CN101473035B - 在酵母表达系统中增强重组外源蛋白的分泌效率的方法 - Google Patents
在酵母表达系统中增强重组外源蛋白的分泌效率的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101473035B CN101473035B CN2006800550471A CN200680055047A CN101473035B CN 101473035 B CN101473035 B CN 101473035B CN 2006800550471 A CN2006800550471 A CN 2006800550471A CN 200680055047 A CN200680055047 A CN 200680055047A CN 101473035 B CN101473035 B CN 101473035B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- semi
- lactosi
- yeast
- protein
- inducible promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 201
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 153
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title abstract description 64
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title abstract description 50
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 title 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 title 1
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 title 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 188
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 17
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 67
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 67
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 49
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 claims description 45
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 claims description 42
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 41
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 20
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 claims description 19
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 11
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 claims description 7
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 5
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 claims description 3
- CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N Senegenin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@](C)(C(O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)C(CC[C@]4(CCC(C[C@H]44)(C)C)C(O)=O)=C4[C@@H](CCl)C[C@@H]3[C@]21C CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N 0.000 claims description 3
- 239000009871 tenuigenin Substances 0.000 claims description 3
- 102100039555 Galectin-7 Human genes 0.000 claims description 2
- 101000608772 Homo sapiens Galectin-7 Proteins 0.000 claims description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 abstract description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 abstract 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 abstract 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 144
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 29
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 16
- 108010001496 Galectin 2 Proteins 0.000 description 14
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 13
- 102100021735 Galectin-2 Human genes 0.000 description 10
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 10
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 9
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 9
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 8
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101100243108 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PDI1 gene Proteins 0.000 description 7
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 7
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 7
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 7
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 7
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 6
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 6
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 6
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 6
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 101150037782 GAL2 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Substances CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 4
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000010189 intracellular transport Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 4
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 3
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 3
- 238000012366 Fed-batch cultivation Methods 0.000 description 3
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 3
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 3
- 241000222124 [Candida] boidinii Species 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 3
- 230000005477 standard model Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000237974 Conus textile Species 0.000 description 2
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 2
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 2
- 241001480714 Humicola insolens Species 0.000 description 2
- 244000285963 Kluyveromyces fragilis Species 0.000 description 2
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- 241001138402 Millerozyma acaciae Species 0.000 description 2
- 101100494726 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pep-4 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 2
- 101100451950 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HXT14 gene Proteins 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 2
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N Ala-Ala-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N Ala-Leu-Thr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- DYXOFPBJBAHWFY-JBDRJPRFSA-N Ala-Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N DYXOFPBJBAHWFY-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- XCIGOVDXZULBBV-DCAQKATOSA-N Ala-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O XCIGOVDXZULBBV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 241001237431 Anomala Species 0.000 description 1
- HYQYLOSCICEYTR-YUMQZZPRSA-N Asn-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HYQYLOSCICEYTR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ACKNRKFVYUVWAC-ZPFDUUQYSA-N Asn-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N ACKNRKFVYUVWAC-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- NURJSGZGBVJFAD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Cys-Ser Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)C(=O)O NURJSGZGBVJFAD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- XDGBFDYXZCMYEX-NUMRIWBASA-N Asp-Glu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O XDGBFDYXZCMYEX-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- XWKBWZXGNXTDKY-ZKWXMUAHSA-N Asp-Val-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O XWKBWZXGNXTDKY-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- XQFLFQWOBXPMHW-NHCYSSNCSA-N Asp-Val-His Chemical compound N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)O XQFLFQWOBXPMHW-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000244202 Caenorhabditis Species 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- 241000237942 Conidae Species 0.000 description 1
- 102000001493 Cyclophilins Human genes 0.000 description 1
