CN105647824A - 甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达 - Google Patents
甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105647824A CN105647824A CN201610056340.5A CN201610056340A CN105647824A CN 105647824 A CN105647824 A CN 105647824A CN 201610056340 A CN201610056340 A CN 201610056340A CN 105647824 A CN105647824 A CN 105647824A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- amino acid
- trna
- cell
- alpha
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/84—Pichia
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供在甲基营养酵母菌,例如巴斯德毕赤酵母中产生含非天然氨基酸的多肽的正交翻译系统。还提供了在甲基营养酵母菌,例如巴斯德毕赤酵母中产生含非天然氨基酸的多肽的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年12月11日由TravisYoung提交的美国临时专利申请序列号61/007,341的优先权和权益,其名为“甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达(INVIVOUNNATURALAMINOACIDEXPRESSIONINTHEMETHYLOTROPHICYEASTPICHIAPASTORIS)”,该申请的内容出于所有目的通过引用全文纳入本文。
对于联邦政府资助研发下作出发明的权利声明
本发明是在美国能源部,材料科学部位的基金号DE-FG03-00ER46051的美国政府支持下作出。美国政府对本发明享有一定权利。
发明领域
本发明涉及蛋白质化学领域,例如,翻译生物化学。本发明涉及在甲基营养酵母菌,例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中产生包含非天然氨基酸的多肽的组合物和方法。
发明背景
借助异源正交tRNA/氨酰tRNA合成酶配对(O-tRNA/O-RS配对)可将非天然氨基酸高效而高保真地位点特异性掺入多肽(Deiters等,(2003)“AddingAminoAcidswithNovelReactivitytotheGeneticCodeofSaccharomycescerevisiae.(加入对酿酒酵母的遗传学密码具有新型反应活性的氨基酸)”JAmChemSoc125:11782-11783;Wang等,(2001)“ExpandingtheGeneticcodeofEscherichiacoli.(扩增大肠杆菌遗传密码)”Science292:498-500;Chin等,(2003)“AnExpandedEukaryoticGeneticCode.(扩增的真核细胞遗传密码)”Science301:964-7)。这些O-tRNA/O-RS配对识别它们的相关(cognate)非天然氨基酸,但不与利用它们的系统的内源性tRNA、氨酰tRNA合成酶或氨基酸显著交叉反应。迄今为止,该技术已能将具有独特立体和/或化学特性的超过30种不同的非天然氨基酸遗传编码掺入大肠杆菌、酿酒酵母和哺乳动物细胞中合成的蛋白质(Xie,J等,(2006)“Achemicaltoolkitforproteins–anexpandedgeneticcode.(蛋白质的化学工具箱-扩增的遗传密码)”NatureRevMolCellBiol7:775-782;Wang,L等,(2005)“Expandingthegeneticcode.(扩增遗传密码)”AgnewChemIntEdit44:34-66,Liu等,(2007)“Geneticincorporationofunnaturalaminoacidsintoproteinsinmammaliancells.(非天然氨基酸遗传掺入哺乳动物细胞中的蛋白质)”NatureMethods4:239-244)。该方法对于开发和大规模生产生物学特性增强、毒性降低和/或半衰期延长的治疗性蛋白质特别有用。
大肠杆菌(E.coli)和酿酒酵母(S.cerevisiae)表达系统广泛用于合成异源蛋白质,它们适用于大规模合成包含非天然氨基酸的蛋白质(AddingAminoAcidswithNovelReactivitytotheGeneticCodeofSaccharomycesCerevisiae.(加入对酿酒酵母的遗传学密码具有新型反应活性的氨基酸)JAmChemSoc125:11782-11783;Wang等,(2001)“ExpandingtheGeneticcodeofEscherichiacoli.(扩增大肠杆菌遗传密码)”Science292:498-500)。然而,这些表达系统无一良好适用于产生重组哺乳动物蛋白,这些蛋白常需要硫酸化、糖基化或翻译后修饰以显示所需生物学活性。此外,这些宿主对于产生治疗性蛋白质无一是最佳的:大肠杆菌中产生的蛋白质常含有高浓度的热原化合物,例如内毒素,而酿酒酵母合成的蛋白质可能含有抗原性α1,3聚糖连接键。
相比之下,甲基营养酵母菌,例如巴斯德毕赤酵母已鉴定为用作异源蛋白质的重组表达系统的有吸引力候选对象(Lin-Cereghino等,(2000)“HeterologousproteinexpressioninthemethylotrophicyeastPichiapastoris.(甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的异源蛋白质表达)”FEMSMicrobiolRev24:45-66)。甲基营养酵母菌的真核亚细胞结构使得它们能进行合成生物学活性哺乳动物蛋白质所需的许多翻译后折叠、加工和修饰。与酿酒酵母中表达的蛋白质不同,甲基营养酵母菌,例如巴斯德毕赤酵母产生的蛋白质不大可能含有会妨碍异源表达糖蛋白的下游加工的高甘露糖聚糖结构。此外,甲基营养酵母菌中合成的蛋白质不含热原和抗原性化合物。
甲基营养酵母菌表达系统对于大规模蛋白质合成特别有用。例如,酵母菌巴斯德毕赤酵母的重组蛋白表达水平比酿酒酵母、细菌、昆虫或哺乳动物系统中高10-100倍。此外,不难在简单的、含盐明确的培养基中培养甲基营养型,例如巴斯德毕赤酵母,从而无需杆状病毒表达系统或哺乳动物组织培养所需的昂贵培养基添加剂和设备。此外,巴斯德毕赤酵母适于遗传操作,为利用酿酒酵母而开发的许多分子生物学技术也适用于巴斯德毕赤酵母。
本领域需要在低成本表达系统中将非天然氨基酸位点特异性掺入蛋白质的新方案,所述表达系统能产生包含复杂翻译后修饰的生物学活性的异源蛋白质。本领域需要开发能在甲基营养酵母菌中将非天然氨基酸掺入多肽中的O-tRNA/O-RS配对和表达系统。概览以下内容可明白本文所述的发明实现了此类和其它需要。
发明概述
位点特异性地掺入具有独特官能团的非天然氨基酸能产生显示提高的或新型立体、化学或生物学特性的蛋白质。这种蛋白质可具有治疗或药物应用,优选在能产生包含复杂翻译后修饰的生物学活性异源蛋白质的低成本表达系统中产生。本发明提供可用于在甲基营养酵母菌,例如巴斯德毕赤酵母表达系统中将非天然氨基酸位点特异性掺入蛋白质的方法和组合物。
在一方面,本发明提供将非天然氨基酸掺入甲基营养酵母菌,例如巴斯德毕赤酵母合成的多肽的组合物。所述组合物包含含有非天然氨基酸、正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)和正交tRNA(O-tRNA)的甲基营养酵母细胞,其中O-RS在甲基营养酵母细胞中优先用非天然氨基酸氨酰化正交tRNA(O-tRNA),其中O-tRNA在甲基营养酵母细胞中识别选择者密码子(selectorcodon)并优先被O-RS用非天然氨基酸氨酰化。甲基营养酵母细胞可以是,例如假丝酵母属(Candida)细胞、汉森酵母属(Hansenula)细胞、球拟酵母菌属(Torulopsis)细胞或毕赤酵母属(Pichia)细胞,例如巴斯德毕赤酵母细胞。甲基营养酵母细胞可任选包含,例如任何本文所述的非天然氨基酸。
可任选从整合入基因组的核酸表达细胞的O-RS和O-tRNA。例如,可任选将包含编码O-RS的多核苷酸的核酸整合于,例如编码ARG4基因、ADE1基因、HIS4基因、URA3基因、AOX1基因、AOX2基因或MET2基因的基因座,如编码或包含O-tRNA的核酸可能的那样。可任选从诱导型启动子,例如AOX1启动子、AOX2启动子、ICL1启动子或FLD1启动子表达O-RS。可任选从组成型启动子,例如YPT1启动子或GAP启动子表达O-RS。可任选从高水平组成型启动子,例如PGK1启动子表达O-tRNA。甲基营养酵母菌细胞的O-RS和O-tRNA任选衍生自非真核生物,例如大肠杆菌。
甲基营养酵母菌细胞可任选包含含有编码感兴趣多肽的多核苷酸的核酸,其中该多核苷酸包含O-tRNA所识别的选择者密码子。编码感兴趣多肽的核酸可任选以单拷贝整合入基因组,而整合可任选由编码非必需基因,例如AOX1的基因座处的基因替代介导,因此产生具有mutS甲醇利用表型的细胞。编码感兴趣多肽的核酸可任选以多拷贝整合入基因组,从而产生具有甲醇利用mutS表型的细胞。核酸编码的感兴趣多肽可任选包括但不限于:本文所述的任何蛋白质和多肽。任选从诱导型启动子,例如AOX1启动子、AOX2启动子、ICL1启动子或FLD1启动子表达感兴趣多肽。可任选从组成型启动子,例如YPT1启动子或GAP启动子表达感兴趣多肽。
在另一方面,本发明提供在甲基营养酵母菌细胞中产生在所选位置包含非天然氨基酸的感兴趣多肽的方法。这些方法包括提供含有非天然氨基酸、正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)、正交tRNA(O-tRNA)和编码感兴趣多肽的感兴趣核酸的甲基营养酵母菌细胞,其中O-RS在甲基营养酵母中优先用非天然氨基酸氨酰化正交tRNA(O-tRNA),其中O-tRNA在优先被O-RS用非天然氨基酸氨酰化,而感兴趣的核酸包含O-tRNA所识别的至少一个选择者密码子。甲基营养酵母菌细胞可以任选是假丝酵母属细胞、汉森酵母属细胞、球拟酵母菌属细胞或毕赤酵母属细胞,例如巴斯德毕赤酵母细胞。这些方法还包括在感兴趣多肽的翻译期间对选择者密码子起反应而将非天然氨基酸掺入感兴趣核酸的所选位置,从而产生在所选位置包含非天然氨基酸的感兴趣多肽。提供非天然氨基酸可任选包括提供本文所述的任何非天然氨基酸。
提供O-RS可任选包括将编码启动子下游O-RS的O-RS多核苷酸整合入细胞的基因组并表达所编码的O-RS。将O-RS多核苷酸整合入基因组可任选包括将该多核苷酸整合于编码ARG4基因、ADE1基因、HIS4基因、URA3基因、AOX1基因、AOX2基因或MET2基因的基因座。可任选从诱导型启动子,例如AOX1启动子、AOX2启动子、ICL1启动子或FLD1启动子,或从组成型启动子,例如YPT1启动子或GAP启动子表达O-RS。
提供O-tRNA包括提供琥珀抑制型tRNA、赭石抑制型tRNA、乳白抑制型tRNA或识别四碱基密码子的、罕用密码子或非编码密码子的tRNA。提供O-tRNA可任选包括将编码高水平组成型启动子下游O-tRNA的O-tRNA多核苷酸整合入细胞的基因组并表达该O-tRNA。将O-tRNA多核苷酸整合入细胞的基因组可任选包括将该多核苷酸整合于编码ARG4基因、ADE1基因、HIS4基因、URA3基因、AOX1基因、AOX2基因或MET2基因的基因座。可任选从PGK1启动子表达O-tRNA。
提供编码感兴趣多肽的感兴趣核酸可包括提供任选编码(但不限于)本文所述任何蛋白质和多肽的核酸。提供感兴趣核酸可任选包括将感兴趣核酸置于诱导型启动子,例如AOX1启动子、AOX2启动子、ICL1启动子或FLD1启动子或组成型启动子,例如YPT1启动子或GAP启动子的转录控制下。提供感兴趣的核酸还包括将其整合入细胞的基因组。感兴趣的核酸可任选以单拷贝整合入基因组,例如整合于编码AOX1基因、ADE1基因、HIS4基因、URA3基因、ARG4基因、AOX2基因或MET2基因的基因座。感兴趣核酸可任选以多拷贝整合入细胞的基因组,例如整合于AOX1基因的基因座5’。
产生在所选位置包含非天然氨基酸的多肽可任选包括以缓冲复合甲醇培养基(bufferedcomplexmethanolmedia)(BMMY):缓冲最低甲醇(bufferedminimalmethanol)(BMM)=1:9的比例培养适当制备的甲基营养酵母菌细胞,例如假丝酵母属细胞、汉森酵母属细胞、球拟酵母菌属细胞或毕赤酵母属细胞,例如巴斯德毕赤酵母细胞,并在摇瓶中培养该培养物以诱导多肽表达。产生在所选位置含有非天然氨基酸的多肽可任选包括培养酵母菌培养物直至其达到稠密的浆状物。产生的多肽可任选包含二硫键、得到硫酸化和/或糖基化。产生的多肽可任选以最高10毫克/升的浓度自培养物中表达。
在巴斯德毕赤酵母中产生在所选位置含有非天然氨基酸的多肽可包括用合适巴斯德毕赤酵母的菌落接种YPD培养基以产生第一培养物,29-30℃,在摇瓶中以280rpm振荡培养该第一培养物至接近饱和,利用该第一培养物接种1升缓冲培养基甘油酵母提取物(BMGY)以产生第二培养物。该方法包括将该第二培养物培养至OD600为8.0,以1500xg离心该第二培养物5分钟从而形成沉淀物,将该沉淀物重悬在200ml1:9比例的缓冲复合甲醇培养基(BMMY):缓冲最低甲醇(BMM)中以产生第三培养物。最后,在巴斯德毕赤酵母中产生在所选位置含有非天然氨基酸的多肽的方法包括随后在120-144小时期间每24小时将甲醇加入该第三培养物至终浓度为0.5%,以维持诱导多肽。
试剂盒也是本发明特征之一。例如,试剂盒可装有非天然氨基酸和本发明的甲基营养酵母菌细胞。细胞可任选包含整合入其基因组的编码O-tRNA的核酸和/或编码O-RS的核酸,例如其中所述O-RS和O-tRNA在任何上述启动子的转录控制下。试剂盒可装有利用本文细胞的组件,例如将含有一个或多个选择者密码子并编码感兴趣多肽的核酸整合入甲基营养酵母菌细胞基因组的使用说明书。试剂盒可装有容纳试剂盒诸组分的容器,用试剂盒提供的细胞实施本文所述任何方法的使用说明材料,例如产生在所选位置含有一个或多个非天然氨基酸的感兴趣多肽。
本领域技术人员应知道本发明提供的方法、试剂盒和组合物可单独使用或联用。例如,可将本发明的甲基营养酵母菌细胞用于本文所述方法以产生在所选位置含有非天然氨基酸的感兴趣多肽。或者,可采用这些方法产生,例如最高10毫克/升浓度的硫酸化多肽、糖基化多肽和/或包含一个或多个二硫键的多肽。技术人员应知道本文所述本发明特征的其它组合。
定义
在详细描述本发明之前,应当理解本发明并不限于特定的生物学系统,当然也可以改变。还应知道本文所用的术语只是为了描述具体的实施方式,而非限制性的。除非另有明确指出,本说明书和随附的权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”也包括复数对象。因此,除非另外说明,例如述及“一种氨酰tRNA合成酶(RS)”任选包括两种或多种RS分子的组合;述及作为实际物质的“核酸”或“细胞”任选包括多拷贝的该核酸或许多细胞。
除非另外说明,本文所用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域的普通技术人员理解的意义相同。尽管与本文所描述的那些方法和材料相似或等价的任何方法和材料都可用于实施本发明,但是本文描述的是优选材料和方法。在本发明的说明书和权利要求中,下列术语可与下文所述的定义一起使用。
相关:术语“相关”指共同起作用或彼此具有一定特异性的组分,例如正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS),其中该O-RS用非天然氨基酸特异性氨酰化该O-tRNA。
衍生自:本文所用术语“衍生自”指从特定分子或生物、或者根据该特定分子或生物的序列信息分离的组分,或者利用该特定分子或生物或序列信息制备的组分。例如,衍生自第二多肽的多肽可包含与该第二多肽的氨基酸序列相同或基本相似的氨基酸序列。以多肽为例,可通过例如天然产生的诱变、人工定点诱变或人工随机诱变获得衍生的种类。用来衍生多肽的诱变可以是有意定点的或是有意随机的,或混用这两者。诱变多肽以产生衍生自第一多肽的不同多肽可以是随机的(例如,由聚合酶失真(infidelity)造成),而衍生的多肽的鉴定可通过例如本文引用的参考文献所述的合适筛选方法完成。多肽的诱变通常需要操作编码该多肽的多核苷酸。
编码:本文所用的术语“编码”指用多聚大分子或序列链中的信息来指导不同于该第一分子或序列链的第二分子或序列链产生的任何过程。本文所用的该术语应用广泛,可用于各领域。在一些方面,术语“编码”描述了半保留DNA复制的过程,其中双链DNA分子的一条链用作模板,借助依赖DNA的DNA合成酶来编码新合成的互补姊妹链。在另一方面,术语“编码”指用一种分子的信息来指导化学性质不同于该第一分子的第二分子产生的任何过程。例如,DNA分子可编码RNA分子,例如,通过依赖DNA的RNA聚合酶的转录过程。RNA分子也可编码多肽,例如翻译过程。当术语“编码”用于描述翻译过程时,其含义也延伸至编码氨基酸的三联密码子。在一些方面,RNA分子可编码DNA分子,例如通过包括依赖RNA的DNA合成酶的逆转录过程。在另一方面,DNA分子可编码多肽,应该知道该情况用“编码”同时包括转录和翻译过程。
起反应:本文所用的术语“起反应”指本发明的O-tRNA识别选择者密码子并介导与该tRNA偶联的非天然氨基酸掺入延伸中的多肽链的过程。
非-真核生物:本文所用的术语“非-真核生物”指属于原核生物界(也称为原核生物(Procarya))的生物。非-真核生物,例如原核生物通常因其以下特征而区别于真核生物:单细胞组织,通过出芽或分裂的无性生殖,缺乏膜束缚的核与其它膜束缚的细胞器,环状染色体,存在操纵子,不存在内含子、信使(RNA)加帽和聚-AmRNA,以及其它生物化学特征,如不同的核糖体结构。原核生物包括真细菌和古细菌(Archaea)(有时称为“古细菌(Archaebacteria)”)亚界。在原核生物界有时将蓝细菌(蓝绿藻)与支原体分为不同类别。
正交:本文所用的术语“正交”指与某细胞或翻译系统的内源性相应分子相比,某分子(例如,正交tRNA(O-tRNA)和/或正交氨酰tRNA合成酶(O-RS))与该细胞内源性组分起作用的效率降低,或不能与该细胞的内源性组分起作用。就tRNA和氨酰-tRNA合成酶而言,正交指与和内源性tRNA合成酶起作用的内源性tRNA相比,正交tRNA不能与内源性tRNA合成酶起作用或起作用的效率降低;或者与和内源性tRNA起作用的内源性tRNA合成酶相比,正交氨酰tRNA合成酶与内源性tRNA不起作用或起作用的效率降低,所述效率降低例如,小于20%的效率,小于10%的效率,小于5%的效率,或小于1%的效率。正交分子缺乏细胞中功能正常的内源性互补分子。例如,与内源性RS氨酰化内源性tRNA相比,细胞的任何内源性RS氨酰化细胞中正交tRNA的效率降低或者甚至为0。在另一例子中,与内源性RS氨酰化内源性tRNA相比,正交RS氨酰化感兴趣细胞中任何内源性tRNA的效率降低或者甚至为0。可将能与第一正交分子一起起作用的第二正交分子引入细胞。例如,正交tRNA/RS配对包括在细胞中共同起作用且与对照,例如相应的tRNA/RS内源性配对相比其效率是,例如45%效率、50%效率、60%效率、70%效率、75%效率、80%效率、90%效率、95%效率或99%效率,或更高的所引入补充组分,或活性正交配对。
正交氨酰tRNA合成酶:本文所用的正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)是在感兴趣翻译系统内用氨基酸优先氨酰化O-tRNA的酶。O-RS加载到O-tRNA上的氨基酸可以是任何氨基酸,无论是天然、非天然或是人工的,并且不限于本文所述的。该合成酶任选与天然酪氨酰氨基酸合成酶相同或同源,或者与称为O-RS的合成酶相同或同源。
正交-tRNA:本文所用的正交tRNA(O-tRNA)是与感兴趣翻译系统正交的tRNA,其中所述tRNA是,例如:(1)与天然产生的tRNA相同或基本类似;(2)通过天然或人工诱变衍生自天然产生的tRNA;(3)由考虑了(1)或(2)的野生型或突变型tRNA序列的任何方法产生;(4)与野生型或突变型tRNA同源;(5)与称为正交tRNA合成酶底物的任何示例性tRNA同源;或(6)称为正交tRNA合成酶底物的任何示例性tRNA的保守变体。O-tRNA可加载有氨基酸,或处于非负载状态。还应知道“O-tRNA”任选被相关合成酶用非天然氨基酸加载(氨酰化)。应该知道,实际上优选利用本发明的O-tRNA在翻译期间对选择者密码子起反应而将基本上任何非天然氨基酸掺入延伸的多肽。
多肽:多肽是指任何长度的,通常但不绝对是由共价肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然的,或其组合)的任何寡聚物。多肽可以是任何来源的,例如,天然多肽、通过重组分子基因技术制备的多肽、细胞和翻译系统的多肽、或者以无细胞合成方式制备的多肽。多肽的特征由其氨基酸序列决定,例如,其组成氨基酸残基的一级结构。在本文中,多肽的氨基酸序列不限于全长序列,也可能是部分序列或完整序列。另外,这并不意味着根据是否拥有任何特定生物活性来限制多肽。在本文中,术语“蛋白质”是多肽的同义词。术语“肽”是指小的多肽,例如而不限于长2-25个氨基酸的多肽。
优先氨酰化:对于本文所用正交翻译系统而言,当某表达系统中O-RS使O-tRNA加载氨基酸的效率高于其使任何内源性tRNA加载氨基酸的效率时,该O-RS“优先氨酰化”相关O-tRNA。即,当翻译系统中存在摩尔比大致相等的O-tRNA与任何给定的内源性tRNA时,O-RS加载O-tRNA的频率高于它加载内源性tRNA的频率。当翻译系统中存在等摩尔浓度的O-tRNA与内源性tRNA时,由O-RS加载的O-tRNA与由O-RS加载的内源性tRNA的相对比例优选较高,最好导致O-RS仅加载或几乎仅加载O-tRNA。当存在等摩尔浓度的O-tRNA与O-RS时,O-RS加载的O-tRNA与内源性tRNA的相对比例大于1:1,优选至少约2:1,更优选5:1,更优选10:1,更优选20:1,更优选50:1,更优选75:1,更优选95:1、98:1、99:1、100:1、500:1、1,000:1、5,000:1或更高。
