CN104066841B - 表达载体和蛋白质的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于分泌要取得的蛋白质(Z)或具有该蛋白质(Z)部分的融合蛋白的表达载体、使用该表达载体的转化体的制造方法、该转化体和使用该转化体制造蛋白质的方法。表达载体，其特征在于，具有表达盒，该表达盒包含编码下述蛋白质(Y)的结构基因序列(y)、位于所述结构基因序列(y)的下游的编码作为要取得的蛋白质的蛋白质(Z)的结构基因序列(z)、用于表达包括所述蛋白质(Y)部分和所述蛋白质(Z)部分的融合蛋白的启动子序列和终止子序列，所述蛋白质(Y)为PDI1(蛋白质二硫键异构酶，Protein disulfide isomerase1)的全长蛋白质、PDI1的部分蛋白质或它们的突变蛋白质。

Description

表达载体和蛋白质的制造方法
技术领域
本发明涉及用于分泌生产蛋白质的表达载体、使用该表达载体的转化体及其制造方法以及使用该转化体的蛋白质的制造方法。
背景技术
一直以来，使用基因重组技术的外源蛋白质的生产大量采用大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和枯草杆菌(Bacillus)属等的微生物或者动物细胞、植物细胞和昆虫细胞进行。来源于各种生物的蛋白质被视作生产的对象，已经有许多蛋白质采用这些生物进行工业化生产，用于医药品等。特别是分泌生产外源蛋白质与生产的外源蛋白质积聚于细胞内的情况相比，不仅从纯化容易的角度来看是优选的方法，而且分泌生产的蛋白质进入宿主细胞的分泌途径，因此被进行适当的处理，例如二硫键的形成和糖链的形成，具有可形成与天然的蛋白质相同或非常接近的立体结构的优点。
通过以在外源蛋白质的N末端添加分泌信号肽的状态生产，可分泌生产外源蛋白质。例如，作为被粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe，以下称为S.pombe)识别的分泌信号，可例举来源于参与S.pombe的接合的接合信息素(P-因子)的前体的分泌信号的多肽(例如参照专利文献1)。如果培养导入了编码使该多肽融合于外源蛋白质的N末端的融合蛋白的结构基因的S.pombe的转化体，则所生产的该融合蛋白在高尔基体或内质网(ER)中被分离为信号肽和外源蛋白质，外源蛋白质被从宿主细胞分泌至培养基中。
此外，对于分泌蛋白质的生产量增加，已知通过使PDI1与外源的分泌蛋白质共表达，该分泌蛋白质的分泌生产量(宿主所生产的蛋白质中被分泌的量)增加(例如参照非专利文献1)。PDI1(蛋白质二硫键异构酶，Protein disulfide isomerase1)是具有分子伴侣功能，集中存在于ER的蛋白质。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第1996/23890号
非专利文献
非专利文献1:Mukaiyama等，Applied Microbiology and Biotechnology，(2010)，86卷，4号，1135～1143页.
发明的概要
发明所要解决的技术问题
专利文献1中记载的分泌信号肽在可通过以S.pombe为宿主的蛋白质表达系统分泌生产要取得的蛋白质且可实现其大量生产方面非常优秀。但是，根据要取得的蛋白质的种类，生产量可能会不足，需要构建以更高的效率分泌生产蛋白质的表达系统。此外，在所述共表达系统中，也存在下述问题：根据要取得的蛋白质的种类，生产量不足，表达的蛋白质无法高效地通过分泌途径，分泌途径中途的该蛋白质凝集等。
于是，本发明的目的在于提供可高效地分泌生产要取得的蛋白质或包含该蛋白质部分的融合蛋白的表达载体，以及从导入了该表达载体的转化体制造该蛋白质或该融合蛋白的方法。
解决技术问题所采用的技术方案
本发明人为了解决上述课题而进行了认真研究，结果发现通过使作为要取得的蛋白质的蛋白质(Z)与已知具有分子伴侣功能的PDI1(蛋白质二硫键异构酶，Proteindisulfide isomerase1)融合而表达，可高效地分泌生产该蛋白质(Z)或包含该蛋白质(Z)部分的融合蛋白，从而完成了本发明。
本发明的表达载体、转化体的制造方法、转化体、蛋白质的制造方法和克隆载体为下述[1]～[15]。
[1]表达载体，其特征在于，具有表达盒，该表达盒包含编码下述蛋白质(Y)的结构基因序列(y)、位于所述结构基因序列(y)的下游的编码作为要取得的蛋白质的蛋白质(Z)的结构基因序列(z)、用于表达包括所述蛋白质(Y)部分和所述蛋白质(Z)部分的融合蛋白的启动子序列和终止子序列，
所述蛋白质(Y)为PDI1(蛋白质二硫键异构酶，Protein disulfide isomerase1)的全长蛋白质、PDI1的部分蛋白质或它们的突变蛋白质。
[2]如上述[1]的表达载体，其中，所述蛋白质(Y)具有PDI1的内质网转移信号。
[3]如上述[1]或[2]的表达载体，其中，所述蛋白质(Y)为由内质网转移信号、a结构域、b结构域、x结构域构成的部分蛋白质，由内质网转移信号、a结构域、b结构域、b’结构域、x结构域构成的部分蛋白质，或它们中的任一个的部分蛋白质的突变蛋白质。
[4]如上述[1]～[3]中的任一项的表达载体，其中，所述PDI1为酵母的PDI1、来源于丝状菌的PDI1或来源于人的PDI1。
[5]如上述[1]～[4]中的任一项的表达载体，其中，在所述结构基因序列(y)与所述结构基因序列(z)之间具有编码由氨基酸或肽形成的剪切位点(W)的结构基因序列(w)，该剪切位点(W)作为在细胞内或细胞外于所述蛋白质(Z)部分的N末端侧被剪切的位点起作用。
[6]如上述[5]的表达载体，其中，所述剪切位点(W)为在细胞内于所述融合蛋白的蛋白质(Z)部分的N末端侧被剪切的位点。
[7]如上述[6]的表达载体，其中，所述剪切位点(W)为KR(K:赖氨酸,R:精氨酸)，或与所述蛋白质(Z)部分结合的C末端侧为KR的氨基酸数3以上的肽。
[8]如上述[5]的表达载体，其中，所述剪切位点(W)为被可在所述融合蛋白的蛋白质(Z)部分的N末端侧进行剪切的蛋白酶识别的位点。
[9]如上述[1]～[8]中的任一项的表达载体，其中，所述蛋白质(Y)至少包括内质网转移信号、a结构域、b结构域。
[10]转化体的制造方法，其特征在于，将上述[1]～[9]中的任一项的表达载体导入宿主细胞中。
另外，作为转化体的制造方法，较好是以下的[10-2]的制造方法。[10-2]转化体的制造方法，其特征在于，将上述[1]～[9]中的任一项的表达载体导入宿主细胞中，将上述表达载体中的表达盒整合至宿主细胞的染色体的至少一处。
[11]转化体，其特征在于，具有上述[1]～[9]中的任一项的表达载体作为染色体外基因。
[12]转化体，其特征在于，在染色体中具有上述[1]～[9]中的任一项的表达载体中的表达盒。
此外，上述[11]和[12]的转化体的宿主细胞较好是酵母或丝状菌，更好是所述宿主细胞为裂殖酵母(schizosaccharomyces)属酵母。
[13]蛋白质的制造方法，其特征在于，培养上述[11]或[12]的转化体，从所得的培养液取得所述融合蛋白或所述蛋白质(Z)。
另外，作为蛋白质的制造方法，较好是以下的[13-2]和[14]的制造方法。[13-2]蛋白质的制造方法，其特征在于，对在染色体中具有上述[6]或[7]的表达载体中的表达盒或者具有上述[6]或[7]的表达载体作为染色体外基因的转化体进行培养，从所得的培养液取得所述蛋白质(Z)。
[14]蛋白质的制造方法，其特征在于，对在染色体中具有上述[8]的表达载体中的表达盒或者具有上述[8]的表达载体作为染色体外基因的转化体进行培养，从所得的培养液取得所述融合蛋白，再通过蛋白酶在该融合蛋白的蛋白质(Z)部分的N末端侧剪切而制造所述蛋白质(Z)。
[15]克隆载体，其特征在于，具有可在宿主细胞内起作用的启动子序列、位于该启动子序列的下游且受该启动子控制的编码下述蛋白质(Y)的结构基因序列(y)、位于该结构基因序列(y)的下游且用于导入结构基因的克隆位点、和可在该宿主细胞内起作用的终止子序列，
所述蛋白质(Y)为PDI1的全长蛋白质、PDI1的部分蛋白质或它们的突变蛋白质。
另外，作为上述克隆载体，较好是下述[15-2]的克隆载体。[15-2]克隆载体，其中，在所述结构基因序列(y)与所述克隆位点之间，具有编码KR或者编码C末端侧为KR的氨基酸数3以上的肽的结构基因序列(w)。
发明的效果
通过本发明的表达载体，可制造能以从宿主被分泌的状态生产蛋白质的转化体。
此外，通过使用该转化体的本发明的蛋白质的制造方法，可高效地分泌蛋白质。
从转化体分泌的蛋白质为要取得的蛋白质(即，蛋白质(Z))的情况下，可从培养液取得蛋白质(Z)。此外，分泌的蛋白质为融合蛋白的情况下，可从该融合蛋白制造蛋白质(Z)。
附图的简单说明
图1是PDI1的结构的模式图。
图2是对酵母、丝状菌和来源于人的PDI的氨基酸序列进行比对而得的图。
图3是试验例1的CBB染色的染色图像。
图4是试验例1的使用抗hTF抗体的蛋白质印迹的染色图像。
图5是试验例2的CBB染色的染色图像。
图6是表示试验例2的各菌株的PDI1的全长或部分蛋白质的相对分泌量的图表。
图7是试验例3的CBB染色的染色图像。
图8是表示试验例3的各菌株的hTF的相对分泌量的图表。
图9是试验例4的CBB染色的染色图像。
图10是表示试验例4的各菌株的EGFP(包括融合蛋白)的相对分泌量的图表。
图11是试验例5的CBB染色的染色图像。
图12是试验例5的CBB染色的染色图像。
图13是试验例6的CBB染色的染色图像。
图14是表示试验例6的各菌株的hTF的相对分泌量的图表。
图15是试验例7的CBB染色的染色图像。
图16是表示试验例7的各菌株的hTF的相对分泌量的图表。
图17是试验例8的CBB染色的染色图像。
图18是试验例9的CBB染色的染色图像。
图19是表示试验例9的各菌株的hTF的相对分泌量的图表。
图20是试验例10的CBB染色的染色图像。
图21是表示试验例10的各菌株的各蛋白质的相对分泌量的图表。
图22是试验例11的CBB染色的染色图像。
图23是试验例12的CBB染色的染色图像。
图24是表示试验例12的各菌株的hTF的相对分泌量的图表。
图25是试验例13的CBB染色的染色图像。
图26是表示试验例13的各菌株的EGFP的相对分泌量的图表。
图27是试验例14的CBB染色的染色图像。
图28是表示试验例14的各菌株的EGFP的相对分泌量的图表。
实施发明的方式
[表达载体]
本发明的表达载体的特征在于，具有表达盒，该表达盒包含编码下述蛋白质(Y)的结构基因序列(y)、位于所述结构基因序列(y)的下游的编码作为要取得的蛋白质的蛋白质(Z)的结构基因序列(z)、用于表达包括所述蛋白质(Y)部分和所述蛋白质(Z)部分的融合蛋白的启动子序列和终止子序列，所述蛋白质(Y)为PDI1的全长蛋白质、PDI1的部分蛋白质或它们的突变蛋白质。
通过使用PDI1的全长蛋白质、PDI1的部分蛋白质或该突变蛋白质代替分泌信号肽，可高效地以从宿主被分泌的状态生产蛋白质。分泌的蛋白质为蛋白质(Z)的情况下，可从培养液获得该蛋白质(Z)。分泌的蛋白质为融合蛋白的情况下，可在培养液中或从培养液分离后，在融合蛋白的蛋白质(Z)部分的N末端侧对融合蛋白进行剪切，获得蛋白质(Z)。
(蛋白质(Y))
蛋白质(Y)为PDI1的全长蛋白质、PDI1的部分蛋白质或它们的突变蛋白质。
PDI1是具有分子伴侣功能，集中存在于ER的酶，承担对ER中的蛋白质进行重折叠的作用。PDI1中，除了承担分子伴侣功能的部分以外，还具有作为用于使在核糖体中合成的PDI1转移至ER的信号起作用的部分(ER转移信号)、作为用于将PDI1定位于ER的信号起作用的部分(ER滞留信号)等。
如上所述，已知通过使PDI1与外源的分泌蛋白质共表达，该分泌蛋白质的分泌生产量增加。这推测是由于合成的分泌蛋白质通过ER时，由于PDI1的分子伴侣功能，适当的高级结构形成得到促进。PDI1通过ER滞留信号而通常集中存在于ER，但过度表达的情况下，被分泌至细胞外。
PDI1为在体内负责蛋白质的重折叠的酶。图1中表示PDI1的结构的模式图。PDI1自N末端起依次具有ER转移信号、a结构域、b结构域、b’结构域、x结构域、a’结构域和包括ER滞留信号(ADEL)的c结构域。在a结构域和a’结构域中分别有各1个分子伴侣活性的活性中心(CGHC)，a结构域、b结构域、b’结构域和a’结构域这4个均形成硫氧还蛋白折叠(Cell杂志，第124卷，61-73页，2006年)。此外，酿酒酵母中，C末端部分有利于酶活性。
蛋白质(Y)是具有作为用于使在核糖体中合成的蛋白质转移至ER的信号起作用的部分(ER转移信号)的蛋白质。将编码使其它蛋白质融合于蛋白质(Y)的C末端而得的融合蛋白的结构基因导入宿主细胞的情况下，如果培养所得的转化体，则在核糖体中合成的该融合蛋白转移至ER。然后，与PDI1的过度表达的情况同样，ER内的该融合蛋白被分泌至转化体的细胞外。在ER和高尔基体等转化体内于该融合蛋白的蛋白质(Y)部分与蛋白质(Z)部分之间被剪切的情况下，通过剪切而生成的蛋白质(Z)被分泌至转化体的细胞外。因此，蛋白质(Y)需要ER转移信号或具有与其相同的功能的部分，PDI1的部分蛋白质或突变蛋白质的情况下，该蛋白质具备ER转移信号或具有与其相同的功能的部分。
另一方面，ER滞留信号具有使包含该信号的蛋白质滞留于ER内而不分泌的倾向，因而可能会阻碍融合蛋白的分泌。因此，使具有蛋白质(Y)部分和蛋白质(Z)部分的融合蛋白分泌的情况下，较好是蛋白质(Y)为不具有ER滞留信号的部分蛋白质或者不具备具有与ER滞留信号相同的功能的部分的突变蛋白质。此外，在细胞内融合蛋白被剪切为蛋白质(Z)和具有除此以外的蛋白质(Y)部分的蛋白质的情况下，蛋白质(Z)不具有ER滞留信号，因此其分泌不会受到阻碍。因此，使蛋白质(Z)分泌的情况下，蛋白质(Y)可具备ER滞留信号或具有与ER滞留信号相同的功能的部分。
转移至ER内的融合蛋白被转化为适当的高级结构，因而推测该融合蛋白或由该融合蛋白的剪切产生的蛋白质(Z)的分泌得到促进，因此较好是蛋白质(Y)至少部分维持分子伴侣功能。因此，蛋白质(Y)较好是具有a结构域，更好是具有a结构域和b结构域。可具有a’结构域代替a结构域，也可具有b’结构域代替b结构域。
PDI1的部分蛋白质是指从PDI1的全长蛋白质缺失至少一部分区域的蛋白质。例如，可以是从PDI1的全长蛋白质缺失整个结构域的部分蛋白质，也可以是缺失结构域内的一部分区域的部分蛋白质。