- 108010068682 Cyclophilins Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000235036 Debaryomyces hansenii Species 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101150082479 GAL gene Proteins 0.000 description 1
- NCWOMXABNYEPLY-NRPADANISA-N Glu-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NCWOMXABNYEPLY-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- SJPMNHCEWPTRBR-BQBZGAKWSA-N Glu-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O SJPMNHCEWPTRBR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MTAOBYXRYJZRGQ-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MTAOBYXRYJZRGQ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- MHHUEAIBJZWDBH-YUMQZZPRSA-N Gly-Asp-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)CN MHHUEAIBJZWDBH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- TZOVVRJYUDETQG-RCOVLWMOSA-N Gly-Asp-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CN TZOVVRJYUDETQG-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- 241001149671 Hanseniaspora uvarum Species 0.000 description 1
- UAQSZXGJGLHMNV-XEGUGMAKSA-N Ile-Gly-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N UAQSZXGJGLHMNV-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 1
- IOVUXUSIGXCREV-DKIMLUQUSA-N Ile-Leu-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IOVUXUSIGXCREV-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- XLXPYSDGMXTTNQ-UHFFFAOYSA-N Ile-Phe-Leu Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XLXPYSDGMXTTNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IITVUURPOYGCTD-NAKRPEOUSA-N Ile-Pro-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IITVUURPOYGCTD-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- YKZAMJXNJUWFIK-JBDRJPRFSA-N Ile-Ser-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N YKZAMJXNJUWFIK-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- 101150045458 KEX2 gene Proteins 0.000 description 1
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FBNPMTNBFFAMMH-AVGNSLFASA-N Leu-Val-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N Leu-Val-Arg Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N FBNPMTNBFFAMMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- DNWBUCHHMRQWCZ-GUBZILKMSA-N Lys-Ser-Gln Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O DNWBUCHHMRQWCZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- OBVHKUFUDCPZDW-JYJNAYRXSA-N Met-Arg-Phe Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OBVHKUFUDCPZDW-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- QXEVZBXTDTVPCP-GMOBBJLQSA-N Met-Asn-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCSC)N QXEVZBXTDTVPCP-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- IHRFZLQEQVHXFA-RHYQMDGZSA-N Met-Thr-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN IHRFZLQEQVHXFA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101150070377 PDI gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- WKTSCAXSYITIJJ-PCBIJLKTSA-N Phe-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WKTSCAXSYITIJJ-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 1
- MSHZERMPZKCODG-ACRUOGEOSA-N Phe-Leu-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 MSHZERMPZKCODG-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- IWZRODDWOSIXPZ-IRXDYDNUSA-N Phe-Phe-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CC=CC=C1 IWZRODDWOSIXPZ-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- YMIZSYUAZJSOFL-SRVKXCTJSA-N Phe-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YMIZSYUAZJSOFL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- GMWNQSGWWGKTSF-LFSVMHDDSA-N Phe-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GMWNQSGWWGKTSF-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 1
- MMPBPRXOFJNCCN-ZEWNOJEFSA-N Phe-Tyr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O MMPBPRXOFJNCCN-ZEWNOJEFSA-N 0.000 description 1
- KUSYCSMTTHSZOA-DZKIICNBSA-N Phe-Val-Gln Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N KUSYCSMTTHSZOA-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- JFBJPBZSTMXGKL-JYJNAYRXSA-N Pro-Met-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JFBJPBZSTMXGKL-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- ITUDDXVFGFEKPD-NAKRPEOUSA-N Pro-Ser-Ile Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O ITUDDXVFGFEKPD-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- HRIXMVRZRGFKNQ-HJGDQZAQSA-N Pro-Thr-Gln Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O HRIXMVRZRGFKNQ-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- 102100036351 Protein disulfide-isomerase A2 Human genes 0.000 description 1
- 101710106238 Protein disulfide-isomerase A2 Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100451954 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HXT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100451947 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HXT11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100507958 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HXT9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001076706 Saccharomyces cerevisiae Invertase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001053411 Saccharomyces cerevisiae Invertase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001053412 Saccharomyces cerevisiae Invertase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001053409 Saccharomyces cerevisiae Invertase 5 Proteins 0.000 description 1
- 101001053400 Saccharomyces cerevisiae Invertase 7 Proteins 0.000 description 1
- 101900333157 Saccharomyces cerevisiae Protein disulfide-isomerase Proteins 0.000 description 1
- 241000724650 Saccharomyces cerevisiae killer virus M1 Species 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- BGOWRLSWJCVYAQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BGOWRLSWJCVYAQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N Ser-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N Ser-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SQHKXWODKJDZRC-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000223258 Thermomyces lanuginosus Species 0.000 description 1
- VBMOVTMNHWPZJR-SUSMZKCASA-N Thr-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VBMOVTMNHWPZJR-SUSMZKCASA-N 0.000 description 1
- NHQVWACSJZJCGJ-FLBSBUHZSA-N Thr-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O NHQVWACSJZJCGJ-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 1
- ITDWWLTTWRRLCC-KJEVXHAQSA-N Tyr-Thr-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ITDWWLTTWRRLCC-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- PVPAOIGJYHVWBT-KKHAAJSZSA-N Val-Asn-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O PVPAOIGJYHVWBT-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- ZZGPVSZDZQRJQY-ULQDDVLXSA-N Val-Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O ZZGPVSZDZQRJQY-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- ZHQWPWQNVRCXAX-XQQFMLRXSA-N Val-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N ZHQWPWQNVRCXAX-XQQFMLRXSA-N 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 108010087049 alanyl-alanyl-prolyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 101150099105 alien gene Proteins 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000004098 cellular respiration Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000002038 chemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000014107 chromosome localization Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000012666 negative regulation of transcription by glucose Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 108010084525 phenylalanyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L potassium sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O LJCNRYVRMXRIQR-OLXYHTOASA-L 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 1