当(a)与内源性tRNA相比,O-RS优先氨酰化O-tRNA,和(b)与O-RS用任何天然氨基酸氨酰化O-tRNA相比,氨酰化对非天然氨基酸特异时,称O-RS“优先用非天然氨基酸氨酰化O-tRNA”。即,当包含O-RS和O-tRNA的翻译系统中存在等摩尔量的非天然和天然氨基酸时,O-RS用非天然氨基酸加载O-tRNA的频率高于用天然氨基酸加载的频率。加载有非天然氨基酸的O-tRNA与加载有天然氨基酸的O-tRNA的相对比例优选较高。O-RS最好使O-tRNA仅加载,或者几乎仅加载有非天然氨基酸。当翻译系统中存在等摩尔浓度的天然和非天然氨基酸时,使O-tRNA加载非天然氨基酸与使O-tRNA加载天然氨基酸的相对比例大于1:1,优选至少约2:1,更优选5:1,更优选10:1,更优选20:1,更优选50:1,更优选75:1,更优选95:1、98:1、99:1、100:1、500:1、1,000:1、5,000:1或更高。
选择者密码子:术语“选择者密码子”指翻译过程中为O-tRNA所识别而不为内源性tRNA所识别的密码子。O-tRNA反密码子环识别mRNA上的选择者密码子并在多肽的此位置掺入其氨基酸,例如非天然氨基酸。选择者密码子可包括,例如无义密码子,如终止密码子(如,琥珀、赭石和乳白密码子);四碱基或四碱基以上密码子;罕用密码子;衍生自天然或非天然碱基对的密码子,等等。
抑制活性:本文所用的术语“抑制活性”通常指tRNA(例如,抑制型tRNA)能翻译连读在其它情况中可导致翻译终止或错译(例如,移码)的密码子(例如,作为琥珀密码子的选择者密码子或四个或以上个碱基的密码子)的能力。抑制型tRNA的抑制活性可表示为与第二抑制型tRNA,或与对照系统,例如缺乏O-RS的对照系统相比,观察到的翻译连读活性的百分比。
可通过本领域已知的许多试验测定抑制效率。例如,可采用β-半乳糖苷酶报道试验,如可将衍生的lacZ质粒(该构建物在lacZ核酸序列中含有选择者密码子)连同含有本发明O-tRNA的质粒引入合适生物(例如,可利用正交组分的生物)的细胞。还可引入相关合成酶(可以是多肽或表达时能编码该关联合成酶的多核苷酸)。细胞在培养基中生长至所需密度,例如至OD600约为0.5,进行β-半乳糖苷酶试验,例如用诺瓦金公司(Novagen)的BetaFluorTMβ-半乳糖苷酶试验试剂盒。可将抑制百分比计算为样品相对于可比较对照,例如,衍生的lacZ构建物的观察值的活性百分比,该构建物在所需位置具有相应的有义密码子而非选择者密码子。
抑制型tRNA:抑制型tRNA是在多肽翻译期间通常对终止密码子起反应而掺入氨基酸(即,“连读”)来改变给定翻译系统中信使RNA(mRNA)阅读的tRNA。在一些方面,本发明的选择者密码子是抑制型密码子,例如,终止密码子(如,琥珀、赭石和乳白密码子)、四碱基密码子、罕用密码子等。
翻译系统:术语“翻译系统”指将氨基酸掺入延伸中的多肽链(蛋白质)的各组分。翻译系统的组分可包括,例如核糖体、tRNA、合成酶、mRNA等。
非天然氨基酸:本文所用的术语“非天然氨基酸”指不在20种常见天然氨基酸或罕见的天然氨基酸,例如硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸(pyrrolysine)之列的任何氨基酸,修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物。
附图简述
图1描述了准备将编码人血清白蛋白(HSA)的基因整合入巴斯德毕赤酵母基因组而构建的质粒。
图2描述了准备将编码对-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶(pApaRS)的基因和包含三拷贝tRNACUA的多核苷酸整合入巴斯德毕赤酵母基因组而构建的质粒。
图3说明了为监测表达对-乙酰苯丙氨酰-tRNA合成酶(pApaRS)和tRNACUA的巴斯德毕赤酵母菌株中HSA表达而在甲醇诱导条件下进行的实验结果。
图4说明了为证实非天然氨基酸对-乙酰苯丙氨酸(pApa)掺入HSA而进行的液相层析-串联质谱实验的结果。
图5说明了为证实对-乙酰苯丙氨酸(pApa)掺入HSA而进行的MALDI质谱分析的结果。
图6是本发明可用的各种质粒的示意图。
图7显示了为测定非天然氨基酸对-乙酰苯丙氨酸对选择者密码子起反应而掺入HSA氨基酸第37位的保真度和特异性而进行的实验的结果。
图8显示了为比较pApaRS启动子以便优化琥珀型抑制而进行的实验结果。
图9显示了通过培养基中rHSAE37pApa水平检验的,为测定PAOX2、PYPT1、PICL1、PFLD1、PGAP或PAOX1驱动aaRS的琥珀型抑制水平而进行的实验结果。
图10a显示了ABT-510肽肟连接于rHSAE37pApa的示意图。图10b显示了为测定偶联程度而进行的MALDI质谱法的结果。
图11描述了为说明本发明正交翻译系统可用于在巴斯德毕赤酵母中将除pApa以外的非天然氨基酸(例如,结构3-9)掺入rHSAE37X而进行的实验。
图12描述了为测定pPIC3.5k和pREAV盒是否成功掺入GS200-rHSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS而对4个转化子进行的PCR结果。
图13描述了单一转化GS200-rHSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS的4个不同克隆中pApaRS-His6x的蛋白质印迹。未检测到pApaRS蛋白质。
图14描述了为测定rHSAE37X是否在Mut+突变体中表达更强而进行的实验结果。
图15描述了为扩增各种巴斯德毕赤酵母基因启动子而进行的PCR结果。
图16提供了图9结果的柱状图,其显示rHSAE37pApa中琥珀型抑制与启动子驱动pApaRS产生的函数关系。
图17显示了对25微升BSA标准品或测试蛋白质表达的未纯化rHSA野生型培养物进行的蛋白质凝胶电泳。
图18显示了图11f泳道2的胰凝乳蛋白酶消化rHSAE37DMNB-C蛋白质的LC-MS/MS。
发明详述
本发明有助于在甲基营养酵母菌,例如巴斯德毕赤酵母中产生包含非天然氨基酸的多肽。包含非天然氨基酸的多肽可用作具有新型生物学活性、毒性降低、活性增强和/或半衰期延长的治疗剂。为产生此类蛋白质,在甲基营养酵母菌,例如巴斯德毕赤酵母中利用O-RS/O-tRNA配对相比于其它正交系统,例如大肠杆菌或酿酒酵母具有几种特征性益处。首先,酵母菌,例如巴斯德毕赤酵母的真核亚细胞结构能合成包含非天然氨基酸(UAA)的蛋白质,就生物学活性而言,该蛋白质需要复杂的翻译后修饰,例如糖基化、二硫键形成、硫酸化、酰化、异戊烯化和蛋白质水解加工,例如哺乳动物蛋白,如人血清白蛋白(HSA)和人中性肽链内切酶(NEP)。因此,许多蛋白质在甲基营养酵母菌,例如巴斯德毕赤酵母中产生为生物学活性分子,而在细菌系统中最终是无活性包涵体。第二,在甲基营养酵母菌,例如巴斯德毕赤酵母中产生的包含UAA的蛋白质不含可能妨碍专为治疗应用设计的蛋白质效力的高浓度热原,例如脂多糖或抗原,如高甘露糖寡糖。第三,外来基因在巴斯德毕赤酵母中的遗传操作可采用许多良好建立的技术和方法,例如基因靶向、高频率DNA转化、功能互补克隆(Lin-Cereghino等,(2002)“ProductionofrecombinantproteinsinfermenterculturesoftheyeastPichiapastoris.(在巴斯德毕赤酵母的发酵培养物中产生重组蛋白)”CurrOpinBiotechnol13:329-332)。有内源性诱导型启动子和可选择标记物可用增加了可由该甲基营养宿主产生的各种含UAA蛋白质的灵活性。
除了这些优点,甲基营养酵母菌,例如巴斯德毕赤酵母也良好适用于低成本、大规模合成包含UAA的复杂蛋白质。不难在简单的、含盐明确的培养基中培养甲基营养酵母菌,例如巴斯德毕赤酵母,从而无需杆状病毒表达系统或哺乳动物组织培养所需的昂贵培养基添加剂和高成本设备。甲基营养酵母菌,例如巴斯德毕赤酵母可培养至极高细胞密度,在理想条件下可倍增至细胞悬液呈粘稠浆液。其快速的生长速度使得巴斯德毕赤酵母菌株能产生高水平(例如比酿酒酵母的水平高10-100倍)的异源蛋白质,例如包含UAA的蛋白质。甲基营养酵母菌,例如巴斯德毕赤酵母便于遗传操作、重组蛋白生产经济并且能进行真核生物蛋白质通常相关的翻译后修饰使得它们成为表达包含UAA的异源蛋白质的有利系统。
正交翻译系统组分
通过理解正交tRNA和正交氨酰-tRNA合成酶配对的相关活性能进一步理解用于在甲基营养酵母菌中合成包含非天然氨基酸的蛋白质的新型组合物和方法。将非天然氨基酸掺入这些多肽内可通过改进正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)来识别理想非天然氨基酸并对选择者密码子(例如,琥珀无义密码子,TAG)起反应而将其掺入蛋白质得以实现。这些正交组分不与宿主细胞如毕赤酵母细胞翻译机器的内源性组分或者天然氨基酸交叉反应。本文一个实施例中所用的正交组分包括O-RS,例如衍生自大肠杆菌酪氨酰tRNA-合成酶的O-RS,和O-tRNA,例如,突变型酪氨酰tRNACUA琥珀型抑制基因,二者可在宿主细胞如毕赤酵母中作为正交对起作用。
本文所用的非天然氨基酸是指除硒代胱氨酸和/或吡咯酪氨酸以及20种遗传编码的α氨基酸之外的任何氨基酸、修饰的氨基酸或氨基酸类似物。20种天然氨基酸的结构参见,例如,L.Stryer的《生物化学》(Biochemistry),第3版,1988,FreemanandCompany,纽约。本发明的非天然氨基酸的侧链基团与天然氨基酸不同,尽管非天然氨基酸也可能是20种生成蛋白质的α氨基酸之外的天然化合物。本文所用的非天然氨基酸包括对-(炔丙基氧基)苯丙氨酸、对-甲氧基苯丙氨酸、丹酰基丙氨酸、DMNB-丝氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、O-炔丙基-L-酪氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对-叠氮基-L-苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对-碘-苯丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-氨基-L-苯丙氨酸、酪氨酸的非天然类似物;谷氨酰胺的非天然类似物;苯丙氨酸的非天然类似物;丝氨酸的非天然类似物;苏氨酸的非天然类似物;烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基(alkynl)、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸盐、硼化物(boronate)、磷、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮或氨基取代的氨基酸,或它们的任何组合;带有光活化交联剂的氨基酸;自旋标记的氨基酸;荧光氨基酸;带有新型官能团的氨基酸;与另一分子共价或非共价相互作用的氨基酸;结合金属的氨基酸;含金属的氨基酸;放射性氨基酸;光束缚的和/或光敏异构化的氨基酸;含生物素或生物素类似物的氨基酸;糖基化或糖修饰的氨基酸;含酮氨基酸;包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸;重原子取代的氨基酸;可化学裂解或可光裂解的氨基酸;带有延长侧链的氨基酸;含有毒性基团的氨基酸;糖取代的氨基酸例如糖取代的丝氨酸等;含碳连接的糖的氨基酸;糖取代的半胱氨酸;具有氧化还原活性的氨基酸;含α-羟基的酸;含氨基硫代酸的氨基酸;α,α二取代氨基酸;β-氨基酸;硫代酪氨酸;4-溴-苯丙氨酸;或脯氨酸之外的环状氨基酸。
本发明任选包括多个O-tRNA/O-RS配对。例如,本发明还包括其它O-tRNA/O-RS配对,其中第二O-RS优先用第二非天然氨基酸氨酰化第二O-tRNA,该第二O-tRNA识别第二选择者密码子。多个不同的选择者密码子,例如,独特的三碱基密码子、无义密码子如终止密码子,例如琥珀密码子(UAG)或乳白密码子、非天然密码子、至少一个四碱基密码子、罕用密码子等,可掺入基因,例如,载体核酸和/或互补核酸的编码序列。利用这些不同的选择者密码子,可用多个正交tRNA/合成酶配对同时位点特异性地掺入多个非天然氨基酸,例如包括至少一个非天然氨基酸。这种O-tRNA/O-RS配对可衍生自各种来源,只要该O-tRNA/O-RS配对能在甲基营养酵母菌细胞的环境中保留正交特性。
适用于制备包含一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的O-tRNA和/或O-RS、非天然氨基酸、选择者密码子和正交翻译系统的制备方法和/或改变其特异性的方法通常描述于以下文献,例如,名为“制备正交tRNA-氨酰-tRNA合成酶配对的方法和组合物”(METHODSANDCOMPOSITIONFORTHEPRODUCTIONOFORTHOGONALtRNA-AMINOACYL-tRNASYNTHETASEPAIRS)的国际公布号WO2002/086075;名为“非天然氨基酸的体内掺入”(INVIVOINCORPORATIONOFUNNATURALAMINOACIDS)的WO2002/085923以及名为“扩增真核遗传密码子”(EXPANDINGTHEEUKARYOTICGENETICCODE)的WO2004/094593;2004年7月7日提交的WO2005/019415;2004年7月7日提交的WO2005/007870以及2004年7月7日提交的WO2005/007624。这些申请各自通过引用全文纳入本文。也可参见,Wang和Schultz“扩增遗传密码子”(ExpandingtheGeneticCode)AngewandteChemieInt.Ed.,44(1):34-66(2005);Deiters等,Bioorganic&MedicinalChemistryLetters15:1521-1524(2005);Chin等,J.Am.Chem.Soc.2002,124,9026-9027;以及2005年9月20日提交的国际公布号WO2006/034332,其内容通过引用全文纳入本文。其它细节可见于美国专利号7,045,337;7,083,970;7,238,510;7,129,333;7,262,040;7,183,082;7,199,222;和7,217,809。
甲基营养酵母菌中异源蛋白质的表达和纯化
4种已知的甲基营养酵母菌属,例如汉森酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属和球拟酵母菌属具有使得它们能利用甲醇作为单一碳源的共同代谢途径。在对甲醇诱导的转录调控反应中,几种酶快速高水平合成。由于控制这些基因表达的启动子是最强且最严格调控的酵母菌启动子,甲基营养酵母菌成为大规模生产重组蛋白的最有吸引力的宿主。这些甲基营养酵母菌的细胞可以快速生长至高密度,可通过简单的培养基操作来调节产物表达水平。早已在巴斯德毕赤酵母、P.methanolica、P.angusta(也称为多形汉森酵母(Hansenulapolymorpha))和博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)中开发了表达系统,以下文献进一步描述了这些系统:Houard等,(2002)“Engineeringofnon-conventionalyeastsforefficientsynthesisofmacromolecules:themethylotrophicgenera.(工程改造非常规酵母菌以便有效合成单分子:甲基营养酵母菌属)”Biochimie84:1089-1093;Gellison(2002)HansenulaPolymorpha:BiologyandApplications(多形汉森酵母:生物学和应用),第1版,W-V公司(Wiley-VCH),纽约;美国专利号6,645,739;Gellisen(2000)“Heterologousproteinproductioninmethylotrophicyeasts.(在甲基营养酵母菌中产生异源蛋白质)”AppliedMicrobiologyandBiotechnology54:741-750。可商品化购得许多这些系统用于学术和工业实验室,例如阿特斯生物技术公司(ArtesBiotecnology)的汉森酵母试剂盒和英杰公司(Invitrogen)的毕赤酵母试剂盒。
在优选的实施方式中,从甲基营养毕赤酵母表达和纯化异源蛋白质。如下所述,例如METHODSANDSTRATEGIESFORSTRAINCONSTRUCTIONINMETHYLOTROPHICYEAST(在甲基营养酵母菌中构建菌株的方法和策略)中,可在毕赤酵母中从调节特征良好适合该目的的醇氧化酶1(AOX1)启动子表达外来基因。酵母菌在利用大多数碳源,例如甘油、葡萄糖或乙醇生长期间,AOX1启动子受到严格阻遏,但在用甲醇生长期间被高度诱导(Tschorp等.(1987)“ExpressionofthelacZgenefromtwomethanol-regulatedpromotersinPichiapastoris.(在巴斯德毕赤酵母中从两个甲醇调节启动子表达lacZ基因)”NuclAcidsRes15:3859-3876)。PAOX1调节的基因所编码蛋白质的表达通常达到用甲醇培养的毕赤酵母中可溶总蛋白的≥30%。为产生重组蛋白,首先用阻遏碳源培养PAOX1-控制的表达菌株以产生生物体,例如最大程度提高培养密度,然后换以含甲醇的培养基,例如BMGY、BMMY或BMM作为单一能源以诱导外来基因表达。
然而,甲醇不诱导的启动子也优选用于表达编码某些蛋白质的异源基因。该表达系统中AOX1启动子的备选启动子是毕赤酵母GAP、FLD1、AOX2、ILC1和YPT1启动子。关于这些启动子的调控、可能有利于从这些启动子表达外来基因的情况和毕赤酵母中通过这些启动子表达外来蛋白质的其它细节描述于,例如Sears等,(1998)“AVersatileSetofVectorsforConstitutiveandRegulatedGeneExpressioninPichiapastoris.(毕赤酵母中组成型和受调控基因表达的一套通用载体)”Yeast14:783-790;Vassileva等,(2001)“ExpressionofhepatitisBsurfaceantigeninthemethylotrophicyeastPichiapastorisusingtheGAPpromoter.(利用GAP启动子在甲基异源酵母菌毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原)”JBiotechnology88:21-35;Shen等,(1998)“Astrongnitrogen-sourceregulatedpromoterforcontrolledexpressionofforeigngenesintheyeastPichiapastoris.(在毕赤酵母中控制外来基因表达的氮源调控的强启动子)”Gene216:93-102;Lin-Cereghino等,“ExpressionofforeigngenesintheyeastPichiapastoris.(在毕赤酵母中表达外来基因)”GeneticEngineeringPrinciplesandMethods(遗传工程改造原理和方法),第23卷,第1版,JaneK.Setlow编,斯普林格公司(Springer),纽约:(2005)。
虽然可用摇瓶进行巴斯德毕赤酵母或其它甲基营养酵母菌中异源蛋白质的表达,但该系统的蛋白质表达水平通常在发酵罐培养中更高,因为在发酵罐中可以控制诸如pH、通气和碳源加料速度等参数,从而达到超过细胞密度,例如>100克/升干细胞重量;>400克/升湿细胞重量;>500OD600单位/毫升(参见,例如Lin-Cereghino等,(2002)“ProductionofrecombinantproteinsinfermenterculturesoftheyeastPichiapastoris.(发酵罐培养巴斯德毕赤酵母来产生重组蛋白)”CurrOpinBiotechnol13:329-332)。巴斯德毕赤酵母表达系统的特点是便于将表达菌株从摇瓶放大到高密度发酵罐培养。
通常采用三步方法在巴斯德毕赤酵母或其它甲基营养酵母菌的发酵罐培养中表达异源蛋白,例如转录控制下的基因编码的蛋白质。在第一步中,用简单的成分确定培养基培养工程改造的巴斯德毕赤酵母或其它甲基营养酵母菌表达菌株,该培养基包含不可发酵的PAOX1-抑制型碳源以允许细胞生长。第二步包括过渡期,在该期间以生长限制速度向培养物中加入甘油以进一步增加培养物的生物体并制备细胞以供诱导。在第三步中,向培养物中加入甲醇,其添加速度应使得细胞在生理上适应代谢甲醇并合成重组蛋白。然后定期上调甲醇加料速度直至获得所需生长速度和蛋白质表达速度(Lin-Cereghino等,“ExpressionofforeigngenesintheyeastPichiapastoris.(在巴斯德毕赤酵母中表达外来基因)”GeneticEngineeringPrinciplesandMethods(遗传工程改造原理和方法),第23卷,第1版,JaneK.Setlow编,斯普林格公司,纽约:(2005))。
培养巴斯德毕赤酵母的培养基廉价,成分确定,由诸如甘油和/或甲醇等碳源、生物素、盐、痕量元素和水构成。培养基不含热原和毒素,因此与人用药剂的制备相容。
可以在胞内或胞外制备巴斯德毕赤酵母或其它甲基营养酵母菌中表达的重组蛋白。由于该酵母菌只分泌低水平的内源蛋白,分泌的重组蛋白可占培养基中蛋白的大部分。因此,将重组蛋白导向培养基中可用作蛋白质纯化中的第一步,从而无需采用苛刻的酵母菌裂解方法并避免内源性巴斯德毕赤酵母蛋白污染重组蛋白的可能性。然而由于蛋白质稳定性和折叠要求,将异源蛋白质分泌入培养基通常只针对正常情况下由它们的天然宿主细胞分泌的那些蛋白质。然而,可利用试剂盒,例如英杰公司的原创毕赤酵母表达试剂盒(OriginalPichiaExpressionKit,Invitrogen)、英杰公司的多拷贝毕赤酵母表达试剂盒(Multi-CopyPichiaExpressionKit,Invitrogen)、研发协作技术公司的毕赤酵母蛋白表达系统(PichiaProteinExpressionSystem,ResearchCorporationTechnologies),其中从业人员可用预先制备的表达盒将感兴趣基因与编码其天然分泌信号、酿酒酵母α-因子前多肽原或巴斯德毕赤酵母酸性磷酸酶(PHO1)信号的序列克隆在框内,从而能分泌入培养基。现已开发了许多技术来回收巴斯德毕赤酵母的胞内重组蛋白(Shepard等,(2002)“RecoveryofintracellularrecombinantproteinsfromtheyeastPichiapastorisbycellpermeabilization.(通过细胞透化处理回收巴斯德毕赤酵母的胞内重组蛋白)”JBiotechnology99:149-160;美国专利号6,821,752)。
蛋白质纯化的通用方法
