CN118222425A - 一种提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌及其构建方法和应用。酵母基因工程菌是对酵母出发菌株进行以下一种以上的操作后得到：过表达SSB1基因、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除SUT067、敲除SUT433、敲除CUT782、强化Sis1p的表达、敲除DER1基因、强化ATPase Kar2p的表达、强化Pdi1p的表达。该酵母基因工程菌从提高细胞整体的转录与翻译能力出发，组合遗传操作显著提升了淀粉酶的产量，是对照菌株的9倍，在生物反应器中的产量达到4g/L。该酵母基因工程菌还可使其他重组蛋白的产率提高2倍以上，在提升具有高经济价值蛋白产量方面展现出强大的潜力，具备广阔的应用前景。

Description

一种提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌及其构建方法和 应用
技术领域
本发明属于基因工程及微生物技术领域，涉及一种提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以其遗传背景清晰、基因操作便捷，培养要求简单，以及兼具微生物与真核生物特性，广泛应用于重组蛋白的表达生产。然而，在表达重组蛋白过程中，酵母细胞需完成一系列复杂的胞内代谢加工步骤，涉及转录、翻译、胞质及内质网内新生肽链折叠、转运等环节。这些关键步骤均可能影响重组蛋白的表达生产，故需通过系统的代谢工程优化，以提高酿酒酵母分泌生产重组蛋白的能力，满足不断增长的重组蛋白市场需求。
通常，通过基因工程技术可提高酵母表达生产重组蛋白的水平，如利用高拷贝质粒增加重组蛋白编码基因的拷贝数，从而提升其转录水平。但此法可能因细胞内转录翻译能力和新生肽链折叠等能力的限制，增加细胞代谢负担。扩大内质网体积可以增加新生肽链折叠与修饰的空间，但可能导致细胞磷脂代谢紊乱和菌体生长能力的下降。改善细胞对重组蛋白的糖基化修饰能力，可提升蛋白稳定性，但过度修饰可能改变重组蛋白的特性，影响产量。过量表达蛋白折叠相关的分子伴侣，如Pdi1p可提高酵母中重组蛋白的表达量。但由于蛋白折叠需多个分子伴侣共同作用，有时此法未必能完全解除重组蛋白的分泌限制，导致提升幅度有限，有待进一步探索合适的基因改造靶点。综上所述，目前的方法及基因靶点仍需进一步完善和扩展。
发明内容
本发明旨在克服现有技术中酿酒酵母重组蛋白表达改造靶点数目有限的局限性，通过探索多个有效的长链非编码RNA(LincRNA)靶点及其与多基因靶点协同作用的策略，本发明显著提升了酿酒酵母的重组蛋白表达效率。围绕增强细胞的转录与翻译过程，本发明通过靶点协同适配改造，优化了酵母细胞内对新生多肽的折叠能力，克服了现有技术的缺陷，实现了酿酒酵母重组蛋白表达能力的显著提升。
本发明的首要目的在于提供一种提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌。
本发明的另一目的在于提供上述提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌的构建方法。
本发明的再一目的在于提供上述提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌，是对酵母出发菌株进行以下一种的操作后得到的酵母基因工程菌：
1)强化ATPase Ssb1p的表达；
2)敲除SEC72基因；
3)敲除RRP6基因；
4)敲除LincRNA SUT067；
5)敲除LincRNA SUT433；
6)敲除LincRNA CUT782；
7)强化HSP70 Sis1p的表达；
8)敲除DER1基因；
9)强化ATPase Kar2p的表达；
10)强化二硫键异构酶Pdi1p的表达；
优选为是以操作1)得到的酵母菌株为基础，再进行操作2)～10)中的至少一项操作得到的的酵母基因工程菌；更优选为按如下操作组合得到的酵母基因工程菌：
组合1：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因；
组合2：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因；
组合3：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除LincRNASUT067；
组合4：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除LincRNASUT433；
组合5：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除LincRNACUT782；
组合6：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除LincRNASUT067、强化HSP70 Sis1p的表达；
组合7：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除LincRNASUT433、强化HSP70 Sis1p的表达；
组合8：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除LincRNACUT782、强化HSP70 Sis1p的表达；
组合9：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除LincRNASUT433、强化HSP70 Sis1p的表达、敲除DER1基因；
组合10：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除LincRNASUT433、强化HSP70 Sis1p的表达、敲除DER1基因、强化ATPase Kar2p的表达；
组合11：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除LincRNASUT433、强化HSP70 Sis1p的表达、敲除DER1基因、强化ATPase Kar2p的表达、强化二硫键异构酶Pdi1p的表达。
所述的酵母出发菌株优选酿酒酵母CEN.PK背景菌株；更优选为CEN.PK 530-1D。
所述强化ATPase Ssb1p的表达优选为将基因SSB1的启动子替换为强启动子；更优选为将基因SSB1的启动子替换为强启动子GPDp。
所述强化HSP70 Sis1p的表达优选为将基因SIS1的启动子替换为强启动子；更优选为将基因SIS1的启动子替换为强启动子PGK1p。
所述强化ATPase Kar2p的表达优选为将基因KAR2的启动子替换为强启动子；更优选为将基因KAR2的启动子替换为强启动子GPDp。
所述的强化二硫键异构酶Pdi1p的表达优选为将基因PDI1的启动子替换为强启动子；更优选为将基因PDI1的启动子替换为强启动子TEF1p。
所述的敲除优选通过同源重组的方法或CRISPR/Cas9基因编辑技术进行无痕敲除。
所述的酵母基因工程菌还含有重组蛋白的表达质粒。
所述的重组蛋白优选为α-淀粉酶、脂肪酶和人血清白蛋白中的至少一种。
上述酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)将质粒pAlphaAmyCPOT转入酵母出发菌株后得到菌株L01；
(2)将核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的基因片段GPDp-SSB1-CYC1t整合至菌株L01基因组中的X-3中性位点后得到菌株L02；
(3)敲除菌株L02基因组中的SEC72基因后得到菌株L03；
(4)敲除菌株L03基因组中的RRP6基因后得到菌株L04；