- 238000009418 renovation Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000001476 sodium potassium tartrate Substances 0.000 description 1
- 235000011006 sodium potassium tartrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 108010071097 threonyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 108020005087 unfolded proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000009941 weaving Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
提供了提高重组外源蛋白在酵母表达系统中的分泌效率的方法。该方法包括用重组外源基因构建体转化酵母宿主以构建转化的酵母菌株，所述重组外源基因构建体包含半乳糖诱导型启动子、分泌信号序列和编码所述外源蛋白的基因；和在所述半乳糖诱导型启动子的活性受到调控的条件下培养所述转化酵母菌株。通过经由适度调控作为半乳糖诱导性启动子的诱导物在细胞中起作用的半乳糖的水平，降低基于半乳糖诱导型启动子的常规酵母表达系统所经历的重组外源蛋白的过表达引起的不溶性沉淀，可以实现重组外源蛋白分泌效率的提高。由于重组外源蛋白分泌效率的提高，本发明有助于提高重组外源蛋白在酵母表达系统中的产率以及降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及在酵母表达系统中提高重组外源蛋白的分泌效率的方法。
背景技术
利用微生物大量产生外源蛋白是蛋白质药业中最重要的技术领域。为了回收和纯化期望的产物，重组外源蛋白可被胞内表达，或者另外可被胞外分泌。胞内表达蛋白质时，蛋白质的过表达在许多情况下经常可导致蛋白质以非活性和水不可溶的形式在胞内累积，并可带来产率降低因素的各种劣势，诸如破裂固体微生物的繁琐的过程以及从存在于细胞中的各种宿主蛋白分离期望蛋白的复杂和艰难的纯化过程。然而，期望蛋白的胞外分泌可提供容易的方式来避免与前述胞内表达蛋白质相关的困难和问题。而且，由于胞外蛋白分泌仅在紧接转录过程之后蛋白质的正确折叠和修饰之后才可成功进行，所以经由胞外分泌的蛋白质产生提供了能够获得活性形式的、具有正确的三级结构的可溶蛋白这一益处。因此，可以说，在蛋白质产率以及蛋白质质量调控方面，蛋白质的胞外分泌优于重组外源蛋白的胞内累积系统。
然而，在许多情况下，在采用强启动子的重组蛋白表达系统中，胞外蛋白分泌系统经常遭受相比于胞内累积系统显著低的表达和分泌水平。为了克服胞外分泌的这类劣势和问题，已经进行了许多研究，以增强蛋白质的胞外分泌收率。大多数研究集中于直接优化信号序列以有效分泌蛋白或发现新的强分泌信号序列(Nucleic Acids Res Suppl.，2003(3)：261-2；和Biochem Cell Biol.1993，71：401-5)。
作为另一种方法，已经进行了许多研究，以通过使用分子生物学技术，经由诱导有助于蛋白质的折叠和水溶解的蛋白伴侣的过表达，促进相应于过表达重组外源蛋白时的初始限速步骤的蛋白质折叠以及防止可在蛋白的胞外分泌之前发生的不溶性沉淀，而增强期望蛋白的分泌效率(Robinson和Wittrup，Biotech.Prog.，11：171，1995；Robinson et al.，Biotechnology，12：381-384，1994；以及Wulfing和Plukthun，Mol.Microbiol.12(5)：685-692，1995)。
半乳糖启动子，传统上被用于诱导外源重组蛋白在酵母中的表达，是一种利用半乳糖作为诱导物的强诱导型启动子。即使蛋白表达的强诱导对于增加外源蛋白的胞内累积或表达水平可以是有利的，这也可导致在期望胞外分泌所需蛋白质时分泌效率下降或者细胞功能异常，原因在于在分泌的早期在细胞中发生不溶性沉淀。这类事件偶尔也在重组表达系统诸如大肠杆菌(E.coli)表达系统和酵母表达系统中观察到。为了克服这类缺点，进行了各种尝试来降低培养温度(Baneyx F.，Curr.Opin.Biotechnol.，10：411-421，1999；以及George Georgiou和Pascal，Curr.Opin.Biotechnol.，7：190-197，1996)。
然而，这类降低培养温度的方法具有与重组外源蛋白产生成本增加相关的劣势，原因在于培养期延长。因此，在本领域中对于开发能够通过调节半乳糖诱导型启动子的活性来增强重组外源蛋白的分泌效率而不降低培养温度的方法存在需求。
为了这个目的，基于半乳糖诱导型启动子的活性可通过调控宿主中半乳糖的可利用度进行调节这一想法，本发明的发明人已经确认，通过使用缺乏参与半乳糖吸收的半乳糖通透酶基因的突变株，或通过经由共添加一定比例的半乳糖和调节分解代谢物阻抑的葡萄糖进行补料分批培养而培养经转化的酵母菌株，提高重组外源蛋白的分泌效率是可能的。本发明基于这些发现已经得以完成。
发明内容
技术问题
因此，考虑上述问题而做出了本发明，并且本发明的一个目的是提供通过遗传修饰酵母宿主菌株或改变培养条件而提高重组外源蛋白在酵母表达系统中的胞外分泌效率的方法。
技术方案
根据本发明的一个方面，通过提供提高外源蛋白分泌效率的方法可实现上述目的和其它目的，所述方法包括步骤(a)用重组外源基因构建体转化酵母宿主以构建转化酵母菌株，所述重组外源基因构建体包含半乳糖诱导型启动子、分泌信号序列和编码所述外源蛋白的基因；和(b)在所述半乳糖诱导型启动子的活性受到调控的条件下培养所述转化酵母菌株。
有益效果
通过经由适度调控作为半乳糖诱导性启动子的诱导物在细胞中起作用的半乳糖的水平，降低基于半乳糖诱导型启动子的常规酵母表达系统所经历的重组外源蛋白的过表达引起的不溶性沉淀，根据本发明的提高外源蛋白分泌效率的方法可实现重组外源蛋白分泌效率的提高。因此，本发明的方法有效提高重组外源蛋白在酵母表达系统中的产率并有效降低生产成本。
附图简述
通过结合附图进行下面的详细描述，本发明的上述目的和其它目的、特征和其它优势将得到更清楚的理解，其中：
图1是示意图，其阐述了其中培养基中的半乳糖穿过酵母细胞膜并作用于外源蛋白表达诱导型启动子的过程，以及其中由葡萄糖进行的分解代谢物阻抑在细胞中发生的过程；
图2是在本发明中使用的重组LK8蛋白表达载体MδLK8的切割图谱；
图3是当除了Gal2基因外各自具有相同遗传背景的两种酵母宿主在作为唯一碳源的半乳糖供应的情况下进行培养时，比较随时间变化的半乳糖消耗速率的曲线图；
图4是照片，其示出了外源基因在转化酵母菌株A中表达后，具有表达诱导期的胞内总外源蛋白的蛋白质印迹分析结果；
图5是照片，其示出了转化酵母菌株A中胞内水溶性外源蛋白的蛋白质印迹分析结果；
图6是照片，其示出外源基因在转化酵母菌株B中表达后，具有表达诱导期的胞内总外源蛋白的蛋白质印迹分析结果。由此可见，相比于利用具有GAL2基因的酵母菌株A作为宿主表达蛋白质，外源蛋白质的胞内不溶性累积随时间相对下降；
图7是曲线图，其比较了通过补料分批培养转化酵母菌株A和B进行外源基因表达后，分泌入培养基中的重组外源蛋白的量与表达诱导期的关系曲线；和
图8是适于在外源蛋白在酵母中表达后允许半乳糖诱导型蛋白质二硫键异构酶基因(PDI1)进行共表达的表达载体pMPDI1的切割图谱。
实施发明的最佳方式
在下文中，本发明将进行更详细的描述。
根据本发明提高外源蛋白的分泌效率的方法包括步骤(a)用重组外源基因构建体转化酵母宿主，所述构建体包含半乳糖诱导型启动子、分泌信号序列和编码所述外源蛋白的基因，以构建转化酵母菌株；和(b)在所述半乳糖诱导型启动子的活性受到调控的条件下培养所述转化酵母菌株。
在本文中，进行步骤(a)，以用重组外源基因表达构建体转化酵母宿主。对于转化方法无特别限制。优选地，通过将重组外源基因构建体插入(或多重插入)酵母宿主的染色体或者通过将基因构建体插入酵母宿主的细胞质使得它可以以环状载体的形式存在，进行转化。基因构建体参入染色体在使用酵母的转化中被称为“整合”，而基因构建体以环状载体的形式参入酵母细胞质是指附加型表达法，其中外源基因以附加体的形式被引入，以在外源基因表达构建体插入可应用于酵母系统的载体(或质粒)之后表达和分泌外源蛋白。附加体是存在于细胞质中的环状DNA并能够独立于宿主细胞的染色体发挥遗传功能。
可用于本发明的半乳糖诱导型启动子的例子可包括任何类型的启动子而无特别限制，只要其通过使用半乳糖作为诱导物在酵母系统中是功能上可操纵的。优选地，可以使用SEQ ID NO：1所示的酿酒酵母(S.cerevisiae)的GAL1启动子、SEQ ID NO：2所示的酿酒酵母的GAL10启动子、SEQ IDNO：3所示的酿酒酵母的GAL7启动子、或它们的组合或融合。更优选GAL1。
分泌信号序列可以是在酵母系统中用作分泌信号或者是本领域中常规上已知的任何序列。例如，信号序列可以选自SEQ ID NO：4所示的MATα信号、SEQ ID NO：5所示的酿酒酵母K1杀伤毒素信号(Brown，J.L.等，TheK1killer toxin：molecular and genetic applications to secretion and cell surfaceassembly.In：Johnston，J.R.Molecular Genetics of Yeast-a practical approach.The practical approach series，1994，第217-265页；和Tokunaga，M.等，Biochem.Res.Commun.，144：613-619，1987)、SEQ ID NO：6所示的酿酒酵母转化酶信号(日本未经审查专利公布1985-041488)、SEQ ID NO：7所示的乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)杀伤毒素信号(Sugisaki，Y.等，Eur.J.Biochem.，141：241-245，1984)、SEQ ID NO：8所示的Pichia acaciae杀伤毒素信号(美国专利6,1,07,057)、葡萄有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)杀伤毒素信号(Radler，F.等，Arch.Microbiol.，154(2)：175-178，1990；和Schmitt，M.J.等，J.Virol.，68(3)：1765-1772，1994)、异常毕赤酵母(汉逊酵母属)(Pichia(Hansenular)anomala)杀伤毒素信号、及其任何组合。
此外，为了增加蛋白质或肽的分泌效率，分泌信号序列可进一步包括前肽序列，还进一步包括信号肽酶的识别位点，例如KEX1(用于杀伤表达1)或KEX2(美国专利4,929,553)。信号肽酶的识别位点的例子可包括Pro-Met-Tyr。
同时，其中所述半乳糖诱导型启动子的活性受到调控的条件可以使用各种方法诸如遗传工程技术和培养技术加以建立。对建立所期望的培养条件的这类技术无特别限制，只要它可能调控半乳糖诱导型启动子的活性。优选地，半乳糖诱导型启动子的活性可通过降低半乳糖从培养基进入转化酵母菌株的转运速率加以调控。
就此而论，包括基于遗传工程的菌株改造技术和培养技术在内的任何方法可被用于降低半乳糖的胞内转运速率，只要它可能降低半乳糖向细胞内的输送。例如，各种遗传工程技术可被用于使作为靶标的转化酵母半乳糖通透酶基因成为非功能性的。优选地，通过使半乳糖通透酶基因缺损或使之部分破坏从而成为非功能性的是首选的。
对缺陷引入或基因破坏的方法无特别限制，只要它们旨在(部分或完全地)使半乳糖通透酶的功能失效。例如，使用本领域中常规已知的各种遗传工程技术，进行基因的缺陷(缺失)或部分(或完全)破坏。
此外，可在本发明中使用的半乳糖通透酶缺陷型菌株不被特别限制。例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BJ3501(ATCC 208280)是通常已知的。
优选地，在步骤(b)中调节半乳糖诱导型启动子活性的条件是在细胞培养期间以一定比例向培养液共添加半乳糖和葡萄糖。对培养方法无特别限制，包括分批培养、连续培养、分批补料培养等。优选分批补料培养。
此外，对半乳糖和葡萄糖的比例无特别限制，只要葡萄糖分解代谢物阻抑致使半乳糖的胞内转运得到抑制，同时半乳糖进行的诱导不受抑制。优选地，半乳糖和葡萄糖的比例在4:1至1:1的范围内。
在通过用包含半乳糖诱导型启动子、分泌信号序列和编码外源蛋白的基因的重组外源基因构建体转化酵母宿主来构建转化酵母菌株中，酵母宿主优选用含有蛋白质二硫键异构酶编码基因的重组外源构建体转化，所述蛋白质二硫键异构酶编码基因在半乳糖诱导型启动子的调控下进行表达。
优选地，提高外源蛋白的分泌效率的方法在步骤(a)和(b)之间进一步包括步骤(a-1)：用含有在半乳糖诱导型启动子调控下表达的蛋白质二硫键异构酶编码基因的重组外源基因构建体进一步转化步骤(a)的转化酵母菌株。
前述另外的步骤(a-1)是指酵母菌株用编码蛋白质二硫键异构酶的基因再转化，蛋白质二硫键异构酶对在细胞内产生的蛋白质的胞外分泌施加优异的影响。
蛋白质二硫键异构酶编码基因转化酵母菌株，可以在经由用包含半乳糖诱导型启动子、分泌信号序列和编码外源蛋白的基因的重组外源基因构建体转化酵母宿主来构建转化酵母的步骤(a)之前，通过前述用蛋白质二硫键异构酶编码基因转化酵母菌株来进行，或者可以在步骤(a)之后另外通过利用蛋白质二硫键异构酶编码基因的转化酵母菌株的另外的转化步骤(a-1)来进行。
可用于本发明的蛋白质二硫键异构酶编码基因不被特别限制于来自某些物种的具体序列，只要它们可进行二硫键异构化。优选地，蛋白质二硫键异构酶基因选自SEQ ID NO：9所示的酿酒酵母PDI1(Tachikawa，H.et al.，J.Biochem.，110(2)：306-313，1991)、SEQ ID NO：10所示的织锦芋螺(Conustextile)PDI(美国专利申请US2004/0203132 A1)、SEQ ID NO：11所示的线虫(C.elegans)PDI(Page，A.P.，DNA Cell Biol.，16(11)：1335-1343，1997)、SEQ ID NO：12所示的人胰腺PDI基因(Desilva，M.G.etal.，DNA Cell Biol.，15(1)：9-16，1997)、SEQ ID NO：13所示的米曲霉(Aspergillus oryzae)PDI(WO 95/00636)、SEQ ID NO：14所示的博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)PDI(美国专利5,965,426)、SEQ ID NO：15所示的特异腐质霉(Humicolainsolens)PDI(美国专利5,700,659)及其任何组合。