如上所述，作为蛋白质(Y)需要ER转移信号，还较好是具有分子伴侣功能，因此较好是蛋白质(Y)具有a结构域。另外，较好是具有b结构域。ER滞留信号被认为可能会阻碍蛋白质的分泌，因而较好是蛋白质(Y)没有ER滞留信号，也较好是没有存在ER滞留信号的c结构域。
如果以结构域和信号为单位表示部分蛋白质，可例举例如自N末端起依次由ER转移信号、a结构域、b结构域构成的部分蛋白质[以下记作PDI1(ab)]，由ER转移信号、a结构域、b结构域、b’结构域构成的部分蛋白质[以下记作PDI1(abb’)]，由ER转移信号、a结构域、b结构域、x结构域构成的部分蛋白质[以下记作PDI1(abx)]，由ER转移信号、a结构域、b结构域、b’结构域、x结构域构成的部分蛋白质[以下记作PDI1(abb’x)]，作为没有c结构域的PDI1的部分蛋白质[以下记作PDI1(-c)]，作为没有ER滞留信号的PDI1的部分蛋白质[以下记作PDI1(-ADEL)]。
所述部分蛋白质中的结构域和信号只要保持该结构域或信号的功能，N末端侧和/或C末端侧就可比原来的结构域或信号区域短。例如，所述PDI1(ab)中，b结构域的C末端侧可比原来的b结构域短。此外，在原来该结构域邻接的结构域不存在的情况下，所述部分蛋白质中的各结构域可包含该不存在的邻接结构域的区域的一部分(但是，如下所述，失去不存在的邻接结构域的功能)。例如，所述PDI1(ab)中，b结构域的C末端侧可延伸至b’结构域侧而具有b’结构域的N末端侧的一部分。同样地，PDI1(abx)中，可在b结构域和x结构域之间存在b’结构域的一部分。
所述部分蛋白质中不存在的结构域和信号只要失去它们的功能，所述部分蛋白质中可存在其一部分的区域。例如，PDI1(-c)可在其a’结构域的C末端侧存在c结构域的N末端侧的一部分。
ER转移信号具有使合成的蛋白质转移至ER的功能。此外，a结构域和a’结构域起到分子伴侣功能的活性中心的作用，与底物蛋白质(作为基于PDI的分子伴侣功能所作用的对象的蛋白质)进行二硫键交换反应。b结构域和b’结构域起到与底物蛋白质结合的功能。c结构域有利于a’结构域结构的稳定化，间接对分子伴侣功能有贡献。另外，c结构域包含ER滞留信号，因此还具有使合成的蛋白质集中存在于ER的功能。例如，某种部分蛋白质是否保持a结构域或a’结构域的功能通过对该部分蛋白质进行ScRNase测试、Di-E-GSSG测试等直接测定分子伴侣功能来考察。
本发明中，PDI1的突变蛋白质是指PDI1的全长蛋白质的突变蛋白质和PDI1的部分蛋白质的突变蛋白质。PDI1的突变蛋白质是PDI1的全长蛋白质或PDI1的部分蛋白质中1个或2个以上的氨基酸置换、缺失、插入和/或添加而得的蛋白质。从PDI1的全长蛋白质或部分蛋白质被置换等的氨基酸的数量较好是1～20个，更好是1～10个，进一步更好是1～5个。
本发明中，作为蛋白质(Y)使用的PDI1的突变蛋白质只要具有ER转移信号的功能，可保持分子伴侣功能，也可是失去分子伴侣功能的突变蛋白质。作为失去分子伴侣功能的突变蛋白质，可例举对于PDI1的全长蛋白质或至少包含a结构域和a’结构域中的任一个的部分蛋白质将分子伴侣活性的活性中心(CGHC)中的半胱氨酸残基(C)置换为例如丝氨酸残基(C)等其它氨基酸的突变蛋白质。
本发明中，由于蛋白质(Z)和所述融合蛋白的分泌生产效率非常高，作为蛋白质(Y)，较好是使用PDI1(abx)、PDI1(abb’x)或该突变蛋白质，更好是使用PDI1(abx)或PDI1(abb’x)，进一步更好是使用PDI1(abx)。此外，如上所述，这些部分蛋白质内的各结构域与原来的结构域相比，可以更短，也可以更长。
对于作为蛋白质(Y)的基础的PDI1，只要在宿主细胞中，合成的所述融合蛋白转移至ER，该融合蛋白或作为其剪切物的蛋白质(Z)被分泌至细胞外，就可使用来自于任意生物种的蛋白质，考虑导入表达载体的宿主的生物种适当确定。本发明的表达载体被用于以酵母或丝状菌为宿主的表达系统的情况下，作为蛋白质(Y)的来源，较好是来源于酵母、丝状菌或人的PDI1，更好是来源于酵母(Saccharomyces)属酵母、裂殖酵母属酵母、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属酵母、毕赤酵母(Pichia)属酵母、假丝酵母(Candida)属酵母、曲霉(Aspergillus)属丝状菌、木霉(Trichoderma)属丝状菌、镰刀菌(Fusarium)属丝状菌、青霉(Penicillium)属丝状菌、或支顶孢(Acremonium)属丝状菌的PDI1。作为裂殖酵母属酵母，可例举S.pombe、日本裂殖酵母(Schizosaccharomyces japonicus)、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)等。
作为来源于酵母或丝状菌的PDI1，具体可例举S.pombe的PDI1(UniProt(全球蛋白质资源，Universal Protein Resource)的ID编号:Q10057)(序列编号1)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)的PDI1(UniProt的ID编号:Q9Y8F3)(序列编号2)、酿酒酵母的PDI1(UniProt的ID编号:P17967)(序列编号3)、毕赤酵母(Pichia pastoris)的PDI(UniProt的ID编号:B3VSN1)(序列编号4)、白色念珠菌(Candida albicans)的PDI(UniProt的ID编号:C4YSW3)(序列编号5)、里氏木霉(Trichoderma reesei)的PDI1(PRF(蛋白质研究基金会，Protein Research Foundation)的ID编号:2520344A)(序列编号6)和米曲霉(Aspergillus oryzae)的PDIA(UniProt的ID编号:Q00248)(序列编号7)。
对来自于各酵母和丝状菌的PDI的氨基酸序列进行比对而得的图示于图2。图2中也示出同样进行了比对的来源于人的PDI的氨基酸序列。图2的比对使用通用的比对制作软件ClustalW(得分矩阵采用BLOSUM得分矩阵)制成。来源于其它生物种的PDI1中的图1所示的结构域结构例如可使用各种比对制作软件将该PDI1的氨基酸序列与S.pombe的PDI1比对来确定。
作为蛋白质(Y)，可以是由下述(1)～(4)中的任一氨基酸序列形成，具有包含合成的蛋白质(Y)部分的融合蛋白转移至ER的功能的蛋白质。以序列编号1表示的氨基酸序列是S.pombe的PDI1的全长氨基酸序列。(1)以序列编号1表示的氨基酸序列。(2)以序列编号1表示的氨基酸序列中，1个或2个以上的氨基酸置换、缺失、插入和/或添加了的氨基酸序列。(3)与以序列编号1表示的氨基酸序列具有30％以上的同源性的氨基酸序列。(4)与以序列编号1表示的氨基酸序列具有70％以上的类似性的氨基酸序列。(5)包含所述(1)～(4)中的任一项中记载的氨基酸序列的氨基酸序列。
作为所述(3)的氨基酸序列，与以序列编号1表示的氨基酸序列的同源性较好是在30％以上，更好是在35％以上，进一步更好是在40％以上，进一步更好是在60％以上，进一步更好是在80％以上，特别好是在90％以上。
对于氨基酸序列之间的同源性，将2个氨基酸序列按照对应的氨基酸最大程度一致的条件在与插入和缺失对应的部分加入空隙并并列，作为相对于所得的比对中除了空隙之外的整个氨基酸序列、一致的氨基酸的比例求得。
同源性的比例的数值为将整个氨基酸序列平均而得的值，可部分存在比该数值高的部分和比该数值低的部分。例如，在作为蛋白质(Y)的功能方面并不需要的结构域中的同源性可以较低。承担需要的功能(作为ER转移信号的功能)的部分、承担较好是存在的功能(分子伴侣功能等)的部分的氨基酸序列的同源性越高越好。
此外，作为所述(4)的氨基酸序列，与以序列编号1表示的氨基酸序列的类似性较好是在70％以上，更好是在75％以上，进一步更好是在80％以上，进一步更好是在90％以上。与所述(3)的情况同样，类似性的比例也可根据承担的功能存在类似性更低的部分或类似性更高的部分。
对于氨基酸序列之间的类似性(序列类似性)，将2个氨基酸序列按照对应的氨基酸最大程度一致的条件在与插入和缺失对应的部分加入空隙并并列，作为相对于所得的比对中除了空隙之外的整个氨基酸序列、化学性质类似的氨基酸一致的比例求得。
氨基酸序列之间的同源性和类似性可使用该技术领域中公知的各种同源性检索软件求得。本发明中的氨基酸序列的同源性的值通过以用公知的同源性检索软件ClustalW(得分矩阵采用BLOSUM得分矩阵)得到的比对为基础的计算得到。
化学性质类似的氨基酸具体为以下的组合：
(1)作为具有羟基的亲水性的中性氨基酸的丝氨酸和苏氨酸；
(2)作为体积大的具有疏水性侧链的疏水性氨基酸的甲硫氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；
(3)作为亲水性的酸性氨基酸的天门冬氨酸和谷氨酸；
(4)作为具有羧基酰胺化而得的官能团的亲水性的中性氨基酸的天门冬酰胺和谷氨酰胺；
(5)作为亲水性的碱性氨基酸的赖氨酸、精氨酸和组氨酸；
(6)作为具有芳香环的疏水性氨基酸的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；
(7)侧链的结构类似的天门冬酰胺和天门冬氨酸、或者谷氨酰胺和谷氨酸的组合。
(蛋白质(Z))
本发明的表达载体具有编码蛋白质(Y)的结构基因序列(y)和位于该结构基因序列(y)的下游的编码蛋白质(Z)的结构基因序列(z)。蛋白质(Z)是通过导入本发明的表达载体制成的转化体生产的目标蛋白质。
蛋白质(Z)可以是宿主原来具有的蛋白质，也可以是来源于宿主以外的生物种的蛋白质(异种蛋白质)等宿主原来不具有的外源蛋白质。此外，可以是任一种生物原来具有的天然型的蛋白质，也可以是人工合成的蛋白质，还可以是使2种以上的蛋白质融合而得的嵌合蛋白质。蛋白质(Z)较好是外源蛋白质，更好是作为多细胞生物的动物或植物产生的蛋白质，进一步更好是哺乳动物(包括人)产生的蛋白质。另外，蛋白质(Z)可以具有His标签、FLAG标签、Myc标签、GST标签等蛋白质表达纯化领域中公知的各种标签。
蛋白质(Z)具有二硫键的情况下，蛋白质(Y)较好是具有分子伴侣功能。与蛋白质(Y)的分子伴侣功能消失或降低的情况相比，具有分子伴侣功能的情况下，蛋白质(Y)与蛋白质(Z)的融合蛋白或蛋白质(Z)的分泌生产效率进一步提高。蛋白质(Z)不具有二硫键的情况下，蛋白质(Y)的分子伴侣功能的有无对融合蛋白或蛋白质(Z)的分泌生产效率几乎没有影响。
编码蛋白质(Z)的结构基因序列(z)结合在编码蛋白质(Y)的结构基因序列(y)的下游，以使得结构基因序列(y)和结构基因序列(z)为同一阅读框。由此，具有蛋白质(Y)部分和蛋白质(Z)部分的融合蛋白通过本发明的表达载体表达。
为了取得蛋白质(Z)，较好是在所述结构基因序列(y)与所述结构基因序列(z)之间配置编码由氨基酸或肽形成的剪切位点(W)的结构基因序列(w)，该剪切位点(W)作为在细胞内或细胞外于所述蛋白质(Z)部分的N末端侧被剪切的位点起作用。结构基因序列(z)、结构基因序列(w)、结构基因序列(y)以形成同一阅读框的方式结合。该情况下，核糖体中合成的融合蛋白是具有蛋白质(Y)、剪切位点(W)和蛋白质(Z)依次结合而得的结构的融合蛋白(以下称为融合蛋白(YWZ))。融合蛋白(YWZ)直接从转化体细胞分泌，或者在转化体细胞内被加工(剪切)而生成蛋白质(Z)，该蛋白质(Z)被分泌。融合蛋白(YWZ)在细胞内被加工而分泌蛋白质(Z)的情况下，融合蛋白(YWZ)在ER内或从其移动到的高尔基体内被加工，通过加工生成的蛋白质(Z)被认为经分泌小泡被分泌至细胞外。
为了融合蛋白(YWZ)的加工在蛋白质(Z)部分的N末端侧、即剪切位点(W)与蛋白质(Z)部分之间准确发生，较好是剪切位点(W)的C末端侧由特定的氨基酸或肽形成。作为该剪切位点(W)，较好是由KR(K:赖氨酸，R:精氨酸)形成的序列或C末端的序列为KR的氨基酸数3以上的序列。该融合蛋白(YWZ)中，KR的R与蛋白质(Z)部分的N末端氨基酸结合。C末端的序列为KR的氨基酸数3以上的序列的氨基酸数无限定，较好是在20以下，更好是在10以下。如果剪切位点(W)的长度长，则融合蛋白(YWZ)变大，细胞内的生产效率可能会降低。
融合蛋白(YWZ)被分泌至转化体的细胞外的情况下，通过从所分泌的融合蛋白(YWZ)切离蛋白质(Z)部分，从而制成蛋白质(Z)。为了自融合蛋白(YWZ)容易地制造蛋白质(Z)，剪切位点(W)较好是以在融合蛋白(YWZ)的蛋白质(Z)部分的N末端侧被剪切的方式被蛋白酶识别的位点。该蛋白酶识别融合蛋白(YWZ)中的剪切位点(W)，剪切该剪切位点(W)的C末端侧(即，剪切位点(W)与蛋白质(Z)之间)。
作为具体的所述蛋白酶，可例举肠激酶、Xa因子等。肠激酶是识别DDDDK序列在该肽部分的C末端侧剪切的蛋白酶，Xa因子是识别IEGR序列在该肽部分的C末端侧剪切的蛋白酶。通过使肠激酶与具有由DDDDK形成的序列或C末端的序列为DDDDK的氨基酸数6以上的序列作为剪切位点(W)的融合蛋白(YWZ)作用而获得蛋白质(Z)。同样地，通过使Xa因子与具有由IEGR形成的序列或C末端的序列为IEGR的氨基酸数5以上的序列作为剪切位点(W)的融合蛋白(YWZ)作用而获得蛋白质(Z)。
C末端的序列为DDDDK的氨基酸数6以上的序列或C末端的序列为IEGR的氨基酸数5以上的序列的氨基酸数无限定，较好是在20以下，更好是在10以下。如果剪切位点(W)的长度长，则融合蛋白(YWZ)变大，细胞内的生产效率可能会降低。
(启动子和终止子)
本发明的表达载体在结构基因序列(y)的上游具有启动子，在结构基因序列(z)的下游具有终止子。通过该启动子和终止子，合成具有蛋白质(Y)部分和蛋白质(Z)部分的融合蛋白。
启动子和终止子只要是可在将本发明的表达载体导入宿主的情况下起作用而在该宿主内表达所述融合蛋白即可，可根据宿主的生物种，从公知的启动子和终止子中适当选择使用。本发明中所用的启动子和终止子可以是宿主原来有的序列，也可以是来源于病毒的启动子等宿主原来没有的序列。