(5)将步骤(4)所得酵母工程菌株L04进行以下的一种以上操作，得到所述的酵母基因工程菌：
S1、敲除菌株L04基因组中的LincRNA SUT067，得到菌株L05；
S2、敲除菌株L04基因组中的LincRNA SUT433，得到菌株L06；
S3、敲除菌株L04基因组中的LincRNA CUT782，得到菌株L07；
S4、将基因片段PGK1p-SIS1-CYC1t整合至菌株L05基因组中的SUT067基因座位置，得到菌株L08；
S5、将基因片段PGK1p-SIS1-CYC1t整合至菌株L06基因组中的SUT433基因座位置，得到菌株L09；
S6、将基因序列PGK1p-SIS1-CYC1t整合至菌株L07基因组中的CUT782基因座位置，得到菌株L10；
(6)敲除步骤(5)所得酵母工程菌株L09基因组中的DER1基因，得到菌株L11；
(7)将步骤(6)所得酵母工程菌株L11的KAR2基因的启动子替换为强启动子GPDp，得到菌株L12；
(8)将步骤(7)所得酵母工程菌株L12的PDI1基因的启动子替换为强启动子TEF1p，得到菌株L13。
上述酵母基因工程菌的构建方法，还包括以下步骤：
(9)将核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的基因片段GPDp-NCW2-amylase表达盒插入步骤(8)所得酵母工程菌株基因组中的XI-3位点，得到工程菌株L14；
(10)将质粒pAlphaAmyCPOT从工程菌株L14脱除，得到菌株Q13；
(11)将质粒pCP-Alipase和pCP-AHSA分别转入步骤(10)所得酵母工程菌株Q13，得到菌株Q13L和Q13A。
上述的酵母基因工程菌在表达重组蛋白中的应用；
所述的应用是将含有重组蛋白表达质粒的酵母基因工程菌接种到发酵培养基中进行发酵培养，之后收集发酵产物以获得所需的重组蛋白。
所述的发酵培养基优选为SD-2×SCAA+Ura发酵培养基。
所述的发酵培养的条件优选为20～40℃、100～300rpm条件下培养84～108h；更优选为30℃、200rpm条件下培养96h。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明构建了一种提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌，能显著提高多种重组蛋白的产量，如α-淀粉酶、脂肪酶、人血清白蛋白的产量分别提高了455％、200％、500％。与直接提高重组蛋白编码基因拷贝数等的传统方法不同，本发明的酵母基因工程菌通过针对提高细胞转录与翻译能力的靶点进行改良，结合非编码RNA和基因层面的组合遗传操作，揭示出能够提升蛋白分泌的新型非编码RNA靶点，显著增强了工程酵母菌株的异源蛋白分泌能力。该酵母基因工程菌在提升具有高经济价值蛋白产量方面展现出强大的潜力，具备广阔的应用前景。
附图说明
图1是质粒示意图；其中，(A)是用于蛋白表达的携带POT1筛选标记的CPOTud质粒，(B)是用于表达淀粉酶的质粒pAlphaAmyCPOT。
图2是实施例2制备的L01、L02、L03、L04酵母工程菌株在试管中发酵生产α-淀粉酶的数据图。
图3是实施例2中L01、L04、L05、L06、L07、L08、L09、L10酵母工程菌株在试管中发酵生产α-淀粉酶的数据图。
图4是实施例2中L01、L09、L11、L12、L13酵母工程菌株在试管中发酵生产α-淀粉酶的数据图。
图5是实施例2中L01和L14酵母工程菌株在试管中发酵生产α-淀粉酶的数据图。
图6是实施例2中L14酵母工程菌株在生物反应器中发酵生产α-淀粉酶及葡萄糖消耗量的数据图。
图7是实施例2中SDS-PAGE分析酵母工程菌株发酵液上清中的重组蛋白人血清白蛋白(A)和脂肪酶含量(B)的结果图。
图8是重组蛋白人血清白蛋白(A)和脂肪酶产量(B)的数据图；由软件ImageJ分析图7计算而得。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，则通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2017)、《酵母遗传学方法实验指南》(北京：科学出版社，2016)中所述的条件进行。
下述实施例中应用到的CRISPR技术参见现有技术(Nat.Commun.2019,10:1053)。
下列实施例中所使用的质粒p416GPD已在文献“Yeast vectors for thecontrolled expression of heterologous proteins in different geneticbackgrounds.Gene 1995,156:119-122.”中公开；psgtRNA、pScURA、pCas质粒或相应的DNA序列已在文献“A gRNA-tRNA array for CRISPR-Cas9 based rapid multiplexed genomeediting in Saccharomyces cerevisiae.Nat.Commun.2019,10:1053”中公开(详见该文献的附加材料)。质粒pAlphaAmyCPOT、pCP-AHSA、pSPGM1已在文献“Efficient proteinproduction by yeast requires global tuning of metabolism.Nat.Commun.2017,8,1131.”中公开(详见该文献的附加材料)。
为更好地理解本发明的内容，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK背景菌株CEN.PK 530-1D[已在文献“Efficient protein production by yeast requiresglobal tuning of metabolism.Nat.Commun.2017,8,1131”中公开，详见该文献额附加材料]为基础，为具体实施例作进一步说明。
下列实施例中所涉及的培养基如下：
LB液体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，溶剂为去离子水；固体培养基添加质量百分比2％琼脂粉。
LB/AMP培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，溶剂为去离子水；固体培养基添加质量百分比2％琼脂粉，以上灭菌后冷却至40℃左右，加入100μg/mL氨苄青霉素(过滤除菌)。
YPD培养基：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖(单独灭菌后再加入)，溶剂为去离子水；固体培养基添加质量百分比2％琼脂粉。
YPE培养基：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，0.5g/L葡萄糖，10ml无水乙醇/L(注：葡萄糖分开灭菌，无水乙醇过滤除菌)，溶剂为去离子水；固体培养基添加质量百分比2％琼脂粉。
SE-Ura营养缺陷培养基：0.77g/L CSM-Ura，1.7g/L YNB w/o aa and(NH4)2SO4(Yeast Nitrogen Base without Amino acids and Ammonium sulphate)，5.0g/L(NH4)2SO4，0.5g/L葡萄糖，10mL无水乙醇/L(注：葡萄糖分开灭菌，无水乙醇过滤除菌)，调节pH值至5.5-6.0，，溶剂为去离子水；固体培养基添加2％琼脂粉。
SD-Ura营养缺陷培养基：0.77g/L CSM-Ura，1.7g/L YNB w/o aa and(NH4)2SO4，5.0g/L(NH4)2SO4，20g/L葡萄糖(注：葡萄糖分开灭菌)，调节pH值至5.5-6.0，溶剂为去离子水；固体培养基添加质量百分比2％琼脂粉。