编码蛋白质二硫键异构酶的基因构建体不被特别限制于具体载体或其等价物。优选的是具有图8所示的切割图谱的pMPDI。
在酵母表达系统中，半乳糖诱导型启动子被广泛应用，其具有强表达强度。在细胞内存在作为诱导物的半乳糖时，半乳糖诱导型启动子被激活，然后导致基因在上述半乳糖诱导型启动子调控下进行高丰度表达。由于这类可诱导性，半乳糖诱导型启动子被用作在酵母中表达外源重组蛋白的有用手段。
然而，如以前所讨论，本发明人观察到，在外源蛋白质的分泌发生之前，外源蛋白质的不可溶沉淀在表达早期在细胞中发生(见图4)。
本发明人已经进行了各种广泛和深入的研究和实验来解决上述问题以及提高外源蛋白的胞外分泌。为了这个目的，基于这样的事实——由于在细胞中半乳糖的过丰度导致的半乳糖诱导型启动子过活化是外源蛋白在其分泌之前发生胞内不溶性沉淀的主要原因，本发明人进行了研究，以确认通过调控被用作半乳糖诱导型启动子的表达诱导物的半乳糖的胞内流入，重组外源蛋白的分泌效率是否得到提高。
首先，经半乳糖的胞内摄取途径分析，半乳糖的胞内转化可经由各种途径发生。半乳糖转化的主要途径是半乳糖通透酶(Gal2)，其作为半乳糖操纵子的组成，在半乳糖的存在下得到表达，并表现出对半乳糖的最高亲和性。
然而，甚至当宿主细胞是半乳糖通透酶(Gal2)活性缺陷时，半乳糖转运也未被完全阻断。相反，这样的Gal2-缺陷型宿主细胞可通过另外的方法实现半乳糖的胞内转运，例如通过在细胞膜上存在的各种己糖转运蛋白，例如HXT1、HXT9、HXT11和HXT14(Wieczorke R.et al.，FEBS.Lett.464(3)：123-128，1999)，即使其它己糖转运蛋白对于半乳糖具有相对低的亲和性。因此，至少操纵GAL启动子所必需的最小量的半乳糖可被转运入细胞(见图1)。图1是概念图，其说明了其中在培养基中的半乳糖穿过酵母细胞膜然后作用于诱导外源蛋白表达的启动子这一过程以及其中葡萄糖在细胞中导致分解代谢物阻抑这一过程。
基于在图1中所示的该图解，本发明人考虑了通过使用编码Gal2——一种主要的半乳糖转运蛋白——的基因(Gal2)缺陷的酵母宿主来最小化半乳糖的胞内转运是可能的。为了这个目的，首先，在半乳糖诱导型启动子的调控下表达外源基因的重组外源基因构建体被引入作为宿主的、具有Gal2基因缺陷的酿酒酵母BJ3501(ATCC 208280)(下文称为“酵母宿主B”)，从而构建转化酵母(下文称为“转化酵母宿主B”)，并且如此转化的酵母菌株在含半乳糖的培养基中培养。之后，将在转化酵母菌株B中重组外源蛋白的分泌效率与作为宿主的另一转化酵母菌株(下文称为“转化酵母宿主A”)进行比较，该另一转化酵母菌株通过不具有Gal2基因缺陷的正常酵母菌株(酿酒酵母2805，下文称为“酵母宿主A”)的转化而获得。
如图3所示，当除了Gal2基因外各自具有相同遗传背景的酵母宿主A和B在含有半乳糖作为唯一碳源的培养基中培养并且培养基中半乳糖随时间的浓度被测定并在两组之间进行比较时，确认了半乳糖进入细胞的流入速率根据Gal2基因的存在/不存在而显著变化。
而且，使用外源蛋白的抗体，通过蛋白质印迹分析，确认了相比于当酵母宿主A被用作外源蛋白表达的宿主时(见图4和5)，当酵母菌株B——由于Gal2基因的无操作，其半乳糖进入细胞的流入速率低——被用作外源蛋白表达的宿主时(见图6)，由外源蛋白在半乳糖诱导型启动子调控下过表达引起的外源蛋白的胞内不溶性沉淀相对下降。此外，还通过分泌入培养基中的外源蛋白的HPLC分析，确认了在外源蛋白的不溶性沉淀在实践培养条件下降低的同时，外源蛋白的胞外分泌和分泌效率的增加——本发明的最终目的——也被实现(见图7)。在本发明的一个实施方式中，即使具有半乳糖通透酶基因缺失的酵母菌株被用于降低半乳糖的胞内流入，抑制半乳糖通透酶基因功能的反义、siRNA、抗体、拮抗剂等也可被用于同一目的。
对于合适地调节半乳糖的胞内可用性，本发明人已经采取了这样的策略，其中导致分解代谢物阻抑(当葡萄糖是细胞的培养基环境中的主要碳源时，促进葡萄糖利用的某些糖代谢基因的表达的抑制)的葡萄糖和用作半乳糖诱导型启动子的诱导物的半乳糖被“共给料”入分批补料培养基，以诱导两种糖的同步消耗，使得外源蛋白的过表达依靠一部分包含在培养基中的葡萄糖，由分解代谢物阻抑适当调节。
图1是示意性图表，其说明了半乳糖和葡萄糖对细胞中半乳糖诱导型启动子的诱导和抑制的两种相反的作用(K.-D.Entian和H.-J.Schuller，Glucose Repression in Yeast.In：Yeast Sugar Metabolism，F.K.Zimmermann，K.-D.Entian.，eds.pp.409-434.Technomic Publishing AG，Bassel，Switzerland，1997)。
就此而论，经由适于维持培养基中葡萄糖浓度低于0.1g/L的葡萄糖限制型分批补料培养，通过加入混合碳源，防止了葡萄糖对半乳糖诱导型启动子的完全抑制。
本发明人将上述方法称为混合碳源补料策略。在本发明中，细胞在含有各种比例的葡萄糖/半乳糖的分批补料培养基中培养，并且对于每一种情况，人工调控外源蛋白的分泌。此外，在不同比例的葡萄糖/半乳糖下，所分泌的外源蛋白的量进行了比较，从而确认在具有不同的半乳糖转化能力的酵母宿主菌株中外源蛋白分泌所需的最适葡萄糖/半乳糖比(见下文的表1和2)。
相比于仅使用半乳糖作为唯一碳源的常规表达诱导法，当本发明所设计的混合碳源补料方法被用于酵母宿主A和B时，每细胞的外源蛋白产率以及每诱导物的外源蛋白产率分别增加了105％(表1)和85％(表2)。此外，当前述的转化酵母菌株A和B通过应用所述混合碳源补料方法分别进行分批补料培养时，揭示了存在不同的最适葡萄糖/半乳糖浓度。
具有相对高的半乳糖胞内流入和消耗速率的转化酵母菌株A对于外源蛋白的最适分泌表现出大约1:1葡萄糖/半乳糖比的混合碳源，而由于半乳糖通透酶的无操作而具有降低的半乳糖转运能力的转化酵母菌株B表现出大约2:3的最适比的混合碳源(葡萄糖/半乳糖)，从而相比于转化酵母菌株A需要培养基中相对高比例的半乳糖(见表1和2)。结果间接证明了在使用半乳糖诱导型启动子的外源蛋白表达系统中半乳糖转运能力和混合碳源对外源蛋白表达的影响与本发明的目的很好地一致。
另一方面，本发明人进行了研究，以确认通过用编码被称为蛋白质折叠助手的蛋白质二硫键异构酶的基因(PDI1)连同在半乳糖诱导型启动子调控下表达的外源基因构建体转化宿主细胞，蛋白质分泌效率是否得到提高。
首先，含有SEQ ID NO：9所示的酿酒酵母蛋白质二硫键异构酶基因(PDI1)的表达载体pMPDI1被构建，并且所得到的表达载体连同外源基因构建体被分别转化入酵母宿主菌株A和B。然后，转化酵母菌株在含半乳糖的培养基中培养，并测定蛋白质分泌效率(见表3).结果，可以看出，用外源基因构建体和pMPDI1载体转化酵母宿主A相对于对照组(未参入PDI1基因的酵母宿主A)在蛋白质分泌效率上表现出30％的增加，而使用酵母宿主B的转化相对于对照组在蛋白质分泌效率上表现出72％的增加。
如上文所详细描述，根据本发明提高外源蛋白的分泌效率的方法使得能够经由适度调控细胞中作为半乳糖诱导型启动子的诱导物发挥作用的半乳糖的水平，通过降低在基于半乳糖诱导型启动子的常规酵母表达系统中遇到的外源蛋白质的过表达引起的不溶性沉淀，提高重组外源蛋白的分泌效率。因此，本发明的方法可有效地用于提高重组外源蛋白在酵母表达系统中的产率并降低生产成本。
发明方式
实施例
现在，将参考下列实施例，更详细地描述本发明。这些实施例仅仅被提供来阐述本发明，并且不应该被解释成限制本发明的范围和精神。
实施例1：在酵母宿主A和B之间胞内半乳糖转运能力的比较
酵母宿主A(酿酒酵母2805，基因型：MATα pep4::HIS3 prb1-Δ1.6Rhis3-Δ200 ura3-52 GAL2 can1，Sohn，J.H.et al.Proc.Biochem.，30：653-660，1995；和Kim，T.H.et al.Biotechnol.Lett.24：279-286，2002)和酵母宿主B(酿酒酵母BJ3501，基因型：MATα pep4::HIS3 prb1-Δ1.6Rhis3-Δ200 ura3-52gal2 can1，ATCC 208280，USA)在YPD琼脂板上划线，并在30℃下置于培养箱中约18小时，以及分离集落。酵母宿主A和B的每一集落被接种入单独的YPG[酵母提取物1％(w/v)、蛋白胨2％(w/v)和半乳糖2％(w/v)]液体培养基并在30℃下在培养箱中振荡培养约80小时。为了测定半乳糖随时间的消耗，通过经由3，5-二硝基水杨酸(DNS)分析定量还原糖，测定培养基中的残留半乳糖浓度(Mohun，A.F.和Cook，I.J.，J.Clin.Pathol.，15：169-180，1962，见图3)。
图3是当除了Gal2基因缺陷外各自具有相同遗传背景的两种酵母宿主在作为唯一碳源的半乳糖供应的情况下进行培养时，比较随时间变化的半乳糖消耗速率的曲线图。由图3可见，相比于其中Gal2基因正常发挥功能的酵母宿主A，Gal2基因缺陷型酵母宿主B表现出每单位时间的半乳糖消耗速率下降得到了确认。
实施例2：使用酵母宿主A和B构建分泌外源蛋白的酵母转化体
2-1.使用酵母宿主A，构建分泌外源蛋白的酵母转化体酿酒酵母2805/MδLK8
使用被本发明人用来在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中产生重组LK8的表达载体pMBRI-LK8(韩国专利公布特许公开2004-0069840)，进行α-因子分泌信号和LK8 cDNA的共分离。该申请通过引用以其全部内容并入本文。pMBRI-LK8载体用EcoR I处理7小时，并使用PCR纯化试剂盒(Qiagen，USA)进行洗涤。然后，该载体用BamH I处理7小时，而DNA通过凝胶电泳进行分离。使用凝胶提取试剂盒(Qiagen，USA)，获得DNA片段，其具有α-因子分泌信号SEQ ID NO：4和LK8 cDNA序列SEQ ID NO：16。如此获得的DNA片段被插入p426GAL1(ATCC 87833，USA)载体的GAL1启动子和CYC1终止子之间，从而构建表达载体pMCLK8(6.9kb)，其可被用于在酵母中产生重组LK8。所产生的载体pMCLK8含有GAL1启动子，其因此允许通过半乳糖诱导蛋白表达。在酵母转化之后，使用URA3标记作为选择标记，在选择培养基中选择转化体。之后，为了将由α-因子分泌信号序列和LK8 cDNA组成的表达盒插入酵母染色体中，该表达盒被插入含有δ序列和用来如下选择插入的载体的新霉素抗性基因(neo)的pδneo载体(Lee，F.W.和Da Silva，N.A.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，48：339，1997)，以便确保期望的基因可被插入δ序列——位于酵母染色体中的转座元件之一。
首先，分别使用切割GAL1启动子和CYC1终止子两端的限制酶Sac I和Kpn I，由pMCLK8载体分离LK8表达盒。在本文中，由于LK8表达盒和pδneo载体的序列都含有Sal I限制性位点并且在pδneo载体上存在的SalI限制性位点基本上是将该载体整合入酵母染色体所必需的，所以DNA平端试剂盒(DNA blunting kit(Takara，Japan))被用来除去在LK8表达盒上存在的Sal I限制性位点。另一方面，因为pδneo载体不含有Kpn I限制性位点，上述的DNA平端试剂盒被用来将pδneo载体的Xba I限制性位点和分离的LK8表达盒的Kpn I限制性位点都转化成平端。然后，如此平端化的LK8表达盒和pδneo载体用连接酶连接，以构建重组载体，其被命名为MδLK8重组表达载体(图2)。图2是用于本发明的重组LK8蛋白表达载体的切割图谱。
之后，使用Alkali Cation Yeast Transformation Kit(Q-BIOgene，Canada)，用上述重组MδLK8表达载体转化酿酒酵母2805(Sohn，J.H.et al.Proc.Biochem.，30：653-660，1995；和Kim，T.H.etal.，Biotechnol.Lett.，24：279-286，2002)。使用含有抗生素G418硫酸盐(antibiotic G418 sulfate)的YPD板[2％(w/v)蛋白胨、1％(w/v)酵母提取物、2％(w/v)葡萄糖和2％(w/v)琼脂]，选择用MδLK8重组表达载体转化酵母菌株。G418硫酸盐的浓度被分别调节到5g/L、10g/L和15g/L，从而选择最高抗生素抗性的酵母菌株，其被命名为酿酒酵母2805/MδLK8。在下文中，为了简洁和方便，该酵母菌株将被称为“转化酵母A”。
2-2：使用酵母宿主B，构建分泌外源蛋白的酵母转化体酿酒酵母BJ3501/MδLK8
根据如实施例2-1相同的方式，酿酒酵母BJ3501(ATCC 208280，USA)——除了GAL2基因缺陷外其具有与酿酒酵母2805相同的基因型——用实施例2-1中构建的重组表达载体MδLK8进行转化。然后，进行集落筛选，以选择具有最高分泌效率的克隆，其最终被命名为酿酒酵母BJ3501/MδLK8#36，并保藏于韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology(KRIBB，Daejon，Korea)，保藏号为KCTC10582BP(保藏于2004年1月13日)。在下文，为了简洁和方便起见，该转化体菌株将被称为“转化酵母菌株B”。
实施例3：使用半乳糖作为碳源，比较在分批补料培养中转化酵母菌株A和B的外源蛋白分泌能力
在使用半乳糖分批补料培养实施例2中的酵母转化体A和B的情况下，进行下列的分析，以比较外源蛋白的分泌效率。首先，作为主种子的转化酵母菌株在1至3vvm的空气和200至1000rpm下，在添加有2％(w/v)葡萄糖的YPD[酵母提取物1％(w/v)和蛋白胨2％(w/v)]培养基中进行种子培养24小时，使得可以获得期望的细胞量和活性(20-倍稀释，OD600＝0.8至1.2)。在YPD培养基中进行种子培养之后，种子培养溶液被接种入起始培养基。首先，分批培养阶段是细胞生长期以及对被用作外源蛋白LK8的表达诱导物的半乳糖的适应期。为了这个目的，细胞被给予半乳糖适应期，同时通过接种超过1％(v/v)的种子培养溶液和供应作为碳源的葡萄糖和半乳糖，使得细胞发生增殖。在本文中，起始培养基由2％(w/v)葡萄糖、3％(w/v)半乳糖、4％(w/v)酵母提取物、0.5％(w/v)酪蛋白氨基酸、0.5g/L尿嘧啶和0.5g/L组氨酸组成。
在分批培养阶段，供应给起始培养基的碳源耗尽后，细胞的呼吸作用(氧消耗)下降，这通过由提供于发酵器上溶解氧探针表征的溶解氧水平的急剧增加而得到确认。从该时间点，使用DO-stat补料策略，加入含有半乳糖作为唯一碳源的培养基，进行分批补料培养。进行该分批补料培养，以进一步增加细胞浓度，并进一步持续维持外源蛋白的表达诱导期，从而提高外源蛋白的产率。
具体而言，由50％(w/v)半乳糖、30g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、1g/L尿嘧啶和2g/L组氨酸组成的分批补料培养基被使用(分批补料培养基I)。为了诱导外源蛋白LK8的高水平分泌，通过以1mL/h至30mL/h的速率补给半乳糖，在培养基中残留半乳糖的量被维持在5％(w/v)以下。通过测定培养基中半乳糖的残留浓度并基于如此得到的值加入合适量的半乳糖从而维持残留半乳糖的水平在合适的值，进行半乳糖补料。通过调控半乳糖的添加，LK8的表达和分泌可以被持续增强，同时在整个期中维持发酵器中残留半乳糖的浓度在5％(w/v)以下。
分批补料培养法在相同培养条件下被应用于在实施例2构建的转化酵母菌株A和B，并且，在两个酵母组之间就酵母的半乳糖转运能力方面比较外源蛋白的表达和分泌曲线。首先，为了比较在酵母细胞中累积的外源蛋白的分布曲线，对在给定培养时间点下从两组酵母组收集的培养样品进行使用抗-LK8抗体的蛋白质印迹分析。为了这个目的，在培养期间周期性收集的每一转化酵母菌株被调节至相同的量，在相同体积的样品缓冲液中煮沸，并在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，以展开胞内蛋白质。如此展开的蛋白质被转移至硝化纤维素膜。为了进行印迹，硝化纤维素膜被放入添加了含有0.1％(v/v)Tween 