各种蛋白质纯化方法是本领域熟知的,可用于纯化和分析在甲基营养酵母菌中表达的包含UAA的蛋白质。这些技术以及分析多肽所需的其它技术包括下列文献所描述的那些:R.Scopes,《蛋白质纯化》(ProteinPurification),S-V公司(Springer-Verlag),纽约(1982);Deutscher,《酶学方法》(MethodsinEnzymology),182卷:蛋白质纯化指导(GuidetoProteinPurification),学术出版公司(AcademicPress,Inc).纽约.(1990);Sandana(1997)《蛋白质的生物分离》(BioseparationofProteins),学术出版公司;Bollag等(1996)《蛋白质方法》(ProteinMethods),第2版,W-L公司(Wiley-Liss),纽约;Walker(1996)《蛋白质方法手册》(TheProteinProtocolsHandbook)休玛娜出版社(HumanaPress),新泽西州;Harris和Angal(1990)《蛋白质纯化应用:实用方法》(ProteinPurificationApplications:APracticalApproach)牛津IRL出版社(IRLPressatOxford),牛津,英格兰;Harris和Angal《蛋白质纯化方法:使用方法》(ProteinPurificationMethods:APracticalApproach)牛津IRL出版社,牛津,英格兰;Scopes(1993)《蛋白质纯化:原理和实践》(ProteinPurification:PrinciplesandPractice),第3版,S-V公司,纽约;Janson和Ryden(1998)《蛋白质纯化:原则、高分辨率方法及应用》(ProteinPurification:Principles,HighResolutionMethodsandApplications),第2版,WV公司,纽约;以及Walker(1998)《蛋白质方法,光盘版》(ProteinProtocolsonCD-ROM),休玛娜出版社,新泽西州;以及其中引用的参考文献。
构建甲基营养酵母菌菌株的方法和策略
通常利用适合在大肠杆菌中复制的穿梭载体工程改造将感兴趣基因置于高度诱导型甲基营养酵母菌启动子控制下的核酸构建物。由于质粒在甲基营养酵母菌中较不稳定,通常使将表达构建物线性化,转化入,例如毕赤酵母属细胞、汉森酵母属细胞、假丝酵母属细胞或球拟酵母属细胞,并整合入基因组。整合通常是位点特异性的;然而,在多形汉森酵母中观察到高频率的非同源整合(Agaphonov等,(2005)“Defectofvacuolarproteinsortingstimulatesproteolyticprocessingofhumanurokinase-typeplasminogenactivatorintheyeastHansenulapolymorpha.(空泡蛋白分选缺陷刺激多形汉森酵母中人尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂的蛋白水解加工)”FEMSYeastReseach5:1029-1035)。关于甲基营养酵母菌的通用分子操作,例如转化、基因靶向、通过功能互补克隆、利用可用的可选择标记等的其它细节可见,例如Peberdy编,(1991)AppliedMolecularGeneticsofFungi(真菌的应用分子遗传学).剑桥大学出版社,英国;HansenulaPolymorpha:BiologyandApplications(多形汉森酵母:生物学和应用),第一版,W-V公司;Higgins和Cregg.PichiaProtocols(MethodsinMolecularBiology)(毕赤酵母方案(分子生物学方法)),第一版.休玛娜出版社:新泽西州(1998);和其中引用的参考文献。
在优选的实施方式中,在甲基营养巴斯德毕赤酵母中表达异源基因。可通过以下三个基础步骤在巴斯德毕赤酵母中表达大多数外来基因:将感兴趣的基因插入表达载体;将该表达载体引入巴斯德毕赤酵母基因组;和分析产生外来基因所表达蛋白的推定表达菌株,该方法在上文描述于构建甲基营养酵母菌菌株的方法和策略中。幸运的是,巴斯德毕赤酵母的分子遗传操作的技术,例如DNA-介导的转化、基因靶向、基因替代和通过功能互补克隆类似于酿酒酵母所述的那些。然而,与酿酒酵母相反,质粒在巴斯德毕赤酵母中不稳定,编码感兴趣蛋白质的表达构建物通过同源重组整合入巴斯德毕赤酵母基因组。巴斯德毕赤酵母的分子遗传操作方案详述于,例如Cregg等,(1985)“Pichiapastorisasahostsystemfortransformations.(巴斯德毕赤酵母作为转化的宿主系统)”MolecCellBiol5:3376-3385;Lin-Cereghino等,“ExpressionofforeigngenesintheyeastPichiapastoris.(在巴斯德毕赤酵母中表达外来基因)”GeneticEngineeringPrinciplesandMethods(遗传工程改造原理和方法),第23卷,第1版,JaneK.Setlow编,斯普林格公司,纽约:(2005);Higgins和Cregg.PichiaProtocols(MethodsinMolecularBiology)(毕赤酵母方案(分子生物学方法)),第一版.休玛娜出版社:新泽西州(1998);Lin-Cereghino等,(2000)“HeterologousproteinexpressioninthemethylotrophicyeastPichiapastoris.(在甲基营养巴斯德毕赤酵母中表达异源蛋白质)”FEMSMicrobiolRev24:45-66,和其中引用的参考文献。
有各种巴斯德毕赤酵母宿主菌株和表达载体可用。实际上,所有巴斯德毕赤酵母表达菌株衍生自伊利诺斯州皮奥里亚市北区研究实验室(NorthernRegionalResearchLaboratories,Peoria,IL)的NRRL-Y111430。大多数表达菌株具有能用于选择包含合适互补标记的表达载体的一个或多个营养缺陷型标记。宿主菌株因AOX1、AOX2或二者中有缺陷而代谢甲醇的能力不同。事实上,在AOX1和/或AOX2中有突变的菌株可能比野生型菌株更好的外来蛋白质生产者(Cregg等.(1987)“HighlevelexpressionandefficientassemblyofhepatitisBantigeninthemethylotrophicyeast,Pichiapastoris.(在甲基营养酵母菌,巴斯德毕赤酵母中乙型肝炎抗原的高水平表达和有效装配)”Bio/Technology5:479-485;Chiruvolu等,(1997)“Recombinantproteinproductioninanalcoholoxidase-defectivestrainofPichiapastorisinfed-batchfermentation.(采用分批补料发酵在巴斯德毕赤酵母的醇氧化酶缺陷型菌株中产生重组蛋白)”EnzymeMicrobTechnol21:277-283)。然而,aox1-菌株甚至保留了高水平地诱导从AOX1启动子表达外来蛋白的能力。宿主菌株,包括某些重组蛋白表达可能更有利的蛋白酶缺陷型宿主菌株的更详细信息见,例如Brierley等,(1998)“Secretionofrecombinantinsulin-likegrowthfactor-1(IGF-1).(重组胰岛素-样生长因子-1(IGF-1)的分泌)”MethodsMolBiol103:149-177;White等,(1995)“Large-scaleexpression,purification,andcharacterizationofsmallfragmentsofthrombomodulin:therolesofthesixthdomainandofmethionine388.(大规模表达、纯化和表征血栓调节蛋白的小片段:第六结构域和甲硫氨酸388的作用)”ProteinEng8:1177-1187。
大多数巴斯德毕赤酵母表达载体设计成大肠杆菌/巴斯德毕赤酵母穿梭载体,该载体含有用于维持在大肠杆菌中的复制起点和在一种或两种生物体中起作用的可选择标记,例如在巴斯德毕赤酵母中可选择的ARG4、HIS4、ADE1、URA3、TRP1和某些抗生素,例如ZeocinTM和和/或可在大肠杆菌中选择的许多抗生素耐受标记中的任一种。表达载体通常包含5’AOX1启动子序列和用于转录终止的AOX1-衍生序列,二者之间有多克隆位点。虽然AOX1启动子已成功用于表达多种外来蛋白,但仍有可能不适用该启动子的情况,例如就生产食品而言。该表达系统中AOX1启动子之外的备选启动子是巴斯德毕赤酵母AOX2、ICL1、GAP、FLD1和YPT1启动子。包含任何上述启动子和可能的载体组分清单的通用表达载体还可见,例如Lin-Cereghino等,“ExpressionofforeigngenesintheyeastPichiapastoris.(在巴斯德毕赤酵母中表达外来基因)”GeneticEngineeringPrinciplesandMethods(遗传工程改造原理和方法),第23卷,第1版,JaneK.Setlow编,斯普林格公司,纽约:(2005);和Lin-Cereghino等,(2000)“HeterologousproteinexpressioninthemethylotrophicyeastPichiapastoris.(在甲基营养巴斯德毕赤酵母中表达异源蛋白质)”FEMSMicrobiolRev24:45-66。此外,许多载体的DNA序列可见英杰公司网址(www.invitrogen.com),各自可从英杰公司获得并用于巴斯德毕赤酵母表达试剂盒中。
通用分子克隆方法和技术
参考文献中描述了很多分离、克隆和扩增核酸的方法以便准备,例如将感兴趣基因克隆入表达构建物,如上文构建甲基营养酵母菌菌株的方法和策略所述,这些方法可用于本发明以便,例如在甲基营养酵母菌,如巴斯德毕赤酵母中提供感兴趣基因并表达。这些技术的进一步细节可见:Berger和Kimmel,“分子克隆技术指南”《酶学方法》(GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymology)第152卷,学术出版社公司,圣迭戈,加利福尼亚州(Berger);Sambrook等,《分子克隆:实验室手册》(MolecularCloning-ALaboratoryManual)(第3版),1-3卷,冷泉港实验室,冷泉港,纽约,2000(“Sambrook”);《核酸方法学手册》(TheNucleicAcidProtocolsHandbook)RalphRapley(编)(2000)冷泉港,休玛娜出版社公司(Rapley);《最新分子生物学方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),F.M.Ausubel等编,《最新方法》(CurrentProtocols),格林出版合伙公司(GreenePublishingAssociates,Inc.)和约翰威利父子公司(JohnWiley&Sons,Inc.)的合作企业(增补2007)(“Ausubel”));《PCR方法,方法和应用指南》(PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications)(Innis等编)学术出版公司.圣迭戈,加利福尼亚州(1990)(Innis);Chen等(编)《PCR克隆方法》(PCRCloningProtocols),第2版(《分子生物学方法》(MethodsinMolecularBiology),第192卷)休玛娜出版社;Viljoen等(2005)《分子诊断PCR手册》(MolecularDiagnosticPCRHandbook)斯普林格公司;Demidov和Broude(编)(2005)《DNA扩增:当代技术和应用》(DNAAmplification:CurrentTechnologiesandApplications)地平线生物科学公司(HorizonBioscience),怀蒙特汉姆(Wymondham),英国。其它有用的参考文献,例如,用于细胞分离和培养,例如,用于随后的核酸分离,包括Freshney(1994)《动物细胞培养,基本技术手册》(CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique),第3版,W-L公司,纽约及其中引用的文献;Payne等(1992)《植物细胞和组织在液体系统中的培养》(PlantCellandTissueCultureinLiquidSystems)约翰威利父子公司纽约,纽约州;Gamborg和Phillips(编)(1995)《植物细胞、组织和器官培养》(PlantCell,TissueandOrganCulture);《基础方法斯普林格实验室手册》(FundamentalMethodsSpringerLabManual),S-V公司(Springer-Verlag)(伯林、海德堡、纽约)以及Atlas和Parks(编)《微生物培养基手册》(TheHandbookofMicrobiologicalMedia)(1993)CRC出版社(CRCPress),伯克莱屯,佛罗里达州。
可商品化购得许多试剂盒用于从细胞纯化质粒或其它相关核酸(参见,例如,法玛西亚生物技术公司(PharmaciaBiotech)的EasyPrepTM和FlexiPrepTM;斯特拉塔基因公司(Stratagene)的StrataCleanTM;恰根公司(Qiagen)的QIAprepTM)。任何分离的和/或纯化的核酸都可以进一步操作以制备其它核酸,用于转染细胞、掺入相关载体以感染生物体以便表达等。典型的克隆载体包含转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列、以及用于调节特定靶核酸表达的启动子。载体任选包含基因表达盒,其含有至少一个独立终止子序列、使表达盒在真核细胞或原核细胞或者二者(例如,穿梭载体)中复制的序列以及用于原核和真核系统的选择标记。参见Sambrook,Ausubel和Berger。另外,基本上任何核酸都可以从任何商业来源定制或订购,例如阿拉巴马州亨茨维尔的操纵子技术公司(OperonTechnologiesInc.,Huntsville,AL)。
感兴趣的蛋白质和多肽
本发明提供将非天然氨基酸掺入甲基营养酵母菌,例如巴斯德毕赤酵母合成的蛋白质的组合物和方法。本发明尤其可用于开发和大规模制备生物学特性增强、毒性降低和/或半衰期延长的治疗蛋白。最宜利用本文所述方法和组合物表达的这种治疗性、诊断性和其它多肽的例子包括但不限于:HSA、人中性肽链内切酶(NEP)、抗体、Fab、Fv、α-1抗胰蛋白酶、血管抑制素、抗溶血因子、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降钙素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配体、c-kit配体、胶原酶、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制物、补体受体1、细胞因子、上皮细胞中性白细胞激活肽-78、GROα、MGSA、GROβ、GROγ、MIP1-α、MIP1-β、MCP-1、人表皮生长因子(hEGF)、上皮细胞嗜中性白细胞激活肽、促红细胞生成素(EPO)、剥落性毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、FGF21、血纤蛋白原、纤连蛋白、G-CSF、GM-CSF、人葡糖脑苷脂酶、促性腺激素变体、生长因子、生长因子受体、hedgehog蛋白、血红蛋白、肝细胞生长因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白(HSA)、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、人胰岛素、人胰岛素-样生长因子(hIGF)、hIGF-I、hIGF-II、人干扰素、IFN-α、IFN-、IFN-γ、白介素、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角化细胞生长因子(KGF)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经营养因子、嗜中性白细胞抑制因子(NIF)、人抑瘤素M(OSM)、成骨蛋白、癌基因产物、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、人生长激素(hGH)、多效生长因子、A蛋白、G蛋白、致热外毒素A、致热外毒素B、致热外毒素C、松弛素、肾素、SCF/c-kit、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合征毒素、胸腺素α1、组织纤溶酶原激活物、肿瘤生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、人肿瘤坏死因子(hTNF)、人肿瘤坏死因子α、人肿瘤坏死因子β、人肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、人血管内皮生长因子(hVEGEF)、hVEGF165、尿激酶、Mos、Ras、Raf、Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、雌激素受体、孕酮受体、睾酮受体、醛固酮受体、LDL受体、炎性分子、信号转导分子、转录激活物、转录抑制物、透明质酸酶(hyalurin)、CD44、皮质酮、人甲状腺过氧化物酶(hTPO)、破伤风毒素片段C、牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(BPTI)、人淀粉样前蛋白(APP)、人抗凝血酶III、BP320抗原、人胱冬酶-3、乙型肝炎表面抗原、人性别类固醇结合蛋白(humansexsteroid-bindingprotein)(hSBP)、人内皮抑制素或gp120。
试剂盒
试剂盒也是本发明的一个特征。例如,试剂盒可装有非天然氨基酸和本发明的甲基营养酵母细胞。细胞可任选包含整合入其基因组的编码O-tRNA的核酸和/或编码O-RS的核酸,例如其中所述O-RS和O-tRNA分别受任何所述启动子的转录控制。试剂盒可装有使用本文所述细胞的组件,例如将含有一个或多个选择者密码子的核酸整合入甲基营养酵母细胞的基因组的使用说明书,其中所述核酸编码感兴趣多肽。试剂盒可装有盛放试剂盒诸组分的容器、实施本文所述任何方法的使用说明材料以及随试剂盒提供的细胞,例如以便制备在所选位置含有一个或多个非天然氨基酸的感兴趣多肽。
实施例
提供以下实施例是为了说明而不是限制本发明。应该知道,本文所述的实施例和实施方式只是为了说明,本领域技术人员鉴于此可以想到各种改进或改变,这些改进或改变应包括在本申请的构思和权限以及随附权利要求书的范围内。
实施例1
构建包含非天然氨基酸的蛋白质的巴斯德毕赤酵母表达系统
将非天然氨基酸(UAA)掺入多肽包括通过开发遗传学编码的正交tRNACUA(O-tRNA)/正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)配对将“第21种”氨基酸加入目前的20种天然蛋白生成性α-氨基酸库。采用定向进化将詹氏甲烷球菌(M.jannaschii)tyrRS的特异性从酪氨酸改变成感兴趣非天然氨基酸以便在大肠杆菌表达系统中用作O-RS。类似地,可将大肠杆菌tyrRS或leuRS的特异性分别从酪氨酸或亮氨酸改变成感兴趣的非天然氨基酸以便在酿酒酵母表达系统中用作O-RS。通过突变体文库的半理性设计,在酿酒酵母和大肠杆菌中成功进化了超过30种氨酰-tRNA合成酶用于掺入相应非天然氨基酸(Xie等,(2005)“Anexpandinggeneticcode.(扩增遗传密码)”Methods36:227-38;Xie等,(2006)“Achemicaltoolkitforproteins:anexpandedgeneticcode.(蛋白质的化学工具包:扩增的遗传密码)”NatRevMolCellBiol7:775-82)。该体内定点方法能将新型化学官能团掺入蛋白质,该方法的效率超过化学tRNA氨酰化或固相合成。迄今为止,独特的化学活性包括光不稳定基团、糖基化氨基酸、光交联剂、酮官能团、金属螯合剂和IR探针(Xie等,(2005)“Anexpandinggeneticcode.(扩增遗传密码)”Methods36:227-38;Wang等,(2006)“Expandingthegeneticcode.(扩增遗传密码)”AnnuRevBiophysBiomolecStruct35:225-249)。该研究感兴趣的是独特的酮残基、对-乙酰基苯丙氨酸和叠氮化物残基、对-叠氮基苯丙氨酸(Zhang等,(2003)“Anewstrategyforthesite-specificmodificationofproteinsinvivo.(体内位点特异性修饰蛋白质的新策略)”Biochemistry42:6735-46)。将这些残基掺入蛋白质能位点特异性地偶联小分子、肽或聚乙二醇(PEG),例如通过肟或酰肼连接。
迄今,在大肠杆菌、酿酒酵母和哺乳动物细胞中利用进化正交合成酶体内表达包含非天然氨基酸的蛋白质已见诸描述(Lie等,(2007)“Thegeneticincorporationofunnaturalaminoacidsintoproteinsinmammaliancells.(在哺乳动物细胞中将非天然氨基酸遗传掺入蛋白质)”NatureMethods4:239-244)。虽然可在这种大肠杆菌和酿酒酵母表达系统中产生许多包含非天然氨基酸的重组表达蛋白,但这些系统不能合成硫酸化蛋白质、糖基化蛋白质或包含复杂的二硫化物交联键的蛋白质,例如人血清白蛋白(HSA)和人中性肽链内切酶或中性溶酶(NEP)。由于HSA和NEP含有复杂的二硫化物连接键,还因为产生生物学活性NEP需要糖基化,大肠杆菌或酿酒酵母中均不能高产率地表达这些蛋白质。
为表达包含非天然氨基酸的HSA或NEP变体,必须改造新型体内UAA表达系统以便改进异源蛋白表达。例如,现已反复证明巴斯德毕赤酵母表达系统可成功地合成硫酸化、糖基化或高度交联的哺乳动物蛋白(Lin-Cereghino等,(2000)“HeterologousproteinexpressioninthemethylotrophicyeastPichiapastoris.(在甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中表达异源蛋白)”FEMSMicrobiolRev24:45-66)。与在酿酒酵母中产生蛋白质相反,在巴斯德毕赤酵母中产生的蛋白质不大可能含有会妨碍下游加工的高甘露糖聚糖结构,巴斯德毕赤酵母中产生的蛋白质也不会含有潜在抗原性的α1,3聚糖连接键。此外,巴斯德毕赤酵母中重组蛋白的表达水平比酿酒酵母中的表达水平高几个数量级(Lin-Cereghino等,(2000)“HeterologousproteinexpressioninthemethylotrophicyeastPichiapastoris.(在甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中表达异源蛋白)”FEMSMicrobiolRev24:45-66)。将进化的UAA合成酶从酿酒酵母转移到巴斯德毕赤酵母能增强包含非天然氨基酸的功能性哺乳动物蛋白质,例如HSA和NEP的表达。