宿主采用裂殖酵母属的情况下，作为裂殖酵母属酵母原来具有的启动子，可例举例如乙醇脱氢酶基因启动子、参与硫胺素代谢的nmt1基因启动子、参与葡萄糖代谢的果糖-1,6-二磷酸酶基因启动子、参与分解代谢物抑制的转化酶基因的启动子(参照国际公开第99/23223号)、热休克蛋白基因启动子(参照国际公开第2007/26617号)。
作为可在裂殖酵母属内起作用且外源的启动子，可例举例如日本专利特开平5-15380号公报、日本专利特开平7-163373号公报、日本专利特开平10-234375号公报中记载的来源于动物细胞病毒的启动子，较好是hCMV启动子、SV40启动子。
作为在裂殖酵母属内起作用的终止子，可例举例如日本专利特开平5-15380号公报、日本专利特开平7-163373号公报、日本专利特开平10-234375号公报中记载的来源于人的终止子，较好是人脂皮质蛋白Ⅰ的终止子。
(载体)
本发明的表达载体是具有包含启动子序列、结构基因序列(y)、结构基因序列(z)和终止子序列的表达盒的载体。较好是还在结构基因序列(y)与结构基因序列(z)之间具有所述结构基因序列(w)的载体。表达盒是指表达所述融合蛋白所需的DNA的组合。
较好是该表达盒中在启动子序列的下游且结构基因序列(y)的上游包含5’-非翻译区。此外，较好是在结构基因序列(z)的下游且终止子序列的上游包含3’-非翻译区。另外，在结构基因序列(z)的下游且终止子序列的上游(包含3’-非翻译区的情况下在其上游)具备终止密码子。
此外，本发明的表达载体可仅包含1个该表达盒，也可包含2个以上。
本发明的表达载体是在具有环状DNA结构或线形DNA结构的载体中整合该表达盒而得的载体。作为使用本发明的表达载体而得的转化体，有该表达盒在宿主的细胞内作为染色体外基因保持的转化体和该表达盒整合至宿主细胞的染色体中的转化体。
制作前者的转化体的情况下，本发明的表达载体较好是包含用于在宿主细胞内复制的序列、即自主复制序列(Autonomously Replicating Sequence:ARS)的表达载体。
制作后者的转化体的情况下，本发明的表达载体较好是作为呈线形DNA结构且不具有ARS的载体导入宿主细胞。例如，本发明的表达载体可以是由线形DNA形成的载体，也可以是具备用于在导入宿主时切开成线形DNA的限制酶识别位点的环状DNA结构的载体。本发明的表达载体具有ARS的情况下，可在删除ARS部分形成线形DNA结构或通过使ARS部分断裂而形成使ARS功能失活的线形DNA结构后，导入宿主。
本发明的表达载体较好是具有用于选择转化体的标记物。作为该标记物，可例举例如ura4基因(营养缺陷性互补标记物)、异丙基苹果酸脱氢酶基因(leu1基因)。
本发明的表达载体例如可通过向具有用于导入外源结构基因的克隆位点的公知的多克隆载体中的该克隆位点插入所述融合蛋白的结构基因来构建。此外，还可通过向公知的载体中整合所述表达盒来构建。
本发明的表达载体还可通过使用包含具备用于插入该结构基因序列(z)的克隆位点代替所述结构基因序列(z)的表达盒的克隆载体来构建。例如，本发明的表达载体还可通过向下述克隆载体的克隆位点整合结构基因序列(z)或其部分序列来构建。还可将结构基因序列(w)与结构基因序列(z)一起整合至该克隆位点。
[克隆载体]
本发明的克隆载体的特征在于，具有可在宿主细胞内起作用的启动子序列、位于该启动子序列的下游且受该启动子控制的所述结构基因序列(y)、位于该结构基因序列(y)的下游且用于导入结构基因的克隆位点和可在该宿主细胞内起作用的终止子序列。本发明的克隆载体较好是具有大肠杆菌的DNA复制起点(ori)。由克隆载体构建表达载体时，通常需要扩增表达载体，使用大肠杆菌作为宿主来扩增表达载体。
本发明的克隆载体可还在结构基因序列(y)与克隆位点之间具有所述结构基因序列(w)。特别好是具有编码KR或编码C末端侧为KR的氨基酸数3以上的肽的所述结构基因序列(w)。
本发明的克隆载体具备的克隆位点是该载体中仅存在于该克隆位点的限制酶识别位点。本发明的克隆载体具备的克隆位点可仅具有1个限制酶识别位点，也可是具有2个以上的限制酶识别位点的多克隆位点。作为该多克隆位点，可直接使用公知的多克隆载体具备的多克隆位点，也可使用适当改变公知的多克隆位点而得的位点。
本发明的克隆载体较好是具有用于识别在克隆位点是否导入了蛋白质(Z)的结构基因序列(z)的标记物。作为该标记物，可例举例如lacZ基因、氨苄青霉素抗性基因等可在大肠杆菌内起作用的药剂抗性基因。
本发明的分泌蛋白质用克隆载体可在该克隆位点的下游且终止子序列的上游(包含3’-非翻译区的情况下在其上游)具备终止密码子。
作为用于构建本发明的表达载体和本发明的克隆载体的具体的操作方法，可使用公知的方法。例如，可使用文献[J.Sambrook等,《分子克隆(第二版)(MolecularCloning2nded.)》,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989)]中记载的操作方法。除此之外，可通过采用PCR的酶扩增法和化学合成法等构建。
[转化体及其制造方法]
本发明的转化体的特征在于，在染色体中具有所述表达盒，或具有所述表达盒作为染色体外基因。在染色体中具有表达盒是指在宿主细胞的染色体中的1处以上整合有表达盒，具有表达盒作为染色体外基因是指在细胞内具有包含表达盒的表达载体。由于转化体的传代培养容易，较好是在染色体中具有该表达盒。
本发明的转化体具体通过将本发明的表达载体导入宿主细胞来制造。
(宿主)
本发明的转化体的宿主可以是来源于通常在表达外源蛋白质等时用作宿主的任一生物种的细胞。例如，可以是大肠杆菌等原核细胞，也可以是酵母、丝状菌等真核细胞微生物，还可以是哺乳动物细胞、昆虫细胞等动物细胞，还可以是植物细胞。
宿主可以是野生型的细胞，也可以是在1个或多个基因中导入了突变的突变型的细胞。作为突变型，较好是使1个或多个基因缺失或失活的突变型。作为缺失或失活的基因，可例举例如选自能量代谢相关基因群、蛋白酶相关基因群、减数分裂相关基因群、转录相关基因群，与细胞的生长、分裂、DNA合成相关的基因群，蛋白质合成相关基因群、膜转运相关基因群、细胞结构维持相关基因群、信息传递相关基因群或离子动态平衡相关基因群的一种以上。蛋白酶相关基因群中，特别好是选自编码丝氨酸蛋白酶的基因(丝氨酸蛋白酶基因群)、编码氨肽酶的基因(氨肽酶基因群)、编码羧肽酶的基因(羧肽酶基因群)和编码二肽酶的基因(二肽酶基因群)的一种以上的基因被敲除或失活的突变型。宿主内的ER等中存在的蛋白质(Z)或所述融合蛋白可能会被宿主的蛋白酶分解，也可能会在被分泌至细胞外后被从宿主分泌的蛋白酶等分解，但通过使用1个或多个蛋白酶相关基因缺失或失活的宿主，存在可抑制蛋白质(Z)或所述融合蛋白的分解的倾向。
作为使特定的基因缺失或失活的方法，可使用公知的方法。具体来说，可通过使用Latour法(记载于Nucreic Acids Research杂志,第34卷,e11页,2006年；国际公开第2007/063919号等)来使基因缺失。此外，可通过采用诱变剂的突变分离法(《酵母分子遗传学实验法》，1996年，学会出版中心)或利用PCR(聚合酶链式反应)的随机突变法(PCR MethodsApplication杂志,第2卷,28-33页,1992年)等向基因的一部分导入突变而使该基因失活。
进行特定基因的敲除或失活的部分可以是ORF(开放阅读框)部分，也可以是表达调控序列部分。特别优选的方法是采用将结构基因的ORF部分置换为标记物基因的PCR介导同源重组法(Yeast杂志,第14卷,943-951页,1998年)的敲除或失活的方法。
蛋白酶相关基因的敲除或失活可以是敲除整个基因，也可以是敲除基因的一部分而使基因失活。此外，蛋白质相关基因的失活不仅限于敲除基因的一部分，也指在不敲除的情况下改变蛋白酶相关基因的情况。另外，也可向蛋白酶相关基因的序列中插入其它基因或DNA而使蛋白酶相关基因失活。任一种情况下，都可将蛋白酶相关基因变为编码没有活性的蛋白质的基因，或使蛋白酶相关基因无法转录或翻译，从而使其失活。1个细胞具有2个以上某一种蛋白酶相关基因的情况下，可将它们全部敲除，只要该基因编码的蛋白酶的细胞内活性充分降低，也可残存少量的基因。
另外，宿主较好是使用具有用于筛选转化体的标记物的宿主。例如，较好是使用因某一基因缺失而在生长发育中需要特定营养成分的宿主。通过表达载体进行转化来制造转化体的情况下，通过向该表达载体中预先整合该缺失的基因(营养缺陷性互补标记物)，转化体中宿主的营养缺陷性消失。可通过该宿主与转化体的营养缺陷性的差异对两者进行区分而获得转化体。
例如，可将乳清酸核苷5’-磷酸脱羧酶基因(ura4基因)缺失或失活而呈尿嘧啶缺陷性的裂殖酵母属酵母作为宿主，通过具有ura4基因(营养缺陷性互补标记物)的表达载体进行转化后，筛选尿嘧啶缺陷性消失的酵母，从而获得整合了表达载体的转化体。宿主中因缺失而呈营养缺陷性的基因只要是可用于转化体的筛选即可，并不仅限于ura4基因，可以是异丙基苹果酸脱氢酶基因(leu1基因)等。
作为本发明中所用的宿主，较好是既为微生物又为真核生物的酵母或丝状菌，更好是酵母。这是因为确立有培养方法，也不含内毒素。各种酵母类中，较好是以S.pombe为代表的裂殖酵母属酵母。裂殖酵母属酵母被认为与以酿酒酵母为代表的其它酵母相比，例如细胞周期和染色体的结构、RNA剪接等各种性质更类似于高等动物，生产出的蛋白质的乙酰基化、磷酸化和糖链的添加等翻译后修饰也被认为与动物细胞中的翻译后修饰非常接近(Cell杂志,第45卷,781-782页,1986年；Nature杂志,第318卷,78-80页,1985年；TheJournal of Cell Biology杂志,第109卷,2693-2702页,1989年)。因此，通过使用裂殖酵母属酵母作为用于制造蛋白质(Z)的宿主，被期待可获得与动物细胞同样的更接近天然体的基因产物。培养方法也在酵母类中有许多共通点，可容易地应用其它酵母中已知的发现。作为用作宿主的裂殖酵母属酵母，可例举与上述同样的酵母。其中，从可利用各种有用的突变株的角度来看，特别好是S.pombe。
作为宿主优选的S.pombe可以是野生株，也可以是1个或多个蛋白酶相关基因缺失或失活的突变株。作为该突变株中缺失或失活的蛋白酶相关基因，可例举例如以下的基因。金属蛋白酶基因群：cdb4(SPAC23H4.09)、mas2(SPBC18E5.12c)、pgp1(SPCC1259.10)、ppp20(SPAC4F10.02)、ppp22(SPBC14C8.03)、ppp51(SPAC22G7.01c)、ppp52(SPBC18A7.01)、ppp53(SPAP14E8.04)、oma1(SPAP14E8.04)。丝氨酸蛋白酶基因群：isp6(SPAC4A8.04)、ppp16(SPBC1711.12)、psp3(SPAC1006.01)、sxa2(SPAC1296.03c)。半胱氨酸蛋白酶基因群：ppp80(SPAC19B12.08)、pca1(SPCC1840.04)、cut1(SPCC5E4.04)、gpi8(SPCC11E10.02c)、atg4(SPAC19B12.08)。天门冬氨酸蛋白酶基因群：sxa1(SPAC26A3.01)、yps1(SPCC1795.09)、ppp81(SPAC25B8.17)。甲硫氨酸氨肽酶基因：fma2(APBC14C8.03)。
作为使蛋白酶相关基因缺失或失活而得的裂殖酵母属酵母宿主，记载于例如国际公开第2002/101038号、国际公开第2007/015470号等。
(转化方法)
使用所述表达载体，对宿主进行转化。转化方法可使用任何公知的转化方法。作为该转化方法，可例举例如乙酸锂法、电穿孔法、原生质球(spheroplast)法、玻璃珠法等目前公知的方法和日本专利特开2005-198612号公报记载的方法等。此外，还可使用市售的酵母转化用试剂盒。
进行转化后，通常对所得的转化体进行筛选。作为筛选方法，可例举例如以下所示的方法。通过能以所述营养缺陷性标记物选择转化体的培养基进行筛选，从所得的菌落选择多个。接着，将它们分别进行液体培养后，考察各培养液中的蛋白质(Z)或所述融合蛋白的量，筛选该蛋白质的分泌表达量更多的转化体。此外，通过对筛选的转化体进行采用脉冲场凝胶电泳法的基因组分析，可考察整合至染色体的载体的数量和表达盒的数量。
(培养方法)
本发明的转化体可与转化前的宿主同样地进行培养。
用于本发明的转化体的培养的培养液可使用与宿主同种的细胞的培养所用的公知的培养基，包含宿主细胞可同化的碳源、氮源、无机盐类等，可高效地进行宿主细胞的培养即可。作为培养液，可使用天然培养基，也可使用合成培养基。
作为碳源，可例举例如葡萄糖、果糖、蔗糖等糖。
作为氮源，可例举例如氨、氯化铵、乙酸铵等无机酸或无机酸的铵盐、蛋白胨、酪蛋白氨基酸。
作为无机盐类，可例举例如磷酸镁、硫酸镁、氯化钠。
培养可使用公知的细胞培养方法，可通过例如振荡培养、搅拌培养等进行。
培养温度较好是23～37℃。此外，培养时间可适当确定。
培养可以是分批培养，也可以是连续培养。
[蛋白质的制造方法]
本发明的蛋白质的制造方法的特征在于，培养将本发明的表达载体导入宿主细胞而得的转化体(本发明的转化体)，从所得的培养液取得蛋白质(Z)或所述融合蛋白。
培养条件可考虑蛋白质(Z)或所述融合蛋白的种类等适当设定。例如，在16～42℃、较好是25～37℃进行8～168小时，较好是48～96小时。可以是振荡培养和静置培养中的任一种，可根据需要加以搅拌和通气。
自转化体分泌所述融合蛋白的情况下，通过蛋白酶等在该融合蛋白的蛋白质(Z)部分的N末端侧剪切而制造蛋白质(Z)。自该融合蛋白的蛋白质(Z)的制造可使用自培养液分离的融合蛋白进行，也可在自培养液分离之前进行。任一种情况下，自融合蛋白都生成除蛋白质(Z)以外的剪切物(蛋白质(Y)等)，因此较好是将该剪切物与蛋白质(Z)分离。
培养转化体而从培养液分离蛋白质(Z)或所述融合蛋白的情况下，可使用公知的蛋白质分离方法。例如，可在培养后，通过离心分离处理等自含菌体的培养液回收培养上清，自该培养上清分离、纯化融合蛋白。此外，也可反复进行向从培养上清分离的菌体再次加入培养液进行培养的操作，连续地培养转化体而分泌产生蛋白质(Z)或所述融合蛋白。
作为用于取得培养上清中的融合蛋白或蛋白质(Z)的分离、纯化方法，可例举公知的盐析或溶剂沉淀法等利用溶解度差的方法，透析、超滤或凝胶电泳法等利用分子量差的方法，离子交换色谱法等利用电荷差的方法，亲和色谱法等利用特异亲和性的方法，反相高效液相色谱法等利用疏水性差的方法，等电点电泳法等利用等电点差的方法。
作为分离、纯化的蛋白质的确认方法，可例举公知的蛋白质印迹法或活性测定法。经纯化的蛋白质可通过氨基酸分析、氨基末端分析、一级结构分析等判明其结构。