发酵培养基SD-2×SCAA+Ura：1.7g/L YNB(w/o AA,w/o ammonia sulfate)，5.0g/L(NH4)2SO4，13.6g/L Na2HPO4·12H2O，9.7g/L NaH2PO4·2H2O，调节pH值至6.0，高压蒸汽灭菌后，加入终浓度为20g/L葡萄糖，以及SCAA溶液(190mg/L Arg，108mg/L Met，52mg/LTyr，290mg/L Ile，440mg/L Lys，200mg/L Phe，1260mg/L Glu，400mg/L Asp，380mg/L Val，220mg/L Thr，130mg/L Gly，400mg/L Leu，40mg/L Trp，140mg/L His，40mg/L Ura)，1g/L牛血清白蛋白视需要加入；溶剂为去离子水。(注：葡萄糖分开灭菌，牛血清白蛋白、SCAA过滤除菌)。
低浓度葡萄糖补料培养基：200g/L葡萄糖，34.5g/L YNB(w/o AA,w/o ammoniasulfate)，25g/L(NH4)2SO4，50g/L酪蛋白氨基酸(casamino acids)，20g/L KH2PO4，50g/LUra；溶剂为去离子水。
高浓度葡萄糖补料培养基：600g/L葡萄糖，34.5g/L YNB(w/o AA,w/o ammoniasulfate)，25g/L(NH4)2SO4，50g/L casamino acids，20g/L KH2PO4，50g/L Ura；溶剂为去离子水。
下述实施例中所涉及的方法如下：
质粒构建：
(1)Gibson组装方法；具体操作依照NEB Gibson Assembly Cloning kit(货号E2611，NEB)说明书操作；
(2)将5μL Gibson组装体系转化至50μL大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，涂布至LB/AMP固体培养基过夜培养；
(3)筛选获得阳性克隆，扩增培养后提取质粒，具体提取过程依照HiPure PlasmidMicro Kit(货号P1001-03，Magen)说明书操作；
(4)Golden gate组装方法，具体操作依照Golden Gate组装试剂盒(货号E1602L，NEB)说明书操作；
(5)T4连接酶使用方法，具体按照Takara T4 DNA ligase试剂盒(货号2011B，Takara)说明书操作。
酵母菌株转化：
如无特殊说明，均采用醋酸锂转化法，具体操作见相关标准规范。
酵母菌株OD600nm的检测方法：
接种酿酒酵母单菌落于3mL发酵培养基(SD-2×SCAA+Ura)，置于30℃、200rpm摇床培养。取发酵液按适当比例稀释后使用紫外分光光度计测量OD600nm。
α-淀粉酶酶活的检测方法：
α-淀粉酶酶活采用Ceralpha kit(货号K-CERA，Megazyme)进行测定，依照其说明书操作。
SDS-PAGE凝胶电泳：
(1)样品制备：取发酵上清液与5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液按照4:1的体积比例混合，100℃煮沸10min；
(2)凝胶电泳：安装好预制胶(货号M00654，金斯瑞)，加入MOPS电泳缓冲液，上样10μL，打开电泳仪，设置电压150V，电泳时间30-50min。
(3)染色、脱色：采用考马斯亮蓝染色液染色1h后用考马斯亮蓝脱色液过夜脱色。考马斯亮蓝染色液染色和脱色液配制如下：
考马斯亮蓝染色液：称取0.1g考马斯亮蓝R-250，加入45mL甲醇、45mL水和10mL冰乙酸，充分混匀后避光保存；
考马斯亮蓝脱色液：分别量取100mL甲醇、100mL冰乙酸和800mL超纯水，混合均匀后室温保存备用。
(4)凝胶成像仪成像。
下述实施例中所涉及的引物序列如表1所示：
表1：引物序列
实施例1高产重组蛋白的酵母基因工程菌的构建
本实施例酵母基因工程菌的出发菌株为酿酒酵母CEN.PK 530-1D(基因型：MATaHIS3LEU2 TRP1 SUC2 MAL2-8c ura3-52 tpi1(41-707)::loxP-KanMX4-loxP)。
1.1将质粒pAlphaAmyCPOT转入酵母细胞以表达淀粉酶
α-淀粉酶作为一种模式蛋白，常被用在酿酒酵母中重组表达以研究菌株的蛋白分泌能力。在本发明中，亦首先采用α-淀粉酶作为研究对象。
将酵母菌株CEN.PK 530-1D制备成感受态细胞，并通过醋酸锂转化法将α-淀粉酶表达质粒pAlphaAmyCPOT转化至该感受态细胞，涂布至YPD固体培养基上于30℃培养3-4天，使用引物amy-p-F、amy-p-R进行单菌落PCR验证，筛选得到菌株CEN.PK 530-1D/AlphaAmyCPOT，将其命名为酿酒酵母L01。
1.2X-3中性位点插入SSB1基因表达盒，强化表达SSB1
SSB1敲入过程如下：
(1)构建质粒p416-SSB1
首先使用限制性内切酶EcoRI、HindIII对质粒p416GPD进行双酶切，得到酶切框架p416K(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。采用引物SSB1-OE-F、SSB1-OE-R以CEN.PK 530-1D基因组为模板进行PCR扩增，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸120s，扩增35个循环，扩增得到带有与p416K两端同源的25bp同源臂序列片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)；
利用Gibson组装技术，将以上带有与p416K两端同源的25bp同源臂序列片段与酶切框架p416K拼接起来，构建所得质粒命名为p416-SSB1。
(2)构建质粒pCas9-X3
X3中性位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
以质粒psgtRNA为模板，由引物对Primer-1F/Primer-1R扩增得到带有20bp靶向X3位点的gRNA序列，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
以质粒pScURA为模板，由引物对Primer-2F/Primer-2R扩增得到1127bp带有筛选标记URA3的质粒框架片段；PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸30s，扩增30个循环。
利用Golden gate组装技术，将以上两种片段与pCas质粒拼接起来，构建所得质粒命名为pCas9-X3。
(3)PCR扩增SSB1表达盒
以p416-SSB1质粒为模板，采用引物Primer-3F/Primer-3R扩增得到包含X3中性位点上下游各50bp同源的片段的过表达SSB1基因表达盒GPDp-SSB1-CYC1t(核苷酸序列如SEQID NO.4所示)，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸120s，扩增30个循环。
(4)将酵母菌株L01制备成感受态，通过醋酸锂转化法，将质粒pCas9-X3和过表达SSB1基因表达盒同时转化至L01感受态细胞，涂布至SD-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物Primer-4F/Primer-4R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子。
(5)将该阳性菌株接种到3mL YPD液体培养基中于30℃培养3-4天，划线至YPD固体培养基中于30℃培养3-4天，将长出的单菌落分别在SD-Ura、YPD固体培养基上点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为已脱除质粒pCas9-X3的酵母菌株。将其命名为酿酒酵母L02。
