组蛋白的含量测定；
3)通过对细胞生长情况和重组蛋白的分析，得到上述抗氧化胁迫酿酒酵母工程菌株的抗氧化胁迫性能。
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