实施例
以下，示出试验例对本发明进行详细说明。但是，本发明并不受到下述记载的限定。
[试验例1]
将S.pombe的PDI1的全长蛋白质用作蛋白质(Y)。
(表达载体的构建)
首先，分别制成向公知的克隆载体pSL6的多克隆位点插入编码S.pombe的PDI1的结构基因而得的表达载体pPDI1、向公知的克隆载体pSL6的多克隆位点插入将编码S.pombe的PDI1的结构基因的终止密码子敲除并添加AflⅡ的限制酶识别位点得到的基因序列而得的基因融合用载体pPDI1-AflⅡ。
具体来说，通过以来源于S.pombe的野生株(ARC032株，相当于ATCC38366、972h-)的基因组DNA为模板并使用在5’末端具备BspHⅠ的限制酶识别位点的正向引物(序列编号9)和在5’末端具备SalⅠ的限制酶识别位点的反向引物(序列编号10)的PCR，获得PDI1基因的ORF全长的在5’末端具有BspHⅠ的限制酶识别位点且在3’末端具备SalⅠ的限制酶识别位点的PCR产物(PDI1片段)。
将该PDI1片段用限制酶BspHⅠ和SalⅠ进行双重消化，且将pSL6用限制酶AarⅠ和SalⅠ进行双重消化，将两者进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得质粒。将该质粒记作pPDI1。
此外，通过以来源于S.pombe的野生株的基因组DNA为模板并使用序列编号9的正向引物和在5’末端具备KpnⅠ和AflⅡ的限制酶识别位点的反向引物(序列编号11)的PCR，获得PDI1基因的ORF全长中敲除终止密码子并在5’末端具有BspHⅠ的限制酶识别位点且在3’末端具备KpnⅠ和AflⅡ的限制酶识别位点的PCR产物(PDI1-AflⅡ片段)。
将该PDI1-AflⅡ片段用限制酶BspHⅠ和KpnⅠ进行双重消化，且将pSL6用限制酶AarⅠ和KpnⅠ进行双重消化，将两者进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得质粒。将该质粒记作pPDI1-AflⅡ。
接着，通过向pPDI1-AflⅡ的多克隆位点插入编码在N连接型糖链添加位点导入突变而得的人转铁蛋白(突变型hTF)的结构基因，制成构成编码S.pombe的PDI1与突变型hTF的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1-hTF，同样地制成构成编码介以KR肽使S.pombe的PDI1与突变型hTF结合而得的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1-KR-hTF。此外，制成向pSL6P3中的多克隆位点插入编码突变型hTF的结构基因而得的表达载体pP3hTF。pSL6是在hCMV启动子和LPI终止子之间具备多克隆位点的表达载体。此外，pSL6P3是在hCMV启动子下游配置编码P3分泌信号肽(序列编号8)的基因并在该基因与LPI终止子之间具备多克隆位点的分泌表达载体。
具体来说，通过以编码突变型hTF的人工合成基因(序列编号12)为模板并使用在5’末端具备AflⅡ的限制酶识别位点的正向引物(序列编号13)和在5’末端具备XbaⅠ的限制酶识别位点的反向引物(序列编号14)的PCR，获得突变型hTF基因的ORF全长的在5’末端具有AflⅡ的限制酶识别位点且在3’末端具备XbaⅠ的限制酶识别位点的PCR产物(突变型hTF片段)。
将该突变型hTF片段和pPDI1-AflⅡ分别用限制酶AflⅡ和XbaⅠ进行双重消化，将两者进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得质粒。将该质粒记作pPDI1-hTF。
此外，通过以编码突变型hTF的人工合成基因为模板并使用在5’末端具备AflⅡ的限制酶识别位点和编码KR肽序列的密码子的正向引物(序列编号15)和序列编号14的反向引物的PCR，获得突变型hTF基因的ORF全长的在5’末端具有AflⅡ的限制酶识别位点和编码KR肽序列的密码子且在3’末端具备XbaⅠ的限制酶识别位点的PCR产物(带KR的突变型hTF片段)。
将该带KR的突变型hTF片段、pPDI1-AflⅡ和pSL6P3分别用限制酶AflⅡ和XbaⅠ进行双重消化，将带KR的突变型hTF片段与pPDI1-AflⅡ或pSL6P3进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得各质粒。将该质粒分别记作pPDI1-KR-hTF、pP3hTF。
(宿主)
本试验例中，作为宿主，使用使S.pombe的亮氨酸缺陷株ARC001(基因型:h-、leu1-32)(以下记作A0株)的8种蛋白酶基因缺失而得的A8株(基因型:h-、leu1-32、ura4-D18、△psp3、△isp6、△oma1、△ppp16、△fma2、△sxa2、△atg4、△ppp20)。A8株是通过使用基因盒的目标ORF的基因置换预先构建的株(参照国际公开第2007/015470号)。
(转化体的制备)
用YES(0.5％酵母提取物、3％葡萄糖、0.1mg/mL SP补充剂)培养基使A8株生长至0.6×107细胞数/mL。集菌并清洗后，按照1.0×108细胞数/mL的条件悬浮于0.1M乙酸锂(pH5.0)。然后，向100μL悬浮液中加入1μg将上述中得到的各表达载体用限制酶NotⅠ消化而得的产物，再加入260μL的50％(w/v)聚乙二醇(PEG4000)水溶液并充分搅拌后,在30℃孵育30分钟,添加43μL的DMSO后，再在42℃孵育5分钟。通过离心除去PEG4000，清洗后悬浮于150μL的灭菌水，涂布于极限琼脂培养基。3～5天后，获得转化体。
将使用pP3hTF得到的转化体记作P3hTF株，使用pP3hTF和pPDI1得到的转化体记作P3hTF+PDI1株，使用pPDI1得到的转化体记作PDI1株，使用pPDI1-hTF得到的转化体记作PDI1-hTF株，使用pPDI1-KR-hTF得到的转化体记作PDI1-KR-hTF株。
(蛋白质的分泌生产)
将各转化体和A8株分别接种至试管内的5mL的YPD+MES(1％酵母提取物、1％蛋白胨、2％葡萄糖、0.3M2-吗啉乙磺酸一水合物)培养基(pH6.0)，在32℃培养3天。对培养液进行离心分离处理，向回收的4mL培养上清中以最终浓度达到10％(w/w)的条件添加TCA(三氯乙酸)并冷却，回收所得的沉淀物。向该沉淀物中添加40μL的SDS-PAGE用样品缓冲液，在95℃孵育5分钟，制成样品。将该样品中的15μL(相当于培养上清1.5mL)点样至丙烯酰胺凝胶，SDS-PAGE后进行CBB染色，通过LAS4000影像系统(富士胶片株式会社(富士フィルム社)制)检测染色图像。此外，将该样品中的2.5μL(相当于培养液0.25mL)点样至丙烯酰胺凝胶，SDS-PAGE后转印至PVDF膜，实施蛋白质印迹。作为蛋白质印迹的一次抗体，使用稀释至1:500的山羊多克隆抗hTF抗体(卡尔生物化学公司(CALBIOCHEM社)制，美国)，作为二次抗体，使用稀释至1:1000的磷酸酶结合兔抗山羊IgG抗血清(KPL公司(Kirkegaard and PerryLaboratories，Inc.)制，美国)。此外，hTF条带(对hTF特异性的信号)通过高灵敏度化学发光(BCIP/NBT磷酸酶底物，KPL公司制，美国)可视化而进行检测。
将CBB染色图像示于图3，蛋白质印迹的染色图像示于图4。图3和4中，“M”是点样了分子量标记物的泳道。其结果如图3所示，可确认过度表达的PDI1株中，PDI1大量分泌。此外，表达将公知的P3分泌信号肽添加于N末端的hTF(P3hTF)的情况下，可确认在培养液中分泌有P3分泌信号肽被切断的hTF，与PDI1共表达的P3hTF+PDI1株与P3hTF株相比，hTF的分泌生产量更多。此外，由图3和图4可确认，在PDI1-hTF株中，培养液中分泌有在N末端添加了PDI1的hTF(PDI1-hTF)。此外，对于PDI1-KR-hTF株，图3中在与P3hTF株大致相同的大小的位置和与PDI1株大致相同的大小的位置检出条带，图4中在与P3hTF株大致相同的大小的位置检出条带。由该结果可知，PDI1-KR-hTF株中，hTF以与PDI1切离的状态分泌。
[试验例2]
对S.pombe的PDI1的部分蛋白质的分泌难易度进行了考察。
(表达载体的构建)
分别制成向pSL6的多克隆位点插入了编码S.pombe的PDI1(ab)的结构基因的表达载体pPDI1(ab)、向pSL6的多克隆位点插入了编码PDI1(abx)的结构基因的表达载体pPDI1(abx)、向pSL6的多克隆位点插入了编码PDI1(abb’)的结构基因的表达载体pPDI1(abb’)、向pSL6的多克隆位点插入了编码PDI1(abb’x)的结构基因的表达载体pPDI1(abb’x)、向pSL6的多克隆位点插入了编码PDI1(-c)的结构基因的表达载体pPDI1(-c)、向pSL6的多克隆位点插入了编码PDI1(-x)的结构基因的表达载体pPDI1(-x)或者向pSL6的多克隆位点插入了编码PDI1(-ADEL)的结构基因的表达载体pPDI1(-ADEL)。PDI1(-x)是从PDI1的全长蛋白质敲除x结构域而得的部分蛋白质。
具体来说，通过以pPDI1为模板并使用序列编号9的正向引物和在5’末端具备KpnⅠ的限制酶识别位点的序列编号16～序列编号20的各反向引物的PCR，获得分别编码PDI1的第1～232个、第1～339个、第1～354个、第1～462个和第1～488个的氨基酸的各结构基因的在5’末端具有BspHⅠ的限制酶识别位点且在3’末端具有KpnⅠ的限制酶识别位点的各PCR产物(PDI1(ab)片段、PDI1(abb’)片段、PDI1(abb’x)片段、PDI1(-c)片段和PDI1(-ADEL)片段)。
此外，通过以pPDI1为模板并使用序列编号9的正向引物和在5’末端具备KpnⅠ的限制酶识别位点及编码PDI1的x结构域的基因的反向引物(序列编号21)的PCR，获得编码在PDI1的第1～232个的氨基酸的C末端配置了x结构域的蛋白质的结构基因的在5’末端具有BspHⅠ的限制酶识别位点且在3’末端具有KpnⅠ的限制酶识别位点的PCR产物(PDI1(abx)片段)。
此外，通过以pPDI1为模板并使用序列编号9的正向引物和使编码b’结构域的基因区域的3’末端21碱基与编码a’结构域的基因区域的5’末端22碱基重叠而得的反向引物(序列编号22)的PCR，获得在编码PDI1的第1～339个的氨基酸的基因的3’末端具有编码a’结构域的基因区域的5’末端22碱基的PCR产物。另一方面，通过使用使编码b’结构域的基因区域的3’末端21碱基与编码a’结构域的基因区域的5’末端22碱基重叠而得的正向引物(序列编号23)和序列编号20的反向引物的PCR，获得在编码PDI1的第354～488个的氨基酸的基因的5’末端具有编码b’结构域的基因区域的3’末端21碱基的PCR产物。通过以两PCR产物为模板并使用序列编号9的正向引物和序列编号20的反向引物的PCR，获得编码使PDI1的第1～339个的氨基酸与第354～488个的氨基酸序列连接而得的蛋白质的结构基因的在5’末端具有BspHⅠ的限制酶识别位点且在3’末端具有KpnⅠ的限制酶识别位点的PCR产物(PDI1(-x)片段)。
将所述的各片段(PDI1(ab)片段、PDI1(abx)片段、PDI1(abb’)片段、PDI1(abb’x)片段、PDI1(-c)片段、PDI1(-x)片段和PDI1(-ADEL)片段)用限制酶BspHⅠ和KpnⅠ进行双重消化，并将pSL6用限制酶AarⅠ和KpnⅠ进行双重消化，将各片段与pSL6进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得各质粒。将该质粒分别记作pPDI1(ab)、pPDI1(abx)、pPDI1(abb’)、pPDI1(abb’x)、pPDI1(-c)、pPDI1(-x)和pPDI1(-ADEL)。
(转化体的制备)
使用制成的表达载体，与试验例1同样地以A8株为宿主制成转化体。将使用pPDI1(ab)得到的转化体记作PDI1(ab)株，使用pPDI1(abx)得到的转化体记作PDI1(abx)株，使用pPDI1(abb’)得到的转化体记作PDI1(abb’)株，使用pPDI1(abb’x)得到的转化体记作PDI1(abb’x)株，使用pPDI1(-c)得到的转化体记作PDI1(-c)株，使用pPDI1(-x)得到的转化体记作PDI1(-x)株，使用pPDI1(-ADEL)得到的转化体记作PDI1(-ADEL)株。
(蛋白质的分泌生产)
与试验例1同样地进行操作，分别对制成的转化体和试验例1中制成的PDI1株进行培养，通过TCA沉淀回收沉淀物。向该沉淀物中添加40μL的SDS-PAGE用样品缓冲液，在95℃孵育5分钟，制成样品。将PDI1株的该样品中的8μL(相当于0.8mL培养上清)点样至丙烯酰胺凝胶，对于其它转化体，以PDI1株的点样量为基准，将与各转化体中表达的PDI的分子量成反比的量点样至丙烯酰胺凝胶。SDS-PAGE后进行CBB染色，通过LAS4000影像系统(富士胶片株式会社制)检测染色图像。将检出的PDI1的条带用多用途影像分析仪(富士胶片株式会社制)进行定量，算出将PDI1株的PDI1的分泌量设为1时的各转化体的PDI1的相对分泌量。
将CBB染色图像示于图5，各菌株的PDI1的全长蛋白质或部分蛋白质的相对分泌量的计算结果示于图6。图5和图6中，“PDI1(full)”是点样由PDI1株得到的样品的泳道。此外，图5中的“M”与图3同样。其结果是，观察到与PDI1的全长蛋白质相比，部分蛋白质的分泌量更高，除了PDI1(abx)和PDI1(abb’x)之外，有分子量越小、分泌量越多的倾向。PDI1(abx)和PDI1(abb’x)的分泌量明显比其它部分蛋白质多，PDI1(abb’x)的分泌量最多。PDI1(-x)虽然分泌合成的蛋白质，但呈舵状检出条带，可知分解严重。该结果提示，分泌量因PDI1的低分子化而增大，x结构域对分泌表达重要。
[试验例3]
对于使用试验例2中分泌生产量最多的PDI1(abb’x)作为蛋白质(Y)的情况与使用P3分泌信号肽的情况，比较hTF的分泌生产量。
(表达载体的构建)
首先，制成向pSL6的多克隆位点插入了将编码S.pombe的PDI1(abb’x)的结构基因的终止密码子敲除并添加AflⅡ的限制酶识别位点而得的基因序列的基因融合用载体pPDI1(abb’x)-AflⅡ。