和5％(w/v)脱脂乳的PBS缓冲液的溶液，其在室温下温和搅拌2小时。之后，将兔抗LK8 Ab加至同一溶液，然后该溶液在室温下温和搅拌1小时，并用含有0.1％(v/v)Tween 
的PBS缓冲液重复洗涤五次。接下来，抗兔IgG-HRP(抗兔IgG-辣根过氧化物酶，Sigma，USA)被加入添加了含有0.1％(v/v)Tween 和5％(w/v)脱脂乳的PBS缓冲液的溶液，并且如此处理的硝化纤维素膜被浸入其中抗兔IgG-HRP被加入的溶液中，并在室温下温和搅拌1小时。然后，膜用含有0.1％(v/v)Tween 的PBS缓冲液重复洗涤五次。取出膜，并使其在加入检测溶液的化学发光检测试剂盒(SuperSignalTMWest Pico kit，Pierce，USA)中经历发光反应，并固定在感光膜上。检查膜上的阴影(见图4、5和6)。图4是照片，其示出了外源基因在转化酵母菌株A中表达后，具有表达诱导期的胞内总外源蛋白的蛋白质印迹分析结果；图5是照片，其示出了转化酵母菌株A中胞内水溶性外源蛋白的蛋白质印迹分析结果；以及图6是照片，其示出外源基因在转化酵母菌株B中表达后，具有表达诱导期的胞内总外源蛋白的蛋白质印迹分析结果。
如图4中所示，可以看出，当半乳糖转运能力由于GAL2基因的正常操作而处于正常时，诱导外源基因表达的分批补料培养的持续导致了较高的外源蛋白胞内累积。然而，如图5中所示，可以看出，当蛋白质印迹仅进行来分析细胞中的水溶性蛋白质时，外源蛋白质随着时间的过去主要是不可溶蛋白质的形式，而不是可溶蛋白质的形式。另一方面，如图6所示，可以看出，由于Gal2基因缺陷而具有降低的半乳糖转运能力的酵母菌株B在表达期内表现出外源蛋白的胞内累积下降。
为了确认图6的结果是由于具有Gal2基因缺陷的转化酵母菌株B中外源蛋白的分泌效率增加所致，还是由于蛋白质表达水平的总体下降所致，在实施例2中构建的转化酵母菌株A和B在相同的培养条件下进行分批补料培养，并且对细胞培养物进行高效液相色谱(HPLC)分析，以量化分泌的外源蛋白。首先，离心细胞培养物，并通过0.2μm的过滤器过滤所得到的上清液。然后，在HPLC中在214nm的波长下，使100μl的过滤样品经历吸光度(OD)测定。通过反相分离柱(VydacTM c18柱，Grace Vydac，USA)，使用展开剂——例如含1％(w/v)三氟乙酸(TCA)的乙腈和含1％(w/v)TCA的水——作为流动相，分离外源蛋白LK8。在本文中，流动相由从25％(v/v)开始至40％(v/v)的乙腈梯度组成，从而能够利用疏水相互作用分离具有单峰的纯外源蛋白质。此外，在通过二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)分析测定作为标准物的高纯度外源蛋白后，可以获得HPLC中的面积积分以及外源蛋白浓度的校准曲线。使用如此得到的校准曲线，使该无细胞培养上清液进行HPLC分析，从而计算积分面积，并且所得到的值被应用于使用标准样品(LK8)的校准曲线，从而量化培养上清液中的外源蛋白(图7)。
图7是曲线图，其比较了通过补料分批培养转化酵母菌株A和B进行外源基因表达后，在表达诱导期内分泌入培养基中的重组外源蛋白的量。在该曲线图中，实心圆(-·-)表示在转化酵母菌株A(酿酒酵母2805/MδLK8)中重组外源蛋白的胞外分泌，而空心正方形(-□-)表示转化酵母菌株B(酿酒酵母BJ3501/MδLK8)中重组外源蛋白的胞外分泌。如图7所示，可以看出，相比于半乳糖转运功能正常的转化酵母菌株A的蛋白质胞外分泌，半乳糖转运降低的转化酵母菌株B的蛋白质胞外分泌表现出2倍以上的增加。
实施例4：混合碳源补料对转化酵母菌株A中半乳糖诱导型启动子活性阻抑的影响以及外源蛋白分泌收率的比较
储存于-70℃下的实施例2-1的转化酵母菌株A以5至10％(v/v)的浓度接种在10mL YPD培养基上，并在30℃和180rpm下在振荡培养箱中进行种子培养24小时(第一种子培养期)。然后，培养的细胞在200mL YPD培养基中传代，并在相同的培养条件下进行种子培养24小时(第二种子培养期)。在由4％(w/v)酵母提取物、3％(w/v)酪蛋白氨基酸、0.05％(w/v)组氨酸、0.05％(w/v)尿嘧啶、2％(w/v)葡萄糖和3％(w/v)半乳糖组成的培养基中进行分批培养，同时分别调节培养条件至30℃、600rpm和pH5.0。通过根据溶解氧的量改变搅拌器的速度，调控所述分批培养。在分批培养的后期，溶解氧下降，原因在于细胞呼吸旺盛。为了防止溶解氧的下降，调控空气供应和搅拌速度，以使溶解氧保持高于最大溶解氧的40％，直至分批培养完成。之后，在由3％(w/v)酵母提取物(Difco，USA)、2％(w/v)蛋白胨(Difco，USA)、0.2％(w/v)组氨酸(Sigma，USA)和0.1％(w/v)尿嘧啶(Sigma，USA)组成的培养基中进行分批补料培养。作为对照组，半乳糖的浓度被调节至50％(w/v)。对于葡萄糖和半乳糖之比为1:4的实验组，葡萄糖和半乳糖被分别加至10％(w/v)葡萄糖和40％(w/v)半乳糖的浓度。对于葡萄糖和半乳糖之比为1:1的实验组，葡萄糖和半乳糖被分别加至25％(w/v)葡萄糖和25％(w/v)半乳糖的浓度。对于葡萄糖和半乳糖之比为4:1的实验组，葡萄糖和半乳糖被分别加至40％(w/v)葡萄糖和10％(w/v)半乳糖的浓度。
通过调控液体培养基的供应速度以确保溶解氧被维持在最大溶解氧的20至80％的水平、培养基中剩余总还原糖(半乳糖+葡萄糖)的浓度被维持在0.5至5％(w/v)的水平以及葡萄糖浓度被维持在0.1g/L以下，进行分批补料培养。在分批培养和分批补料培养期间，样品被定期收集，并进行在600nm处的OD测定、碳源测定和分泌外源蛋白(LK8)的量化(表1)。
通过测量培养基中葡萄糖和半乳糖的残留量，进行碳源测定。首先，通过使用葡萄糖分析试剂盒(Glucose-E Kit，目录号BC103-E，Young-DongPharm.，Seoul，Korea)的酶促方法，如下进行葡萄糖浓度的测定。收集的样品在12,000rpm下离心，并取出所得到的上清液。混合包含在使用所述酶促法的上述分析试剂盒中的100mL稀释的PGO酶粉(过氧化物酶100U+葡萄糖氧化酶500U)、以及100mL的缓冲液，以制备显色试剂。20μl的葡萄糖标准样品被加入3mL的显色试剂。根据如上所述的相同方法，20μl的分析样品也被加入该显色试剂。所得到的混合物在37℃下反应5min，并在505nm的波长下测定每一样品的吸光度(OD)。葡萄糖标准样品和分析样品的吸光度值被应用于给定的方程，并计算培养基中残留葡萄糖的量。通过测量总还原当量的DNS(3，5-二硝基水杨酸)分析，测定培养基中的总碳源。葡萄糖和半乳糖都是还原糖，并对相同当量的DNS显色试剂都表现出相同的应答。100μl的分析样品被加至1mL的DNS试剂，其中基于总共300mL的该DNS试剂，2M氢氧化钠、0.25g 3，5-二硝基水杨酸和75g酒石酸钠钾被加入。随后煮沸该混合物约5分钟，并测量550nm下的吸光度，以测定培养基中剩余的总碳源。以与实施例3中相同的方式，通过HPLC分析，测定分泌入培养基中的外源蛋白的量。
表1
在不同比例的半乳糖和葡萄糖下分批补料培养转化酵母菌株A后的每细胞产率和每诱导物产率
| 培养基中葡萄糖:半乳糖的重量比 | 消耗的总半乳糖(g) | 分泌的LK8(mg/L) | 细胞生长(OD600) | Yp/i1)(mg/g) | Yp/x2)(mg/L/OD) |
| 对照(仅半乳糖) | 270 | 100 | 120 | 0.37 | 0.83 |
| 1:4 | 200 | 114 | 100 | 0.57 | 1.14 |
| 1:1 | 190 | 150 | 88 | 0.79 | 1.70 |
| 4:1 | 78 | 44 | 77 | 0.56 | 0.57 |
1)Yp/i：每诱导物产率(诱导物产率)，单位：每表达诱导物(半乳糖)的分泌外源蛋白量
2)Yp/x：每细胞产率(产品产率)，单位：每细胞的分泌外源蛋白量
当在完成分批培养之后在仅半乳糖作为碳源的情况下以及在具有不同比例的半乳糖和葡萄糖的情况下进行分批补料培养时，分别比较细胞生长、碳源消耗和外源蛋白分泌。
如表1所示，相比于其它实验组，仅使用半乳糖作为唯一碳源的分批补料培养表现出可达约100mg/L的浓度的外源蛋白(LK8)胞外分泌，并显示出最高的细胞生长(OD600＝120)。
当细胞在1:4的葡萄糖和半乳糖下分批补料培养时，外源蛋白的分泌表现出可达114mg/L的水平，而每添加的表达诱导物(半乳糖)的外源蛋白分泌增加40％。添加的葡萄糖在进行分批培养的24小时内被完全消耗，并且在分批补料培养期间加入的葡萄糖也被立即消耗，以保持0.1g/L以下的残留浓度。
相比于其它实验组，经在1:1的葡萄糖和半乳糖下分批补料培养，LK8的分泌显示出可达约150mg/L的最大值。此外，确认了相比于对照组，胞外分泌增加50％，并且每细胞产率(Yp/x：mg/L/OD600)和每诱导物产率(Yp/i，mg/g)分别增加104％和114％，从而确认了外源蛋白分泌效率的增加。
经在4:1的葡萄糖和半乳糖下分批补料培养，外源蛋白的表达和分泌受到抑制，原因在于高比例的葡萄糖，从而仅表现出约44mg/L的最大分泌。
实施例5：混合碳源补料对转化酵母菌株B中半乳糖诱导型启动子活性阻抑的影响以及外源蛋白分泌收率的比较
除了实施例2-2中构建的转化酵母菌株B被用作菌株之外，分别比较当在仅半乳糖作为碳源的情况下以及在具有不同比例的半乳糖和葡萄糖的情况下进行转化酵母菌株B的分批补料培养时，细胞生长、碳源消耗和外源蛋白分泌(见表2)。
表2
在不同比例的半乳糖和葡萄糖下分批补料培养转化酵母菌株B后的每细胞产率和每诱导物产率
| 培养基中葡萄糖：半乳糖的重量比 | 消耗的总半乳糖(g) | 分泌的LK8(mg/L) | 细胞生长(OD600) | Yp/i1)(mg/g) | Yp/x2)(mg/L/OD) |
| 对照(仅半乳糖) | 800 | 250 | 62 | 0.31 | 4.03 |
| 1:4 | 604 | 300 | 39 | 0.50 | 7.84 |
| 2:3 | 287 | 350 | 47 | 1.22 | 7.44 |
| 1:1 | 240 | 330 | 69 | 1.06 | 5.19 |
| 3:2 | 180 | 140 | 50 | 0.53 | 2.8 |
1)Yp/i：每诱导物产率(诱导物产率)，单位：每表达诱导物(半乳糖)的分泌外源蛋白量
2)Yp/x：每细胞产率(产品产率)，单位：每细胞的分泌外源蛋白量
如表2所示，仅使用半乳糖作为唯一碳源的分批补料培养表现出约250mg/L的浓度的外源蛋白(LK8)胞外分泌。
当在1:4的葡萄糖和半乳糖下进行分批补料培养时，外源蛋白的分泌表现出可达300mg/L的水平。此外，葡萄糖在进行分批培养的24小时内被完全消耗，并且在分批补料培养期间加入的葡萄糖也被立即消耗。
经在2:3的葡萄糖和半乳糖下分批补料培养，LK8的最大分泌出现在160小时的时间点，并且反应细胞生长的吸光度为OD600＝47。与糖累积有关，还确认了葡萄糖和半乳糖都被用作碳源。外源蛋白的最大分泌量是约350mg/L，从而表明达到该最大分泌量的时间相比于其它实验组最短。此外，确认了相比于对照组，外源蛋白分泌增加40％，并且每细胞产率(Yp/x：mg/L/OD600)和每诱导物产率(Yp/i，mg/g)分别增加293％和85％，从而确认了外源蛋白分泌效率的显著增加。
相比于其它实验组，经在1:1的葡萄糖和半乳糖下分批补料培养，细胞生长最活跃。此外，LK8的分泌量显示出显著高的可达约350mg/L的值。然而，经与显示出相似的最大分泌量、使用2:3的葡萄糖和半乳糖的实验比较，使用1:1的葡萄糖和半乳糖的实验经过大约380小时来达到350mg/L的分泌量，这表明需要大约2.5-倍长的培养期来达到外源蛋白的同一最大分泌水平。
经在3:2的葡萄糖和半乳糖下分批补料培养，细胞生长相对高，而糖消耗也活跃。然而，外源蛋白的表达和分泌受到抑制，原因在于高比例的葡萄糖，从而仅表现出约140mg/L的最大分泌。
实施例6：在酵母菌株A和B中经由PDI1基因的过表达来增加外源蛋白的分泌效率
6-1.PDI1-共表达菌株的构建
6-1-1.PDI1表达载体的构建
为了确保可通过半乳糖诱导表达蛋白质二硫键异构酶(PDI)，根据下列方法，编码蛋白质二硫键异构酶的PDI1基因被插入含有GAL10启动子的表达载体：首先，为了除去2μ酵母复制原点，用Mun I和SnaB I切割pESC-URA(Stratagene，USA)，并用DNA聚合酶(Klenow片段，New EnglandBiolabs，USA)处理，从而使所得到的5.9-kb平末端DNA片段再连接，以获得优化的载体pMK71。使用得到的载体pMK71、作为模板的酿酒酵母2805-衍生染色体、以及两个引物PDI1F：5′-ATAAGAATGCGGCCGCCATACATCTATCCCGTTATGAAG-3′(SEQID NO：17)和PDI1R：5′-GGACTAGTTTACAA TTCATCGTGAATGGCATC-3′(SEQ ID NO：18)，进行PCR，以获得含有PDI1基因的1.7-kbDNA片段，所述PDI1基因具有Not I/Spe I限制性切割位点并如SEQ ID NO：9所示。然后，线性化的pMK71和1.7-kb DNA片段分别用Not I和Spe I切割，而切割的产物互相连接，以构建PDI1基因表达载体，其被命名为pMPDI1(图8)。图8是pMPDI1表达载体的切割图谱，所述pMPDI1表达载体适于在外源蛋白在酵母中表达后允许通过半乳糖进行蛋白质二硫键异构酶(PDI1)共表达。
6-1-2.PDI1-共表达LK8生产菌株的构建
转化酵母菌株A和B分别用在实施例6-1-1中构建的载体pMPDI1转化。使用Alkali Cation Yeast Transformation Kit(Q-BIO gene，Canada)，根据生产商的说明，进行转化。如此转化酵母菌株分别被称为酿酒酵母2805/MδLK8/PDI和酿酒酵母BJ3501/MδLK8/PDI。
6-2.PDI1对外源蛋白分泌的共表达效应以及酵母菌株A和B之间的比较
为了比较PDI1基因对外源蛋白分泌的共表达效应，转化酵母菌株A和B以及pMPDI1-转化酵母菌株A和B(酿酒酵母2805/MδLK8/PDI和酿酒酵母BJ3501/MδLK8/PDI)在-70℃储藏下取出，然后以与实施例3相同的方式进行分批补料培养，以诱导外源蛋白质的表达和分泌(见表3)。
表3
在存在或不存在PDI1基因共表达的情况下，在转化酵母菌株A和B中外源蛋白的最大胞外分泌之比较
1)对照：无PDI1的共表达
由表3可见，酿酒酵母2805/MδLK8表现出100mg/L的LK8分泌，而酿酒酵母2805/MδLK8/PDI1表现出130mg/L的LK8分泌，因此表明，在酿酒酵母2805/MδLK8/PDI1中实现了更高的外源蛋白分泌。
此外，另一酵母菌株酿酒酵母BJ3501/MδLK8表现出250mg/L的LK8分泌，而酿酒酵母BJ3501/MδLK8/PDI1表现出430mg/L的LK8分泌，从而进一步表明在具有PDI1共表达的酵母菌株中，外源蛋白的分泌更高。也就是说，在两种不同的菌株，具有PDI1共表达的酵母菌株表现出比无PDI1共表达的酵母菌株更高的LK8分泌量。
尽管为了说明的目的，已经公开了本发明的优选实施方式，但本领域普通技术人员将理解，不背离如所附权利要求所公开的发明的范围和精神，各种变化、添加和替换是可能的。
序列表
序列表以电子形式附上
序列表
<110>财团法人牧岩生命工学研究所
<120>在酵母表达系统中增强重组外源蛋白的分泌效率的方法
<130>4p-10-03
<160>14
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>453
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<220>
<221>promoter
<222>(1)..(453)
<223>GAL1promoter
<400>1
agtacggatt agaagccgcc gagcgggtga cagccctccg aaggaagact ctcctccgtg 60