1.3敲除SEC72基因
SEC72的敲除过程如下：
(1)构建质粒pCas9-SEC72
SEC72的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
以质粒psgtRNA为模板，由引物对Primer-5F/Primer-1R扩增得到带有20bp靶向SEC72基因编码区的gRNA序列，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
以质粒pScURA为模板，由引物对Primer-2F/Primer-2R扩增得到1127bp带有筛选标记URA3的质粒框架片段；PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸30s，扩增30个循环。
利用Golden gate组装技术，将以上两种片段与pCas质粒拼接起来，构建所得质粒命名为pCas9-SEC72。
(2)PCR扩增SEC72修复片段
以CEN.PK 530-1D基因组为模板，采用引物Primer-6F/Primer-6R经PCR扩增、凝胶回收获得与SEC72基因上下游有50bp同源臂的SEC72靶向修复片段，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
(3)将酵母菌株L02制备成感受态，通过醋酸锂转化法，将质粒pCas9-SEC72和SEC72靶向修复片段同时转化至L02感受态细胞，涂布至SD-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物Primer-7F/Primer-7R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子。
(4)将该阳性菌株接种到3mL YPD液体培养基中于30℃培养3-4天，划线至YPD固体培养基中于30℃培养3-4天，将长出的单菌落分别在SD-Ura、YPD固体培养基上点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为已脱除质粒pCas9-SEC72的酵母菌株。将其命名为酿酒酵母L03。
1.4敲除RRP6基因
RRP6的敲除过程如下：
(1)构建质粒pCas9-RRP6
RRP6的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
以质粒psgtRNA为模板，由引物对Primer-8F/Primer-1R扩增得到带有20bp靶向RRP6基因编码区的gRNA序列，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
以质粒pScURA为模板，由引物对Primer-2F/Primer-2R扩增得到1127bp带有筛选标记URA3的质粒框架片段；PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸30s，扩增30个循环。
利用Golden gate组装技术，将以上两种片段与pCas质粒拼接起来，构建所得质粒命名为pCas9-RRP6。
(2)PCR扩增RRP6修复片段
以CEN.PK 530-1D基因组为模板，采用引物Primer-9F/Primer-9R经PCR扩增、凝胶回收获得与RRP6基因上下游有50bp同源臂的RRP6靶向修复片段，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
(3)将酵母菌株L03制备成感受态，通过醋酸锂转化法，将质粒pCas9-RRP6和RRP6靶向修复片段同时转化至L03感受态细胞，涂布至SD-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物Primer-10F/Primer-10R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子。
(4)将该阳性菌株接种到3mL YPD液体培养基中于30℃培养3-4天，划线至YPD固体培养基中于30℃培养3-4天，将长出的单菌落分别在SD-Ura、YPD固体培养基上点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为已脱除质粒pCas9-RRP6的酵母菌株。将其命名为酿酒酵母L04。
1.5非编码RNA SUT067敲除过程如下：
(1)构建质粒pCas9-SUT067
非编码RNA SUT067的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
以质粒psgtRNA为模板，由引物对Primer-11F/Primer-1R扩增得到带有20bp靶向SUT067的gRNA序列，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
以质粒pScURA为模板，由引物对Primer-2F/Primer-2R扩增得到1127bp带有筛选标记URA3的质粒框架片段；PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸30s，扩增30个循环。
利用Golden gate组装技术，将以上两种片段与pCas质粒拼接起来，构建所得质粒命名为pCas9-SUT067。
(2)PCR扩增SUT067修复片段
以CEN.PK 530-1D基因组为模板，采用引物Primer-12F/Primer-12R经PCR扩增、凝胶回收获得与非编码RNA SUT067上下游有50bp同源臂的SUT067靶向修复片段，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
(3)将酵母菌株L04制备成感受态，通过醋酸锂转化法，将质粒pCas9-SUT067和SUT067靶向修复片段同时转化至L04感受态细胞，涂布至SD-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物Primer-13F/Primer-13R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子。
(4)将该阳性菌株接种到3mL YPD液体培养基中于30℃培养3-4天，划线至YPD固体培养基中于30℃培养3-4天，将长出的单菌落分别在SD-Ura、YPD固体培养基上点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为已脱除质粒pCas9-SUT067的酵母菌株。将其命名为酿酒酵母L05。
1.6非编码RNA SUT433敲除过程如下：
(1)构建质粒pCas9-SUT433
非编码RNA SUT433的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
以质粒psgtRNA为模板，由引物对Primer-14F/Primer-1R扩增得到带有20bp靶向SUT433的gRNA序列，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
以质粒pScURA为模板，由引物对Primer-2F/Primer-2R扩增得到1127bp带有筛选标记URA3的质粒框架片段；PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸30s，扩增30个循环。
利用Golden gate组装技术，将以上两种片段与pCas质粒拼接起来，构建所得质粒命名为pCas9-SUT433。
(2)PCR扩增SUT433修复片段