具体来说，通过以pPDI1(abb’x)为模板并使用序列编号9的正向引物和在5’末端具备KpnⅠ和AflⅡ的限制酶识别位点的反向引物(序列编号24)的PCR，获得编码PDI1(abb’x)的基因片段中敲除终止密码子并在5’末端具有BspHⅠ的限制酶识别位点且在3’末端具备KpnⅠ和AflⅡ的限制酶识别位点的PCR产物(PDI1(abb’x)-AflⅡ片段)。
将该PDI1(abb’x)-AflⅡ片段用限制酶BspHⅠ和KpnⅠ进行双重消化，且将pSL6用限制酶AarⅠ和KpnⅠ进行双重消化，将两者进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得质粒。将该质粒记作pPDI1(abb’x)-AflⅡ。
接着，通过向pPDI1(abb’x)-AflⅡ的多克隆位点插入编码突变型hTF的结构基因，制成构成编码S.pombe的PDI1(abb’x)与突变型hTF的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1(abb’x)-hTF，同样地制成构成编码介以KR肽使S.pombe的PDI1(abb’x)与突变型hTF结合而得的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1(abb’x)-KR-hTF。
具体来说，将pPDI1-hTF和pPDI1-KR-hTF分别用限制酶AflⅡ和SalⅠ进行双重消化并回收突变型hTF片段和带KR的突变型hTF片段，另一方面，将pPDI1(abb’x)-AflⅡ用限制酶AflⅡ和SalⅠ进行双重消化，将突变型hTF片段或带KR的突变型hTF片段与pPDI1(abb’x)-AflⅡ进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得各质粒。将该质粒分别记作pPDI1(abb’x)-hTF、pPDI1(abb’x)-KR-hTF。
(转化体的制备)
使用制成的表达载体，与试验例1同样地以A8株为宿主制成转化体。将使用pPDI1(abb’x)-hTF得到的转化体记作abb’x-hTF株，使用pPDI1(abb’x)-KR-hTF得到的转化体记作abb’x-KR-hTF。
(蛋白质的分泌生产)
与试验例1同样地进行操作，分别对制成的转化体、试验例1中制成的P3hTF株和P3hTF+PDI1株、试验例2中制成的PDI1(abb’x)株以及A8株进行培养，通过TCA沉淀回收沉淀物。向该沉淀物中添加40μL的SDS-PAGE用样品缓冲液，在95℃孵育5分钟，制成样品。将该样品中的10μL(相当于1mL培养上清)点样至丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，与试验例2同样地进行操作，取得CBB染色图像后，对各条带定量，算出将P3hTF株的hTF的分泌量设为1时的各转化体的hTF的相对分泌量。abb’x-hTF株中，全长的融合蛋白的分泌量少，因此算出通过该融合蛋白的分解得到的hTF的相对分泌量。
将CBB染色图像示于图7，各菌株的hTF的相对分泌量的计算结果示于图8。图7中的“M”与图3同样。由该结果可知，abb’x-hTF株和abb’x-KR-hTF株与P3hTF株相比，hTF分泌量均更多，通过在N末端具有PDI1(abb’x)，分泌生产效率比使用P3分泌信号肽的情况高。特别是abb’x-KR-hTF株，hTF的分泌量比P3hTF+PDI1株多。但是，abb’x-hTF株中，融合蛋白PDI1(abb’x)-hTF的全长蛋白质的量少。
[试验例4]
对于使用试验例2中分泌生产量最多的PDI1(abb’x)作为蛋白质(Y)的情况与使用P3分泌信号肽的情况，比较EGFP的分泌生产量。
(表达载体的构建)
通过向pPDI1(abb’x)-AflⅡ的多克隆位点插入编码EGFP的结构基因，制成构成编码S.pombe的PDI1(abb’x)与EGFP的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1(abb’x)-EGFP，同样地制成构成编码介以KR肽使S.pombe的PDI1(abb’x)与EGFP结合而得的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1(abb’x)-KR-EGFP。此外，制成向pSL6P3中的多克隆位点插入编码EGFP的结构基因而得的表达载体pP3EGFP。
具体来说，通过以编码EGFP的人工合成基因(序列编号25)为模板并使用在5’末端具备AflⅡ的限制酶识别位点的正向引物(序列编号26)和在5’末端具备KpnⅠ的限制酶识别位点的反向引物(序列编号27)的PCR，获得EGFP基因的ORF全长的在5’末端具有AflⅡ的限制酶识别位点且在3’末端具备KpnⅠ的限制酶识别位点的PCR产物(EGFP片段)。
将该EGFP片段和pPDI1(abb’x)-AflⅡ分别用限制酶AflⅡ和KpnⅠ进行双重消化，将两者进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得质粒。将该质粒记作pPDI1-EGFP。
此外，通过以编码EGFP的人工合成基因为模板并使用在5’末端具备AflⅡ的限制酶识别位点和编码KR肽序列的密码子的正向引物(序列编号28)和序列编号27的反向引物的PCR，获得EGFP基因的ORF全长的在5’末端具有AflⅡ的限制酶识别位点和编码KR肽序列的密码子且在3’末端具备KpnⅠ的限制酶识别位点的PCR产物(带KR的EGFP片段)。
将该带KR的EGFP片段、pPDI1(abb’x)-AflⅡ和pSL6P3分别用限制酶AflⅡ和KpnⅠ进行双重消化，将带KR的EGFP片段与pPDI1-AflⅡ或pSL6P3进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得各质粒。将该质粒分别记作pPDI1(abb’x)-KR-EGFP、pP3EGFP。
(转化体的制备)
使用制成的表达载体，与试验例1同样地以A8株为宿主制成转化体。将使用pP3EGFP得到的转化体记作P3EGFP株，使用pP3EGFP和pPDI1得到的转化体记作P3EGFP+pPDI1株，使用pPDI1(abb’x)-EGFP得到的转化体记作abb’x-EGFP株，使用pPDI1(abb’x)-KR-EGFP得到的转化体记作abb’x-KR-EGFP株。
(蛋白质的分泌生产)
与试验例1同样地进行操作，分别对制成的转化体、试验例2中制成的PDI1(abb’x)株和A8株进行培养，通过TCA沉淀回收沉淀物。向该沉淀物中添加40μL的SDS-PAGE用样品缓冲液，在95℃孵育5分钟，制成样品。将该样品中的10μL(相当于1mL培养上清)点样至丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，与试验例2同样地进行操作，取得CBB染色图像后，对各条带定量，算出将P3EGFP株的EGFP的分泌量设为1时的各转化体的EGFP(包括融合蛋白)的相对分泌量。
将CBB染色图像示于图9，各菌株的EGFP的相对分泌量的计算结果示于图10。图9中的“M”与图3同样。由该结果可知，abb’x-EGFP株和abb’x-KR-EGFP与P3EGFP株相比，EGFP分泌量均更多，通过在N末端具有PDI1(abb’x)，分泌生产效率比使用P3分泌信号肽的情况高。此外，EGFP不具有二硫键，即使共表达PDI1，分泌量也不会增加。
[试验例5]
宿主采用S.pombe的A0株，对于使用试验例2中分泌生产量最多的PDI1(abb’x)作为蛋白质(Y)的情况与使用P3分泌信号肽的情况，比较hTF和EGFP的分泌生产量。
(转化体的制备)
宿主采用A0株，使用试验例1～4中制成的表达载体pP3hTF、pPDI1(abb’x)-KR-hTF、pP3EGFP、pPDI1(abb’x)-KR-EGFP、pPDI1(abb’x)和pPDI1，与试验例1同样地制成转化体。
(蛋白质的分泌生产)
与试验例1同样地进行操作，分别对制成的转化体和A0株进行培养，通过TCA沉淀回收沉淀物。向该沉淀物中添加40μL的SDS-PAGE用样品缓冲液，在95℃孵育5分钟，制成样品。将该样品中的10μL(相当于1mL培养上清)点样至丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，与试验例1同样地进行操作，取得CBB染色图像。
A0株、P3hTF株、abbx’-KR-hTF株、PDI1(abb’x)株和PDI1株的CBB染色图像示于图11，A0株、P3EGF株、abb’x-KR-EGF株、PDI1(abb’x)株和PDI1株的CBB染色图像示于图12。图11和图12中，“PDI1(full)”是点样由PDI1株得到的样品的泳道，“M”与图3同样。其结果是，A0株未观察到PDI1的分泌，观察到PDI1(abb’x)的分泌。推测是由于A0株分泌的PDF1的全长蛋白质被A0株具有的各种蛋白酶分解。此外，在hTF方面与A8株不同，与使用P3分泌信号肽的情况相比，使用PDI1(abb’x)的情况下，hTF的分泌量未增大。另一方面，在EGFP方面与A8株同样，与使用P3分泌信号肽的情况相比，使用PDI1(abb’x)的情况下，EGFP的分泌量多，在分泌生产效率方面可确认PDI1(abb’x)的优势地位。
[试验例6]
对于作为蛋白质(Y)使用PDI1(abb’x)的情况和使用PDI1(abx)的情况，比较hTF的分泌生产量。
(表达载体的构建)
首先，制成向pSL6的多克隆位点插入了将编码S.pombe的PDI1(abx)的结构基因的终止密码子敲除并添加AflⅡ的限制酶识别位点而得的基因序列的基因融合用载体pPDI1(abx)-AflⅡ。
具体来说，通过以pPDI1(abx)为模板并使用序列编号9的正向引物和序列编号24的反向引物的PCR，获得编码PDI1(abx)的基因片段中敲除终止密码子并在5’末端具有BspHⅠ的限制酶识别位点且在3’末端具备KpnⅠ和AflⅡ的限制酶识别位点的PCR产物(PDI1(abx)-AflⅡ片段)。
将该PDI1(abx)-AflⅡ片段用限制酶BspHⅠ和KpnⅠ进行双重消化，且将pSL6用限制酶AarⅠ和KpnⅠ进行双重消化，将两者进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得质粒。将该质粒记作pPDI1(abx)-AflⅡ。
接着，通过向pPDI1(abx)-AflⅡ的多克隆位点插入编码突变型hTF的结构基因，制成构成编码S.pombe的PDI1(abx)与突变型hTF的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1(abx)-hTF，同样地制成构成编码介以KR肽使S.pombe的PDI1(abx)与突变型hTF结合而得的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1(abx)-KR-hTF。
具体来说，将pPDI1-hTF和pPDI1-KR-hTF分别用限制酶AflⅡ和SalⅠ进行双重消化，回收突变型hTF片段和带KR的突变型hTF片段。另一方面，将pPDI1(abx)-AflⅡ用限制酶AflⅡ和SalⅠ进行双重消化，将突变型hTF片段或带KR的突变型hTF片段与pPDI1(abx)-AflⅡ进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得各质粒。将该质粒分别记作pPDI1(abx)-hTF、pPDI1(abx)-KR-hTF。
(转化体的制备)
使用制成的表达载体，与试验例1同样地以A8株为宿主制成转化体。将使用pPDI1(abx)-hTF得到的转化体记作abx-hTF株，使用pPDI1(abx)-KR-hTF得到的转化体记作abx-KR-hTF。
(蛋白质的分泌生产)
与试验例1同样地进行操作，分别对制成的转化体、试验例2中制成的PDI1(abb’x)株和PDI1(abx)株、试验例3中制成的abb’x-hTF株和abb’x-KR-hTF株进行培养，通过TCA沉淀回收沉淀物。向该沉淀物中添加40μL的SDS-PAGE用样品缓冲液，在95℃孵育5分钟，制成样品。将该样品中的10μL(相当于1mL培养上清)点样至丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，与试验例3同样地进行操作，取得CBB染色图像后，对各条带定量，算出将P3hTF株的hTF的分泌量设为1时的各转化体的hTF的相对分泌量。
将CBB染色图像示于图13，各菌株的hTF的相对分泌量的计算结果示于图14。图13中的“M”与图3同样。其结果是，与PDI1(abb’x)株和PDI1(abx)株的情况不同，作为蛋白质(Y)使用PDI1(abx)的abx-KR-hTF株和abx-hTF株分别与使用PDI1(abb’x)的abb’x-KR-hTF株和abb’x-hTF株相比，hTF分泌量更多。可认为表现出整个融合蛋白中的蛋白质(Y)的部分变小的效果。
[试验例7]
对于作为蛋白质(Y)使用PDI1(abb’x)的情况和使用在PDI1(abb’x)中的分子伴侣功能的活性位点加入突变的蛋白质的情况，比较hTF的分泌生产量。
(表达载体的构建)
首先，向pSL6的多克隆位点插入了编码将S.pombe的PDI1(abb’x)的a结构域中的分子伴侣活性的活性中心(CGHC)的2个半胱氨酸残基(C)置换为丝氨酸残基(S)的突变蛋白质PDI1(abb’x)(C→S)的结构基因的pPDI1(abb’x)(C→S)，向pSL6的多克隆位点插入了将编码pPDI1(abb’x)(C→S)的结构基因的终止密码子敲除并添加AflⅡ的限制酶识别位点而得的基因序列的基因融合用载体pPDI1(abb’x)(C→S)-AflⅡ。
具体来说，通过以pPDI1(abb’x)为模板并使用序列编号9的正向引物和包含向密码子中引入突变而将a结构域中的分子伴侣活性的活性中心(CGHC)的2个半胱氨酸残基(C)置换为丝氨酸残基(S)的部分的反向引物(序列编号29)的PCR，获得编码PDI1的第1～55个的氨基酸且第51个和第54个的半胱氨酸残基置换为丝氨酸残基的蛋白质的部分基因的PCR产物。另一方面，通过以pPDI1(abb’x)为模板并使用作为序列编号29的引物的互补链的正向引物(序列编号30)和序列编号18的反向引物的PCR，获得编码PDI1的第49～354个的氨基酸且第51个和第54个的半胱氨酸残基置换为丝氨酸残基的蛋白质的部分基因的PCR产物。通过以两PCR产物为模板并使用序列编号9的正向引物和序列编号18的反向引物的PCR，获得编码PDI1的第1～354个的氨基酸且第51个和第54个的半胱氨酸残基置换为丝氨酸残基的蛋白质的结构基因的在5’末端具有BspHⅠ的限制酶识别位点且在3’末端具有KpnⅠ的限制酶识别位点的PCR产物(PDI1(abb’x)(C→S)片段)。
将该PDI1(abb’x)(C→S)片段用限制酶BspHⅠ和KpnⅠ进行双重消化，且将pSL6用限制酶AarⅠ和KpnⅠ进行双重消化，将两者进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得质粒。将该质粒记作pPDI1(abb’x)(C→S)。
此外，通过以pPDI1(abb’x)(C→S)为模板并使用序列编号9的正向引物和序列编号24的反向引物的PCR，获得编码PDI1(abb’x)(C→S)的基因片段中敲除终止密码子并在5’末端具有BspHⅠ的限制酶识别位点且在3’末端具备KpnⅠ和AflⅡ的限制酶识别位点的PCR产物(PDI1(abb’x)(C→S)-AflⅡ片段)。
将该PDI1(abb’x)(C→S)-AflⅡ片段用限制酶BspHⅠ和KpnⅠ进行双重消化，且将pSL6用限制酶AarⅠ和KpnⅠ进行双重消化，将两者进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得质粒。将该质粒记作pPDI1(abb’x)(C→S)-AflⅡ。
接着，通过向pPDI1(abb’x)(C→S)-AflⅡ的多克隆位点插入编码突变型hTF的结构基因，制成构成编码S.pombe的PDI1(abb’x)(C→S)与突变型hTF的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1(abb’x)(C→S)-hTF，同样地制成构成编码介以KR肽使S.pombe的PDI1(abb’x)(C→S)与突变型hTF结合而得的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1(abb’x)(C→S)-KR-hTF。
具体来说，将pPDI1-hTF和pPDI1-KR-hTF分别用限制酶AflⅡ和SalⅠ进行双重消化并回收突变型hTF片段和带KR的突变型hTF片段，另一方面，将pPDI1(abb’x)(C→S)-AflⅡ用限制酶AflⅡ和SalⅠ进行双重消化，将突变型hTF片段或带KR的突变型hTF片段与pPDI1(abb’x)(C→S)-AflⅡ进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得各质粒。将该质粒分别记作pPDI1(abb’x)(C→S)-hTF、pPDI1(abb’x)(C→S)-KR-hTF。
(转化体的制备)
使用制成的表达载体，与试验例1同样地以A8株为宿主制成转化体。将使用pPDI1(abb’x)(C→S)得到的转化体记作abb’x(C→S)株，使用pPDI1(abb’x)(C→S)-hTF得到的转化体记作abb’x(C→S)-hTF株，使用pPDI1(abb’x)(C→S)-KR-hTF得到的转化体记作abb’x(C→S)-KR-hTF株。
(蛋白质的分泌生产)
与试验例1同样地进行操作，分别对制成的转化体、试验例2中制成的PDI1(abb’x)株、试验例3中制成的abb’x-hTF株和abb’x-KR-hTF株进行培养，通过TCA沉淀回收沉淀物。向该沉淀物中添加40μL的SDS-PAGE用样品缓冲液，在95℃孵育5分钟，制成样品。将该样品中的10μL(相当于1mL培养上清)点样至丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，与试验例3同样地进行操作，取得CBB染色图像后，对各条带定量，算出将P3hTF株的hTF的分泌量设为1时的各转化体的hTF的相对分泌量。
将CBB染色图像示于图15，各菌株的hTF的相对分泌量的计算结果示于图16。图15中的“M”与图3同样。其结果是，PDI1(abb’x)(C→S)株中，PDI1(abb’x)(C→S)与PDI1(abb’x)同样分泌。作为蛋白质(Y)使用PDI1(abb’x)(C→S)的abb’x(C→S)-hTF株和abb’x(C→S)-KR-hTF株分别与使用PDI1(abb’x)的abb’x-hTF株和abb’x-KR-hTF株相比，hTF分泌量低30～40％左右。
[试验例8]
对于作为蛋白质(Y)使用PDI1(abb’x)的情况和使用在PDI1(abb’x)中的分子伴侣功能的活性位点加入突变的蛋白质的情况，比较EGFP的分泌生产量。
(表达载体的构建)
通过向pPDI1(abb’x)(C→S)-AflⅡ的多克隆位点插入编码EGFP的结构基因，制成构成编码S.pombe的PDI1(abb’x)(C→S)与EGFP的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1(abb’x)(C→S)-EGFP，同样地制成构成编码介以KR肽使S.pombe的PDI1(abb’x)(C→S)与EGFP结合而得的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1(abb’x)(C→S)-KR-EGFP。
具体来说，将pPDI1(abb’x)-EGFP和pPDI1(abb’x)-KR-EGFP分别用限制酶AflⅡ和SalⅠ进行双重消化并回收EGFP片段和带KR的EGFP片段，另一方面，将pPDI1(abb’x)(C→S)-AflⅡ用限制酶AflⅡ和SalⅠ进行双重消化，将突变型hTF片段或带KR的突变型hTF片段与pPDI1(abb’x)(C→S)-AflⅡ进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得各质粒。将该质粒分别记作pPDI1(abb’x)(C→S)-EGFP、pPDI1(abb’x)(C→S)-KR-EGFP。
(转化体的制备)
使用制成的表达载体，与试验例1同样地以A8株为宿主制成转化体。将使用pPDI1(abb’x)(C→S)-EGFP得到的转化体记作abb’x(C→S)-EGFP株，使用pPDI1(abb’x)(C→S)-KR-EGFP得到的转化体记作abb’x(C→S)-KR-EGFP株。
(蛋白质的分泌生产)
与试验例1同样地进行操作，分别对制成的转化体、试验例2中制成的PDI1(abb’x)株、试验例4中制成的abb’x-EGFP株和abb’x-KR-EGFP株、试验例7中制成的PDI1(abb’x)(C→S)株进行培养，通过TCA沉淀回收沉淀物。向该沉淀物中添加40μL的SDS-PAGE用样品缓冲液，在95℃孵育5分钟，制成样品。将该样品中的10μL(相当于1mL培养上清)点样至丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，与试验例4同样地进行操作，取得CBB染色图像。
CBB染色图像示于图17。图17中的“M”与图3同样。其结果是，与hTF的情况不同，作为蛋白质(Y)使用PDI1(abb’x)(C→S)的菌株和使用PDI1(abb’x)的菌株中，EGFP分泌量几乎未观察到变化。推测是由于EGFP与hTF不同，原本就不因PDI1产生的分子伴侣效果而受惠。
[试验例9]
对PDI1(abb’x)是否与全长蛋白质同样具有分子伴侣活性进行了考察。
(转化体的制备)
与试验例1同样地进行操作，以A8株为宿主，分别使用pP3hTF和PDI1(abb’x)制成转化体P3hTF+PDI1(abb’x)株，使用pP3hTF和PDI1(abb’x)(C→S)制成转化体P3hTF+PDI1(abb’x)(C→S)株。
(蛋白质的分泌生产)
与试验例1同样地进行操作，分别对制成的转化体、试验例1中制成的P3hTF株和P3hTF+PDI1株、试验例2中制成的PDI1(abb’x)株、试验例3中制成的PDI1(abb’x)-hTF株和PDI1(abb’x)-KR-hTF株、A8株进行培养，通过TCA沉淀回收沉淀物。向该沉淀物中添加40μL的SDS-PAGE用样品缓冲液，在95℃孵育5分钟，制成样品。将该样品中的10μL(相当于1mL培养上清)点样至丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，与试验例3同样地进行操作，取得CBB染色图像后，对各条带定量，算出将P3hTF株的hTF的分泌量设为1时的各转化体的hTF的相对分泌量。
将CBB染色图像示于图18，各菌株的hTF的相对分泌量的计算结果示于图19。图18中的“M”与图3同样。其结果是，P3hTF+PDI1(abb’x)株也与P3hTF+PDI1株同样，hTF的分泌量增大，P3hTF+PDI1(abb’x)(C→S)株的分泌量比P3hTF+PDI1株和P3hTF+PDI1(abb’x)株少，分子伴侣效果低。根据该结果，明确PDI1(abb’x)具有伴侣活性，提示蛋白质(Z)是原本就因PDI1共表达而受惠的蛋白质的情况下，融合于该蛋白质的N末端侧的PDI1(abb’x)也可能起到分子伴侣的作用。
[试验例10]
对于使用试验例2中分泌生产量最多的PDI1(abb’x)作为蛋白质(Y)的情况与使用P3分泌信号肽的情况，比较人生长激素(hGH)和人粒细胞集落刺激因子(GCSF)的分泌生产量。
(表达载体的构建)
通过向PDI1(abb’x)-AflⅡ的多克隆位点插入编码hGH或GCSF的结构基因，分别制成构成编码介以KR肽使S.pombe的PDI1(abb’x)与hGH或GCSF结合而得的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1(abb’x)-KR-hGH和pPDI1(abb’x)-KR-GCSF。此外，制成向pSL6P3中的多克隆位点插入编码hGH或GCSF的结构基因而得的表达载体pP3hGH和pP3GCSF。
具体来说，通过以编码hGH的基因(序列编号31)为模板并使用在5’末端具备AflⅡ的限制酶识别位点和编码KR肽序列的密码子的正向引物(序列编号32)和在5’末端具备KpnⅠ的限制酶识别位点的反向引物(序列编号33)的PCR，获得hGH基因的ORF全长的在5’末端具有AflⅡ的限制酶识别位点且在3’末端具备KpnⅠ的限制酶识别位点的PCR产物(带KR的hGH片段)。
此外，通过以编码GCSF的基因(序列编号34)为模板并使用在5’末端具备AflⅡ的限制酶识别位点和编码KR肽序列的密码子的正向引物(序列编号35)和在5’末端具备KpnⅠ的限制酶识别位点的反向引物(序列编号36)的PCR，获得GCSF基因的ORF全长的在5’末端具有AflⅡ的限制酶识别位点且在3’末端具备KpnⅠ的限制酶识别位点的PCR产物(带KR的GCSF片段)。
将带KR的hGH片段、带KR的GCSF片段、pPDI1(aab’x)-AflⅡ和pSL6P3分别用限制酶AflⅡ和KpnⅠ进行双重消化，将带KR的hGH片段或带KR的GCSF片段与pPDI1-AflⅡ或pSL6P3进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得各质粒。将该质粒分别记作pPDI1(abb’x)-KR-hGH、pP3hGH、pPDI1(abb’x)-KR-GCSF、pP3GCSF。
(转化体的制备)
使用制成的表达载体，与试验例1同样地以A8株为宿主制成转化体。将使用pPDI1(abb’x)-KR-hGH得到的转化体记作abb’x-KR-hGH株，使用pP3hGH得到的转化体记作P3hGH株，使用pPDI1(abb’x)-KR-GSCF得到的转化体记作abb’x-KR-GCSF株，使用pP3GCSF得到的转化体记作P3GCSF株。
(蛋白质的分泌生产)
与试验例1同样地进行操作，对制成的各转化体进行培养，通过TCA沉淀回收沉淀物。向该沉淀物中添加40μL的SDS-PAGE用样品缓冲液，在95℃孵育5分钟，制成样品。将该样品中的10μL(相当于1mL培养上清)点样至丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，与试验例2同样地进行操作，取得CBB染色图像后，对各条带定量，算出将P3信号分泌株(P3hTF株和P3GCSF株)的各目标蛋白质(Z)的分泌量设为1时的各转化体的目标蛋白质(Z)的相对分泌量。
将CBB染色图像示于图20，各菌株的各蛋白质的相对分泌量的计算结果示于图21。图20中的“M”与图3同样。由该结果可知，abb’x-KR-hGH株和abb’x-KR-GCSF分别与对应的P3信号分泌株相比，目标蛋白质(Z)分泌量提高2倍左右，通过在N末端具有PDI1(abb’x)，分泌生产效率比使用P3分泌信号肽的情况高。
[试验例11]
考察以S.pombe为表达宿主的来源于人的PDI1(hPDI)的部分蛋白质的分泌难易度，与来源于S.pombe的PDI1比较分泌量。
(表达载体的构建)
首先，制成向pSL6的多克隆位点插入了添加有编码来源于S.pombe的PDI1的信号肽部分的基因和PvuⅡ的限制酶识别位点的基因序列的PDI1的信号肽添加用载体pPDI1(SP)-PvuⅡ。
具体来说，通过以pPDI1为模板并使用序列编号9的正向引物和在5’末端具备KpnⅠ和PvuⅡ的限制酶识别位点的反向引物(序列编号37)的PCR，获得编码PDI1的信号肽部分的基因片段的在5’末端具有BspHⅠ的限制酶识别位点且在3’末端具备KpnⅠ和PvuⅡ的限制酶识别位点的PCR产物(PDI1(SP)-PvuⅡ片段)。
将该PDI1(SP)-PvuⅡ片段用限制酶BspHⅠ和KpnⅠ进行双重消化，且将pSL6用限制酶AarⅠ和KpnⅠ进行双重消化，将两者进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得质粒。将该质粒记作pPDI1(SP)-PvuⅡ。