由于质粒在巴斯德毕赤酵母中较不稳定,将分别编码感兴趣蛋白质,例如人血清白蛋白(HSA),及O-RS和O-tRNA,例如乙酰苯丙氨酰基tRNA合成酶(pApaRS)和tRNACUA的DNA构建物各自重组入巴斯德毕赤酵母基因组,如英杰公司的多拷贝毕赤酵母表达试剂盒(Multi-copyPichiaExpressionKit,Invitrogen)和它处(Lin-Cereghino等,(2000)“HeterologousproteinexpressioninthemethylotrophicyeastPichiapastoris.(在甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中表达异源蛋白)”FEMSMicrobiolRev24:45-66)所述。将这些构建物引入詹姆斯克雷格实验室(JamesCregglaboratory)馈赠的巴斯德毕赤酵母菌株GS200的基因组。GS200不能在缺乏精氨酸和组氨酸的培养基中生长。将包含HIS4基因的HSA构建物整合入GS200基因组的AOX1基因座,将包含ARG4基因的编码O-RS和O-tRNA的构建物整合入GS200的ARG4基因座。
HSA突变型HSA-Glu37TAG的基因组整合通过两种方法进行:aox1::HSA基因替代和5’AOX1基因插入。选择该突变体在巴斯德毕赤酵母中表达是因为例如对选择者密码子TAG起反应而掺入突变型蛋白的非天然氨基酸在HSA蛋白的一级螺旋中是溶剂可接近的,因而随后能进行体外偶联反应。从国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth),哺乳动物基因保藏所(MammalianGeneCollection)获得野生型HSA的核苷酸序列(野生型HSA)(登录号BC023034),将其克隆入pYES2.1载体以产生上述突变体,按照定点诱变试剂盒(斯特拉塔基因公司)所述的方法制备。将突变型HSA等位基因和野生型HSA各自再克隆入pPIC3.5k的BamHI和EcoRI限制性位点之间,将野生型和突变型HSA表达置于AOX1启动子和终止子的转录控制下(图1)。HSA的24氨基酸哺乳动物“前蛋白(pre-pro)”前导序列,例如氨基酸序列MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR与巴斯德毕赤酵母分泌信号相容,并允许蛋白质输入培养基。该前蛋白序列不存在于成熟HSA上(Yeh等,(1992)“DesignofYeast-SecretedAlbuminDerivativesforHumanTherapy:BiologicalandAntiviralPropertiesofaSerumAlbumin-CD4GeneticConjugate.(设计酵母菌分泌的人治疗用白蛋白衍生物:血清白蛋白-CD4遗传偶联物的生物学和抗病毒特性)”ProcNatlAcadSciUSA89:1904-8)。
用SacI使各自编码HIS4和(GenR)标记的pPIC3.5k-HSA构建物线形化来指导插入5’AOX1基因座,从而获得具有GenRHis+arg-Mut+表型的GS200转化子,或用BglII来指导aox1::HSA基因替代,从而获得具有GenRHis+arg-muts表型的GS200转化子。通过电穿孔利用得到的片段转化感受态GS200细胞。采用英杰公司的多拷贝毕赤酵母表达试剂盒和它处(Sears等,(1998)“AVersatileSetofVectorsforConstitutiveandRegulatedGeneExpressioninPichiapastoris.(毕赤酵母中组成型和受调控基因表达的一套通用载体)”Yeast14:783-790和Becker等,(1991)“HighEfficiencyTransformationofyeastbyelectroporation.(通过电穿孔高效转化酵母菌)”MethodsEnzymolJonAbelson等编,194:182-187)所述的标准方法制备电感受态(electrocompetent)的酵母菌细胞。在缺乏组氨酸的再生葡萄糖基(RDB)琼脂糖平板上选择组氨酸原养型的基因组中携带pPIC3.5k-HSA盒的巴斯德毕赤酵母转化体。然后在补加了0.25-4.0mg/mL的酵母提取物蛋白胨葡萄糖(YPD)琼脂板上筛选转化体的耐受性。aox1::HSA基因替代获得的转化体在补加了0.25mg/mL的YPD平板上生长表明基因组中存在一拷贝的HSA-Glu27TAG盒,而5’AOX1插入获得的转化体在补加了2.5mg/mL的YPD平板上生长表明基因组中存在多拷贝的HSA-Glu27TAG盒。选择aox1::HSA基因替代获得的一个HSA-Glu37TAG转化体和5’AOX1插入获得的一个HSA-Glu37TAG转化体,制成电感受态。冷冻携带一拷贝野生型HSA(mutsarg-表型)的GS200克隆以便用作表达对照。
从pPR1-PGK1+3SUP4-tRNACUA(彼得舒尔茨实验室(PeterSchultzlaboratory)的优化酿酒酵母表达质粒)构建质粒pREAV以便含有编码对-乙酰苯丙氨酰tRNA合成酶(pApaRS)和tRNACUA的插入物(图2)。该正交氨酰-tRNA合成酶/正交tRNA配对衍生自大肠杆菌并已作优化以便将非天然氨基酸对-乙酰苯丙氨酸掺入酿酒酵母表达系统(Chen,S等.(2007)“AnImprovedSystemfortheGenerationandAnalysisofMutantProteinsContainingUnnaturalAminoAcidsinSaccharomycescerevisiae.(在酿酒酵母中产生和分析含非天然氨基酸的突变型蛋白质的改进系统)”JournalMolecBio371:112-22)。
pPR1-PGK1+3SUP4-tRNACUA编码三个串联拷贝的tRNACUA。为构建pREAV,利用pPR1-PGK1+3SUP4-tRNACUA载体作为模板进行PCR以产生恰在编码2u起点和TRP标记的载体区域外含有限制性位点KpnI和HindIII的pPR1-衍生质粒。通过PCR从詹姆斯克雷格实验室馈赠的质粒pBLARG扩增ARG4(登录号AF321097)以产生侧接KpnI和HindIII限制性位点的编码ARG4的片段。将KpnI/HindIIIARG4片段连接入上述pPR1-衍生载体,以替代2u起点和TRP标记。然后通过PCR将AflII和AscI限制性位点引入该构建物中ADH1启动子之外。将编码pApaRS的NotI/EcoRI插入物克隆入经NotI和EcoRI消化线形化的pPIC3.5K质粒,从而将pApaRS表达置于AOX1启动子和终止子的转录控制下。扩增该pPIC3.5K-衍生构建物的包含AOX1启动子、编码pApaRS的基因和AOX1转录终止子的片段,从而产生侧接AflII和AscI限制性位点的PAOX1-pApaRS-TAOX1片段。将该片段连接入AflII/AscI消化的上述pPR1-衍生物以产生pREAV-pApaRS(图2)。最终pREAV-pApaRS构建物包含大肠杆菌pUCori,将编码pApaRS的基因置于AOX1启动子和转录终止子的控制下,并将bla,例如编码β-内酰胺酶、ARG4和三拷贝tRNACUA的基因置于PGK1启动子的转录控制下(图2)。
然后通过AatII消化使得pREAV-pApaRS线形化,线形化的构建物用于转化以前分离的携带突变型HSA等位基因的两种电感受态GS200菌株。在缺乏精氨酸的RDB平板上选择精氨酸原养型转化体,在补加了0-2.5mg/mL的YPD板上筛选转化体的耐受性,如上所述。然后将这些菌株用于下述的后续实验以监测巴斯德毕赤酵母中HSA的表达水平和非天然氨基酸pApa是否掺入突变型HSA蛋白。
在甲醇诱导条件下培养转化株,例如20Mut+分离物和20muts分离物120-144小时。一种GS200HSA-37TAGpREAV-pApaRSmuts分离物和一种GS200HSA-37TAGpREAV-pApaRSMut+分离物因发现各自表达高水平的突变型HSA而选择作进一步分析,表明HSA等位基因编码的选择者密码子的O-tRNA琥珀型抑制。利用变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)对20ul离心培养物样品作凝胶电泳来监测HSA表达。样品作电泳的考马斯-染色聚丙烯酰胺凝胶上显示,仅在非天然氨基酸对-乙酰苯丙氨酸(pApa)存在时观察到HSA表达(图3)。muts分离物的蛋白质产率大约是10-12mg/ml,Mut+分离物的产率是10-15mg/ml。
用构建的菌株反复进行这些实验,从而对选择者密码子起反应而将非天然氨基酸对-叠氮基苯丙氨酸(aAzpa)掺入蛋白质。将衍生自大肠杆菌并已经优化在酿酒酵母表达系统中掺入非天然氨基酸pAzpa的前述对-叠氮基苯丙氨酸合成酶(pAzpaRS)(Chen,S等.(2007)“AnImprovedSystemfortheGenerationandAnalysisofMutantProteinsContainingUnnaturalAminoAcidsinSaccharomycescerevisiae.(在酿酒酵母中产生和分析含有非天然氨基酸的突变型蛋白质的改进系统)”JournalMolecBio371:112-22)克隆入已用EagI和NcoI消化的pREAV。如前所述,用AatII线形化该构建物,将其转化入GS200HSA-37TAGMut+菌株。如上所述分析得到的转化株,一种GS200HSA-37TAGpREAV-pAzpaRSMut+分离物因发现表达含非天然氨基酸pAzpa的高水平HSA而选用于进一步实验中。该分离物仅在补加pAzpa的培养基中表达突变型HSA蛋白。
为证实非天然氨基酸pApa掺入HSA,采用略作改进的英杰公司多拷贝毕赤酵母表达试剂盒所述方法制备制品以放大HSA表达。简言之,利用YPD液体培养基将一个GS200HSA-37TAGpREAV-pApaRSMut+菌落和一个GS200HSA-WTpREAV-pApaRS菌落各自独立培养至接近饱和。利用这两种培养物接种各1升的缓冲培养基甘油酵母提取物(BMGY),29-30℃振荡培养。16-20小时后,培养物各自的光密度(OD600)约为8.0,将它们以1500xg离心5分钟。将细胞沉淀物重悬在200mL的1:9缓冲复合甲醇培养基(BMMY):缓冲最低甲醇(BMM)中。每24小时将甲醇加入1:9BMMY:BMM至终浓度为0.5%以维持诱导。每24小时收集两种培养物的一份20ul试样,共144小时。离心该时程收集的样品以沉淀细胞,上清液作SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳以便分析蛋白质含量。巴斯德毕赤酵母表达系统中甲醇诱导3天后,通常可在考马斯-染色聚丙烯酰胺凝胶上见到对应于HSA分子量的条带。甲醇诱导5天后,在样品作电泳的考马斯染色SDS-PAGE上观察到菌株GS200HSA-37TAGpREAV-pApaRSMut+表达的HSA滴度达到10-12mg/L,相比之下野生型HSA是25-30mg/L。
采用标准纯化技术(参见,例如Sumi等,(1999)“Purificationofrecombinanthumanserumalbumin:efficientpurificationusingSTREAMLINE.(纯化重组人血清白蛋白:采用流水线的有效纯化)”Bioseparation8:195-200;Wantanabe等,(2001)“InvitroandinvivopropertiesofrecombinanthumanserumalbuminfromPichiapastorispurifiedbyamethodofshortprocessingtime.(短处理时间方法纯化巴斯德毕赤酵母的重组人血清白蛋白的体外和体内特性)”PharmRes18:1775-1781)纯化GS200HSA-37TAGpREAV-pApaRSMut+表达的含pApa的突变型HSA蛋白和野生型HSA蛋白。简言之,以3000xg离心GS200HSA-37TAGpREAV-pApaRSMut+和GS200HSA-wtpREAV-pApaRS培养物10分钟。回收各培养物的上清液,加入硫酸铵至80%以沉淀各自的蛋白质,然后以10,000xg离心20分钟。将得到的沉淀物重新溶解于缓冲液A(25mMTris-HCl,25mMNaCl,1mMEDTApH=8.5)+罗氏(Roche)CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物中,用缓冲液A+罗氏CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物透析过夜,利用MonoQ阴离子交换柱经FPLC纯化。采用线性梯度的0-80%缓冲液B(缓冲液A+1MNaCl)洗脱诸组分,用SDSPAGE分析是否存在HSA。发现在20%-30%缓冲液B之间洗脱的组分含有HSA,PBS(pH=7.6)透析并用尺寸排阻柱纯化。收集尺寸排阻柱纯化期间的诸组分,SDSPAGE分析是否存在HSA。发现在13ml和15.5mlPBS(pH=7.6)之间洗脱的那些组分含有HSA,浓缩并用C8反相HPLC柱。采用线性梯度的40-46%水配制乙腈,0.1%三氟乙酸洗脱诸组分,收集并用SDSPAGE分析是否存在HSA。发现用42-45%水配制乙腈,0.1%三氟乙酸从C8柱上洗脱的那些组分含有HSA。
为证实GS200HSA-37TAGpREAV-pApaRSMut+表达的HSA中掺入了pApa,通过胰蛋白酶消化和随后的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析该蛋白质。LC-MS/MS分析结果示于图4。图4描述了过氧乙酸氧化肽ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK的三重荷电先驱离子(m/z=847.765)的部分注释串联质谱。E*表示pApa取代成熟HSA中的E37。观察到的碎片离子系列无疑支持了该取代。
进行了其它实验以证实pApa掺入GS200HSA-37TAGpREAV-pApaRSMut+表达的HSA中。在有1.1kDa包含氨氧基(aminoxy)的肽存在下,野生型HAS和在氨基酸37位包含pApa的HSA各自在150mMNaCl,50mMNaOAc(pH=4.7)中温育。然后如上所述用C8反相HPLC柱纯化样品以除去任何未反应的1.1kDa肽,通过基体辅助激光解吸电离质谱(MALDI)分析。已知pH=4.7时,氨氧基与酮发生正交连接(orthogonalligation)形成肟连接(Dirksen等,(2006)“Nucleophiliccatalysisofoximeligation.(肟连接的亲核催化)”AngewChemIntEdEngl45:7581-4)。因此,估计只有包含氨基酸37位的pApa,例如包含氨基酸37位的溶剂可接近酮基的突变型HSA蛋白质与前述1.1kDa肽形成肟连接。MALDI分析的结果表明只有包含pApa的HSA显示质量增加约1kDa(图5)。相比之下,野生型HSA的质量维持不变,从而进一步证实非天然氨基酸pApa位点特异性掺入突变型HSA蛋白。
实施例2
扩增甲基营养酵母菌,巴斯德毕赤酵母的遗传库
为扩大含非天然氨基酸的蛋白质诱变的效用,开发了甲基营养酵母菌,巴斯德毕赤酵母的重组表达系统。将8种非天然氨基酸的特异性氨酰基-tRNA合成酶/抑制型tRNA(aaRS/tRNACUA)配对插入真核转录控制元件之间,并稳定掺入巴斯德毕赤酵母基因组。甲基营养酵母菌的突变型蛋白质的产量高于150mg/l,其量级优于酿酒酵母所报道的一个数量级。此外,我们证明含有酮基氨基酸(对乙酰苯丙氨酸,图11,结构1)的人血清白蛋白突变体可在该系统中有效表达并高产率地选择性偶联于血小板反应蛋白肽模拟物。该方法应能高产率地产生不可能在现有系统中表达的含非天然氨基酸的复杂蛋白质。
最近,我们开发了可能在原核和真核生物中遗传学编码各种具有新型特性的非天然氨基酸(包括荧光团、金属离子螯合剂、光囚(photocaged)和光交联基团、NMR、结晶和IR探针及翻译后修饰的氨基酸)的方法1-3。这通过开发正交氨酰-tRNA合成酶/抑制型tRNA(aaRS/tRNACUA)配对得以实现,该配对设计成对无义或移码密码子起反应而选择性插入所需的非天然氨基酸。迄今为止,该方法已用于将超过40种非天然氨基酸加入大肠杆菌、酿酒酵母和几种谱系的哺乳动物细胞的遗传库1、2、4。通过将正交aaRS/tRNACUA配对与不同tRNA身份元件移植入宿主生物来实现这些系统的正交性,从而宿主氨酰化机构和移植的aaRS/tRNA配对之间不发生交叉氨酰化(虽然在翻译中仍有作用)。在目前的系统中,已证明在大肠杆菌中利用衍生自詹氏甲烷球菌酪氨酰-RS/tRNACUA配对的aaRS/tRNACUA配对5,在酿酒酵母2、6或哺乳动物细胞中4利用大肠杆菌酪氨酰-或亮氨酰RS/tRNACUA配对最有效。然后采用直接进化改变正交aaRS的特异性,从而其识别感兴趣的非天然氨基酸,而不识别常见的20种氨基酸之一。
为将该方法拓展至产生细菌宿主中不易表达的大量蛋白质,需要低成本、可放大性且能产生复杂、翻译后修饰蛋白质的重组系统。一种这样的宿主是能产生哺乳动物蛋白的巴斯德毕赤酵母,其产量与大肠杆菌的那些相当7。治疗性蛋白质,例如肿瘤坏死因子(TNF)、破伤风毒素片段C(TTC)和人血清白蛋白(HSA)在高密度发酵中提供>10g/l的表达水平8-11。巴斯德毕赤酵母能以这些产量产生蛋白质是因为其醇氧化酶1启动子(PAOX1),这种启动子是已知的高度调节和最强启动子之一12。此外,巴斯德毕赤酵母缺乏可污染大肠杆菌中表达的治疗性蛋白的内毒素,并且不像酿酒酵母那样产生抗原性α1,3聚糖连接键13。另外,目前可能调节巴斯德毕赤酵母中的糖基化模式,包括控制硅烷化,抗炎性抗体中重要的糖连接键14。出于这些原因,我们开发了方法以便在巴斯德毕赤酵母中遗传编码非天然氨基酸。在本文中,我们报道了以高产率和保真度地将8种非天然氨基酸位点特异性地引入该宿主表达的重组人血清白蛋白(rHSA)。
结果
设计双基因盒表达系统.由于巴斯德毕赤酵母中自主复制质粒较不稳定15,设计了将感兴趣靶基因和aaRS/tRNACUA配对编码在两个不同质粒的表达盒中的系统,并将其稳定整合入基因组。利用双重营养缺陷型,GS200(arg4,his4)作为蛋白质表达的宿主菌株,将感兴趣基因插入商品化购得的pPIC3.5k质粒(HIS4,GenR)(图6a)16。rHSA因其用于产生能延长短效治疗性多肽的血清半衰期的融合蛋白或肽生物偶联物而用作模型蛋白17-19。rHSA因其复杂的二硫键交联而无法在大肠杆菌和酿酒酵母中表达。通过PCR诱变产生Glu37TAG突变型rHSA(rHSAE37X),在AOX1启动子和终止子控制下表达以产生pPIC3.5k-rHSAE37X。Glu37位于溶剂可接近的螺旋中,从而有助于肽与引入该位点的化学反应活性非天然氨基酸(即,对-氨酰苯丙氨酸,图11,结构1)偶联,并确保大体积基团的掺入尽可能少地破坏天然蛋白质结构和折叠。HSA的24氨基酸哺乳动物“前蛋白”前导序列(图6e)与在巴斯德毕赤酵母中表达完全相容,并能将成熟蛋白输入培养基中20。以相似方式利用作为蛋白质表达阳性对照的野生型rHSA(rHSA野生型)产生pPIC3.5k-HSA野生型。在5’AOX1启动子中线形化该质粒能将一个或多个拷贝的表达盒整合入基因组;通常拷贝越多靶蛋白的总产量越高21。以此方式整合使得AOX1基因维持完整,从而酵母菌保留了快速利用甲醇的能力(Mut+表型)。或者,可在AOX1表达盒的任一侧作线形化来进行基因替代,从而用pPIC3.5k载体替代AOX1基因16。缺乏AOX1的酵母菌依赖于较弱的AOX2基因以便利用甲醇,其表型是muts。由于muts酵母菌通常进行rHSA表达22,pPIC3.5k-HSAE37X经线形化并用于替代AOX1基因以产生GS200-rHSAE37X(HIS4、arg4、GenR、muts)。成功转化株在缺乏组氨酸的极限培养基平板和含有最多0.25mg/ml氨基糖苷抗生素,遗传霉素的丰富培养基平板上正常生长。
为将正交aaRS/tRNACUA配对整合入基因组,修饰了以前为在酿酒酵母中进行重组过表达而开发的载体23(图6b)。将以前在酿酒酵母中开发的对-乙酰苯丙氨酸(pApa,图11,结构1)特异性氨酰-tRNA合成酶(基因)(pApaRS)24插入醇脱氢酶1启动子(PADH1)和终止子(TADH1)之间,其中His6-标签用于测定其表达。将缺乏5’CCA的同源大肠杆菌作为三串联重复插入磷酸甘油酸酯激酶1启动子之后(PPGK1)。为促进转录后加工,给tRNA侧接酵母菌抑制型tRNA基因,SUP4的区域,如前所述23。真核下游加工加入tRNA功能所需的5’CCA。用精氨琥珀酸裂解酶(ARG4)编码区替代的2μ起点和乳清苷5-磷酸脱羧酶(URA3)标记,从而得到重组真核ARG4载体(pREAV-PADH1-pApaRS)(图6c)。该表达盒的扩增只可能在掺入基因组的情况下发生,因为其缺乏真核复制起点。在ARG4编码区线形化pREAV-PADH1-pApaRS以及随后将转化入GS200-HSAE37X得到完全原养型巴斯德毕赤酵母GS200-HSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS(HIS4,ARG4,GenR,muts)。作为阳性对照,将pREAV-PADH1-pApaRS载体类似地克隆入GS200-HSA野生型得到完全原养型、muts、表达rHSA野生型的巴斯德毕赤酵母菌株。