以CEN.PK 530-1D基因组为模板，采用引物Primer-15F/Primer-15R经PCR扩增、凝胶回收获得与非编码RNA SUT433上下游有50bp同源臂的SUT433靶向修复片段，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
(3)将酵母菌株L04制备成感受态，通过醋酸锂转化法，将质粒pCas9-SUT433和SUT433靶向修复片段同时转化至L04感受态细胞，涂布至SD-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物Primer-16F/Primer-16R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子。
(4)将该阳性菌株接种到3mL YPD液体培养基中于30℃培养3-4天，划线至YPD固体培养基中于30℃培养3-4天，将长出的单菌落分别在SD-Ura、YPD固体培养基上点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为已脱除质粒pCas9-SUT433的酵母菌株。将其命名为酿酒酵母L06。
1.7非编码RNA CUT782敲除过程如下：
(1)构建质粒pCas9-CUT782
非编码RNA CUTC782的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
以质粒psgtRNA为模板，由引物对Primer-17F/Primer-1R扩增得到带有20bp靶向CUT782的gRNA序列，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
以质粒pScURA为模板，由引物对Primer-2F/Primer-2R扩增得到1127bp带有筛选标记URA3的质粒框架片段；PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸30s，扩增30个循环。
利用Golden gate组装技术，将以上两种片段与pCas质粒拼接起来，构建所得质粒命名为pCas9-CUT782。
(2)PCR扩增CUT782修复片段
以CEN.PK 530-1D基因组为模板，采用引物Primer-18F/Primer-18R经PCR扩增、凝胶回收获得与非编码RNA CUT782上下游有50bp同源臂的CUT782靶向修复片段，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
(3)将酵母菌株L04制备成感受态，通过醋酸锂转化法，将质粒pCas9-CUT782和CUT782靶向修复片段同时转化至L04感受态细胞，涂布至SD-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物Primer-40F/Primer-40R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子。
(4)将该阳性菌株接种到3mL YPD液体培养基中于30℃培养3-4天，划线至YPD固体培养基中于30℃培养3-4天，将长出的单菌落分别在SD-Ura、YPD固体培养基上点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为已脱除质粒pCas9-CUT782的酵母菌株。将其命名为酿酒酵母L07。
1.8敲除非编码RNA SUT067的同时，插入SIS1基因表达盒，强化表达SIS1
SIS1敲入过程如下：
(1)构建质粒pSP-SIS1
首先使用限制性内切酶BamHI、KpnI对质粒pSP-GM1进行双酶切，得到酶切框架pSP(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)。采用引物SIS1-OE-F、SIS1-OE-R以CEN.PK 530-1D基因组为模板进行PCR扩增，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸120s，扩增35个循环，扩增得到带有与pSP两端同源的20bp左右同源臂序列片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)。
利用Gibson组装技术，将以上片段与酶切框架pSP拼接起来，构建所得质粒命名为pSP-SIS1。
(2)PCR扩增SIS1表达盒
以pSP-SIS1质粒为模板，采用引物Primer-19F/Primer-19R经PCR扩增、凝胶回收获得与非编码RNA SUT067上下游有50bp同源臂的过表达SIS1基因表达盒(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸120s，扩增30个循环。
(3)将酵母菌株L04制备成感受态，通过醋酸锂转化法，将质粒pCas9-SUT067和过表达SIS1基因表达盒同时转化至L04感受态细胞，涂布至SD-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物Primer-13F/Primer-13R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子。
(4)将该阳性菌株接种到3mL YPD液体培养基中于30℃培养3-4天，划线至YPD固体培养基中于30℃培养3-4天，将长出的单菌落分别在SD-Ura、YPD固体培养基上点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为已脱除质粒pCas9-SUT067的酵母菌株。将其命名为酿酒酵母L08。
1.9敲除非编码RNA SUT433的同时，插入SIS1基因表达盒，强化表达SIS1
SIS1敲入过程如下：
(1)PCR扩增SIS1表达盒
以pSP-SIS1质粒为模板，采用引物Primer-20F/Primer-20R经PCR扩增、凝胶回收获得与非编码RNA SUT433上下游有50bp同源臂的过表达SIS1基因表达盒(核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸120s，扩增30个循环。
(2)将酵母菌株L04制备成感受态，通过醋酸锂转化法，将质粒pCas9-SUT433和过表达SIS1基因表达盒同时转化至L04感受态细胞，涂布至SD-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物Primer-16F/Primer-16R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子。
(3)将该阳性菌株接种到3mL YPD液体培养基中于30℃培养3-4天，划线至YPD固体培养基中于30℃培养3-4天，将长出的单菌落分别在SD-Ura、YPD固体培养基上点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为已脱除质粒pCas9-SUT433的酵母菌株。将其命名为酿酒酵母L09。
1.10敲除非编码RNA CUT782的同时，插入SIS1基因表达盒，强化表达SIS1
SIS1敲入过程如下：
(1)PCR扩增SIS1表达盒
以pSP-SIS1质粒为模板，采用引物Primer-21F/Primer-21R经PCR扩增、凝胶回收获得与非编码RNA CUT782上下游有50bp同源臂的过表达SIS1基因表达盒(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸120s，扩增30个循环。
(2)将酵母菌株L04制备成感受态，通过醋酸锂转化法，将质粒pCas9-CUTC782和过表达SIS1基因表达盒同时转化至L04感受态细胞，涂布至SD-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物Primer-40F/Primer-40R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子。
(3)将该阳性菌株接种到3mL YPD液体培养基中于30℃培养3-4天，划线至YPD固体培养基中于30℃培养3-4天，将长出的单菌落分别在SD-Ura、YPD固体培养基上点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为已脱除质粒pCas9-CUT782的酵母菌株。将其命名为酿酒酵母L10。
1.11敲除DER1基因
DER1的敲除过程如下：
(1)构建质粒pCas9-DER1
DER1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
以质粒psgtRNA为模板，由引物对Primer-22F/Primer-1R扩增得到带有20bp靶向DER1基因编码区的gRNA序列，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
以质粒pScURA为模板，由引物对Primer-2F/Primer-2R扩增得到1127bp带有筛选标记URA3的质粒框架片段；PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸30s，扩增30个循环。
利用Golden gate组装技术，将以上两种片段与pCas质粒拼接起来，构建所得质粒命名为pCas9-DER1。
(2)PCR扩增DER1修复片段
以CEN.PK 530-1D基因组为模板，采用引物Primer-23F/Primer-23R经PCR扩增、凝胶回收获得与DER1基因上下游有50bp同源臂的DER1靶向修复片段，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
(3)将酵母菌株L09制备成感受态，通过醋酸锂转化法，将质粒pCas9-DER1和DER1靶向修复片段同时转化至L09感受态细胞，涂布至SD-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物Primer-24F/Primer-24R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子。
(4)将该阳性菌株接种到3mL YPD液体培养基中于30℃培养3-4天，划线至YPD固体培养基中于30℃培养3-4天，将长出的单菌落分别在SD-Ura、YPD固体培养基上点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为已脱除质粒pCas9-DER1的酵母菌株。将其命名为酿酒酵母L11。
1.12过表达KAR2
过表达KAR2过程如下：
(1)构建质粒pCas9-KAR2
KAR2基因的启动子区核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
以质粒psgtRNA为模板，由引物对Primer-25F/Primer-1R扩增得到带有20bp靶向KAR2基因启动子区的gRNA序列，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
以质粒pScURA为模板，由引物对Primer-2F/Primer-2R扩增得到1127bp带有筛选标记URA3的质粒框架片段；PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸30s，扩增30个循环。
利用Golden gate组装技术，将以上两种片段与pCas质粒拼接起来，构建所得质粒命名为pCas9-KAR2。
(2)PCR扩增KAR2启动子替换片段
以p416GPD质粒为模板，采用引物Primer-26F/Primer-26R扩增得到启动子GPDp启动子替换片段，该片段含有KAR2启动子上下游各50bp的同源臂片段(核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示)。
(3)将酵母菌株L11制备成感受态，通过醋酸锂转化法，将质粒pCas9-KAR2和GPDp启动子替换片段同时转化至L11感受态细胞，涂布至SD-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物Primer-27F/Primer-27R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子。
(4)将该阳性菌株接种到3mL YPD液体培养基中于30℃培养3-4天，划线至YPD固体培养基中于30℃培养3-4天，将长出的单菌落分别在SD-Ura、YPD固体培养基上点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为已脱除质粒pCas9-KAR2的酵母菌株。将其命名为酿酒酵母L12。
1.13过表达PDI1
过表达PDI1过程如下：
(1)构建质粒pCas9-PDI1
PDI1基因的启动子区核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
以质粒psgtRNA为模板，由引物对Primer-28F/Primer-1R扩增得到带有20bp靶向PDI1基因启动子区的gRNA序列，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
以质粒pScURA为模板，由引物对Primer-2F/Primer-2R扩增得到1127bp带有筛选标记URA3的质粒框架片段；PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸30s，扩增30个循环。
利用Golden gate组装技术，将以上两种片段与pCas质粒拼接起来，构建所得质粒命名为pCas9-PDI1。
(2)PCR扩增PDI1启动子替换片段
以pSP-GM1质粒为模板，采用引物Primer-29F/Primer-29R扩增得到TEF1p启动子替换片段用于替换PDI1原生的启动子，该片段含有PDI1启动子上下游各50bp的同源臂片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)。
(3)将酵母菌株L12制备成感受态，通过醋酸锂转化法，将质粒pCas9-PDI1和TEF1p启动子替换片段同时转化至L12感受态细胞，涂布至SD-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物Primer-30F/Primer-30R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子。
(4)将该阳性菌株接种到3mL YPD液体培养基中于30℃培养3-4天，划线至YPD固体培养基中于30℃培养3-4天，将长出的单菌落分别在SD-Ura、YPD固体培养基上点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为已脱除质粒pCas9-PDI1的酵母菌株。将其命名为酿酒酵母L13。
1.14XI-3中性位点插入GPDp-NCW2-amylase基因表达盒，强化表达淀粉酶
过表达淀粉酶过程如下：
(1)构建质粒pCas9-XI-3
XI-3中性位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
以质粒psgtRNA为模板，由引物对Primer-31F/Primer-1R扩增得到带有20bp靶向PDI1基因启动子区的gRNA序列，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增30个循环。
以质粒pScURA为模板，由引物对Primer-2F/Primer-2R扩增得到1127bp带有筛选标记URA3的质粒框架片段；PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸30s，扩增30个循环。
利用Golden gate组装技术，将以上两种片段与pCas质粒拼接起来，构建所得质粒命名为pCas9-XI-3。
(2)构建CPOTud-NCW2-amylase质粒
采用引物Primer-32F/Primer-32R对以CEN.PK 530-1D基因组为模板进行PCR扩增，合成带有Kozac序列及NCW2信号肽的片段1，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸20s，扩增35个循环；
采用引物Primer-33F/Primer-33R以质粒pAlphaAmyCPOT为模板进行PCR扩增，得到amylase片段2，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸300s，扩增35个循环；
采用引物Primer-36F/Primer-36R对以CEN.PK 530-1D基因组为模板进行PCR扩增，合成带有启动子GPDp序列片段3，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸60s，扩增35个循环；
利用Gibson组装技术，将以上片段1、片段3与从质粒pAlphaAmyCPOT扩增得到的amylase片段2拼接起来，构建所得质粒命名为CPOTud-NCW2-amylase。
(3)PCR扩增GPDp-NCW2-amylase表达盒
以CPOTud-NCW2-amylase质粒为模板，采用引物Primer-34F/Primer-34R扩增得到包含XI-3中性位点上下游各50bp同源的片段的GPDp-NCW2-amylase表达盒修复片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示)，PCR扩增的退火温度为56℃，于72℃延伸120s，扩增30个循环。
(4)将酵母菌株L13制备成感受态，通过醋酸锂转化法，将质粒pCas9-XI-3和GPDp-NCW2-amylase表达盒修复片段同时转化至L13感受态细胞，涂布至SD-Ura固体培养基于30℃培养3-4天，使用引物Primer-35F/Primer-35R进行单菌落PCR验证，筛选得到阳性转化子。
(4)将该阳性菌株接种到3mL YPD液体培养基中于30℃培养3-4天，划线至YPD固体培养基中于30℃培养3-4天，将长出的单菌落分别在SD-Ura、YPD固体培养基上点板验证，仅在YPD培养基上生长的单菌落为已脱去质粒pCas9-XI-3的酵母菌株。将其命名为酿酒酵母L14。
实施例2工程菌株发酵生产重组蛋白α-淀粉酶
2.1工程菌株试管发酵高产α-淀粉酶
(1)分别将上述酿酒酵母菌株L01、L02、L03、L04、L05、L06、L07、L08、L09、L10、L11、L12、L13、L14从平板接种至3mL SD-2×SCAA+Ura发酵培养基，在30℃、200rpm条件下培养96h，制备得到发酵液。其中根据不同发酵批次设置相应的对照菌作为参照。
(2)取发酵液稀释50倍后使用紫外分光光度计测量OD600nm。
(3)取发酵液离心后取上清液用于测定工程菌株分泌生产的α-淀粉酶含量。
(4)由图2可知，L02菌株通过过表达SSB1基因，其α-淀粉酶产量比L01菌株更高。在L02菌株敲除SEC72基因，构建出的L03菌株的α-淀粉酶产量进一步提高。L04菌株为L03菌株敲除RRP6基因后构建得到，L04菌株的α-淀粉酶产量高于L03菌株。由图3可知，在L04菌株基础上，分别敲除SUT067、SUT433、CUT782后，构建的L05、L06、L07菌株的α-淀粉酶产量均高于L04菌株；而基于L04菌株构建的L08、L09、L10菌株亦实现了α-淀粉酶产量的提升。由图4可知，在L09菌株中敲除DER1基因，得到的L11菌株α-淀粉酶产量高于L10菌株。在L11菌株中过表达KAR2基因后，构建的L12菌株α-淀粉酶产量进一步提升。L13菌株在L12菌株的基础上过表达PDI1基因，其α-淀粉酶产量相比L12菌株显著提升，与L01菌株相比，α-淀粉酶产量提升约4.5倍。如图5所示，提高淀粉酶的表达水平可显著增加L14菌株中的重组蛋白α-淀粉酶产量，达到L01菌株的约9倍。
2.2生物反应器补料发酵连续取样测定酵母工程菌株α-淀粉酶的产量
(1)将酿酒酵母菌株L14从平板接种至20mL YPD培养基中，在30℃、200rpm的条件下过夜培养以制备种子液。随后将种子液接种于装有280mL的SD-2×SCAA+Ura培养基的1L生物反应器中，初始发酵液接种浓度为OD600nm＝0.01。在30℃和溶氧量大于26％的条件下进行培养，起始转速为600rpm，若溶氧低于26％，则提高转速直至1200rpm。培养约33h后，使用低浓度葡萄糖补料培养基进行补料；培养约58h后，使用高浓度葡萄糖补料培养基进行补料直至发酵结束。
(2)当转速达到1200rpm且溶氧低于26％时，停止补料。溶氧回升后，继续补料。
(3)使用4M KOH和2M HCl自动调节生物反应器中的培养基pH值，确保发酵过程pH维持在6左右。
(4)定时进行发酵液取样，稀释后，使用紫外分光光度计测量OD600nm。
(5)定时进行发酵液取样，离心后取上清测定α-淀粉酶产量。
(6)由图6可知，工程菌株L14在生物反应器发酵96小时后，α-淀粉酶产量可达4g/L。
实施例3工程菌株发酵高产其它重组蛋白
(1)脱除质粒pAlphaAmyCPOT
将菌株L13接种于3mL YPE液体培养基，于30℃下培养3-4天，再将其划线至YPE固体培养基并继续于30℃培养3-4天。通过在YPE和YPD固体培养基上点板验证，筛选出在YPE中正常生长，而在YPD中生长较差(整体菌落小或几乎不长)的单菌落，这些菌落即为已脱除质粒pAlphaAmyCPOT的菌株。将其命名为酿酒酵母Q13。
(2)构建pCP-Alipase质粒
基因合成带有Kozak序列(AACAAA)及α-factor信号肽的脂肪酶片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示)，使用KpnI及NheI在37℃双酶切带有Kozak序列及α-factor信号肽的脂肪酶片段30min，得到片段1；使用KpnI及NheI在37℃双酶切pAlphaAmyCPOT质粒，得到框架2；
将酶切后的片段1及框架2经纯化后，在22℃使用T4连接酶连接30min后进行转化，构建所得质粒命名为pCP-Alipase。
(3)通过醋酸锂转化法，将质粒pCP-Alipase(表达脂肪酶)、pCP-AHSA(表达人血清白蛋白)分别转化至菌株CEN.PK 530-1D、Q13，并涂布至YPD培养基于30℃培养3-4天，所得菌株分别命名为Q0L、Q13L及Q0A、Q13A。
(4)分别将上述酿酒酵母菌株Q0L、Q13L及Q0A、Q13A从平板接种至3mL SD-2×SCAA+Ura发酵培养基，在30℃、200rpm的条件下培养96h，制备得到发酵液。
(5)取发酵液稀释50倍后使用紫外分光光度计测量OD600nm。
(6)将发酵液离心后取上清液，进行SDS-PAGE分析。由结果可知(图7、图8)，相比于对照，人血清白蛋白和脂肪酶两种重组蛋白的产量分别提高约500％和200％。说明本发明构建得到的酵母工程菌株在高效表达重组蛋白方面有较好的普适性，具备广阔的产业化应用前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌，其特征在于：所述提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌是对酵母出发菌株进行以下一种的操作后得到的酵母基因工程菌：
1)强化ATPase Ssb1p的表达；
2)敲除SEC72基因；
3)敲除RRP6基因；
4)敲除LincRNA SUT067；
5)敲除LincRNA SUT433；
6)敲除LincRNA CUT782；
7)强化HSP70 Sis1p的表达；
8)敲除DER1基因；
9)强化ATPase Kar2p的表达；
10)强化二硫键异构酶Pdi1p的表达。
2.根据权利要求1所述的提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌，其特征在于：所述提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌是以操作1)得到的酵母菌株为基础，再进行操作2)～10)中的至少一项操作得到的的酵母基因工程菌。
3.根据权利要求2所述的提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌，其特征在于：所述提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌是按如下操作组合得到的酵母基因工程菌：
组合1：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因；
组合2：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因；
组合3：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除LincRNASUT067；
组合4：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除LincRNASUT433；
组合5：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除LincRNACUT782；
组合6：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除LincRNASUT067、强化HSP70 Sis1p的表达；
组合7：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除LincRNASUT433、强化HSP70 Sis1p的表达；
组合8：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除LincRNACUT782、强化HSP70 Sis1p的表达；
组合9：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除LincRNASUT433、强化HSP70 Sis1p的表达、敲除DER1基因；
组合10：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除LincRNASUT433、强化HSP70 Sis1p的表达、敲除DER1基因、强化ATPase Kar2p的表达；
组合11：强化ATPase Ssb1p的表达、敲除SEC72基因、敲除RRP6基因、敲除LincRNASUT433、强化HSP70 Sis1p的表达、敲除DER1基因、强化ATPase Kar2p的表达、强化二硫键异构酶Pdi1p的表达。
4.根据权利要求1～3任一项所述的提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌，其特征在于：所述的酵母基因工程菌还含有重组蛋白的表达质粒。
5.根据权利要求4所述的提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌，其特征在于：所述的重组蛋白为α-淀粉酶、脂肪酶和人血清白蛋白中的至少一种。
6.根据权利要求1～3和5任一项所述的提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌，其特征在于：
所述的酵母出发菌株为酿酒酵母CEN.PK背景菌株；
所述强化ATPase Ssb1p的表达为将基因SSB1的启动子替换为强启动子；
所述强化HSP70 Sis1p的表达为将基因SIS1的启动子替换为强启动子；
所述强化ATPase Kar2p的表达为将基因KAR2的启动子替换为强启动子；
所述的强化二硫键异构酶Pdi1p的表达为将基因PDI1的启动子替换为强启动子；
所述的敲除通过同源重组的方法或CRISPR/Cas9基因编辑技术进行无痕敲除。
7.根据权利要求6所述的提高重组蛋白产量的酵母基因工程菌，其特征在于：
所述强化ATPase Ssb1p的表达为将基因SSB1的启动子替换为强启动子GPDp；
所述强化HSP70 Sis1p的表达为将基因SIS1的启动子替换为强启动子PGK1p；
所述强化ATPase Kar2p的表达为将基因KAR2的启动子替换为强启动子GPDp；
所述的强化二硫键异构酶Pdi1p的表达为将基因PDI1的启动子替换为强启动子TEF1p。
8.权利要求3所述提高重组蛋白产量的的酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将质粒pAlphaAmyCPOT转入酵母出发菌株后得到菌株L01；
(2)将核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的基因片段GPDp-SSB1-CYC1t整合至菌株L01基因组中的X-3中性位点后得到菌株L02；
(3)敲除菌株L02基因组中的SEC72基因后得到菌株L03；
(4)敲除菌株L03基因组中的RRP6基因后得到菌株L04；
(5)将步骤(4)所得酵母工程菌株L04进行以下的一种以上操作，得到所述的酵母基因工程菌：
S1、敲除菌株L04基因组中的LincRNA SUT067，得到菌株L05；
S2、敲除菌株L04基因组中的LincRNA SUT433，得到菌株L06；
S3、敲除菌株L04基因组中的LincRNA CUT782，得到菌株L07；
S4、将基因片段PGK1p-SIS1-CYC1t整合至菌株L05基因组中的SUT067基因座位置，得到菌株L08；
S5、将基因片段PGK1p-SIS1-CYC1t整合至菌株L06基因组中的SUT433基因座位置，得到菌株L09；
S6、将基因序列PGK1p-SIS1-CYC1t整合至菌株L07基因组中的CUT782基因座位置，得到菌株L10；
(6)敲除步骤(5)所得酵母工程菌株L09基因组中的DER1基因，得到菌株L11；
(7)将步骤(6)所得酵母工程菌株L11的KAR2基因的启动子替换为强启动子GPDp，得到菌株L12；
(8)将步骤(7)所得酵母工程菌株L12的PDI1基因的启动子替换为强启动子TEF1p，得到菌株L13。
9.根据权利要求8所述提高重组蛋白产量的的酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于还包括以下步骤：
(9)将核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的基因片段GPDp-NCW2-amylase表达盒插入步骤(8)所得酵母工程菌株基因组中的XI-3位点，得到工程菌株L14；
(10)将质粒pAlphaAmyCPOT从工程菌株L14脱除，得到菌株Q13；
(11)将质粒pCP-Alipase和pCP-AHSA分别转入步骤(10)所得酵母工程菌株Q13，得到菌株Q13L和Q13A。
10.权利要求1～7任一项所述的酵母基因工程菌在表达重组蛋白中的应用。
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