cgtcctcgtc ttcaccggtc gcgttcctga aacgcagatg tgcctcgcgc cgcactgctc 120
cgaacaataa agattctaca atactagctt ttatggttat gaagaggaaa aattggcagt 180
aacctggccc cacaaacctt caaatgaacg aatcaaatta acaaccatag gatgataatg 240
cgattagttt tttagcctta tttctggggt aattaatcag cgaagcgatg atttttgatc 300
tattaacaga tatataaatg caaaaactgc ataaccactt taactaatac tttcaacatt 360
ttcggtttgt attacttctt attcaaatgt aataaaagta tcaacaaaaa attgttaata 420
tacctctata ctttaacgtc aaggagaaaa aac 453
<210>2
<211>507
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<220>
<221>promoter
<222>(1)..(507)
<223>GAL10promoter
<400>2
tcaaaaatca tcgcttcgct gattaattac cccagaaata aggctaaaaa actaatcgca 60
ttatcatcct atggttgtta atttgattcg ttcatttgaa ggtttgtggg gccaggttac 120
tgccaatttt tcctcttcat aaccataaaa gctagtattg tagaatcttt attgttcgga 180
gcagtgcggc gcgaggcaca tctgcgtttc aggaacgcga ccggtgaaga cgaggacgca 240
cggaggagag tcttccttcg gagggctgtc acccgctcgg cggcttctaa tccgtacttc 300
aatatagcaa tgagcagtta agcgtattac tgaaagttcc aaagagaagg tttttttagg 360
ctaagataat ggggctcttt acatttccac aacatataag taagattaga tatggatagt 420
tatatggata tgtatatggt ggtaatgcca tgtaatatga ttattaaact tctttgcgtc 480
catccaaaaa aaaagtaaga atttttg 507
<210>3
<211>625
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<220>
<221>promoter
<222>(1)..(625)
<223>GAL7promoter
<400>3
ggagttcagt gataaaagtg tcacagcgaa tttcctcata tgtagggacc gaattgttta 60
caagttctct gtaccaccat ggagacatca aagattgaaa atctatggaa agatatggac 120
ggtagcaaca agaatatagc acgagccgcg gatttatttc gttacttttg atatcactca 180
caactattgc gaagcgcttc agtgaaaaaa tcataaggaa aagttgtaaa tattattggt 240
actattcgtt tggtaaagta gagggggtaa tttttcccct ttattttgtt catacattct 300
taaattgctt tgcctctcct tttggaaagc tatacttcgg agcactgttg agcgaaggct 360
cattagatat attttctgtc attttcctta acccaaaaat aagggagagg gtccaaaaag 420
cgctcggaca actgttgacc gtgatccgaa ggactggcta tacagtgttc acaaaatagc 480
caagctgaaa ataatgtgta gcctttagct atgttcagtt agtttggcta gcaaagatat 540
aaaagcaggt cggaaatatt tatgggcatt attatgcaga gcatcaacat gataaaaaaa 600
acagttgaat attccctcaa aaatg 625
<210>4
<211>85
<212>PRT
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>4
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg
85
<210>5
<211>26
<212>PRT
<213>Saccharomyces cerevisiae killer virus M1
<400>5
Met Thr Lys Pro Thr Gln Val Leu Val Arg Ser Val Ser Ile Leu Phe
1 5 10 15
Phe Ile Thr Leu Leu His Leu Val Val Ala
20 25
<210>6
<211>19
<212>PRT
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>6
MetLeu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys
1 5 10 15
Ile Ser Ala
<210>7
<211>17
<212>PRT
<213>Kluyveromyces lactis
<400>7
Met Asn Ile Phe Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Phe Val Gln Gly
1 5 10 15
Leu
<210>8
<211>48
<212>PRT
<213>Pichia acaciae
<400>8
Met Leu Ile Ile Val Leu Leu Phe Leu Ala Thr Leu Ala Asn Ser Leu
1 5 10 15
Asp Cys Ser Gly Asp Val Phe Phe Gly Tyr Thr Arg Gly Asp Lys Thr
20 25 30
Asp Val His Lys Ser Gln Ala Leu Thr Ala Val Lys Asn Ile Lys Arg
35 40 45
<210>9
<211>1569
<212>DNA
<213>Saccharomyces cerevisiae
<300>
<301>Tachikawa，H.etal.
<302>Molecular structure of a yeastgene，PDI1，encoding protein
disulfide isomerase thatis essential for cell growth
<303>J.Biochem.
<304>110
<305>2
<306>306-313
<400>9
atgaagtttt ctgctggtgc cgtcctgtca tggtcctccc tgctgctcgc ctcctctgtt 60
ttcgcccaac aagaggctgt ggcccctgaa gactccgctg tcgttaagtt ggccaccgac 120
tccttcaatg agtacattca gtcgcacgac ttggtgcttg cggagttttt tgctccatgg 180
tgtggccact gtaagaacat ggctcctgaa tacgttaaag ccgccgagac tttagttgag 240
aaaaacatta ccttggccca gatcgactgt actgaaaacc aggatctgtg tatggaacac 300
aacattccag ggttcccaag cttgaagatt ttcaaaaaca gcgatgttaa caactcgatc 360
gattacgagg gacctagaac tgccgaggcc attgtccaat tcatgatcaa gcaaagccaa 420
ccggctgtcg ccgttgttgc tgatctacca gcttaccttg ctaacgagac ttttgtcact 480
ccagttatcg tccaatccgg taagattgac gccgacttca acgccacctt ttactccatg 540
gccaacaaac acttcaacga ctacgacttt gtctccgctg aaaacgcaga cgatgatttc 600
aagctttcta tttacttgcc ctccgccatg gacgagcctg tagtatacaa cggtaagaaa 660
gccgatatcg ctgacgctga tgtttttgaa aaatggttgc aagtggaagc cttgccctac 720
tttggtgaaa tcgacggttc cgttttcgcc caatacgtcg aaagcggttt gcctttgggt 780
tacttattct acaatgacga ggaagaattg gaagaataca agcctctctt taccgagttg 840
gccaaaaaga acagaggtct aatgaacttt gttagcatcg atgccagaaa attcggcaga 900
cacgccggca acttgaacat gaaggaacaa ttccctctat ttgccatcca cgacatgact 960
gaagacttga agtacggttt gcctcaactc tctgaagagg cgtttgacga attgagcgac 1020
aagatcgtgt tggagtctaa ggctattgaa tctttggtta aggacttctt gaaaggtgat 1080
gcctccccaa tcgtgaagtc ccaagagatc ttcgagaacc aagattcctc tgtcttccaa 1140
ttggtcggta agaaccatga cgaaatcgtc aacgacccaa agaaggacgt tcttgttttg 1200
tactatgccc catggtgtgg tcactgtaag agattggccc caacttacca agaactagct 1260
gatacctacg ccaacgccac atccgacgtt ttgattgcta aactagacca cactgaaaac 1320
gatgtcagag gcgtcgtaat tgaaggttac ccaacaatcg tcttataccc aggtggtaag 1380
aagtccgaat ctgttgtgta ccaaggttca agatccttgg actctttatt cgacttcatc 1440
aaggaaaacg gtcacttcga cgtcgacggt aaggccttgt acgaagaagc ccaggaaaaa 1500
gctgctgagg aagccgatgc tgacgctgaa ttggctgacg aagaagatgc cattcacgat 1560
gaattgtaa 1569
<210>10
<211>1601
<212>DNA
<213>Conus textile
<400>10
gaattcgccc ttactaggat ccgcatcatc atgaagtttt catcttgttt agttttaact 60
cttctggttt ttgtatctgc cgaagatgtc gaacaggagg aaaatgtcca cgttttgacg 120
aagaaaaatt ttgactcctt cataactgat aatgagttcg tgcttgtgga attttatgct 180
ccctggtgtg gccattgcaa ggcattggca ccagaatatg ccaaagctgc aacaactttg 240
gaaaacgaga agtcgaacat caagttggcc aaagtggatg ctactgtgga gggggatttg 300
gcctccaaat ttgatgttcg tggataccca acaatcaagt tcttccgtaa agagaagcct 360
gatggtccag cagactacag tggtggtcgc caagctaaag atattgttga ctggctgaag 420
aagaagacag gaccaccagc caaggaactg aaggagaaag atgaagtcaa ggcttttgtg 480
gaaaaagatg aagttgttgt cattggtttc ttcaaggatc aagaatccac aggtgctttg 540
gccttcaaaa aggcagctgc cggcattgat gacattccat ttgccatcac ttcagaagat 600
catgttttca aggagtacaa gatggacaaa gatggcattg tactgctgaa gaagtttgat 660
gagggccgta atgacttcga ggggaatttg gaggaggagg aggccatcgt caagcacgtc 720
agggaaaacc aactgccact ggttgtagaa ttcactcaag agtctgccca gaagatcttt 780
ggaggtgagg tgaagaacca cattctgctg ttcctgaaga aggaaggtgg agaagacaca 840
attgaaaagt tcagaagtgc agctgaggat ttcaaaggaa aggtcctgtt tatctacttg 900
gacactgaca atgaggagaa tggacgcatc acagagttct ttggcttgaa ggatgatgaa 960
atcccagctg tgcgtctgat ccagctggca gaggacatgt caaagtacaa gcctgagtcc 1020
tcggatttgg aaactgccac catcaagaaa tttgtccagg atttcctgga tgggaaactg 1080
aagccccatc tgatgtctga ggatgtgcct ggtgactggg atgccaagcc tgtgaaggtc 1140
ctggtgggca agaacttcaa ggaagtggcg atggacaaat caaaggctgt ctttgtggag 1200
ttctatgctc cctggtgtgg acactgcaag cagctggccc ctatctggga tgagctgggt 1260
gaaaagtaca aggacagcaa ggacattgtt gttgccaaga tggatgccac tgccaatgag 1320
attgaagagg tcaaagtgca gagcttcccc accctcaagt acttccccaa ggacagcgag 1380
gaggctgtgg actacaatgg cgagagaacc ttggatgctt tcgttaaatt cctcgagagc 1440
ggtggcacgg aaggtgctgg agtgcaagag gatgaggaag aggaagagga agatgaggag 1500
ggtgatgatg aagatctgcc aagagatgaa ctgtagctgt catcggcatc tagactcgaa 1560
gggcgaattc cagcacactg gcggccgtta ctagtggatc c 1601
<210>11
<211>1458
<212>DNA
<213>Caenorhabditis elegans
<300>
<301>Page，A.P.