接着，分别制成向pPDI(SP)-PvuⅡ的多克隆位点插入了编码hPDI(ab)的结构基因的表达载体pPDI1(SP)-hPDI(ab)、向pPDI(SP)-PvuⅡ的多克隆位点插入了编码hPDI(abx)的结构基因的表达载体pPDI1(SP)-hPDI(abx)、向pPDI(SP)-PvuⅡ的多克隆位点插入了编码hPDI(abb’)的结构基因的表达载体pPDI1(SP)-hPDI(abb’)、向pPDI(SP)-PvuⅡ的多克隆位点插入了编码hPDI(abb’x)的结构基因的表达载体pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)或者向pPDI(SP)-PvuⅡ的多克隆位点插入了编码hPDI(abb’xa’c)的结构基因的表达载体pPDI1(SP)-hPDI(abb’xa’c)。
具体来说，通过以编码hPDI的基因(序列编号38)为模板并使用在5’末端添加有胞嘧啶和胸腺嘧啶的正向引物(序列编号39)和在5’末端具备KpnⅠ的限制酶识别位点的序列编号40～序列编号43的各反向引物的PCR，获得分别编码hPDI的第18～236个、第18～349个、第18～364个和第18～508个的氨基酸的各结构基因的在5’末端具有胞嘧啶和胸腺嘧啶且在3’末端具有KpnⅠ的限制酶识别位点的各PCR产物(hPDI(ab)片段、hPDI(abb’)片段、hPDI(abb’x)片段和hPDI(abb’xa’c)片段)。
此外，通过以编码hPDI的基因为模板并使用序列编号39的正向引物和在5’末端具备KpnⅠ的限制酶识别位点及编码hPDI的x结构域的基因的反向引物(序列编号44)的PCR，获得编码在hPDI的第18～236个的氨基酸的C末端配置有x结构域的蛋白质的结构基因的在5’末端具有胞嘧啶和胸腺嘧啶且在3’末端具有KpnⅠ的限制酶识别位点的PCR产物(hPDI(abx)片段)。
将所述的各片段(hPDI(ab)片段、hPDI(abx)片段、hPDI(abb’)片段、hPDI(abb’x)片段和hPDI(abb’xa’c)片段)用限制酶KpnⅠ消化，并将pDPI1(SP)-PvuⅡ和KpnⅠ进行双重消化，将各片段与pPDI1(SP)-PvuⅡ进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得各质粒。将该质粒分别记作pPDI1(SP)-hPDI(ab)、pPDI1(SP)-hPDI(abx)、pPDI1(SP)-hPDI(abb’)、pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)和pPDI1(SP)-hPDI(abb’xa’c)。这些质粒构成编码来源于S.pombe的PDI1的信号肽与各hPDI部分蛋白质的融合蛋白的结构基因。如果通过裂殖酵母表达各融合蛋白，则来源于S.pombe的PDI1的信号肽被设计成在分泌过程中被去除、仅hPDI部分蛋白质被分泌至培养基中。
(转化体的制备)
使用制成的各表达载体，与试验例1同样地以A8株为宿主制成转化体。将使用pPDI1(SP)-hPDI(ab)得到的转化体记作hPDI(ab)株，使用pPDI1(SP)-hPDI(abx)得到的转化体记作hPDI(abx)株，使用pPDI1(SP)-hPDI(abb’)得到的转化体记作hPDI(abb’)株，使用pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)得到的转化体记作hPDI(abb’x)株，使用pPDI1(SP)-hPDI(abb’xa’c)得到的转化体记作hPDI(abb’xa’c)株。
(蛋白质的分泌生产)
与试验例1同样地进行操作，分别对制成的转化体以及试验例2中制成的PDI1(ab)株、PDI1(abx)株、PDI1(abb’)株、PDI1(abb’x)株和PDI1株进行培养，通过TCA沉淀回收沉淀物。向该沉淀物中添加40μL的SDS-PAGE用样品缓冲液，在95℃孵育5分钟，制成样品。将该样品中的10μL(相当于1mL培养上清)点样至丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，通过CBB染色将蛋白质条带可视化。
CBB染色图像示于图22。图22中的“PDI(abb’xa’c)”是点样由PDI1株得到的样品的泳道。此外，图22中的“M”与图3同样。其结果是，若将ab和abx的部分蛋白质相互进行比较，则分泌量均不逊于来源于S.pombe的PDI1和hPDI，将abb’和abb’x、abb’xa’c相互进行比较时，hPDI的分泌量明显多于来源于S.pombe的PDI1。此外，与来源于S.pombe的PDI1同样，hPDI也是部分蛋白质的分泌量更高，hPDI(abx)和hPDI(abb’x)的分泌量比其它部分蛋白质多。
[试验例12]
对于作为蛋白质(Y)使用PDI(abx)或PDI1(abb’x)的情况与使用来源于S.pombe的PDI1的信号肽和hPDI(abx)的融合蛋白(PDI1(SP)-hPDI(abx))或来源于S.pombe的PDI1的信号肽和hPDI(abb’x)的融合蛋白(PDI1(SP)-hPDI(abb’x))的情况，比较hTF的分泌生产量。
(表达载体的构建)
首先，制成向pSL6的多克隆位点插入了将编码PDI1(SP)-hPDI(abx)或PDI1(SP)-hPDI(abb’x)的结构基因的终止密码子敲除并添加AflⅡ的限制酶识别位点而得的基因序列的基因融合用载体pPDI1(SP)-hPDI(abx)-AflⅡ和pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-AflⅡ。
具体来说，通过以pPDI1(SP)-hPDI(abx)或pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)为模板并使用序列编号9的正向引物和在5’末端具备KpnⅠ和AflⅡ的限制酶识别位点的反向引物(序列编号45)的PCR，获得编码PDI1(SP)-hPDI(abx)或PDI1(SP)-hPDI(abb’x)的各融合蛋白的各基因片段中敲除终止密码子并在5’末端具有BspHⅠ的限制酶识别位点且在3’末端具备KpnⅠ和AflⅡ的限制酶识别位点的各PCR产物(PDI1(SP)-hPDI(abx)-AflⅡ片段和PDI1(SP)-hPDI(abb’x)-AflⅡ片段)。
将PDI1(SP)-hPDI(abx)-AflⅡ片段和PDI1(SP)-hPDI(abb’x)-AflⅡ片段用限制酶BspHⅠ和KpnⅠ进行双重消化，且将pSL6用限制酶AarⅠ和KpnⅠ进行双重消化，将两者进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得质粒。将该质粒分别记作pPDI1(SP)-hPDI(abx)-AflⅡ和pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-AflⅡ。
接着，通过向pPDI1(SP)-hPDI(abx)-AflⅡ和pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-AflⅡ的多克隆位点插入编码突变型hTF的结构基因，制成构成编码PDI1(SP)-hPDI(abx)或PDI1(SP)-hPDI(abb’x)与突变型hTF的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1(SP)-hPDI(abx)-hTF和pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-hTF，同样制成构成编码介以KR肽使PDI1(SP)-hPDI(abx)或PDI1(SP)-hPDI(abb’x)与突变型hTF结合而得的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1(SP)-hPDI(abx)-KR-hTF和pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-KR-hTF。
具体来说，将pPDI1-hTF和pPDI1-KR-hTF分别用限制酶AflⅡ和SalⅠ进行双重消化，回收突变型hTF片段和带KR的突变型hTF片段。另一方面，将pPDI1(SP)-hPDI(abx)-AflⅡ和pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-AflⅡ分别用限制酶AflⅡ和SalⅠ进行双重消化，将突变型hTF片段或带KR的突变型hTF片段与pPDI1(SP)-hPDI(abx)-AflⅡ或pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-AflⅡ进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得各质粒。将该质粒分别记作pPDI1(SP)-hPDI(abx)-hTF、pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-hTF、pPDI1(SP)-hPDI(abx)-KR-hTF、pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-KR-hTF。
(转化体的制备)
使用制成的各表达载体，与试验例1同样地以A8株为宿主制成转化体。将使用pPDI1(SP)-hPDI(abx)-hTF得到的转化体记作hPDI(abx)-hTF株，使用pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-hTF得到的转化体记作hPDI(abb’x)-hTF株，使用pPDI1(SP)-hPDI(abx)-KR-hTF得到的转化体记作hPDI(abx)-KR-hTF株，使用pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-KR-hTF得到的转化体记作hPDI(abb’x)-KR-hTF株。
(蛋白质的分泌生产)
与试验例1同样地进行操作，分别对制成的转化体、试验例3中制成的abb’x-hTF株和abb’x-KR-hTF株、试验例6中制成的abx-hTF株和abx-KR-hTF株进行培养，通过TCA沉淀回收沉淀物。向该沉淀物中添加40μL的SDS-PAGE用样品缓冲液，在95℃孵育5分钟，制成样品。将该样品中的10μL(相当于1mL培养上清)点样至丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，与试验例3同样地进行操作，取得CBB染色图像后，对各条带定量，算出将abx-KR-hTF株的hTF的分泌量设为1时的各转化体的hTF的相对分泌量。
将CBB染色图像示于图23，各菌株的hTF的相对分泌量的计算结果示于图24。图23中的“M”与图3同样。其结果是，作为蛋白质(Y)使用PDI1(SP)-hPDI(abx)的hPDI(abx)-KR-hTF株和hPDI(abx)-hTF株分别与使用PDI1(abx)的abx-KR-hTF株和abx-hTF株相比，hTF分泌量更多，可知通过将abx部分从来源于S.pombe的序列置换为来源于人的序列，分泌生产效率进一步提高。
作为蛋白质(Y)使用PDI1(SP)-hPDI(abb’x)的hPDI(abb’x)-KR-hTF株和hPDI(abb’x)-hTF株分别与使用PDI(abb’x)的abb’x-KR-hTF株和abb’x-hTF株相比，hTF分泌量低，特别是hPDI(abb’x)-KR-hTF株中蛋白质(Y)与目标蛋白质(Z)的分离不充分。另一方面，hPDI(abb’x)-hTF株中，蛋白质(Y)与目标蛋白质(Z)的融合蛋白的分泌效率高。
蛋白质(Y)为PDI1(SP)-hPDI(abx)、PDI1(SP)-hPDI(abb’x)的情况下，与使用P3分泌信号肽的情况相比，分泌生产效率均提高。
[试验例13]
对于作为蛋白质(Y)使用PDI1(abx)或PDI1(abb’x)的情况和使用PDI1(SP)-hPDI(abx)或PDI1(SP)-hPDI(abb’x)的情况，比较EGFP的分泌生产量。
(表达载体的构建)
通过向pPDI1(abx)-AflⅡ、pPDI1(SP)-hPDI(abx)-AflⅡ和pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-AflⅡ的多克隆位点插入编码EGFP的结构基因，分别制成构成编码PDI1(abx)、PDI1(SP)-hPDI(abx)或PDI1(SP)-hPDI(abb’x)与EGFP的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1(abx)-EGFP、pPDI1(SP)-hPDI(abx)-EGFP和pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-EGFP，同样制成构成编码介以KR肽使PDI1(abx)、PDI1(SP)-hPDI(abx)或PDI1(SP)-hPDI(abb’x)与EGFP结合而得的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1(abx)-KR-EGFP、pPDI1(SP)-hPDI(abx)-KR-EGFP和pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-KR-EGFP。
具体来说，将pPDI1(abb’x)-EGFP和pPDI1(abb’x)-KR-EGFP分别用限制酶AflⅡ和SalⅠ进行双重消化，回收EGFP片段和带KR的EGFP片段。另一方面，将pPDI1(abx)-AflⅡ、pPDI1(SP)-hPDI(abx)-AflⅡ和pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-AflⅡ分别用限制酶AflⅡ和SalⅠ进行双重消化，将EGFP片段或带KR的EGFP片段与pPDI1(abx)-AflⅡ、pPDI1(SP)-hPDI(abx)-AflⅡ或pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-AflⅡ进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得各质粒。将该质粒分别记作pPDI1(abx)-EGFP、pPDI1(SP)-hPDI(abx)-EGFP、pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-EGFP、pPDI1(abx)-KR-EGFP、pPDI1(SP)-hPDI(abx)-KR-EGFP、pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-KR-EGFP。
(转化体的制备)
使用制成的各表达载体，与试验例1同样地以A8株为宿主制成转化体。将使用pPDI1(abx)-EGFP得到的转化体记作abx-EGFP株，使用pPDI1(SP)-hPDI(abx)-EGFP得到的转化体记作hPDI(abx)-EGFP株，使用pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-EGFP得到的转化体记作hPDI(abb’x)-EGFP株，使用pPDI1(abx)-KR-EGFP得到的转化体记作abx-KR-EGFP株，使用pPDI1(SP)-hPDI(abx)-KR-EGFP得到的转化体记作hPDI(abx)-KR-EGFP株，使用pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-KR-EGFP得到的转化体记作hPDI(abb’x)-KR-EGFP株。
(蛋白质的分泌生产)
与试验例1同样地进行操作，分别对制成的转化体、试验例4中制成的abb’x-EGFP株和abb’x-KR-EGFP株进行培养，通过TCA沉淀回收沉淀物。向该沉淀物中添加40μL的SDS-PAGE用样品缓冲液，在95℃孵育5分钟，制成样品。将该样品中的10μL(相当于1mL培养上清)点样至丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，与试验例3同样地进行操作，取得CBB染色图像后，对各条带定量，算出将abx-KR-EGFP株的EGFP的分泌量设为1时的各转化体的EGFP的相对分泌量。
将CBB染色图像示于图25，各菌株的EGFP的相对分泌量的计算结果示于图26。图25中的“M”与图3同样。其结果是，作为剪切位点(W)加入KR序列的情况下，abx-KR-EGFP株与hPDI(abx)-KR-EGFP株之间和abb’x-KR-EGFP株与hPDI(abb’x)-KR-EGFP株之间，EGFP分泌量几乎未发现差异。另一方面，蛋白质(Y)为PDI1(abx)、PDI1(SP)-hPDI(abx)、PDI1(SP)-hPDI(abb’x)的情况下，与使用P3分泌信号肽的情况相比，分泌生产效率均提高。
不加入剪切位点(W)的情况下，hPDI(abx)-EGFP株与abx-EGFP株相比，hPDI(abb’x)-EGFP株与abb’x-EGFP株相比，蛋白质(Y)与EGFP的融合蛋白的分泌量明显提高，显示将abx或abb’x部分从来源于S.pombe的序列置换为来源于人的序列而得的蛋白质(Y)的优势地位。
[试验例14]
对于作为蛋白质(Y)使用PDI1(abx)或PDI1(abb’x)的情况和使用PDI1(SP)-hPDI(abx)或PDI1(SP)-hPDI(abb’x)的情况，比较GCSF的分泌生产量。
(表达载体的构建)
通过向pPDI1(abx)-AflⅡ、pPDI1(abb’x)-AflⅡ、pPDI1(SP)-hPDI(abx)-AflⅡ和pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-AflⅡ的多克隆位点插入编码GCSF的结构基因，分别制成构成编码PDI1(abx)、PDI1(abb’x)、PDI1(SP)-hPDI(abx)或PDI1(SP)-hPDI(abb’x)与GCSF的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1(abx)-GCSF、pPDI1(abb’x)-GCSF、pPDI1(SP)-hPDI(abx)-GCSF和pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-GCSF，同样地制成构成编码介以KR肽使PDI1(abx)、PDI1(SP)-hPDI(abx)或PDI1(SP)-hPDI(abb’x)与GCSF结合而得的融合蛋白的结构基因的表达载体pPDI1(abx)-KR-GCSF、pPDI1(SP)-hPDI(abx)-KR-GCSF和pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-KR-GCSF。
具体来说，通过以编码GCSF的基因为模板并使用在5’末端具备AarⅠ的限制酶识别位点的正向引物(序列编号46)和序列编号36的反向引物的PCR，获得GCSF基因的ORF全长的在5’末端具有AarⅠ的限制酶识别位点且在3’末端具有KpnⅠ的限制酶识别位点的PCR产物(GCSF片段)。将GCSF片段用AarⅠ和KpnⅠ进行双重消化，pPDI1(abx)-AflⅡ、pPDI1(abb’x)-AflⅡ、pPDI1(SP)-hPDI(abx)-AflⅡ和pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-AflⅡ分别用限制酶AflⅡ和KpnⅠ进行双重消化，将GCSF片段与pPDI1(abx)-AflⅡ、pPDI1(abb’x)-AflⅡ、pPDI1(SP)-hPDI(abx)-AflⅡ或pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-AflⅡ进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得各质粒。将该质粒分别记作pPDI1(abx)-GCSF、pPDI1(abb’x)-GCSF、pPDI1(SP)-hPDI(abx)-GCSF、pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-GCSF。
此外，将pPDI1(abb’x)-KR-GCSF用限制酶AflⅡ和SalⅠ进行双重消化，回收带KR的GCSF片段。另一方面，将pPDI1(abx)-AflⅡ、pPDI1(SP)-hPDI(abx)-AflⅡ和pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-AflⅡ分别用限制酶AflⅡ和SalⅠ进行双重消化，将带KR的GCSF片段与pPDI1(abx)-AflⅡ、pPDI1(SP)-hPDI(abx)-AflⅡ或pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-AflⅡ进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α后，获得各质粒。将该质粒分别记作pPDI1(abx)-KR-GCSF、pPDI1(SP)-hPDI(abx)-KR-GCSF、pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-KR-GCSF。
(转化体的制备)
使用制成的各表达载体，与试验例1同样地以A8株为宿主制成转化体。将使用pPDI1(abx)-GCSF得到的转化体记作abx-GCSF株，使用pPDI1(abb’x)-GCSF得到的转化体记作abb’x-GCSF株，使用pPDI1(SP)-hPDI(abx)-GCSF得到的转化体记作hPDI(abx)-GCSF株，使用pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-GCSF得到的转化体记作hPDI(abb’x)-GCSF株，使用pPDI1(abx)-KR-GCSF得到的转化体记作abx-KR-GCSF株，使用pPDI1(SP)-hPDI(abx)-KR-GCSF得到的转化体记作hPDI(abx)-KR-GCSF株，使用pPDI1(SP)-hPDI(abb’x)-KR-GCSF得到的转化体记作hPDI(abb’x)-KR-GCSF株。
(蛋白质的分泌生产)
与试验例1同样地进行操作，分别对制成的转化体、试验例A中制成的abb’x-KR-GCSF株进行培养，通过TCA沉淀回收沉淀物。向该沉淀物中添加40μL的SDS-PAGE用样品缓冲液，在95℃孵育5分钟，制成样品。将该样品中的10μL(相当于1mL培养上清)点样至丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，与试验例3同样地进行操作，取得CBB染色图像后，对各条带定量，算出将abx-KR-GCSF株的GCSF的分泌量设为1时的各转化体的GCSF的相对分泌量。
将CBB染色图像示于图27，各菌株的EGFP的相对分泌量的计算结果示于图28。图27中的“M”与图3同样。其结果是，作为剪切位点(W)加入KR序列的情况下，蛋白质(Y)为PDI1(abx)、PDI1(SP)-hPDI(abx)、PDI1(SP)-hPDI(abb’x)的情况下，各转化体的GCSF分泌量均未发现大的差异。另一方面，不加入剪切位点(W)的情况下，hPDI(abb’x)-GCSF株中，蛋白质(Y)与GCSF的融合蛋白的分泌量明显高于其它转化体，GCSF本身的分泌量也提高。由该结果可知，在N末端具有PDI1(SP)-hPDI(abb’x)且不加入剪切位点(W)的情况下，与使用其它分泌方式的情况相比，GCSF的分泌生产效率提高。
产业上利用的可能性
本发明的表达载体和蛋白质的制造方法可高效地分泌生产蛋白质，因此特别优选用于有用的蛋白质的大量表达。
另外，在这里引用2012年1月23日提出申请的日本专利申请2012-010569号的说明书、权利要求书、附图和摘要的所有内容，作为本发明说明书的揭示采用。

Claims (14)

1.表达载体，其特征在于，具有表达盒，该表达盒包含编码下述蛋白质(Y)的结构基因序列(y)、位于所述结构基因序列(y)的下游的编码作为要取得的蛋白质的蛋白质(Z)的结构基因序列(z)、用于表达包括所述蛋白质(Y)部分和所述蛋白质(Z)部分的融合蛋白的启动子序列和终止子序列，
所述蛋白质(Y)为PDI1的部分蛋白质或它们的突变蛋白质；所述PDI1是指蛋白质二硫键异构酶，即Protein disulfide isomerase 1，
所述蛋白质(Y)具有PDI1的内质网转移信号，
所述蛋白质(Y)为由内质网转移信号、a结构域、b结构域、x结构域构成的部分蛋白质，由内质网转移信号、a结构域、b结构域、b’结构域、x结构域构成的部分蛋白质，或它们中的任一个的部分蛋白质的突变蛋白质，
所述突变蛋白质是将分子伴侣活性的活性中心CGHC中的半胱氨酸残基C置换为丝氨酸残基S的突变蛋白质。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述PDI1为酵母的PDI1、来源于丝状菌的PDI1或来源于人的PDI1。
3.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述PDI1为来源于裂殖酵母属的粟酒裂殖酵母的PDI1或来源于人的PDI1；所述粟酒裂殖酵母即Schizosaccharomyces pombe。
4.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，在所述结构基因序列(y)与所述结构基因序列(z)之间具有编码由氨基酸或肽形成的剪切位点(W)的结构基因序列(w)，该剪切位点(W)作为在细胞内或细胞外于所述蛋白质(Z)部分的N末端侧被剪切的位点起作用。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述剪切位点(W)为在细胞内于所述融合蛋白的蛋白质(Z)部分的N末端侧被剪切的位点。
6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述剪切位点(W)为KR，或与所述蛋白质(Z)部分结合的C末端侧为KR的氨基酸数3以上的肽；其中，K表示赖氨酸，R表示精氨酸。
7.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述剪切位点(W)为被可在所述融合蛋白的蛋白质(Z)部分的N末端侧进行剪切的蛋白酶识别的位点。
8.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述蛋白质(Y)至少包括内质网转移信号、a结构域、b结构域。
9.转化体的制造方法，其特征在于，将权利要求1～8中的任一项所述的表达载体导入宿主细胞中。
10.转化体，其特征在于，具有权利要求1～8中的任一项所述的表达载体作为染色体外基因。
11.转化体，其特征在于，在染色体中具有权利要求1～8中的任一项所述的表达载体中的表达盒。
12.蛋白质的制造方法，其特征在于，培养权利要求10或11所述的转化体，从所得的培养液取得所述融合蛋白或所述蛋白质(Z)。
13.蛋白质的制造方法，其特征在于，对在染色体中具有权利要求7所述的表达载体中的表达盒或者具有权利要求7所述的表达载体作为染色体外基因的转化体进行培养，从所得的培养液取得所述融合蛋白，再通过蛋白酶在该融合蛋白的蛋白质(Z)部分的N末端侧剪切而制造所述蛋白质(Z)。
14.克隆载体，其特征在于，具有可在宿主细胞内起作用的启动子序列、位于该启动子序列的下游且受该启动子控制的编码下述蛋白质(Y)的结构基因序列(y)、位于该结构基因序列(y)的下游且用于导入结构基因的克隆位点、和可在该宿主细胞内起作用的终止子序列，
所述蛋白质(Y)为PDI1的部分蛋白质或它们的突变蛋白质，
所述蛋白质(Y)具有PDI1的内质网转移信号，
所述蛋白质(Y)为由内质网转移信号、a结构域、b结构域、x结构域构成的部分蛋白质，由内质网转移信号、a结构域、b结构域、b’结构域、x结构域构成的部分蛋白质，或它们中的任一个的部分蛋白质的突变蛋白质，
所述突变蛋白质是将分子伴侣活性的活性中心CGHC中的半胱氨酸残基C置换为丝氨酸残基S的突变蛋白质。
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