巴斯德毕赤酵母中的琥珀型抑制.在甲醇诱导条件下培养2-3天后,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶的考马斯染色观察到从GS200-HSA野生型/pREAV-PADH1-pApaRS分离的克隆产生全长rHSA野生型。相比之下,以甲醇作为主要碳源并添加pApa氨基酸来培养GS200-HSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS的克隆6天未能产生全长rHSAE37pApa。基因组PCR证实所有构建物整合入基因组(图12),Northern印迹分析发现tRNACUA的转录约比酿酒酵母中的相同表达盒高1.5倍(图7a)。然而,蛋白质印迹未检测到含His6x-标签的pApaRS(图13)。这些结果表明琥珀型抑制的缺乏与pApaRS的掺入差相关。因此,进一步修饰pREAV以用强PAOX1启动子驱动pApaRS表达,并将增强型Kozak共有序列(ACCATGG)25加入pApaRS基因的5’端。还用AOX1终止子(TAOX1)替代ADH1终止子(TADH1)以得到pREAV-PAOX1-pApaRS(图6d)。转化入GS200-rHSAE37X获得具有所述相同表型的GS200-rHSAE37X/pREAV-PAOX1-pApaRS。该转化的克隆只在有甲醇和pApa氨基酸存在下产生全长rHSAE37pApa,其水平约为含有rHSA野生型的相同克隆的10-20%。甲醇诱导后2-3天,SDS-PAGE凝胶观察到蛋白质,每24小时添加甲醇至0.5%,表达6天后达到峰值(图7b)。缺乏pREAV表达盒、pPIC3.5k表达盒、甲醇添加或pApa氨基酸的酵母菌不产生可由考马斯染色检测的蛋白质。没有pApa氨基酸存在下蛋白质不表达表明配对与内源性氨酰化元件之间没有交叉氨酰化发生。胰蛋白酶消化物,LC-MS/MS证实pApa位点特异性地掺入rHSAE37X(图7c)。观察到的片段离子显示非天然氨基酸只掺入残基37处。
优化表达.为优化rHSAE37pApa表达,通过将pPIC3.5k-rHSAE37X插入AOX1基因座的5’区(这样保留了AOX1基因的完整性)来产生GS200-rHSAE37X/pREAV-PAOX1-pApaRS(HIS4,ARG4,GenR)快速甲醇利用(Mut+)突变株。以此方式插入基因组可导致多聚化,从而产生GenR和感兴趣基因的串联拷贝7。得到的克隆显示耐受最高1.0mg/ml的遗传霉素,而上述muts克隆在0.25mg/ml遗传霉素以上死亡,这与多拷贝表达盒的掺入一致7、16。在有甲醇和pApa氨基酸存在下分析分离克隆的全长rHSAE37pApa表达显示产生的蛋白质比相应的muts多约1.5-2.0倍(图14)。为进一步增加rHSAE37pApa的产量,比较6种不同启动子(包括PAOX1)在pREAV载体中驱动pApaRS转录的能力。测定转录物mRNA水平、pApaRS蛋白质水平和rHSAE37pApa总产率。衍生自酵母菌GTP结合蛋白I(YPT1)26、27和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)12、28的两种组成型启动子和醇氧化酶II(AOX2)29、甲醛脱氢酶I(FLD1)12和异柠檬酸裂解酶I(ICL1)12的三种甲醇诱导型启动子因它们与甲醇诱导的相容性而选择。利用截短的PAOX2,其通过删除两个阻遏结合序列之一而增强该启动子29。在合成酶的过度产生对于酵母菌有毒性,或者螯合细胞能量使之不能产生rHSAE37X的情况中可利用较弱的PYPT1和PGAP启动子26。通过PCR扩增所有巴斯德毕赤酵母基因组DNA的启动子连同它们的5’非翻译区(图15)。序列证实后,将各启动子克隆入pApaRS的pREAV载体5’(端)以替代PAOX1,并将其转化入以前产生的Mut+GS200-HSAE37X(图8a)。终止子保留TAOX1。甲醇诱导6天后,通过Northern和蛋白质印迹监测P-启动子-pApaRS表达水平并与PAOX1-pApaRS比较(图8b-d)。由于巴斯德毕赤酵母的固有表达差异,选择两个克隆以供蛋白质印迹分析,通过Northern印迹分析最高生产克隆。在mRNA水平,PFLD1驱动pApaRS转录比PAOX1好4倍,产生的pApaRS蛋白多5倍。PGAP、PYPT1、PICL1和PAOX2均显示pApaRS表达低于PFLD1。与该结果一致的是,总琥珀型抑制最高,其中通过rHSAE37pApa表达检测到PFLD1-pApa进入培养基(图9)。最高产量是>150mg/l或rHSA野生型的约43%(352mg/l)(图16、17)。
肟连接于rHSAE37pApa.为证明这种修饰的rHSA是否能用作生物化学肽的运载体,在rHSAE37pApa的唯一酮侧链和抗血管生成性肽ABT-510之间进行肟连接(图10)。该血小板反应蛋白-1(TSP-1)裂解素1型重复模拟物在人中显示强效的抗肿瘤活性,但通过静脉内给予时会被肾脏快速清除30-32。合成以独特ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸UAA替代第6L-正缬氨酸残基的9氨基酸肽模拟物。根据已知的TSP-1的结构-活性关系,在该位置进行修饰估计不会显著改变生物学活性33。pH<5时,氨基氧基与pApa的酮基经历选择性肟连接从而将ABT-510肽共价连接于rHSAE37pApa的残基37(图10a,上图)。以前的偶联方案利用苯胺催化剂进行有效连接34、35;然而,不利用苯胺而利用75μMrHSAE37pApa和三-倍过量肽的过夜反应中,肟偶联于rHSAE37pApa的产率约为77%。通过基体辅助激光解吸电离(MALDI)质谱证实该肽衍生rHSAE37pApa的程度(图10b)。在相同条件下用氨基-氧基修饰的ABT-510肽处理rHSA野生型(残基37处的谷氨酸)时,MALDI质谱未观察到偶联。
将8种UAA加入遗传库.为说明该新产生的重组表达系统的通用性,将酿酒酵母方法开发的非天然aaRS插入pREAV-PFLD1。将对-苯甲酰苯丙氨酸(pBpa,光交联剂,图11,结构3)2、对-叠氮基苯丙氨酸(pAzapa,光交联剂,化学反应活性,图11,结构4)36、对-(炔丙基氧基)苯丙氨酸(pPpa,化学反应活性,图11,结构5)36、对-甲氧基苯丙氨酸(pMpa,结构/功能探针,图11,结构6)2和对-碘代苯丙氨酸(pIpa,重原子,图11,结构7)2的特异性aaRS均插入优化的pREAV-PFLD1载体中PFLD1之后(图11a、b)。为比较,野生型大肠杆菌酪氨酰-RS(野生型,图11,结构2)也插入新的表达载体。转化入GS200-HSAE37X(HIS4,arg4,GenR,Mut+)后,比较选择的克隆与含有pREAV-PFLD1-pApaRS的菌株抑制rHSAE37X中37位的琥珀型突变的能力。pApa和pAzapa突变体的抑制率相似(rHSA野生型产率的40-45%);除pIpa外,所有其它突变体表达>25%的rHSA野生型产率。没有相关氨基酸存在下未观察到蛋白质表达,证明该新系统的高度正交性(图11c)。
最近,制备了第二正交大肠杆菌亮氨酰-衍生RS/tRNACUA配对(称为LeuRS的aaRS)以便在酿酒酵母中将其它非天然氨基酸掺入蛋白质37、38。为在新巴斯德毕赤酵母表达系统中容纳衍生自该正交配对的非天然LeuRS,修饰pREAV-PFLD1质粒的tRNA区域。如前所述,切除PPGK1下游已有的表达盒,替换以对应于缺乏5’CCA并由SUP4区段隔开的三串联重复的编码区,从而产生pREAVleu-PFLD1。将4,5-二甲氧基-2-硝基苄基丝氨酸(DMNB-S,光囚丝氨酸,图11,结构8)37和2-氨基-3-(5-(二甲基氨基)萘-1磺酰胺)丙酸(丹酰基丙氨酸,丹酰基荧光团,图11,结构9)38的特异性LeuRS突变体插入PFLD1后产生pREAVleu-PFLD1-LeuRS(图11d-f)。转化入Mut+GS200-rHSAE37X后,利用选择的克隆表达相应的突变型rHSAE37X(图11f)。最近,DMNB-S的特异性LeuRS突变体显示能接受因可较为简便地合成而用于这些表达实验中的DMNB-S的半胱氨酸类似物(DMNB-C)。虽然没有相关氨基酸存在下有少量全长蛋白质产生,但胰蛋白酶消化物的LC-MS/MS证实该系统在有相应非天然氨基酸存在下的高保真度(图18)。表达3天后,rHSAE37DMNB-C的抑制率是rHSA野生型产率的约37%,rHSAE37丹酰基的抑制率是rHSA野生型产率的23%。
讨论
在酿酒酵母中优化含有非天然氨基酸蛋白质表达的早先尝试在模型系统中获得的最高产量是8-15mg/l,比本发明开发的巴斯德毕赤酵母中显示的产量低多于一个的数量级。Wang实验室的工作最近证明酵母菌中无义介导mRNA降解(NMD)途径的敲减可将蛋白质表达最高增加2-倍39。联用衍生自SNR52的启动子来驱动tRNACUA转录,它们能达到的突变型蛋白质产量比以前在酿酒酵母中产生的(约为15mg/l)高300-倍39。因此,敲除NMD途径的UPF1基因和利用SNR52-tRNACUA启动子系统还可增加巴斯德毕赤酵母中的产量。此外,Kobayashi实验室的工作证明,当以分批补料发酵而非标准摇瓶表达时,巴斯德毕赤酵母的rHSA野生型产量要高多于一个数量级(>10gl-1)10。
总之,我们将生物合成掺入非天然氨基酸的方法拓展至甲基营养酵母菌。两种aaRS/tRNACUA配对显示在巴斯德毕赤酵母中是正交的,它们用于对rHSAE37X的残基37处的琥珀密码子起反应而表达含8个不同非天然氨基酸的突变型蛋白。这种通用性水平提示该表达系统适用于许多其它非天然氨基酸及目前在酿酒酵母中开发的合成酶,不限于本文讨论的非天然氨基酸或aaRS/tRNACUA配对。该新系统的高产量和保真度使其能获得有用量的具有独特生物学和药学特性的治疗性蛋白质。例如,可采用化学方法,如肟连接或铜催化1,3-环化加成反应(点击化学(clickchemistry))位点特异性地PEG化或交联蛋白质,可掺入金属离子结合氨基酸以结合放射性同位素,可分别制备肽或毒素与运载体蛋白,例如HSA或靶向蛋白,例如抗体的偶联物。此外,在体外抗血管生成试验中检验了前述rHSAE37pApa-ABT-510偶联物。拓展rHSAE37pApa用作内源性、非-免疫原性运载体的尝试目前应用于其它快速清除的肽,包括糖原样肽1模拟物(GLP-1)和甲状旁腺激素(PTH)肽。
方法
构建pPIC3.5k-rHSA.rHSA基因得自哺乳动物基因保藏所(MammalianGeneCollection)(NIH),基因登录号BC034023。为与pPIC3.5k线形化相容16,利用以下引物(IDT)通过改进的快变诱变(斯特拉塔基因公司)方法40除去rHSA的BglII位点以产生rHSA野生型:BglII(781)用–BglII1F,5’-GACAGACCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATG-3’和–BglII1R,5’-GGTAAGGTCTGTCACTAACTTGGAAACTTCTGCAAACTCAGCTTTGGG-3’;BglII(817)用–BglII2F,5’-CATGGAGACCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGG-3’和–BglII2R,5’-CAAGCAGGTCTCCATGGCAGCATTCCGTGTGGAC-3’。采用改进的快变方法和以下引物将第37位Glu残基替换成琥珀密码子TAG以产生rHSAE37X:Glu37F’,5’-GATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTTAGGATCAT-3’和Glu37R’,5’-GTTTTTGCAAATTCAGTTACTTCATTCACTAATTTTACATGATCCTAAAATGG-3’。利用以下引物扩增rHSA野生型和rHSAE37XrHSA野生型:HAS正向,5’-ATCCGAGGATCCAAACGATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTC-3’和HAS反向,5’-GCTAACGAATTCATTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGC-3’,用EcoRI和BamHI(NEB)消化并连接入类似消化的pPIC3.5k载体(英杰公司,载体图谱见http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/ppic3.5kpao_man.pdf)以产生pPIC3.5k-rHSA野生型或pPIC3.5k-rHSAE37X。通过DNA测序证实构建物并在大肠杆菌DH10B(英杰公司)中扩增。
构建pREAV.利用以下引物,通过PCR扩增含pApaRS的载体23以加入限制性位点KpnI和HindIII,不包括TRP和2μ起始区:pESCF,5’-TACCACTAGAAGCTTGGAGAAAATACCGCATCAGGAAATTGTAAACGT-3’和pESCR,5’-GTGAGGGCAGGTACCGTTCTGTAAAAATGCAGCTCAGATTCTTTGTTTG-3’,用HindIII和KpnI(NEB)消化。用以下引物扩增pBLARG(加利福尼亚州克莱尔蒙特凯克研究生院的詹姆斯克雷格实验室(JamesCregglaboratory,KeckGraduateInstitute,Claremont,CA)馈赠)的ARG4编码区:ARG4F新,5’-AAATATGGTACCTGCCCTCACGGTGGTTACGGT-3’和ARG4R新,5’-CATTTCAAGCTTCTAGTGGTAGGAATTCTGTACCGGTTTAC-3’,用KpnI和HindIII消化,连接入类似消化的PCR产物以产生重组真核ARG4载体,pREAV-PADH1-pApaRS。为产生pREAV-PAOX1-pApaRS,从pPIC3.5k获得AOX1启动子和终止子序列。用以下引物扩增pApaRS:酮基-Koz-F,5’-TTCTGAGAATTCACCATGGCAAGCAGTAACTTGATTAAACAATTGC-3’和酮基RSR6xHis,5’-TAGGCTCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTCCAGCAAATCAGACAGTAATTCTTTTTAC-3’,用EcoRI和NotI(NEB)消化,连接入类似消化的pPIC3.5k以产生pPIC3.5k-pApaRS。利用以下引物,通过PCR扩增pREAV-PADH1-pApaRS以加入限制性位点AscI和AflII,不包括PADH1-pApaRS-TADH1区:pESC-AOX-酮基F,5’-ATCGTACTTAAGGAAAGCGTACTCAAACAGACAACCATTTCC-3’和pESC-AOX-酮基R,5’-TTCTCAGGCGCGCCATCGCCCTTCCCAACAGTTGCG-3’。利用以下引物扩增pPIC3.5k-pApaRS的PAOX1-pApaRS-TAOX1编码区:pPIC-酮基AOX5F,5’-ATCGTACTTAAGAGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAATGAAAC-3’和pPIC-酮基AOXTTR,5’-TGCACAGGCGCGCCAAGCTTGCACAAACGAACTTCTCACTTAATCTTC-3’,用AscI和AflII(NEB)消化,连接入类似消化的pREAV-PADH1-pApaRSPCR产物以产生pREAV-PAOX1-pApaRS。通过分子大小作图和测序证实构建物。
将表达盒转化入巴斯德毕赤酵母.双重营养缺陷型菌株GS200(his4,arg4)由凯克研究生院的詹姆斯克雷格实验室馈赠,其用作宿主巴斯德毕赤酵母菌株。酵母菌感受态、转化的方法和培养基配方见多拷贝毕赤酵母表达试剂盒–版本F16(英杰公司,手册见http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/pichmulti_man.pdf)。简言之,为产生GS200-rHSAE37X(HIS4,arg4,GenR,muts),用BglII(NEB)线形化20μgpPIC3.5k-rHSAE37X,通过乙醇沉淀浓缩至10μl,加入2mm电穿孔小杯(费希尔公司(Fisher))中的80μl新鲜感受态GS200,采用巴斯德毕赤酵母设置(2000V,25μF,200Ω),用拜尔莱得公司(BioRad)的GenePulserXcell进行电穿孔。在1ml冷的1M山梨醇中回收细胞。将250μl回收的细胞涂布在补加了4mg/mlL-精氨酸(arg)的再生葡萄糖琼脂(RDB)平板(15cm)上,30℃温育。3天后,将菌落挑入含1ml酵母蛋白胨葡萄糖(YPD)培养基的96孔2ml平板(Nunc),培养过夜(29.2℃,300r.p.m.)。培养液作1:100稀释,将1-2μl试样涂布在含0.25ml-1遗传霉素(英杰公司)的YPD琼脂平板上,30℃温育。4天后,菌落G3显示生长良好,挑取,制成感受态。采用上述方案及感受态G3进行转化以产生GS200-rHSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS和GS200-rHSAE37X/pREAV-PAOX1-pApaRS(HIS4,ARG4,GenR,muts),除了回收的细胞涂布在缺乏L-组氨酸(his)和arg的RDB平板上。3天后,将菌落挑入96孔2ml平板,再次如上所述筛选对0.25mg/ml遗传霉素的耐受性。采用相同方式产生GS200-rHSA野生型/pREAV-PADH1-pApaRS(HIS4,ARG4,GenR,muts)以便分离菌落F2。通过将pREAV-PAOX1-pApaRS转化入GS200来产生GS200-pREAV-PAOX1-pApaRS(his4,ARG4,GenR,muts),但涂布在补加了4mg/ml组氨酸的RDB平板上并且不再筛选遗传霉素耐受性。
检验蛋白质表达.所有蛋白质表达实验遵循多拷贝毕赤酵母表达试剂盒中用于muts的方案16。简言之,从含有0.25mg/ml遗传霉素的平板挑取GS200-rHSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS、GS200-rHSAE37X/pREAV-PAOX1-pApaRS或GS200-rHSA野生型/pREAV-PADH1-pApaRS的14个菌落,在10ml缓冲甘油-复合培养基(BMGY)培养(29.2℃,300r.p.m.)至接近饱和(OD600≈12-18)。以1500g(10分钟)离心培养液,重悬在含2mMpApa氨基酸(合成化学公司(SynChem))的2ml缓冲甲醇-复合培养基(BMMY)中。继续生长6天,每24小时补加甲醇至0.5%。每24小时加入200μl(10%培养液体积)培养基或无菌水以补偿蒸发量。每24小时取出50μl培养液,3000g(5分钟)离心以除去细胞。将25μl除去细胞的培养液加入12.5μlSDS加载缓冲液,95℃加热1分钟,在4-20%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶(英杰公司)上作电泳(150V1小时)。3天后,通过考马斯染色(40%甲醇,10%乙酸,50%水,0.1%(w/v)考马斯亮蓝R250(西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)))明显观察到GS200-rHSAE37X/pREAV-PAOX1-pApaRS和GS200-rHSA野生型/pREAV-PADH1-pApaRS表达中66.5kDa的条带,6天后达到峰值。GS200-rHSAE37X/pREAV-PAOX1-pApaRS的克隆G3-2和GS200-rHSA野生型/pREAV-PADH1-pApaRS的F2-野生型显示表达最高,将它们用于进一步的比较。通过考马斯染色GS200-rHSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS的克隆无一显示有表达。为证实琥珀型抑制是pApa特异性的,如上所述在有或没有2mMpApa和0.5%甲醇存在下表达GS200、G3、GS200-pREAV-PAOX1-pApaRS、G3-2和F2-野生型的克隆(图7b)。
tRNANorthern印迹.两个巴斯德毕赤酵母克隆,G3-2和GS200以及两个酿酒酵母克隆,SCY4-pPR1-PPGK1+2SUP4-tRNA和SCY4分别在它们各自的表达条件下培养,通过PurelinkmiRNA分离试剂盒(英杰公司)的方案和试剂收集微小RNA(miRNA)。将各样品的2μgRNA加载到两个6%NovexTBE-脲凝胶上(英杰公司),180V电泳1小时。利用XCellSurelockMini-Cell(英杰公司)、0.5xTBE缓冲液(英杰公司)和随附方法将RNA转移至帕尔生命科学公司(PallLifeScience)的BiodyneB尼龙膜。膜与UVStratalinker2400(斯特拉塔基因公司)自动交联。采用皮尔斯公司的北2南化学发光杂交和检测试剂盒(North2SouthChemiluminescentHybridizationandDetectionKit,Pierce)的方案和试剂进行杂交和检测。简言之,一条印迹与tRNAser的以下特异性生物素化探针温育:tRNAser酿酒酵母1,5’-/5Biosg/CATTTCAAGACTGTCGCCTTAACCACTCGGCCAT-3’,tRNAser酿酒酵母2,5’-/5Biosg/GAACCAGCGCGGGCAGAGCCCAACACATTTCAAG-3’,tRNAser毕赤酵母1,5’-/5Biosg/CTGCATCCTTCGCCTTAACCACTCGGCCATCGTA-3’,tRNAser毕赤酵母2,5’-/5Biosg/ACACGAGCAGGGTTCGAACCTGCGCGGGCAGAGC-3’,而第二印迹与的特异性生物素化探针温育:tRNA5’生物素,5’-/5Biosg/GGAAGGATTCGAACCTTCGAAGTCGATGACGG-3’和tRNA3’生物素,5’-/5Biosg/TCTGCTCCCTTTGGCCGCTCGGGAACCCCACC-3’。55℃温育探针过夜,结合于链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)偶联物,用鲁米诺/增强剂–稳定的过氧化物溶液(皮尔斯公司)检测(图7a)。利用PhotoshopCS2(Adobe),通过条带密度测定tRNA相对量。
rHSAE37X的放大表达、纯化和质谱.对于rHSAE37pApa的放大表达,改进检验表达方案。将1LBMGY接种于YPD配制的20ml饱和的G3-2培养液,培养至(约24小时,29.2℃,300r.p.m.)至OD600≈12-18。以1500g离心培养液,重悬在补加了10%BMMY和2mMpApa的200ml缓冲最低甲醇(BMM)。培养6天后(29.2℃,300r.p.m.甲醇和体积补加),以3000g离心培养液,弃去细胞,将培养液流过0.22μm滤器(米利波尔公司(Milipore))。4℃加入NH4SO4并缓慢搅拌至50%饱和(58.2g)来硫酸铵(NH4SO)沉淀培养液,20,000g离心20分钟,再加入NH4SO4至75%饱和(31.8g),20,000g离心20分钟。第二次沉淀中含有rHSAE37pApa,将其重悬在FPLC缓冲液A(25mMTris-HCl,25mM氯化钠,1mMEDTA,1x蛋白酶抑制剂混合物(罗氏公司(Roche)),pH=8.5)中。利用AKTA纯化仪FPLC(AB公司(AmershamBiosciences)),MonoQ5/5柱(GE保健公司(GEHealthcare))纯化(20-35%缓冲液B(缓冲液A+1MNaCl)洗脱)重新溶解的蛋白质。通过SDS-PAGE凝胶电泳分析诸组分,合并,用30MWCO透析盒(皮尔斯公司)以PBS透析,利用AKTA纯化仪FPLC,Superdex20010/300GL(GE保健公司)纯化(14分钟后洗脱,PBS,0.5毫升/分钟)。SDS-PAGE凝胶电泳分析诸组分,合并,用DynamaxHPLC(蓝尼公司(Rainin)),C8VydacHPLC柱(300mm,5μm,格雷丝公司(Grace))纯化(水配制的40-46%MeCN,0.1%TFA洗脱)。SDS-PAGE凝胶分析诸组分,含rHSAE37pApa的组分经快速冷冻并冻干成白色粉末。以相似方式纯化F2-野生型的rHSA野生型。
胰蛋白酶消化、纳米-RPLC-MS/MS.还原条件下(10mMTCEP,1M胍HCl,100mM三乙醇胺HCl,pH=7.8),用胰蛋白酶消化纯化的rHSAE37X过夜。通过反相固相提取(Sep-Pak,C18,Waters)纯化消化物并冻干。冻干的肽与过氧甲酸(9份浓甲酸+1份30%H2O2)41在冰上温育1小时将半胱氨酸氧化成磺基丙氨酸,将甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸砜。加入过量的巯基乙醇并用水作20倍稀释来猝灭反应。用装配了热电公司的LTQOrbitrap杂交质谱仪(LTQOrbitraphybridmassspectrometer,ThermoElectron)的安捷仑技术公司(AgilentTechnologies)的HPLC系统进行纳米-RPLC-MS/MS。将胰蛋白酶消化物以约2微升/分钟的流速加载到通气柱设置的预柱上(4cm,100μmi.d.,5μm,MonitorC18,柱工程公司(ColumnEngineering))42。10分钟的加载/洗涤期间后,将预柱在线切换为分析柱(10cm,75μmi.d.,5μmC18)开始梯度洗脱。层析曲线是100%溶剂A(0.1%水性乙酸)到50%溶剂B(乙腈配制的0.1%乙酸),40分钟,约100纳升/分钟。按照前10方案(top10scheme)进行数据依赖性MS/MS采集,其中质谱仪编程为首先记录高分辨率Orbitrap扫描(m/z500–2,000),然后是10次数据-依赖性MS/MS扫描(相对碰撞能量=35%;3Da分离窗)。利用MASCOT(矩阵科学公司(Matrixscience),伦敦,英国)检索SwissProt51.6数据库的原始数据进行蛋白质鉴定,其中pApa作为变量修饰(variablemodification)。
产生Mut+表型.为产生GS200-rHSAE37X/pREAV-PAOX1-pApaRS(HIS4,ARG4,GenR,Mut+),用SacI或SalI(NEB)线形化20μgpPIC3.5k-rHSAE37X,将其转化入新鲜感受态GS200,如前所述。在1ml的冷1M山梨醇中回收细胞,涂布到补加了0.4mg/mlarg的RDB平板上。将菌落挑入含1mlYPD的2ml96孔平板,生长至饱和(29.2℃,300r.p.m.),1:100稀释,将样品涂布到含0-3.0mg/ml遗传霉素的平板上。将在最高1.0mg/ml遗传霉素下能存活的克隆1D12制成感受态,用前述pREAV-PAOX1-pApaRS转化,涂布到缺乏Arg或His的RDB平板上。将菌落挑入1ml96孔平板,生长至饱和,1:100稀释,在遗传霉素1.0mg/ml平板上再筛选。挑取14个存活克隆,在有pApa氨基酸和甲醇存在下检验rHSAE37pApa表达。为连续性,采用上述muts方案。克隆K5显示蛋白质表达最高,将其与G3-2在测试表达中比较(图14)。利用PhotoshopCS2(Adobe),通过条带密度测定蛋白质相对量。
构建pREAV-P启动子-pApaRS.分别利用以下引物,通过PCR分别从基因组DNA(巴斯德毕赤酵母GS200)扩增5种启动子PAOX2、PYPT1、PICL1、PFLD1和PGAP:PAOX2F,5’-GTATCGCTTAAGTCCAAGATAGGCTATTTTTGTCGCATAAATTTTTGTC-3’和PAOX2R,5’-CGTTAGCCATGGTTTTCTCAGTTGATTTGTTTGTGGGGATTTAGTAAGTCG-3’;PYPT1F,5’-GTATCGCTTAAGCATATGATGAGTCACAATCTGCTTCCACAGACGAG-3’和PYPT1R,5’-CGTTAGCCATGGGACTGCTATTATCTCTGTGTGTATGTGTGTATTGGGC-3’;PICL1F,5’-GTATCGCTTAAGGAATTCGGACAAATGTGCTGTTCCGGTAGCTTG-3’和PICL1R,5’-CGTTAGCCATGGTCTTGATATACTTGATACTGTGTTCTTTGAATTGAAAG-3’;PFLD1F,5’-GTATCGCTTAAGGCATGCAGGAATCTCTGGCACGGTGCTAATGG-3’和PFLD1R,5’-CGTTAGCCATGGTGTGAATATCAAGAATTGTATGAACAAGCAAAGTTGG-3’;PGAP1F,5’-GTATCGCTTAAGGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTCGTC-3’和PGAP1F,5’-CGTTAGCCATGGTGTGTTTTGATAGTTGTTCAATTGATTGAAATAGGGAC-3’(图15)。用AflII和NcoI(NEB)消化PCR扩增的片段,连接入类似消化的pREAV-PAOX1-pApaRS(通过琼脂糖凝胶纯化除去PAOX2编码区后)以产生pREAV-P启动子-pApaRS。序列证实后,用AatII线形化质粒(包括以前构建的pREAV-PAOX1-pApaRS),转化入新鲜感受态的GS200-rHSAE37X(克隆1D12),涂布到前述缺乏Arg或His的RDB平板上以产生GS200-rHSAE37X/pREAV-P启动子-pApaRS(HIS4,ARG4,GenR,Mut+)。筛选存活克隆对0.75和1.0mg/ml遗传霉素的耐受性。将对应于各启动子的48个克隆挑入含BMGY的1mL96孔平板,培养至饱和(29.2℃,24小时,300r.p.m.)。以1500g离心饱和培养液10分钟,将细胞重悬在200μLBMMY+2mMpApa氨基酸中。6天后(29.2℃,300r.p.m.,补加),3000g离心10分钟以澄清培养液,利用96针孔工具将1-2μL澄清的培养液点样在0.45微米硝酸纤维素膜(拜尔莱得公司)。采用标准蛋白质印迹技术43,用HSA抗体[1A9]HRP偶联物(阿比康公司(Abcam))探测膜,用ECLHRP化学发光检测试剂和方案(GE保健公司)检测。选择对应于各启动子(AOX2:A6,B7;YPT1:D11,B7;ICL1:E5,H3;FLD1:E11,F3;GAP:B7,B10;和AOX1:E3,E7)的两个表达最高的克隆作平行测试表达(图8)。
pApaRSNorthern印迹.在测试表达条件下培养表达最高的克隆AOX2,B7;YPT1,D11;ICL1,H3;FLD1,E11;GAP,B7;和AOX1,E36天。收集3x108个细胞(2.5ml,OD600=1.0),通过RiboPure–酵母试剂盒(安变公司(Ambion))试剂和方法分离总RNA。将13μg各RNA样品加载到2%甲醛凝胶(2%琼脂糖,20mMMOPS,8mM乙酸钠,2.2mM甲醛,pH=7.0)上。加载前,将3体积的NorthernMax甲醛加载染料(安变公司)与1体积RNA混合,加热至65℃,15分钟,在冰上冷却5分钟。对凝胶进行电泳(50V,2小时),通过18S和28SrRNA的溴化乙啶染色证实等量加载(图8c,上图)。通过标准印迹设备,在10xSSC缓冲液(1.5M氯化钠,0.15M柠檬酸钠pH=7.0)中将RNA吸到BiodyneB尼龙膜(帕尔生命科学公司)上。用2xSSC缓冲液清洗膜两次,干燥并与斯特拉塔基因公司的UVStratalinker2400自交联。采用皮尔斯公司的北2南化学发光杂交和检测试剂盒的方案和试剂进行杂交和检测。简言之,55℃,温育400-500μg生物素化探针过夜:酮基RS3生物素5’-/5Biosg/TGAGACGCTGCTTAACCGCTTC-3’和酮基RS4生物素5’-/5Biosg/TAAAGAAGTATTCAGGATCGGACTG-3’,结合链霉亲和素-HRP偶联物,用鲁米诺/增强剂–稳定的过氧化物溶液(皮尔斯公司)检测(图8c,下图)。利用PhotoshopCS2,通过条带密度测定mRNA相对滴度。
pApaRS蛋白质印迹.在测试表达条件下培养克隆AOX2:A6,B7;YPT1:D11,B7;ICL1:E5,H3;FLD1:E11,F3;GAP:B7,B10;和AOX1:E3,E7,沉淀(3000g,10分钟),用2mlYeastBuster(诺瓦金公司(Novagen))+10mMβ-巯基乙醇和完全(罗氏)蛋白酶抑制剂片剂裂解。以20,000g澄清样品,将15μl裂解液在4-20%SDS-PAGE凝胶上作电泳(1:15小时,150V)。利用转印迹SD半干转移室(拜尔莱得公司),在Tobin转移缓冲液(24mMtris基料,192mM甘氨酸,20%乙醇)(2小时,20V,100mAmp)中将蛋白质转移至0.45微米硝酸纤维素膜(拜尔莱得公司)。考马斯染色凝胶上残留的蛋白质(图8b,上图)以确保等量加载。采用标准蛋白质印迹技术43,用抗His6x-HRP偶联抗体(西格玛-阿尔德里奇公司)印迹膜,用ECL(GE保健公司)HRP化学发光检测试剂和方案检测(图8b,下图)。利用PhotoshopCS2,通过条带密度测定相对表达率。
rHSAE37X-ABT-510肟连接.合成了(Anaspec)ABT-510肽模拟物,其中ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸替代了第6个L-正缬氨酸残基(序列:Ac-Sar-Gly-Val-D-aloIle-Thr-Lys(Aoa)-Ile-Arg-Pro-NEt分子量=1097.3Da)。将2.25mM(0.5mg)肽加入200μl肟连接缓冲液(1.5M氯化钠,500mM乙酸钠,pH=4.4)中的75μMrHSAE37pApa或rHSA野生型(1.0mg),37℃温育过夜。用DynamaxHPLC(蓝尼公司),C8VydacHPLC柱(300mm, 5μm,格雷丝公司)纯化(水配制的40-46%乙腈洗脱)反应体系。收集诸组分,合并,通过考马斯染色SDS-PAGE凝胶分析。利用装有芥子酸基体的线性MALDI-TOFMSBiflexIII(BD公司(BurkerDaltonics))仪器检测完整蛋白质的质量。利用rHSA野生型+肽和rHSAE37pApa+肽之间的质量差异(由于E37pApa突变而低30Da(905Da减去60Da=845Da))测定连接效率(约77%)。蛋白质处理前后rHSA野生型质量的改变忽略不计。
pREAV-PFLD1-(合成酶tyr)构建和转化:利用酮基-Koz-F和酮基RSR6xHis(上述),通过PCR扩增酪氨酸(野生型)、pBpa、pAzapa、pPpa、pMpa和pIpa的特异性非天然aaRS,用NcoI和EagI(NEB)消化,连接入类似消化的pREAV-PFLD1-pApaRS(通过琼脂糖凝胶纯化除去pApaRS区后)。序列证实后,将质粒转化入前述的GS200-rHSAE37X克隆1D12以产生GS200-rHSAE37X/pREAV-PFLD1-(合成酶tyr)(HIS4,ARG4,GenR,Mut+)。各次转化选择12个克隆,如前所述以96孔形式通过点印迹筛选。选择各自的最佳产生克隆(tyr,A9;pBpa,B7;pAzapaC9;pPpa,D6;pMpa,E6;和pIpa,F6),与FLD1,E11在测试表达中比较(图11c)。利用PhotoshopCS2,通过条带密度测定相对蛋白质产量。
pREAV-PFLD1-(合成酶leu)构建和转化:为产生pREAVleu-PFLD1,合成(DNA2.0)对应于缺乏5’CCA并由SUP4区段隔开的三串联重复的片段,并利用以下引物作PCR扩增:LeutRNAF,5’-AAGGAAGCTAGCCTCTTTTTCAATTGTATATGTG-3’和LeutRNAR,5’-CGTACACGCGTCTGTACAGAAAAAAAAGAAAAATTTG-3’。用NheI和MluI(NEB)消化得到的643bp产物,连接入类似消化的pREAV-PFLD1-pApaRS(通过琼脂糖凝胶纯化除去酪氨酰tRNA后)以产生pREAVleu-PFLD1-pApaRS。利用以下引物扩增DMNB-S和丹酰基非天然氨基酸的特异性aaRS:LeuRSF,5’-ATTCACACCATGGAAGAGCAATACCGCCCGGAAGAG-3’和LeuRSR,5’-TTAATTCGCGGCCGCTTAGCCAACGACCAGATTGAGGAGTTTACCTG-3’,用NcoI和NotI(NEB)消化,连接入类似消化的pREAVleu-PFLD1-pApaRS(通过琼脂糖凝胶纯化除去pApaRS编码区后)以产生pREAVleu-PFLD1-DMNB-S或pREAVleu-PFLD1-丹酰基(图11d)。序列证实后,将质粒转化入GS200-rHSAE37X(克隆1D12)并以所述的96孔点印迹形式筛选。克隆A:A5(DMNB-S)和B:G12(丹酰基)鉴定为缓冲液最低甲醇(BMM)培养基中诱导后,在测试表达条件下生长3天的成功生产克隆。为进行比较,rHSA野生型在BMMY中表达3天(图11f)。通过上述LC-MS/MS进一步证实丹酰基和DMNB-S(氨基酸类似物)的掺入(图18)。通过PhotoshopCS2测定相对条带密度。
附图说明
图6:显示标记(栗色)、复制起点(黑色)、靶蛋白(橙色)、控制元件(绿色)和抑制型tRNA(“tRNA(CUA)”,淡蓝色)的真核生物中琥珀型抑制的载体。(a)用于巴斯德毕赤酵母中体内多拷贝掺入和表达的市售可得pPIC3.5k穿梭载体的图谱16。将rHSAE37X(橙色)亚克隆在AOX1启动子和终止子之间。(b)含有配对,在PADH1控制下的,用于酿酒酵母的优化琥珀型抑制载体23。tRNACUA重复由SUP4基因(未标出)的诸区域隔开,由PPGK1驱动。(c)修饰的pPR1-PPGK1+3SUP4-tRNA质粒,其中2μ真核起点和TRP标记被替换为ARG4以产生pREAV-PADH1-pApaRS。(d)PADH1和TADH1被替换为它们相应的AOX1以产生pREAV-PAOX1-pApaRS。(e)rHSAE37X的前61个氨基酸。前蛋白前导序列(蓝色,绿色)能将rHSAE37X输入培养基,并在运输期间切除从而产生始于天冬氨酸的成熟蛋白质(rHSA,橙色)。成熟rHSA的第37位残基(X,红色)表示对琥珀密码子起反应而掺入的非天然氨基酸。
图7:巴斯德毕赤酵母中pApa的琥珀型抑制。(a)采用Northern印迹(底部凝胶)检验酿酒酵母+pPR1-PPGK1-3SUP4-tRNA(泳道1)和巴斯德毕赤酵母+pREAV-PADH1-pApaRS(泳道2)的抑制型转录。对于阴性对照,泳道3和4分别是不含载体酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母菌株。上凝胶显示内源性丝氨酸tRNA的Northern印迹,说明所有样品中等量的miRNA制品。(b)为检验该系统的保真度,利用变性SDS-PAGE凝胶并作考马斯染色分析生长6天的25μl澄清培养基。泳道2是GS200;泳道3是GS200-HSAE37X;泳道4是GS200-pREAV-PAOX1-pApaRS;泳道5-7是GS200-HSAE37X/pREAV-PAOX1-pApaRS;泳道8是GS200-HSA野生型/pREAV-PADH1-pApaRS。琥珀型抑制只在含有两种载体并用甲醇和pApa氨基酸(pApaAA)的酵母菌中发生。(c)在成熟rHSAE37pApa的残基37处含有非天然氨基酸pApa(标有E*)的胰蛋白酶肽(上部)的MS/MS片段。观察到的碎片离子系列无疑支持了该取代。以标准术语标记序列离子44。
图8:比较优化琥珀型抑制的pApaRS启动子。(a)pREAV-P启动子-pApaRS线形图,显示了改变的启动子区域(绿色,红色轮廓)。PCR扩增基因组DNA的启动子(图12)。(b)以甲醇作为主要碳源培养用pREAV-P启动子-pApaRS的转化GS200-rHSAE37X各次的两个克隆6天,裂解,用SDS-PAGE凝胶分离(上部凝胶)。考马斯染色凝胶以验证等量加载。蛋白质印迹分析裂解液的pApaRs-His6x(下部凝胶)。(c)通过Northern印迹分析在b中产生最多蛋白质的克隆的pApaRSmRNA转录(下部凝胶)。用溴化乙锭染色18s和28s核糖体RNA的条带(上部凝胶)以证实RNA完整性和等量加载。(d)通过染色条带密度测定的b的柱状图,一式两份的平均值。误差棒表示方差。
图9:通过培养液中的rHSAE37pApa检测的PAOX2、PYPT1、PICL1、PFLD1、PGAP或PAOX1驱动aaRS的琥珀型抑制水平。用甲醇作为主要碳源和pApa氨基酸分别培养各启动子系统的两个克隆6天。用变性SDS-PAGE凝胶对25μl澄清的培养液作电泳,并作考马斯染色。以BSA作对照,通过条带密度计算的rHSA野生型(泳道15)是351.6mg/l(图17)。根据密度,PFLD1(泳道9和10的平均值)表达43%的蛋白质,或151.2mg/l(图16)。
图10:ABT-510肽与rHSAE37pApa的肟连接。(a)连接的示意图。ABT-510肽包含ε-(2-(氨基氧基)乙酰基)-L-赖氨酸作为第6残基。37℃温育75μMrHSAE37pApa(蓝色)与2.25mM肽过夜,形成了肟连接键(右上方)。相同条件下rHSA野生型(红色)无反应发生。(b)MALDI质谱法显示偶联程度。相比于与rHSA野生型(红色)温育,肽与含有rHSAE37pApa的酮(蓝色)温育产生905Da质量漂移,表明约77%的rHSAE37pApa连接于ABT-510。
图11:将8个非天然氨基酸加入遗传库。(a)含大肠杆菌酪氨酰-RS基因(橙色)和酪氨酰抑制型tRNA表达盒(tRNA(CUA),淡蓝色)的优化pREAV-PFLD1载体的示意图。(b)具有特异性大肠杆菌酪氨酰-RS的6种非天然氨基酸(1,3-7,描述于文本中)和酪氨酸(2)的结构。(c)在有(+)和没有(–)非天然氨基酸,1,3-7以及它们相应的aaRS存在下,rHSAE37X(其中X限定为非天然氨基酸)的表达。对25μl未纯化的澄清培养液作SDS-PAGE凝胶电泳并作考马斯染色。泳道2是rHSAE37Y表达及野生型(wt)酪氨酰-RS。泳道15是rHSA野生型的表达。(d)含大肠杆菌亮氨酰-RS基因(LeuRS,橙色)和亮氨酰抑制型tRNA表达盒(leu-tRNA(CUA),淡蓝色,红色轮廓)的优化pREAVleu-PFLD1载体的示意图。(e)具有特定大肠杆菌亮氨酰aaRS的DMNB-C和丹酰基非天然氨基酸(8,9,描述于文中)的结构。(f)有(+)和没有(–)非天然氨基酸,8,9以及它们相应的LeuRS存在下,rHSAE37X的表达。利用SDS-PAGE凝胶并作考马斯染色分析各蛋白表达的25μl未纯化的澄清培养液。泳道4是rHSA野生型的表达情况,也是3天后的。
图12:PCR扩增基因组DNA的非天然氨基酸抑制系统的3种组分,显示将pPIC3.5k和pREAV表达盒成功掺入GS200-rHSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS。一次转化选择4个克隆,标记为1-4。预计的PCR产物是rHSA1851bp、pApaRS1317bp和tRNA表达盒1100bp。克隆2中缺乏pApaRS扩增可能是技术误差。
图13:一次转化的GS200-rHSAE37X/pREAV-PADH1-pApaRS的4个不同克隆中pApaRS-His6x的蛋白质印迹。未检测到pApaRS蛋白。
图14:用SDS-PAGE凝胶并作考马斯染色分析GS200-rHSAE37X/pREAV-PAOX1-pApaRS(Mut+)培养物(泳道1)或GS200-rHSAE37X/pREAV-PAOX1-pApaRS(muts)培养物(泳道2)的25ul澄清培养液。条带密度测定到Mut+克隆的rHSAE37X表达量是约1.5-2.0倍。
图15:利用5种不同启动子的特异性引物PCR扩增基因组DNA中它们相应的启动子。显示的是溴化乙啶染色凝胶,其中1kb+分子量梯在PCR产物侧翼。PCRS的预计长度是PAOX2342bp、PYPT1508bp、PICL1683bp、PFLD1597bp和PGAP493bp。
图16:图9的柱状图,显示rHSAE37pApa中琥珀型抑制与启动子驱动pApaRS产生的函数关系。通过图9所示SDS-PAGE凝胶上的考马斯条带密度测定蛋白质产生。如图17所述定量测定rHSA野生型。
图17:对25μlBSA标准品或测试蛋白质表达的未纯化rHSA野生型培养液进行SDS-PAGE凝胶电泳。泳道7是rHSA野生型测试蛋白质表达培养液的1:1稀释液。对BSA标准品条带密度(泳道1-4)作图,并作线性拟合。rHSA野生型条带(2x泳道7和泳道8)的密度平均为83.33或351.55mg/ml。非天然蛋白质的产量(其它图中的rHSAE37X)测定为相同rHSA野生型样品的百分比。
图18:图11f的泳道2的rHSAE37DMNB-C蛋白进行胰蛋白酶消化,然后进行方法章节所述的LC-MS/MS,除了消化物中胰凝乳蛋白酶替代胰蛋白酶。上幅色谱图(黑色)显示24.45-60.05分钟之间LC-MS/MS运行的总离子计数(TIC)。第三(绿色)和第四(蓝色)色谱图分别是2+和3+荷电物质的离子提取,对应于胰凝乳蛋白酶肽,XDHVKLVNEVTEF,其中X(rHSA的第37位残基)是DMNB-C(峰下总面积,“MA”=224582204)。第五(芥末色)和第六(紫色)色谱图分别是2+和3+荷电物质的离子提取,对应于胰凝乳蛋白酶肽,XDHVKLVNEVTEF,其中X是亮氨酸的异亮氨酸(峰下中面积“MA”=20029397)。如下所示进行计算:百分比E37DMNB-C=224582204/(224582204+20029397)*100=91.8%和百分比E37L=20029397/(224582204+20029397)*100=8.2%。未检测到可察觉量的对应于X处其它天然氨基酸掺入的离子种类。
参考文献
1.Wang,L.,Xie,J.和Schultz,P.G.Expandingthegeneticcode(扩增遗传密码).AnnuRevBiophysBiomolStruct35,225-249(2006).
2.Chin,J.W.等.Anexpandedeukaryoticgeneticcode(扩增的真核遗传密码).Science301,964-967(2003).
3.Xie,J.和Schultz,P.G.Achemicaltoolkitforproteins--anexpandedgeneticcode(蛋白质的化学工具箱-扩增的遗传密码).NatRevMolCellBiol7,775-782(2006).
4.Liu,W.,Brock,A.,Chen,S.和Schultz,P.G.Geneticincorporationofunnaturalaminoacidsintoproteinsinmammaliancells(哺乳动物细胞中非天然氨基酸遗传掺入蛋白质).NatMethods4,239-244(2007).
5.Wang,L.和Schultz,P.G.AgeneralapproachforthegenerationoforthogonaltRNAs(产生正交tRNA的通用方法).ChemBiol8,883-890(2001).
6.Chin,J.W.,Cropp,T.A.,Chu,S.,Meggers,E.和Schultz,P.G.Progresstowardanexpandedeukaryoticgeneticcode(扩增的真核遗传密码的进展).ChemBiol10,511-519(2003).
7.Cereghino,J.L.和Cregg,J.M.HeterologousproteinexpressioninthemethylotrophicyeastPichiapastoris(甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的异源蛋白质表达).FEMSMicrobiolRev24,45-66(2000).
8.Shekhar,C.Pichiapower:India'sbiotechindustryputsunconventionalyeasttowork(毕赤酵母的能力:印度生物技术工业使得非常规酵母菌工作).ChemBiol15,201-202(2008).
9.Clare,J.J.,Rayment,F.B.,Ballantine,S.P.,Sreekrishna,K.和Romanos,M.A.High-levelexpressionoftetanustoxinfragmentCinPichiapastorisstrainscontainingmultipletandemintegrationsofthegene(在含有基因的多个串联整合的巴斯德毕赤酵母菌株中高水平表达破伤风毒素片段C).Biotechnology(纽约)9,455-460(1991).
10.Ohya,T.,Ohyama,M.和Kobayashi,K.OptimizationofhumanserumalbuminproductioninmethylotrophicyeastPichiapastorisbyrepeatedfed-batchfermentation(通过反复分批补料发酵优化甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的人血清白蛋白产生).BiotechnolBioeng90,876-887(2005).
11.Sreekrishna,K.等.High-levelexpression,purification,andcharacterizationofrecombinanthumantumornecrosisfactorsynthesizedinthemethylotrophicyeastPichiapastoris(在甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中合成的重组人肿瘤坏死因子的高水平表达、纯化和表征).Biochemistry28,4117-4125(1989).
12.Cos,O.,Ramon,R.,Montesinos,J.L.和Valero,F.Operationalstrategies,monitoringandcontrolofheterologousproteinproductioninthemethylotrophicyeastPichiapastorisunderdifferentpromoters:areview(甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中在不同启动子控制下异源蛋白产生的操作策略、监测和控制:综述).MicrobCellFact5,17(2006).
13.Cregg,J.M.,Vedvick,T.S.和Raschke,W.C.RecentadvancesintheexpressionofforeigngenesinPichiapastoris(巴斯德毕赤酵母中外来基因的表达的最新进展).Biotechnology(纽约)11,905-910(1993).
14.Li,H.等.OptimizationofhumanizedIgGsinglycoengineeredPichiapastoris(在工程改造的巴斯德毕赤酵母中优化人源化IgG).NatBiotechnol24,210-215(2006).
15.Higgins,D.R.和Cregg,J.M.IntroductiontoPichiapastoris(巴斯德毕赤酵母介绍).MethodsMolBiol103,1-15(1998).
16.InvitrogenLife,T.,第K1750-01卷,Edn.F85(英杰生命技术公司(InvitrogenLifeTechnologies),卡尔斯巴德,加利福尼亚州92008;2005).
17.Kim,J.G.等.Developmentandcharacterizationofaglucagon-likepeptide1-albuminconjugate:theabilitytoactivatetheglucagon-likepeptide1receptorinvivo(胰高血糖素-样肽1-白蛋白偶联物的开发和表征:体内激活胰高血糖素-样肽1受体的能力).Diabetes52,751-759(2003).
18.Huang,Y.S.等.Preparationandcharacterizationofanovelexendin-4humanserumalbuminfusionproteinexpressedinPichiapastoris(巴斯德毕赤酵母中表达的新型exendin-4人血清白蛋白融合蛋白的制备和表征).JPeptSci14,588-595(2008).
19.Chuang,V.T.,Kragh-Hansen,U.和Otagiri,M.Pharmaceuticalstrategiesutilizingrecombinanthumanserumalbumin(利用重组人血清白蛋白的药学策略).PharmRes19,569-577(2002).
20.Kobayashi,K.Summaryofrecombinanthumanserumalbumindevelopment(重组人血清白蛋白开发综述).Biologicals34,55-59(2006).
21.Buckholz,R.G.和Gleeson,M.A.Yeastsystemsforthecommercialproductionofheterologousproteins(商品化制备异源蛋白的酵母菌系统).Biotechnology(纽约)9,1067-1072(1991).
22.Kupcsulik,B.和Sevella,B.OptimizationofspecificproductformationratebystatisticalandformalkineticmodeldescriptionsofanHSAproducingPichiapastorisMut(S)strain(通过产生HSA的巴斯德毕赤酵母Mut(S)菌株的统计学和正常动力学模型描述来优化特定产物形成速率).ChemBiochemEngQ19,99-108(2005).
23.Chen,S.,Schultz,P.G.和Brock,A.AnimprovedsystemforthegenerationandanalysisofmutantproteinscontainingunnaturalaminoacidsinSaccharomycescerevisiae(在酿酒酵母中产生和分析突变型含非天然氨基酸的蛋白质的改进系统).JMolBiol371,112-122(2007).
24.Zhang,Z.等.Anewstrategyforthesite-specificmodificationofproteinsinvivo(蛋白质的体内位点特异性修饰的新方案).Biochemistry42,6735-6746(2003).
25.Kozak,M.Downstreamsecondarystructurefacilitatesrecognitionofinitiatorcodonsbyeukaryoticribosomes(下游二级结构有助于真核核糖体识别起始密码子).ProcNatlAcadSciUSA87,8301-8305(1990).
26.Sears,I.B.,O'Connor,J.,Rossanese,O.W.和Glick,B.S.AversatilesetofvectorsforconstitutiveandregulatedgeneexpressioninPichiapastoris(毕赤酵母中组成型和调控基因表达的一套通用载体).Yeast14,783-790(1998).
27.Segev,N.,Mulholland,J.和Botstein,D.TheyeastGTP-bindingYPT1proteinandamammaliancounterpartareassociatedwiththesecretionmachinery(酵母菌GTP-结合YPT1蛋白和哺乳动物对等物与分泌方法相关).Cell52,915-924(1988).
28.Waterham,H.R.,Digan,M.E.,Koutz,P.J.,Lair,S.V.和Cregg,J.M.IsolationofthePichiapastorisglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenasegeneandregulationanduseofitspromoter(巴斯德毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的分离及其启动子的调节和使用).Gene186,37-44(1997).
29.Ohi,H.,Miura,M.,Hiramatsu,R.和Ohmura,T.Thepositiveandnegativecis-actingelementsformethanolregulationinthePichiapastorisAOX2gene(巴斯德毕赤酵母AOX2基因中甲醇调节的正和负顺式作用元件).MolGenGenet243,489-499(1994).
30.Hoekstra,R.等.PhaseIsafety,pharmacokinetic,andpharmacodynamicstudyofthethrombospondin-1-mimeticangiogenesisinhibitorABT-510inpatientswithadvancedcancer(晚期癌症患者中血小板反应蛋白-1-模拟血管生成抑制剂ABT-510的I期安全、药代动力学和药效学研究).JClinOncol23,5188-5197(2005).
31.Yang,Q.等.Thrombospondin-1peptideABT-510combinedwithvalproicacidisaneffectiveantiangiogenesisstrategyinneuroblastoma(联用血小板反应蛋白-1肽ABT-510与丙戊酸是成神经细胞瘤的有效抗血管生成策略).CancerRes67,1716-1724(2007).
32.Reiher,F.K.等.Inhibitionoftumorgrowthbysystemictreatmentwiththrombospondin-1peptidemimetics(血小板反应蛋白-1肽模拟物的全身性处理抑制肿瘤生长).IntJCancer98,682-689(2002).
33.Haviv,F.等.Thrombospondin-1mimeticpeptideinhibitorsofangiogenesisandtumorgrowth:design,synthesis,andoptimizationofpharmacokineticsandbiologicalactivities(血管生成和肿瘤生长的血小板反应蛋白-1模拟肽抑制剂:药代动力学和生物学活性的设计、合成和优化).JMedChem48,2838-2846(2005).
34.Dirksen,A.,Hackeng,T.M.和Dawson,P.E.Nucleophiliccatalysisofoximeligation(肟连接的亲核催化).AngewChemIntEdEngl45,7581-7584(2006).
35.Dirksen,A.,Dirksen,S.,Hackeng,T.M.和Dawson,P.E.Nucleophiliccatalysisofhydrazoneformationandtransimination:implicationsfordynamiccovalentchemistry(腙形成和转移的亲核催化:涉及动态共价化学反应).JAmChemSoc128,15602-15603(2006).
36.Deiters,A.等.AddingaminoacidswithnovelreactivitytothegeneticcodeofSaccharomycescerevisiae(将具有新型反应活性的氨基酸加入酿酒酵母的遗传密码).JAmChemSoc125,11782-11783(2003).
37.Lemke,E.A.,Summerer,D.,Geierstanger,B.H.,Brittain,S.M.和Schultz,P.G.Controlofproteinphosphorylationwithageneticallyencodedphotocagedaminoacid(遗传编码的光囚氨基酸控制蛋白质磷酸化).NatChemBiol3,769-772(2007).
38.Summerer,D.等.Ageneticallyencodedfluorescentaminoacid(遗传编码的荧光氨基酸).ProcNatlAcadSciUSA103,9785-9789(2006).
39.Wang,Q.和Wang,L.Newmethodsenablingefficientincorporationofunnaturalaminoacidsinyeast(非天然氨基酸有效掺入酵母菌的新方法).JAmChemSoc130,6066-6067(2008).
40.Zheng,L.,Baumann,U.和Reymond,J.L.Anefficientone-stepsite-directedandsite-saturationmutagenesisprotocol(有效的一步定点和位点饱和诱变方案).NucleicAcidsRes32,e115(2004).
41.Matthiesen,R.,Bauw,G.和Welinder,K.G.Useofperformicacidoxidationtoexpandthemassdistributionoftrypticpeptides(利用过氧甲酸扩大胰蛋白酶肽的质量分布).Analyticalchemistry76,6848-6852(2004).
42.Licklider,L.J.,Thoreen,C.C.,Peng,J.和Gygi,S.P.Automationofnanoscalemicrocapillaryliquidchromatography-tandemmassspectrometrywithaventedcolumn(具有通气空间的纳米级毛细管液相色谱-串联质谱法的自动化).Analyticalchemistry74,3076-3083(2002).
43.Burnette,W.N."Westernblotting":electrophoretictransferofproteinsfromsodiumdodecylsulfate--polyacrylamidegelstounmodifiednitrocelluloseandradiographicdetectionwithantibodyandradioiodinatedproteinA(蛋白质印迹:将蛋白质从十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶转移至未修饰的硝酸纤维素并用抗体和放射性碘标记的A蛋白的X射线照相检测).AnalBiochem112,195-203(1981).
44.Roepstorff,P.和Fohlman,J.Proposalforacommonnomenclatureforsequenceionsinmassspectraofpeptides(肽质谱中序列离子的通用术语建议).BiomedMassSpectrom11,601(1984).
虽然出于清楚和理解的目的描述了上述发明的一些细节,但本领域技术人员从阅读本文可以明白可以在形式和细节中作出各种改变而不脱离本发明的真正范围。例如,上述所有技术和设备可以各种组合使用。如同各篇出版物、专利、专利申请和/或其它文件单独表明出于所有目的通过引用纳入的程度一样,本申请引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其它文件出于所有目的通过引用全文纳入本文。
Claims (44)
1.一种甲基营养酵母细胞,其包含:
a)非天然氨基酸;
b)正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS),其中所述O-RS在甲基营养酵母细胞中优先用非天然氨基酸氨酰化正交tRNA(O-tRNA),并且,所述O-RS由整合入基因组的核酸在FLD1启动子的转录调控下表达,该核酸包含编码所述O-RS的多核苷酸;和
c)正交tRNA(O-tRNA),其中所述O-tRNA在甲基营养酵母细胞中识别选择者密码子并优先被所述O-RS用非天然氨基酸氨酰化,并且,所述O-tRNA由整合入基因组的核酸表达,所述O-RS和所述O-tRNA由同一质粒上的表达盒编码且稳定整合到细胞基因组的ARG4基因,该核酸包含编码或包含所述O-tRNA的多核苷酸;并且
所述O-RS和O-tRNA衍生自大肠杆菌。
2.如权利要求1所述的细胞,其特征在于,所述非天然氨基酸包括:对-(炔丙基氧基)苯丙氨酸、对-甲氧基苯丙氨酸、丹酰基丙氨酸、DMNB-丝氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、O-炔丙基-L-酪氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对-叠氮基-L-苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对-碘-苯丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-氨基-L-苯丙氨酸、酪氨酸的非天然类似物;谷氨酰胺的非天然类似物;苯丙氨酸的非天然类似物;丝氨酸的非天然类似物;苏氨酸的非天然类似物;烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸盐、硼化物、磷、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮或氨基取代的氨基酸,或其任何组合;带有光活化交联剂的氨基酸;自旋标记的氨基酸;荧光氨基酸;带有新型官能团的氨基酸;与另一分子共价或非共价相互作用的氨基酸;结合金属的氨基酸;含金属的氨基酸;放射性氨基酸;光束缚的和/或光敏异构化的氨基酸;含生物素或生物素类似物的氨基酸;糖基化或糖修饰的氨基酸;含酮氨基酸;包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸;重原子取代的氨基酸;可化学裂解或可光裂解的氨基酸;带有延长侧链的氨基酸;含有毒性基团的氨基酸;糖取代的氨基酸例如糖取代的丝氨酸等;含碳连接的糖的氨基酸;糖取代的半胱氨酸;具有氧化还原活性的氨基酸;含α-羟基的酸;含氨基硫代酸的氨基酸;α,α二取代氨基酸;β-氨基酸;硫代酪氨酸;4-溴苯丙氨酸;或脯氨酸之外的环状氨基酸。
3.如权利要求1所述的细胞,其特征在于,从高水平的组成型启动子表达所述O-tRNA。
4.如权利要求1所述的细胞,其特征在于,所述启动子包括PGK1启动子。
5.如权利要求1所述的细胞,其特征在于,所述细胞包含含有编码感兴趣多肽的多核苷酸的核酸,其中所述多核苷酸包含所述O-tRNA所识别的选择者密码子。
6.如权利要求5所述的细胞,其特征在于,所述感兴趣多肽包括HSA、人中性肽链内切酶(NEP)、抗体、Fab、Fv、α-1抗胰蛋白酶、血管抑制素、抗溶血因子、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降钙素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配体、c-kit配体、胶原酶、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制物、补体受体1、细胞因子、上皮细胞中性白细胞激活肽-78、GROα、MGSA、GROβ、GROγ、MIP1-α、MIP1-β、MCP-1、人表皮生长因子(hEGF)、上皮细胞嗜中性白细胞激活肽、促红细胞生成素(EPO)、剥落性毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、FGF21、血纤蛋白原、纤连蛋白、G-CSF、GM-CSF、人葡糖脑苷脂酶、促性腺激素变体、生长因子、生长因子受体、hedgehog蛋白、血红蛋白、肝细胞生长因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白(HSA)、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、人胰岛素、人胰岛素-样生长因子(hIGF)、hIGF-I、hIGF-II、人干扰素、IFN-α、IFN-、IFN-γ、白介素、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角化细胞生长因子(KGF)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经营养因子、嗜中性白细胞抑制因子(NIF)、人抑瘤素M(OSM)、成骨蛋白、癌基因产物、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、人生长激素(hGH)、多效生长因子、A蛋白、G蛋白、致热外毒素A、致热外毒素B、致热外毒素C、松弛素、肾素、SCF/c-kit、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合征毒素、胸腺素α1、组织纤溶酶原激活物、肿瘤生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、人肿瘤坏死因子(hTNF)、人肿瘤坏死因子α、人肿瘤坏死因子β、人肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、人血管内皮生长因子(hVEGEF)、hVEGF165、尿激酶、Mos、Ras、Raf、Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、雌激素受体、孕酮受体、睾酮受体、醛固酮受体、LDL受体、炎性分子、信号转导分子、转录激活物、转录抑制物、透明质酸酶、CD44、皮质酮、人甲状腺过氧化物酶(hTPO)、破伤风毒素片段C、牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(BPTI)、人淀粉样前蛋白(APP)、人抗凝血酶III、BP320抗原、人胱冬酶-3、乙型肝炎表面抗原、人性别类固醇结合蛋白(hSBP)、人内皮抑制素或gp120。
7.如权利要求5所述的细胞,其特征在于,所述核酸整合入基因组。
8.如权利要求7所述的细胞,其特征在于,所述核酸以单拷贝整合入基因组。
9.如权利要求7所述的细胞,其特征在于,所述整合由编码非必需基因的基因座处的基因替代介导。
10.如权利要求9所述的细胞,其特征在于,所述非必需基因是AOX1。
11.如权利要求10所述的细胞,其特征在于,所述细胞显示甲醇利用表型,其中所述甲醇利用表型是mutS。
12.如权利要求7所述的细胞,其特征在于,所述核酸以多拷贝整合入基因组。
13.如权利要求7所述的细胞,其特征在于,所述细胞显示甲醇利用表型,其中所述甲醇利用表型是Mut+。
14.如权利要求5所述的细胞,其特征在于,从诱导型启动子表达所述感兴趣多肽。
15.如权利要求14所述的细胞,其特征在于,所述诱导型启动子包括:AOX1启动子、AOX2启动子、ICL1启动子或FLD1启动子。
16.如权利要求5所述的细胞,其特征在于,从组成型启动子表达所述感兴趣多肽。
17.如权利要求16所述的细胞,其特征在于,所述组成型启动子是YPT1启动子或GAP启动子。
18.如权利要求1所述的细胞,其特征在于,所述甲基营养酵母细胞是假丝酵母属细胞、汉森酵母属细胞、球拟酵母菌属细胞或毕赤酵母属细胞。
19.如权利要求1所述的细胞,其特征在于,所述甲基营养酵母细胞是巴斯德毕赤酵母细胞。
20.一种在甲基营养酵母细胞中产生在所选位置包含非天然氨基酸的感兴趣多肽的方法,该方法包括:
a)提供甲基营养酵母细胞,该细胞含有:
i)非天然氨基酸;
ii)正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS),其中所述O-RS在甲基营养酵母中优先用非天然氨基酸氨酰化正交tRNA(O-tRNA),所述提供O-RS包括将O-RS多核苷酸整合入细胞的基因组并表达所编码的O-RS,其中该O-RS多核苷酸编码启动子下游的O-RS,所述启动子为FLD1启动子,所述O-RS和所述O-tRNA由同一质粒上的表达盒编码且稳定整合到细胞基因组的ARG4基因,并且,所述O-RS和O-tRNA衍生自大肠杆菌;和
iii)正交tRNA(O-tRNA),其中所述O-RS优先用非天然氨基酸氨酰化所述O-tRNA,所述O-tRNA多核苷酸整合入基因组;和
iv)编码感兴趣多肽的感兴趣核酸,其中所述感兴趣的核酸包含所述O-tRNA识别的至少一个选择者密码子;和
b)在感兴趣多肽的翻译期间对选择者密码子起反应而将非天然氨基酸掺入感兴趣核酸的所选位置,从而产生在所选位置包含非天然氨基酸的感兴趣多肽。
21.如权利要求20所述的方法,其特征在于,所述提供非天然氨基酸包括提供:对-(炔丙基氧基)苯丙氨酸、对-甲氧基苯丙氨酸、丹酰基丙氨酸、DMNB-丝氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、O-炔丙基-L-酪氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对-叠氮基-L-苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对-碘-苯丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-氨基-L-苯丙氨酸、酪氨酸的非天然类似物;谷氨酰胺的非天然类似物;苯丙氨酸的非天然类似物;丝氨酸的非天然类似物;苏氨酸的非天然类似物;烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸盐、硼化物、磷、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮或氨基取代的氨基酸,或其任何组合;带有光活化交联剂的氨基酸;自旋标记的氨基酸;荧光氨基酸;带有新型官能团的氨基酸;与另一分子共价或非共价相互作用的氨基酸;结合金属的氨基酸;含金属的氨基酸;放射性氨基酸;光束缚的和/或光敏异构化的氨基酸;含生物素或生物素类似物的氨基酸;糖基化或糖修饰的氨基酸;含酮氨基酸;包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸;重原子取代的氨基酸;可化学裂解或可光裂解的氨基酸;带有延长侧链的氨基酸;含有毒性基团的氨基酸;糖取代的氨基酸例如糖取代的丝氨酸等;含碳连接的糖的氨基酸;糖取代的半胱氨酸;具有氧化还原活性的氨基酸;含α-羟基的酸;含氨基硫代酸的氨基酸;α,α二取代氨基酸;β-氨基酸;硫代酪氨酸;4-溴苯丙氨酸;或脯氨酸之外的环状氨基酸。
22.如权利要求20所述的方法,其特征在于,所述细胞包含的O-tRNA是琥珀抑制型tRNA、赭石抑制型tRNA、乳白抑制型tRNA或识别四碱基密码子的、罕用密码子或非编码密码子的tRNA,所述O-tRNA由高水平组成型启动子转录控制下的O-tRNA多核苷酸编码。
23.如权利要求22所述的方法,其特征在于,所述高水平组成型启动子包括PGK1启动子。
24.如权利要求20所述的方法,其特征在于,所述提供编码多肽的感兴趣核酸包括提供编码以下的核酸:HSA、人中性肽链内切酶(NEP)、抗体、Fab、Fv、α-1抗胰蛋白酶、血管抑制素、抗溶血因子、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降钙素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配体、c-kit配体、胶原酶、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制物、补体受体1、细胞因子、上皮细胞中性白细胞激活肽-78、GROα、MGSA、GROβ、GROγ、MIP1-α、MIP1-β、MCP-1、人表皮生长因子(hEGF)、上皮细胞嗜中性白细胞激活肽、促红细胞生成素(EPO)、剥落性毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、FGF21、血纤蛋白原、纤连蛋白、G-CSF、GM-CSF、人葡糖脑苷脂酶、促性腺激素变体、生长因子、生长因子受体、hedgehog蛋白、血红蛋白、肝细胞生长因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白(HSA)、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、人胰岛素、人胰岛素-样生长因子(hIGF)、hIGF-I、hIGF-II、人干扰素、IFN-α、IFN-、IFN-γ、白介素、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角化细胞生长因子(KGF)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经营养因子、嗜中性白细胞抑制因子(NIF)、人抑瘤素M(OSM)、成骨蛋白、癌基因产物、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、人生长激素(hGH)、多效生长因子、A蛋白、G蛋白、致热外毒素A、致热外毒素B、致热外毒素C、松弛素、肾素、SCF/c-kit、可溶性补体受体I、可溶性I-CAM1、可溶性白介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合征毒素、胸腺素α1、组织纤溶酶原激活物、肿瘤生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、人肿瘤坏死因子(hTNF)、人肿瘤坏死因子α、人肿瘤坏死因子β、人肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、人血管内皮生长因子(hVEGEF)、hVEGF165、尿激酶、Mos、Ras、Raf、Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、雌激素受体、孕酮受体、睾酮受体、醛固酮受体、LDL受体、炎性分子、信号转导分子、转录激活物、转录抑制物、透明质酸酶、CD44、皮质酮、人甲状腺过氧化物酶(hTPO)、破伤风毒素片段C、牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(BPTI)、人淀粉样前蛋白(APP)、人抗凝血酶III、BP320抗原、人胱冬酶-3、乙型肝炎表面抗原、人性别类固醇结合蛋白(hSBP)、人内皮抑制素或gp120。
25.如权利要求20所述的方法,其特征在于,提供感兴趣核酸包括将在启动子的转录控制下的该核酸整合入细胞的基因组。
26.如权利要求25所述的方法,其特征在于,将所述核酸整合入基因组包括将所述核酸以单拷贝整合入基因组。
27.如权利要求26所述的方法,其特征在于,将所述核酸整合入基因组包括在编码以下基因的基因座处整合所述核酸:ARG4基因、ADE1基因、HIS4基因、URA3基因、AOXI基因、AOX2基因或MET2基因。
28.如权利要求25所述的方法,其特征在于,提供所述核酸包括将所述核酸以多拷贝整合入基因组。
29.如权利要求28所述的方法,其特征在于,将所述核酸整合入基因组包括在AOX1的基因座5’处整合所述核酸。
30.如权利要求25所述的方法,其特征在于,所述启动子是诱导型启动子。
31.如权利要求30所述的方法,其特征在于,所述诱导型启动子包括:AOX1启动子、AOX2启动子、ICL1启动子或FLD1启动子。
32.如权利要求25所述的方法,其特征在于,所述启动子是组成型启动子。
33.如权利要求32所述的方法,其特征在于,所述组成型启动子是YPT1启动子或GAP启动子。
34.如权利要求20所述的方法,其特征在于,提供甲基营养酵母细胞包括提供假丝酵母属细胞、汉森酵母属细胞、球拟酵母菌属细胞或毕赤酵母属细胞。
35.如权利要求20所述的方法,其特征在于,提供甲基营养酵母细胞包括提供巴斯德毕赤酵母细胞。
36.如权利要求20所述的方法,其特征在于,产生在所选位置包含非天然氨基酸的多肽包括以1:9比例的缓冲复合甲醇培养基(BMMY):缓冲最低甲醇(BMM)培养适当制备的甲基营养酵母细胞,并在摇瓶中培养该培养物以诱导该多肽表达。
37.如权利要求36所述的方法,其特征在于,培养适当制备的甲基营养酵母细胞包括培养假丝酵母属细胞、汉森酵母属细胞、毕赤酵母属细胞或球拟酵母菌属细胞。
38.如权利要求36所述的方法,其特征在于,培养适当制备的甲基营养酵母细胞包括培养巴斯德毕赤酵母细胞。
39.如权利要求37所述的方法,其特征在于,产生在所选位置含有非天然氨基酸的多肽包括培养该培养物直至其达到粘稠浆液以产生所述多肽。
40.如权利要求20所述的方法,其特征在于,产生的多肽被硫酸化。
41.如权利要求20所述的方法,其特征在于,产生的多肽被糖基化。
42.如权利要求20所述的方法,其特征在于,产生的多肽包含二硫键。
43.如权利要求20所述的方法,其特征在于,产生的多肽以最高10毫克/升的浓度自所述细胞中表达。
44.如权利要求20所述的方法,其特征在于,产生在所选位置含有非天然氨基酸的多肽包括:
a)用合适巴斯德毕赤酵母的菌落接种YPD培养基以产生第一培养物;
b)29-30℃,在摇瓶中以280rpm振荡培养该第一培养物至接近饱和;
c)利用该第一培养物接种1升缓冲培养基甘油酵母提取物(BMGY)以产生第二培养物;
d)将该第二培养物培养至OD600为8.0;
e)以1500xg离心该第二培养物5分钟从而形成沉淀物;
f)将该沉淀物重悬在200ml1:9比例的缓冲复合甲醇培养基(BMMY):缓冲最低甲醇(BMM)中以产生第三培养物;和
g)在120-144小时期间每24小时将甲醇加入该第三培养物至终浓度为0.5%,以维持诱导多肽表达。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US734107P | 2007-12-11 | 2007-12-11 | |
US61/007,341 | 2007-12-11 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2008801266965A Division CN101939410A (zh) | 2007-12-11 | 2008-12-10 | 甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105647824A true CN105647824A (zh) | 2016-06-08 |
Family
ID=40756044
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2008801266965A Pending CN101939410A (zh) | 2007-12-11 | 2008-12-10 | 甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达 |
CN201610056340.5A Pending CN105647824A (zh) | 2007-12-11 | 2008-12-10 | 甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2008801266965A Pending CN101939410A (zh) | 2007-12-11 | 2008-12-10 | 甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8647840B2 (zh) |
EP (2) | EP2231856A4 (zh) |
JP (3) | JP2011527886A (zh) |
KR (1) | KR20100105846A (zh) |
CN (2) | CN101939410A (zh) |
AU (1) | AU2008335778B2 (zh) |
BR (1) | BRPI0819929A2 (zh) |
CA (1) | CA2708760A1 (zh) |
IL (2) | IL206300A (zh) |
RU (1) | RU2010125104A (zh) |
WO (1) | WO2009075847A2 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108473542A (zh) * | 2015-10-26 | 2018-08-31 | 科学与工业研究委员会 | 遗传修饰的酵母细胞和改进的用于生产凝块特异性链激酶的方法 |
CN112940956A (zh) * | 2021-04-18 | 2021-06-11 | 江南大学 | 采用双启动子增强乳铁蛋白表达的毕赤酵母及其应用 |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8647840B2 (en) | 2007-12-11 | 2014-02-11 | The Scripps Research Institute | In vivo unnatural amino acid expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris |
WO2010053636A1 (en) * | 2008-11-06 | 2010-05-14 | Tate & Lyle Technology Ltd | Enhanced production and purification of a natural high intensity sweetener |
JP5959201B2 (ja) * | 2008-12-10 | 2016-08-02 | ザ スクリプス リサーチ インスティテュート | 化学的に反応性の非天然アミノ酸を使用するキャリア−ペプチド接合体の製造 |
DE102010056289A1 (de) | 2010-12-24 | 2012-06-28 | Geneart Ag | Verfahren zur Herstellung von Leseraster-korrekten Fragment-Bibliotheken |
CN103145845A (zh) * | 2011-12-06 | 2013-06-12 | 吉林圣元科技有限责任公司 | Tat与人野生型P53融合蛋白在毕赤酵母中的表达 |
CN103060411B (zh) * | 2013-01-05 | 2014-02-05 | 义马煤业集团煤生化高科技工程有限公司 | 一种甲醇蛋白肽的生产方法 |
WO2014145521A2 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Alderbio Holdings Llc | Fermentation process for antibody production |
CN104312932B (zh) * | 2014-10-24 | 2018-03-27 | 北京科兴中维生物技术有限公司 | 一种甲醇营养型酵母的蛋白诱导方法 |
AU2016364229A1 (en) * | 2015-11-30 | 2018-05-31 | European Molecular Biology Laboratory | Means and methods for preparing engineered proteins by genetic code expansion in insect cells |
CN106770866A (zh) * | 2015-12-17 | 2017-05-31 | 中国医科大学 | 可实现人血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒及测定方法 |
CN105385693B (zh) * | 2015-12-25 | 2018-09-18 | 安阳工学院 | 一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法 |
CN112142846B (zh) * | 2020-10-10 | 2022-07-08 | 西北大学 | Aox特异性抗体组合及其制备方法和用途 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7045337B2 (en) * | 2001-04-19 | 2006-05-16 | The Scripps Research Institute | In vivo incorporation of unnatural amino acids |
WO2006068802A2 (en) * | 2004-12-22 | 2006-06-29 | Ambrx, Inc. | COMPOSITIONS OF AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE AND USES THEREOF |
Family Cites Families (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7229789B1 (en) | 2001-01-19 | 2007-06-12 | N.V. Organon | Methods and compositions for extracting proteins from cells |
US6645739B2 (en) | 2001-07-26 | 2003-11-11 | Phoenix Pharmacologies, Inc. | Yeast expression systems, methods of producing polypeptides in yeast, and compositions relating to same |
WO2004035605A2 (en) | 2002-10-16 | 2004-04-29 | The Scripps Research Institute | Glycoprotein synthesis |
MXPA05006836A (es) | 2002-12-22 | 2005-08-16 | Scripps Research Inst | Colecciones ordenadas de proteinas. |
DE602004006112T2 (de) | 2003-04-03 | 2007-12-27 | Dow Corning Corp., Midland | Feuchtigkeitshärtende organosiloxanzusammensetzung |
CN103215228A (zh) | 2003-04-17 | 2013-07-24 | 斯克利普斯研究院 | 扩展真核生物遗传密码 |
MXPA05013833A (es) | 2003-06-18 | 2006-05-17 | Scripps Research Inst | Adiciones al codigo genetico de aminoacidos reactivos no naturales. |
US7527943B2 (en) | 2003-07-07 | 2009-05-05 | The Scripps Research Institute | Compositions of orthogonal glutamyl-tRNA and aminoacyl-tRNA synthetase pairs and uses thereof |
DE602004011789T2 (de) | 2003-07-07 | 2009-02-12 | The Scripps Research Institute, La Jolla | Zusammensetzungen der orthogonalen Lysyl-tRNA und Aminoacyl-tRNA Synthetase Paaren und ihre Verwendungen |
EP1704242A4 (en) | 2003-07-07 | 2008-06-18 | Scripps Research Inst | COMPOSITIONS WITH PAIRS OF ORTHOGONAL LEUCYL-TRNA AND AMINOACYL-TRNA-SYNTHETASE AND USES THEREOF |
EP1687401B1 (en) | 2003-10-14 | 2012-11-21 | The Scripps Research Institute | Site-specific incorporation of redox active amino acids into proteins |
WO2006001832A2 (en) | 2003-12-18 | 2006-01-05 | The Scripps Research Institute | Selective incorporation of 5-hyroxytryptophan into proteins in mammalian cells |
MXPA06013586A (es) | 2004-05-25 | 2007-11-09 | Scripss Res Inst | Incorporacion especifica del sitio de aminoacidos no naturales que contienen atomos pesados en proteinas para la determinacion de la estructura cristalina. |
EP1797177A4 (en) | 2004-09-21 | 2008-07-09 | Scripps Research Inst | ADDITION OF PHOTOREGULATED AMINO ACIDS TO THE GENETIC CODE |
JP2008513039A (ja) | 2004-09-21 | 2008-05-01 | ザ スクリップス リサーチ インスティテュート | 真正細菌の蛋白質へのアルキニルアミノ酸のインビボ組込み |
JP2008513806A (ja) | 2004-09-22 | 2008-05-01 | ザ スクリップス リサーチ インスティテュート | Nmr試験のための蛋白質の部位特異的標識 |
WO2006045116A2 (en) | 2004-10-20 | 2006-04-27 | The Scripps Research Institute | In vivo site-specific incorporation of n-acetyl-galactosamine amino acids in eubacteria |
CA2594557C (en) | 2004-12-22 | 2016-04-26 | Ambrx, Inc. | Modified human growth hormone |
CA3005835C (en) | 2004-12-22 | 2023-01-31 | Ambrx, Inc. | Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides |
US7619128B2 (en) * | 2005-03-25 | 2009-11-17 | Exxonmobil Chemical Patents Inc. | Stabilizing catalyst activity during catalyst regeneration |
BRPI0617191A2 (pt) | 2005-10-12 | 2011-07-19 | Scripps Research Inst | modificação pós-traducional de polipeptìdeos expressos em fagos |
EP2465870A1 (en) | 2005-11-07 | 2012-06-20 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences |
ES2388932T3 (es) | 2005-12-02 | 2012-10-19 | Genentech, Inc. | Polipéptidos de unión y usos de los mismos |
WO2007103490A2 (en) | 2006-03-09 | 2007-09-13 | The Scripps Research Institute | System for the expression of orthogonal translation components in eubacterial host cells |
CN101405401B (zh) | 2006-03-16 | 2013-03-27 | 斯克利普斯研究院 | 含非天然氨基酸苯基硒代半胱氨酸的蛋白质的遗传编程表达 |
EA200870555A1 (ru) | 2006-05-19 | 2009-04-28 | Тева Фармасьютикал Индастриз, Лтд. | Слитые белки, их применение и способы их получения |
US8715958B2 (en) | 2006-06-29 | 2014-05-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Cell-free synthesis of proteins containing unnatural amino acids |
NZ580686A (en) | 2007-05-02 | 2012-11-30 | Ambrx Inc | Modified interferon beta polypeptides and their uses |
US8647840B2 (en) | 2007-12-11 | 2014-02-11 | The Scripps Research Institute | In vivo unnatural amino acid expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris |
JP5959201B2 (ja) | 2008-12-10 | 2016-08-02 | ザ スクリプス リサーチ インスティテュート | 化学的に反応性の非天然アミノ酸を使用するキャリア−ペプチド接合体の製造 |
-
2008
- 2008-12-10 US US12/734,995 patent/US8647840B2/en active Active
- 2008-12-10 BR BRPI0819929-9A2A patent/BRPI0819929A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-12-10 RU RU2010125104/10A patent/RU2010125104A/ru not_active Application Discontinuation
- 2008-12-10 AU AU2008335778A patent/AU2008335778B2/en not_active Ceased
- 2008-12-10 CN CN2008801266965A patent/CN101939410A/zh active Pending
- 2008-12-10 EP EP08860799A patent/EP2231856A4/en not_active Ceased
- 2008-12-10 CA CA2708760A patent/CA2708760A1/en not_active Abandoned
- 2008-12-10 WO PCT/US2008/013568 patent/WO2009075847A2/en active Application Filing
- 2008-12-10 EP EP14194373.8A patent/EP2889370A1/en not_active Withdrawn
- 2008-12-10 KR KR1020107015262A patent/KR20100105846A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-12-10 JP JP2010537955A patent/JP2011527886A/ja active Pending
- 2008-12-10 CN CN201610056340.5A patent/CN105647824A/zh active Pending
-
2010
- 2010-06-10 IL IL206300A patent/IL206300A/en not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-09-02 IL IL228238A patent/IL228238A/en not_active IP Right Cessation
- 2013-10-02 JP JP2013207554A patent/JP6073205B2/ja active Active
-
2014
- 2014-01-27 US US14/165,199 patent/US9732349B2/en active Active
-
2016
- 2016-04-15 JP JP2016082136A patent/JP2016144469A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7045337B2 (en) * | 2001-04-19 | 2006-05-16 | The Scripps Research Institute | In vivo incorporation of unnatural amino acids |
WO2006068802A2 (en) * | 2004-12-22 | 2006-06-29 | Ambrx, Inc. | COMPOSITIONS OF AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE AND USES THEREOF |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108473542A (zh) * | 2015-10-26 | 2018-08-31 | 科学与工业研究委员会 | 遗传修饰的酵母细胞和改进的用于生产凝块特异性链激酶的方法 |
CN108473542B (zh) * | 2015-10-26 | 2023-05-09 | 科学与工业研究委员会 | 遗传修饰的酵母细胞和改进的用于生产凝块特异性链激酶的方法 |
CN112940956A (zh) * | 2021-04-18 | 2021-06-11 | 江南大学 | 采用双启动子增强乳铁蛋白表达的毕赤酵母及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2231856A2 (en) | 2010-09-29 |
IL206300A0 (en) | 2010-12-30 |
WO2009075847A3 (en) | 2009-09-11 |
RU2010125104A (ru) | 2012-01-20 |
JP6073205B2 (ja) | 2017-02-01 |
EP2231856A4 (en) | 2011-05-18 |
AU2008335778B2 (en) | 2014-04-10 |
CA2708760A1 (en) | 2009-06-18 |
EP2889370A1 (en) | 2015-07-01 |
IL206300A (en) | 2014-07-31 |
JP2014039554A (ja) | 2014-03-06 |
US20110014650A1 (en) | 2011-01-20 |
AU2008335778A1 (en) | 2009-06-18 |
JP2016144469A (ja) | 2016-08-12 |
WO2009075847A2 (en) | 2009-06-18 |
IL228238A (en) | 2014-09-30 |
US20140287464A1 (en) | 2014-09-25 |
CN101939410A (zh) | 2011-01-05 |
US9732349B2 (en) | 2017-08-15 |
KR20100105846A (ko) | 2010-09-30 |
BRPI0819929A2 (pt) | 2014-10-14 |
US8647840B2 (en) | 2014-02-11 |
JP2011527886A (ja) | 2011-11-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105647824A (zh) | 甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达 | |
CN102307905B (zh) | 利用化学反应性非天然氨基酸产生载体-肽偶联物 | |
Graumann et al. | Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems | |
CN101535338A (zh) | 在哺乳动物细胞中将非天然氨基酸遗传掺入蛋白质 | |
EP3663319A1 (en) | Preparation method for novel fusion protein and use of fusion protein for improving protein synthesis | |
US20090197339A1 (en) | In vivo unnatural amino acid expression in the methylotrophic yeast pichia pastoris | |
US10174304B2 (en) | Expression vector and method for producing protein | |
EP3730621A1 (en) | Tandem dna element capable of enhancing protein synthesis efficiency | |
JP7239205B2 (ja) | 新規宿主細胞及びそれを用いた目的タンパク質の製造方法 | |
AU2014200726A1 (en) | In vivo unnatural amino acid expression in the methylotrophic yeast pichia pastoris | |
RU2315105C1 (ru) | ШТАММ ДРОЖЖЕЙ PICHIA PASTORIS PS107(pPIC9HAbIL-2), ЯВЛЯЮЩИЙСЯ ПРОДУЦЕНТОМ ГИБРИДНОГО БЕЛКА, СОСТОЯЩЕГО ИЗ АЛЬБУМИНА ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pPIC9HAbIL-2 И СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ | |
WO2024051855A1 (zh) | 一种核酸构建物以及在ivtt体系中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160608 |