<302>Cyclophilin and protein disulfide isomerase genes are
co-transcribed in a functionally related manner in Caenorhabditis
elegans
<303>DNA Cell Biology
<304>16
<305>11
<306>1335-1343
<400>11
atgtcactgt cagtgtcctt tatcttcctc ctggtcgcat caatcggagc agttgttgct 60
gacagcgaaa acgtgcttgt tctcactgaa agcaatttcg aagaaactat caatggaaat 120
gagtttgttc tagtcaaatt ctatgctcca tggtgtgtac attgcaagtc tcttgctcca 180
aagtacgacg aagccgccga tttgctgaag gaggaaggat ccgatatcaa gctcgccaag 240
gttgacgcca ccgaaaacca agctcttgca tccaagttcg aggtccgtgg atatccaact 300
atcctctact tcaagagtgg aaagccaacg aaatacaccg gaggacgcgc caccgctcaa 360
attgtcgatt gggtcaagaa gaagagtgga ccaactgtta ccactgttga gtcagttgag 420
caactcgagg aattgaaggg aaagaccaga gttgttgttc ttggatactt caaggacgcg 480
aaatctgatg ctgctaccat ctacaacgaa gttgctgatt ctgtcgatga cgcattcttc 540
gccgttgccg gttctgctga ggttgctgct gccgcatctt tgaatgaaga tggagtcgct 600
cttatccgca ctgatggaga cgacagcgag actagcacaa ttgctgaagc tgaaatcacc 660
aacaccatcg ctcttaagca atggctccac gcttacaagc tctctgccgt gaccgagttc 720
acccacgaat ctgctcaaga aatcgtcgga ggagacctca aaaagttcca ctttttgatc 780
atccgcaagt cagactcttc tttcgatgag actattgcca agttcactga ggtcgctaag 840
aagttccgtg ctaagatcgt ctttgttctt ctcgacgttg atgttgaaga gaacgcaaga 900
attctcgagt tcctcggagt cgatgccaag aacaccccag ccaacagaat tgtcagcctt 960
gccgatcaag ttgagaagtt caagccacaa gaaggagaag atttcgaagc tttcaccaac 1020
tcatatttgg aaggaaagtc tgctcaagac ttgaaggctc aagatcttcc agaagattgg 1080
aatgcactcc cagttaaggt tctcgtcgcc tccaacttca acgaaattgc ccttgatgaa 1140
accaagactg tcttcgtcaa attctacgcc ccatggtgcg gacattgcaa gcaactggtt 1200
ccagtttggg atgagcttgc tgagaagtac gagtccaacc caaatgttgt cattgcaaag 1260
cttgatgcta ctctcaacga gcttgccgac gtcaaggtca actctttccc aaccctgaag 1320
ctgtggccag ccggatcttc taccccagtc gactatgatg gagacagaaa cctcgagaag 1380
ttcgaagaat ttgtcaacaa gtatgctgga tctgcttccg aatctgaaac cgcatctcag 1440
gatcacgaag agctttaa 1458
<210>12
<211>1536
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<300>
<301>Desilva，M.G.et al.
<302>Characterization and chromosomal localization of a new protein
disulfide isomerase，PDIp，highly expressed in human pancreas
<303>DNACell Biology
<304>15
<305>1
<306>9-16
<400>12
atggcttcgt gcccatgggg tcaggaacag ggagcgagga gcccctcgga ggagcctcca 60
gaggaggaaa tccccaagga ggatgggatc ttggtgctga gccgccacac cctgggcctg 120
gccctgcggg agcaccctgc cctgctggtg gaattctatg ccccgtggtg tgggcactgc 180
caggccctgg cccccgagta cagcaaggca gctgccgtgc tcgcggccga gtcaatggtg 240
gtcacgctgg ccaaggtgga tgggcccgcg cagcgcgagc tggctgagga gtttggtgtg 300
acggagtacc ctacgctcaa gttcttccgc aatgggaacc gcacgcaccc cgaggagtac 360
acaggaccac gggacgctga gggcattgcc gagtggctgc gacggcgggt ggggcccagt 420
gccatgcggc tggaggatga ggcggccgcc caggcgctga tcggtggccg ggacctagtg 480
gtcattggct tcttccagga cctgcaggac gaggacgtgg ccaccttctt ggccttggcc 540
caggacgccc tggacatgac ctttggcctc acagaccggc cgcggctctt tcagcagttt 600
ggcctcacca aggacactgt ggttctcttc aagaagtttg atgaggggcg ggcagacttc 660
cccgtggacg aggagcttgg cctggacctg ggggatctgt cgcgcttcct ggtcacacac 720
agcatgcgcc tggtcacgga gttcaacagc cagacgtctg ccaagatctt cgcggccagg 780
atcctcaacc acctgctgct gtttgtcaac cagacgctgg ctgcgcaccg ggagctccta 840
gcgggctttg gggaggcagc tccccgcttc cgggggcagg tgctgttcgt ggtggtggac 900
gtggcggccg acaatgagca cgtgctgcag tactttggac tcaaggctga ggcagccccc 960
actctgcgct tggtcaacct tgaaaccact aagaagtatg cgcctgtgga tgggggccct 1020
gtcaccgcag cgtccatcac tgctttctgc catgcagtcc tcaacggcca agtcaagccc 1080
tatctcctga gccaggagat accccctgat tgggatcagc ggccagttaa gaccctcgtg 1140
ggcaagaatt ttgagcaggt ggcttttgac gaaaccaaga atgtgtttgt caagttctat 1200
gccccgtggt gcacccactg caaggagatg gcccctgcct gggaggcatt ggctgagaag 1260
taccaagacc acgaggacat catcattgct gagctggatg ccacggccaa cgagctggat 1320
gccttcgctg tgcacggctt ccctactctc aagtacttcc cagcagggcc aggtcggaag 1380
gtgattgaat acaaaagcac cagggacctg gagactttct ccaagttcct ggacaacggg 1440
ggcgtgctgc ccacggagga gtccccggag gagccagcag ccccgttccc ggagccaccg 1500
gccaactcca ctatggggtc caaggaggaa ctgtag 1536
<210>13
<211>1547
<212>DNA
<213>Aspergillus oryzae
<400>13
atgcggactt tcgcaccttg gatcttgagc cttctagggg cttctgctgt agcttctgct 60
gccgatgcga ctgccgaagc tccctccgat gtggtctcgc tcaccgggga cacattcgaa 120
actttcgtca aggagcatga cctagttttg gccgagtttt ttgctccctg gtgtggccat 180
tgcaaggctc tcgctccgaa atacgagcag gccgccactg agttaaagga aaagaacatt 240
ccgctggtca aggttgattg caccgaggaa gaggctcttt gtagggacca aggtgttgaa 300
ggttacccca cgctgaagat tttccgtggc cttgacgctg ttaagcctta tcagggagct 360
cgtcagaccg aggcgattgt ttcatacatg gtcaagcagt cactacctgc tgtgtcccct 420
gtcaccccag aaaacctcga agagatcaag actatggaca agattgtcgt tattggttat 480
atcgcgtctg acgaccagac tgccaatgat atattcacca cttttgccga gtcacagaga 540
gacaactacc tcttcgccgc cacaagtgat gcatcgatcg ctaaggcaga aggtgttaag 600
caaccttcga ttgttctcta taaagacttc gatgaaaaga aagctactta tgatggagag 660
attgaacagg atgccctcct cagttgggtc aagactgcca gtaccccctt ggtgggcgag 720
ctgggcccag agacttactc cggatatata acggctggca ttccactggc gtacattttc 780
gccgaaacca aagaagagcg tgagcagttc accgaggagt tcaagttcat cgccgagaaa 840
cacaagggtt ccatcaatat tgtcaccatt gacgccaagt tgtacggcgc tcatgcaggc 900
aatctcaacc ttgacccctc caagttccct gcattcgcta ttcaagaccc tgaaaagaac 960
gccaagtatc cttatgacca gtcgaaggaa gtcaaggcca aggatatcgg taaattcatc 1020
caagacgttc ttgatgataa agtagagcca agcattaagt ctgaggctat tcctgagact 1080
caggaaggtc ctgttactgt tgttgtcgcg cattcctata aggatctcgt ccttgacaac 1140
gagaaggacg tccttctcga attttatgcg ccatggtgcg gacactgcaa ggcccttgcc 1200
ccgaagtacg aggaacttgc aagcctttac aaggatattc ctgaagttac catcgccaaa 1260
attgacgcaa cggccaacga tgtccccgac tccattacag gatttcctac tattaagctc 1320
ttcgctgccg gcgccaagga ctccccagtt gaatatgaag gctctcgcac ggtggaggac 1380
ctcgccaact tcgtcaagga gaatggcaag cacaaggtcg atgctcttga agttgatccg 1440
aagaaagaac aggagagtgg cgatgccacc gagactcggg ccgcctctga cgagaccgaa 1500
actcctgctg ctactagcga tgacaagtct gagcatgatg aattgta 1547
<210>14
<211>1593
<212>DNA
<213>Candida boidinii
<400>14
atgaagttaa ctaatttcaa agttattgcc acaattcttg cttgtttaac agttgttaga 60
gctgatgatg gtggtgccat tgcatctcca gattccgctg ttgttaaatt aactgctgat 120
tcattcgaat cattcatgaa agaaaatcca ttagtcttag ctgaattttt tgctccttgg 180
tgtggtcatt gtaaaagatt gggtcctgaa tttcaagttg ctgctgataa attagttgaa 240
aaagatatta gattagctca aattgattgt accgaagaaa aagatttatg ttcttcttat 300
ggtattaaag gttacccaac tttaaaagtc tttagaggtt acgaaaatga accttctgat 360
tatgctggtc aaagaacttc agattcaatc atttcttata tggttaaaca atcaacccca 420
cctgtctcca tcgttgatga tctctcagat atcgaagata caattaaaga atcaaatgat 480
cctgtcttta ttcaagtctt accaaaaggt tctaaatctg ttgaagccgg taactcaact 540
ttctttgaaa tcgctaatgg tttaagagat aactactctt ttatttcaac aacaagtact 600
gaattctctt caaaatactt gaaaggtatt aaaaaatcag atactccatc ttatattctc 660
tttagaccaa atgaagaatt gtctgatgct tcaatctata aatttgatga aattgatgat 720
actcatttaa tcgaattctt aaacgttgaa tcaaaacctt tattcggtga aatggatggt 780
tcttctttcc aatcttatat ggaaatgaaa ttaccagttg cttattattt ctataatgaa 840
atctctgaaa aagatgccgt ctctgatgcc atcagtaaat tagctaaaac tcatagaggt 900
aaagttaatt tcgttggttt agacgcttct aaatatggtt tacacgctaa gaatattaac 960
atgaaggaag aattccctct tttcgctatt cacgatttag caactgaatt aaaatacggt 1020
atctcccaag ataaaccatt agataataaa ttaattccaa aattcgttga agatttcgtt 1080
gctggtaaat tagaagcaat cattaaatca gaaccaatcc cagaaactca agattctcca 1140
gtttaccatt tagtcggtaa agaacatgat aaaattatta cctctgataa agatgtctta 1200
gttaaatatt acgctccatg gtgtggtcac tgtaaaaaat tagctccagt ctttgaagaa 1260
ttagctgctg tttatgaatc agttgctcca ggtaaagtct tattagctga tttagatcat 1320
actgaaaatg atgtcaccgg tgttcacatt gaaggttacc caactatcgt cttataccca 1380
gccgatggtt cagaaccagt tgtttacgaa ggtaacagat cttttgaatc tttctccgat 1440
ttcattaaag aaaaaggttc atcaggtgtt gatgctaatg cattaaaaga accttaccca 1500
gaagaaggta ctgaaggtgc tccagttgat ccagaatcag ttggtgatgc tgaaaaagaa 1560
gatgattctg ctgctgatgt tcgtgatgaa tta 1593
<2l0>15
<211>1518
<212>DNA
<213>Humicola insolens
<400>15
atgcataagg cccagaagtt cgcgctcggc ctgcttgccg cggcggcagt tgccacagct 60
tcggatgttg tccagctgaa gaaggacacc ttcgacgact tcatcaagac gaatgacctt 120
gttctcgccg aattcttcgc gccgtggtgc ggtcactgca aggctctcgc ccccgagtac 180
gaggaggctg cgaccacact gaaggagaag aacatcaagc tcgccaaggt ggactgcaca 240
gaggagacgg acctctgcca acaacatggt gttgagggct acccgactct caaggtcttc 300
cgcggccttg acaacgtctc cccctacaag ggccagcgca aggctgctgc tatcacctcg 360
tacatgatca agcagtctct gcccgccgtg tccgaggtca cgaaggacaa cctggaggag 420
ttcaagaagg ccgacaaggc cgtccttgtc gcctatgtgg atgcttccga caaggcgtcc 480
agtgaggttt tcacccaggt cgccgagaag ctgcgcgaca actacccgtt cggctccagc 540
agcgatgctg cgctggccga ggctgagggc gtcaaggctc ccgctatcgt cctttacaag 600
gactttgatg agggcaaggc ggtcttctcc gagaagttcg aggtggaggc gatcgagaag 660
ttcgccaaga cgggcgccac cccgctcatt ggcgagattg gccccgaaac ctactccgac 720
tacatgtcgg ccggcatccc tctggcctac attttcgccg aaacggccga ggagcggaag 780
gagctcagcg acaagctcaa gccgatcgcc gaggctcagc gcggcgtcat taactttggt 840
actattgacg ccaaggcttt tggtgcccac gccggcaacc tgaacctgaa gaccgacaag 900
ttccccgcct tcgccatcca ggaggtcgcc aagaaccaga agttcccctt cgatcaggag 960
aaggagatca ccttcgaggc gatcaaggct ttcgtcgacg actttgtcgc cggtaagatc 1020
gagcccagca tcaagtcgga gccgatccct gagaagcagg agggccccgt caccgtcgtc 1080
gttgccaaga actacaatga gatcgtcctg gacgacacca aggatgtgct gattgagttc 1140
tacgccccgt ggtgcggcca ctgcaaggcc ctggctccca agtacgagga gctcggcgcc 1200
ctgtatgcca agagcgagtt caaggaccgg gtcgtcatcg ccaaggttga tgccacggcc 1260
aacgacgttc ccgatgagat ccagggattc cccaccatca agctgtaccc ggccggtgcc 1320
aagggtcagc ccgtcaccta ctctggctcg cgcactgtcg aggacctcat caagttcatc 1380
gccgagaacg gcaagtacaa ggccgccatc tcggaggatg ccgaggagac gtcgtccgca 1440
accgagacga ccaccgagac ggccaccaag tcggaggagg ctgccaagga gacggcgacg 1500
gagcacgacg agctctag 1518
<210>16
<211>258
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>gene
<222>(1)..(258)
<223>LK8cDNA
<400>16
gaacaggact gcatgtttgg gaatgggaaa ggataccggg gcaagaaggc aaccactgtt 60
actgggacgc catgccagga atgggctgcc caggagcccc atagacacag cacgttcatt 120
ccagggacaa ataaatgggc aggtctggaa aaaaattact gccgtaaccc tgatggtgac 180
atcaatggtc cctggtgcta cacaatgaat ccaagaaaac tttttgacta ctgtgatatc 240
cctctctgtg catcctct 258
<210>17
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Foward Primer for S.cerevisiae PDI1(PDI1F)
<400>17
ataagaatgc ggccgccata catctatccc gttatgaag 39
<210>18
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Reverse Primer for S.cerevisiae PDI1(PDI1R)
<400>18
ggactagttt acaattcatc gtgaatggca tc 32
Claims (6)
1.一种提高外源蛋白的分泌效率的方法，其包括步骤：
(a)用重组外源基因构建体转化酵母宿主，所述构建体包含半乳糖诱导型启动子、分泌信号序列和编码外源蛋白的基因，以构建转化酵母菌株；和
(b)在所述半乳糖诱导型启动子的活性受到调控的条件下培养所述转化酵母菌株，其中通过降低半乳糖从培养基进入所述转化酵母菌株的转运速率对所述半乳糖诱导型启动子活性进行调控；所述半乳糖诱导型启动子的活性受到调控的条件是在培养时向所述培养基共添加半乳糖和葡萄糖，其中所述半乳糖和葡萄糖的比例在4∶1至1∶1的范围内；且所述培养通过分批补料培养进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过将重组外源基因构建体插入所述酵母宿主的染色体或者通过将所述重组外源基因构建体以环状载体的形式引入所述酵母宿主的细胞质，进行步骤(a)的所述转化。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述半乳糖诱导型启动子是SEQID NO：1所示的GAL1启动子、SEQ ID NO：2所示的GAL10启动子、或SEQ ID NO：3所示的GAL7启动子。
4.根据权利要求1所述的方法，其中通过使所述转化酵母的半乳糖通透酶基因缺陷或部分破坏从而使其成为非功能性的来降低半乳糖从培养基进入所述转化酵母菌株的转运速率。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述酵母宿主用重组外源基因构建体转化，所述重组外源基因构建体含有在半乳糖诱导型启动子的调控下表达的蛋白质二硫键异构酶编码基因。
6.根据权利要求1所述的方法，进一步在步骤(a)和(b)之间包括步骤(a-1)：用含有在半乳糖诱导型启动子的调控下表达的蛋白质二硫键异构酶编码基因的重组外源基因构建体进一步转化步骤(a)的转化酵母菌株。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2006/002374 WO2007148840A1 (en) | 2006-06-20 | 2006-06-20 | Methods for enhancing a secretion efficiency of recombinant foreign protein in yeast expression system |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101473035A CN101473035A (zh) | 2009-07-01 |
| CN101473035B true CN101473035B (zh) | 2012-08-22 |
Family
ID=38833566
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2006800550471A Expired - Fee Related CN101473035B (zh) | 2006-06-20 | 2006-06-20 | 在酵母表达系统中增强重组外源蛋白的分泌效率的方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8298787B2 (zh) |
| EP (1) | EP2041280B1 (zh) |
| JP (1) | JP4955764B2 (zh) |
| CN (1) | CN101473035B (zh) |
| WO (1) | WO2007148840A1 (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2722389B1 (en) * | 2011-06-15 | 2018-03-07 | Hong Jin Kim | Method for enhancing the production yield of human papillomavirus l1 protein |
| CN104066841B (zh) * | 2012-01-23 | 2018-01-02 | 旭硝子株式会社 | 表达载体和蛋白质的制造方法 |
| CN106834334A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-06-13 | 上海科技大学 | 一种用于酵母表面展示抗体Fab片段的质粒 |
| CN113528527B (zh) * | 2021-07-29 | 2023-09-29 | 华东理工大学 | 一种用于重组蛋白表达的启动子及其应用 |
| ES2955461A1 (es) | 2022-05-24 | 2023-12-01 | Univ Valencia Politecnica | Levadura y plasmido para la exposicion de proteinas en superficie |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1256711A (zh) * | 1997-05-27 | 2000-06-14 | (株)韩-合纤 | 利用来自酿酒酵母的高效表达载体制备重组蛋白质的方法 |
| WO2005071074A1 (en) * | 2004-01-27 | 2005-08-04 | Mogam Biotechnology Research Institute | Transformed saccharomyces cerevisiae and method for mass-production of lk8 protein using the same |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ207925A (en) | 1983-04-25 | 1988-05-30 | Genentech Inc | Yeast expression vehicle consisting of a yeast promoter and signal peptide encoding region linked to a heterologus peptide coding region; expression and culture |
| US4929553A (en) | 1987-05-29 | 1990-05-29 | Canadian Patents & Development Ltd. | Protease for specific processing of secreted proteins |
| US6291205B1 (en) * | 1992-06-12 | 2001-09-18 | Merck & Co., Inc. | Method of increasing production of disulfide bonded recombinant proteins by saccharomyces cerevisiae |
| WO1997012044A2 (en) | 1995-09-25 | 1997-04-03 | Chiron Corporation | Pichia secretory leader for protein expression |
-
2006
- 2006-06-20 CN CN2006800550471A patent/CN101473035B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2006-06-20 WO PCT/KR2006/002374 patent/WO2007148840A1/en active Application Filing
- 2006-06-20 US US12/305,768 patent/US8298787B2/en active Active
- 2006-06-20 JP JP2009516385A patent/JP4955764B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-06-20 EP EP06768960.4A patent/EP2041280B1/en not_active Not-in-force
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1256711A (zh) * | 1997-05-27 | 2000-06-14 | (株)韩-合纤 | 利用来自酿酒酵母的高效表达载体制备重组蛋白质的方法 |
| WO2005071074A1 (en) * | 2004-01-27 | 2005-08-04 | Mogam Biotechnology Research Institute | Transformed saccharomyces cerevisiae and method for mass-production of lk8 protein using the same |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 王颖等.工业酵母菌株转化体系的建立.《工业微生物》.2004,第34卷(第1期),6-11. * |
| 说明书第2页第4段. |
| 说明书第6页第1－4段，尤其是第3段第4行 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8298787B2 (en) | 2012-10-30 |
| WO2007148840A1 (en) | 2007-12-27 |
| US20100184136A1 (en) | 2010-07-22 |
| CN101473035A (zh) | 2009-07-01 |
| JP2009540820A (ja) | 2009-11-26 |
| EP2041280B1 (en) | 2016-08-10 |
| EP2041280A4 (en) | 2009-12-02 |
| EP2041280A1 (en) | 2009-04-01 |
| JP4955764B2 (ja) | 2012-06-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101310023B (zh) | 用于生产重组蛋白质的翻译融合配偶体文库和从中筛选的翻译融合配偶体 | |
| EP2681308B1 (en) | Protein expression | |
| KR20170138543A (ko) | 메틸영양성 효모를 유전적으로 조작하는 발현 구축물 및 방법 | |
| CN102686731A (zh) | 生产具有改善的分泌效率的重组蛋白质的方法 | |
| CN101473035B (zh) | 在酵母表达系统中增强重组外源蛋白的分泌效率的方法 | |
| US9012367B2 (en) | Rapid screening method of translational fusion partners for producing recombinant proteins and translational fusion partners screened therefrom | |
| KR101087760B1 (ko) | 신규한 재조합 효모 균주 및 이를 이용한 에탄올 및 목적단백질의 동시 생산 방법 | |
| CN102459609B (zh) | 包含表达增强子的真核宿主细胞 | |
| Fowler et al. | Gene expression systems for filamentous fungi | |
| KR20130000883A (ko) | 클루이베로마이세스 마르시아누스 내에서의 향상된 단백질 생산 | |
| JP2023512309A (ja) | 高収量組換え微生物のためのシステムおよび方法ならびにその使用 | |
| EP2886642B1 (en) | Transformant of schizosaccharomyces pombe mutant, and cloning vector | |
| KR100672745B1 (ko) | 효모 발현시스템에서의 재조합 외래단백질의 분비효율을향상시키는 방법 | |
| KR100798894B1 (ko) | 재조합단백질 생산용 단백질융합인자 | |
| RU2771079C1 (ru) | Трансформант дрожжей Ogataea haglerorum - продуцент фитазы Escherichia coli | |
| KR102613937B1 (ko) | 갈락토스 이용에 관여하는 모든 유전자가 결손된 효모 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질 생산방법 | |
| KR20070101190A (ko) | 재조합단백질 생산용 단백질융합인자 | |
| Asgari et al. | Expression of growth factors in Dictyostelium discoideum | |
| Goossens et al. | Cloning, expression, and purification of the N-terminal domain of the Flo1 flocculation protein from Saccharomyces cerevisiae in Pichia pastoris | |
| WO2004003205A1 (en) | Hansenula polymorpha mutant strains with defect in outer chain biosynthesis and the production of recombinant glycoproteins using the same strains | |
| CN117777276A (zh) | 一种促进马克斯克鲁维酵母分泌表达人乳铁蛋白的方法 | |
| CN118165850A (zh) | 活性pcp蛋白的重组菌及pcp蛋白的制备方法 | |
| EP2388331A1 (en) | Constitutive promoter | |
| Mohamed et al. | HIGH LEVEL EXPRESSION OF RECOMBINANT ERYTHROPOIETIN IN HANSENULA POLYMORPHA | |
| WO2002010342A2 (en) | Yeast strains |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120822 Termination date: 20210620 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |