JP2016144469A - メタノール資化性酵母ピキア・パストリスにおけるインビボ非天然アミノ酸発現 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】)非天然アミノ酸と;b)メタノール資化性酵母細胞において直交tRNA(O−tRNA)を前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)と;c)セレクターコドンを認識し、メタノール資化性酵母細胞においてO−RSにより前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される直交tRNA(O−tRNA)を含むメタノール資化性酵母細胞。
【選択図】図6
Description
本願は米国仮出願第61/007,341号、発明の名称「メタノール資化性酵母ピキア・パストリスにおけるインビボ非天然アミノ酸発現(IN VIVO UNNATURAL AMINO ACID EXPRESSION IN THE METHYLOTROPHIC YEAST PICHIA PASTORIS)」、発明者Travis Youngら、出願日2007年12月11日の優先権と特典を主張し、その開示内容全体を全目的で本明細書に援用する。
本発明は米国エネルギー省、材料科学部からの助成番号DE−FG03−00ER46051として米国政府助成下に創出された。米国政府は本発明に所定の権利を有する。
本発明は蛋白質化学、例えば翻訳生化学の分野に関する。本発明は非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドをピキア・パストリス(Pichia pastoris)等のメタノール資化性酵母で生産するための組成物と方法に関する。
更に、メタノール資化性酵母で合成される蛋白質は発熱性及び抗原性化合物を含まない。
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定生物系に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの記載を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形の不定冠詞及び定冠詞はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)」と言う場合には、場合により2個以上のRS分子の組合せを含み、「核酸」又は「細胞」と言う場合には、場合により実際問題として核酸の多数のコピー又は多数の細胞を含む。
直交分子は細胞内に機能的に正常な相補的内在分子をもたない。例えば、細胞中の直交tRNAがこの細胞の任意内在RSによりアミノアシル化される効率は内在tRNAが内在RSによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。別の例では、直交RSが該当細胞の任意内在tRNAをアミノアシル化する効率は内在tRNAが内在RSによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。第1の直交分子と共働する第2の直交分子を細胞に導入することができる。例えば、直交tRNA/RS対は対照(例えば対応するtRNA/RS内在対、又は活性直交対)の効率に比較して所定の効率(例えば45%の効率、50%の効率、60%の効率、70%の効率、75%の効率、80%の効率、90%の効率、95%の効率、又は99%以上の効率)で細胞において共働する導入相補成分を含む。
例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のO−tRNAを含むプラスミドと共に誘導体化lacZプラスミド(構築物はlacZ核酸配列中にセレクターコドンを有する)を適当な生物(例えば直交成分を使用することができる生物)に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも(ポリペプチド又は発現時にコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして)導入することができる。細胞を培地で所望密度(例えばOD600=約0.5)まで増殖させ、例えばBetaFluor(登録商標)β−ガラクトシダーゼアッセイキット(Novagen)を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照(例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンを有する誘導体化lacZ構築物から観測される値)に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
P. pastoris等のメタノール資化性酵母は非常に高い細胞密度まで増殖することができ、理想的な条件下では細胞懸濁液がペーストのコンシステンシーになる点まで増殖することができる。その特徴的な増殖速度により、組換えP. pastoris株は異種蛋白質(例えばUAAを組込んだ蛋白質)を高レベル(例えば出芽酵母の10〜100倍のレベル)で生産することができる。メタノール資化性酵母(例えばP. pastoris)は遺伝子操作が容易であり、組換え蛋白質生産が経済的であり、一般に真核蛋白質に付随する翻訳後修飾を実施できるため、UAAを組込んだ異種蛋白質の発現に有利なシステムである。
非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質をメタノール資化性酵母で合成するための新規組成物及び方法の理解は直交tRNAと直交アミノアシルtRNAシンテターゼの対に付随する活性を理解することにより更に深められる。これらのポリペプチドへの非天然アミノ酸の組込みは所望非天然アミノ酸を認識し、セレクターコドン(例えば、アンバーナンセンスコドンTAG)に応答して蛋白質に組込むように直交tRNA(O−tRNA)と直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)を適応させることにより実施される。これらの直交成分は宿主細胞(例えばP. pastoris細胞)の翻訳機構の内在成分又は天然アミノ酸と交差反応しない。本明細書に記載する1例で使用される直交成分としては、O−RS(例えば大腸菌チロシルtRNAシンテターゼから誘導されるO−RS)と、宿主細胞(例えばP. pastoris)で直交対として機能するO−tRNA(例えば突然変異体チロシルtRNACUAアンバーサプレッサー)が挙げられる。
4種類の公知メタノール資化性酵母属(例えばHansenula,Pichia,Candida,及びTorulopsis)は代謝経路が共通であるため、メタノールを単独炭素源として利用することができる。メタノール誘導に転写調節応答し、酵素のいくつかは迅速に高レベルで合成される。これらの遺伝子の発現を制御するプロモーターは最強で最も厳密に調節される酵母プロモーターであるため、メタノール資化性酵母は組換え蛋白質の大規模生産用宿主として非常に魅力的になっている。これらのメタノール資化性酵母の細胞は迅速に高密度まで増殖させることができ、培地の単純な操作により産物発現レベルを調節することができる。これまでにP. pastoris、P. methanolica、P. angusta(別称Hansenula polymorpha)及びCandida boidiniiで発現システムが開発されており、これらのシステムは例えばHouard, et al. (2002) "Engineering of non-conventional yeasts for efficient synthesis of macromolecules: the methylotrophic genera." Biochimie 84:1089-1093; Gellison (2002) Hansenula Polymorpha: Biology and Applications, 1st Ed., Wiley-VCH, NY;米国特許第6,645,739号、Gellisen (2000) "Heterologous protein production in methylotrophic yeasts." Applied Microbiology and Biotechnology 54:741-750に更に詳述されている。これらのシステムの多くは市販されており、例えば学術及び産業研究室用としてArtes BiotecnologyからHansenulaキット、InvitrogenからPichiaキットが市販されている。
従って、組換え蛋白質を培地に加えると、蛋白質精製の第1段階として機能することができ、苛酷な酵母溶解プロトコルに従う必要がなくなり、内在P. pastoris蛋白質による組換え蛋白質の汚染の可能性が避けられる。他方、蛋白質安定性及びフォールディング要件により、培地への異種蛋白質の分泌は一般にその天然宿主により通常分泌される蛋白質のみに限定される。しかし、既製発現カセットにより実施者が培地への分泌を可能にするようにその天然分泌シグナル、出芽酵母α因子プレプロペブチド、又はP. pastoris酸性ホスファターゼ(PHO1)シグナルをコードする配列とインフレームで該当遺伝子をクローニングできるキットが入手可能であり、例えばオリジナルピキア発現キット(Invitrogen)、マルチコピーピキア発現キット(Invitrogen)、ピキア蛋白質発現システム(Research Corporation Technologies)が挙げられる。P. pastorisから細胞内組換え蛋白質を回収する技術は多数のものが開発されている(Shepard, et al. (2002) "Recovery of intracellular recombinant proteins from the yeast Pichia pastoris by cell permeabilization." J Biotechnology 99:149-160;米国特許第6,821,752号)。
種々の蛋白質精製法が当分野で周知であり、メタノール資化性酵母で発現されるUAAを組込んだ蛋白質の精製分析に適用することができる。これらの技術及びポリペプチド分析に必要な他の技術としては、R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology Vol.182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990); Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag, et al. (1996) Protein Methods,2nd Edition Wiley-Liss, NY; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ; Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal Protein Purification Methods:A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification:Principles,High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY;及びWalker (1998) Protein Protocols CD-ROM版 Humana Press, NJ;とその引用文献に記載されているものが挙げられる。
該当遺伝子を高度に誘導性のメタノール資化性酵母プロモーターの制御下に置く核酸構築物を構築するためには大腸菌での複製に適したシャトルベクターが一般に使用される。
メタノール資化性酵母ではプラスミドが比較的不安定であるため、通常では発現構築物を直鎖化し、例えばPichia細胞、Hansenula細胞、Candida細胞、又はTorulopsis細胞に形質転換し、ゲノムに組込む。組込みは一般に部位特異的であるが、Hansenula polymorphaでは高頻度の不均一組込みが認められている(Agaphonov, et al. (2005) "Defect of vacuolar protein sorting stimulates proteolytic processing of human urokinase-type plasminogen activator in the yeast Hansenula polymorpha." FEMS Yeast Reseach 5:1029-1035)。メタノール資化性酵母の一般分子操作(例えば形質転換、遺伝子ターゲティング、機能的相補によるクローニング、入手可能な選択マーカーの使用等)に関するその他の詳細は例えばPeberdy, Ed. (1991) Applied Molecular Genetics of Fungi. Cambridge University Press, UK; Hansenula Polymorpha: Biology and Applications, 1st Ed., Wiley-VCH; Higgins and Cregg. Pichia Protocols (Methods in Molecular Biology), 1st Ed. Humana Press: New Jersey (1998) とその引用文献に記載されている。
例えば「メタノール資化性酵母における株構築方法及びストラテジー」の欄で上述したように該当遺伝子を発現構築物にクローニングするために核酸を単離、クローニング、及び増幅する手順は文献に詳細に記載されており、例えば該当遺伝子を提供し、メタノール資化性酵母(例えばP. pastoris)で発現させるために本発明で使用することができる。これらの技術の更に詳細はBerger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook, et al. Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2000 ("Sambrook"); The Nucleic Acid Protocols Handbook Ralph Rapley (ed) (2000) Cold Spring Harbor, Humana Press Inc. (Rapley); Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel, et al. eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (2007年補遺版) ("Ausubel"); PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(Innis, et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Chen, et al. (ed) PCR Cloning Protocols, Second Edition (Methods in Molecular Biology, volume 192) Humana Press; in Viljoen, et al. (2005) Molecular Diagnostic PCR Handbook Springer;及びDemidov and Broude (eds) (2005) DNA Amplification: Current Technologies and Applications. Horizon Bioscience, Wymondham, UKに記載されている。例えばその後の核酸単離のための例えば細胞単離及び培養に関する他の有用な参考文献としては、Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New Yorkとその引用文献; Payne, et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)及びAtlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton,FLが挙げられる。
本発明はメタノール資化性酵母(例えばP. pastoris)により合成された蛋白質に非天然アミノ酸を組込むための組成物と方法を提供する。本発明は生物学的性質を強化し、毒性を低減し、及び/又は半減期を延長した治療用蛋白質の開発及び大規模生産に特に有用であると思われる。本明細書に記載する方法と組成物を使用することにより最も有益に発現されるこのような治療用、診断用、及び他のポリペプチドの例としては限定されないが、HSA、ヒト中性エンドペプチダーゼ(NEP)、抗体、Fab、Fv、α1アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、C−X−Cケモカイン、T39765、NAP−2、ENA−78、gro−a、gro−b、gro−c、IP−10、GCP−2、NAP−4、SDF−1、PF4、MIG、カルシトニン、cキットリガンド、サイトカイン、CCケモカイン、単球化学誘引蛋白質−1、単球化学誘引蛋白質−2、単球化学誘引蛋白質−3、単球炎症性蛋白質−1α、単球炎症性蛋白質−1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40リガンド、cキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子(CSF)、補体因子5a、補体阻害剤、補体受容体1、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−78、GROα、MGSA、GROβ、GROγ、MIP1−α、MIP1−β、MCP−1、ヒト表皮増殖因子(hEGF)、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン(EPO)、剥離毒素、第IX因子、第VII因子、第VIII因子、第X因子、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、FGF21、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、G−CSF、GM−CSF、ヒトグルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン変異体、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグ蛋白質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子(HGF)、ヒルジン、ヒト血清アルブミン(HSA)、ICAM−1、ICAM−1受容体、LFA−1、LFA−1受容体、ヒトインスリン、ヒトインスリン様増殖因子(hIGF)、hIGF−I、hIGF−II、ヒトインターフェロン、IFN−α、IFN−β、IFN−γ、インターロイキン、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子(NIF)、ヒトオンコスタチンM(OSM)、骨形成蛋白質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、PD−ECSF、PDGF、ペプチドホルモン、ヒト成長ホルモン(hGH)、プレイオトロピン、プロテインA、プロテインG、発熱外毒素A、発熱外毒素B、発熱外毒素C、リラキシン、レニン、SCF/cキット、可溶性補体受容体I、可溶性I−CAM1、可溶性インターロイキン受容体、可溶性TNF受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα1、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子(TGF)、TGF−α、TGF−β、ヒト腫瘍壊死因子(hTNF)、ヒト腫瘍壊死因子α、ヒト腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)、VLA−4蛋白質、VCAM−1蛋白質、ヒト血管内皮増殖因子(hVEGEF)、hVEGF165、ウロキナーゼ、Mos、Ras、Raf、Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、LDL受容体、炎症性分子、シグナル伝達分子、転写アクチベーター、転写サプレッサー、ヒアルリン、CD44、コルチコステロン、ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ(hTPO)、破傷風毒素Cフラグメント、ウシ膵臓トリプシンインヒビター(BPTI)、ヒトアミロイド前駆体蛋白質(APP)、ヒトアンチトロンビンIII、BP320抗原、ヒトカスパーゼ3、B型肝炎表面抗原、ヒト性ステロイド結合蛋白質(hSBP)、ヒトエンドスタチン、又はgp120が挙げられる。
キットも本発明の特徴である。例えば、キットは非天然アミノ酸と本発明のメタノール資化性酵母細胞を含むことができる。細胞は場合によりそのゲノムに組込まれたO−tRNAをコードする核酸及び/又はO−RSをコードする核酸を含むことができ、例えばO−RSとO−tRNAは上記プロモーターのいずれかの転写制御下にある。キットは本発明の細胞を使用するためのコンポーネントを含むことができ、例えば、1個以上のセレクターコドンを含み、該当ポリペプチドをコードする核酸をメタノール資化性酵母細胞のゲノムに組込むための説明書が挙げられる。キットはキットコンポーネントを保持するための容器と、キットで提供される細胞を使用して本発明の任意方法を実施するための説明書、例えば選択位置に1個以上の非天然アミノ酸を組込んだ該当ポリペプチドを生産するための説明書を含むことができる。
非天然アミノ酸(UAA)をポリペプチドに組込むには、遺伝的にコードされる直交tRNACUA(OtRNA)/直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)対の進化により、蛋白質を構成する20種類の天然αアミノ酸の現在のレパートリーに「21番目のアミノ酸」を追加する必要がある。M. jannaschii tyrRSの特異性をチロシンから大腸菌発現システムでO−RSとして使用するための該当非天然アミノ酸に変更するために指向的進化を利用する。同様に、大腸菌tyrRS又はleuRSの特異性を夫々チロシン又はロイシンから出芽酵母発現システムでO−RSとして使用するための該当非天然アミノ酸に変更することができる。突然変異体ライブラリーの半合理的設計により、30種類を上回るアミノアシルtRNAシンテターゼを出芽酵母と大腸菌でその対応する非天然アミノ酸について進化させることに成功している(Xie, et al. (2005) "An expanding genetic code." Methods 36:227-38; Xie, et al. (2006) "A chemical toolkit for proteins:an expanded genetic code." Nat Rev Mol Cell Biol 7:775-82)。このインビボ部位特異的手法により、化学的tRNAアミノアシル化又は固相合成の効率を越えるレベルで新規化学官能基の蛋白質組込みが可能になった。今日までに、ユニークな化学反応基としては、光解離性基、グリコシル化アミノ酸、光架橋基、ケトン官能基、金属キレート基、及びIRプローブが検討されている(Xie, et al. (2005) "An expanding genetic code." Methods 36:227-38; Wang, et al. (2006) "Expanding the genetic code." Annu Rev Biophys Biomolec Struct 35:225-249)。本研究ではユニークなケトン残基であるp−アセチルフェニルアラニンと、アジド残基であるp−アジドフェニルアラニンに着目する(Zhang, et al. (2003) "A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo." Biochemistry 42:6735-46)。これらの残基を蛋白質に組込むと、例えばオキシム又はヒドラジドライゲーションにより小分子、ペプチド、又はポリエチレングリコール(PEG)の部位特異的結合が可能になる。
非天然アミノ酸を組込んだ多数の組換え発現蛋白質をこのような大腸菌及び出芽酵母発現システムで生産することができるが、これらのシステムは硫酸化蛋白質、グリコシル化蛋白質、又は複雑なジスルフィド架橋を含む蛋白質(例えばヒト血清アルブミン(HSA)やヒト中性エンドペプチダーゼないしネプリライシン(NEP))を合成することができない。HSAとNEPはいずれも複雑なジスルフィド結合を含み、生物学的に活性なNEPの産生にはグリコシル化が必要であるため、大腸菌又は出芽酵母でこれらの蛋白質を高収率で発現させることはできない。
進化型UAAシンテターゼを出芽酵母からP. pastorisに移すと、非天然アミノ酸を組込んだ機能的哺乳動物蛋白質(例えばHSAやNEP)の発現を強化することができる。
PBS(pH=7.6)13ml〜15.5mlで溶出した画分はHSAを含有していることが判明したので、濃縮し、C8逆相HPLCカラムで精製した。水中40−46%アセトニトリル,0.1%トリフルオロ酢酸の直線勾配を使用して画分を溶出させ、分取し、SDS PAGEでHSAの有無について分析した。水中42−45%アセトニトリル,0.1%トリフルオロ酢酸でC8カラムから溶出した画分はHSAを含有していることが判明した。
非天然アミノ酸による蛋白質突然変異誘発の有用性を増すために、メタノール資化性酵母Pichia pastorisにおける組換え発現システムを開発した。8種類の非天然アミノ酸に特異的なアミノアシルtRNAシンテターゼ/サプレッサーtRNA(aaRS/tRNACUA)対を真核転写制御因子間に挿入し、P. pastorisゲノムに安定的に組込んだ。メタノール資化性酵母からの突然変異体蛋白質の収率は150mg l−1を上回り、出芽酵母で報告されている収率よりも一桁以上良好であった。更に、ケトアミノ酸(p−アセチルフェニルアラニン,図11,構造1)を組込んだヒト血清アルブミン突然変異体をこのシステムで効率的に発現させることができ、スロンボスポンジンペプチドミメティックと選択的に高収率で結合できることを示す。この手法によると、既存システムでは発現が実際的でない非天然アミノ酸との複合蛋白質を高収率で生産できると思われる。
2遺伝子カセット発現システムの設計。P. pastorisで自律的に複製するプラスミドは相対的に不安定である15ため、該当標的遺伝子とaaRS/tRNACUA対を2個の異なるプラスミドでカセット内にコードさせ、安定的にゲノムに組込んだシステムを考案した。二重栄養要求株GS200(arg4,his4)を蛋白質発現用宿主株として使用し、該当遺伝子を市販pPIC3.5kプラスミド(HIS4,GenR)に挿入した(図6a)16。短命な治療用ポリペプチドの血清半減期を延長する融合蛋白質又はペプチドバイオコンジュゲートを作製するのに有用であるため、rHSAをモデル蛋白質として使用した17−19。大腸菌と出芽酵母におけるrHSAの発現は蛋白質の複雑なジスルフィド架橋により実際的ではない。PCR突然変異誘発法によりGlu37TAG突然変異体rHSA(rHSAE37X)を作製し、AOX1プロモーター及びターミネーター下で発現させ、pPIC3.5k−rHSAE37Xを作製した。Glu37は溶媒接触可能な螺旋に含まれるので、この部位に導入した化学的に反応性の非天然アミノ酸(即ちp−アセチルフェニルアラニン,図11,構造1)とペプチドの結合を容易にし、比較的嵩高な基を組込んだ場合にも天然蛋白質構造及びフォールディングの妨害を最小にできると考えられる。HSAの24アミノ酸哺乳動物「プレプロ」リーダー配列(図6e)はP. pastorisにおける発現に完全に適合可能であり、培地への成熟蛋白質の放出を可能にする20。蛋白質発現の陽性対照として、野生型rHSA(rHSAWT)を使用して同様にpPIC3.5k−HSAWTを作製した。このプラスミドを5’AOX1プロモーターで直鎖化すると、カセットの1コピー以上のゲノム組込みが可能になり、一般にコピー数が多いほど標的蛋白質の総収率も高くなる21。このような組込みではAOX1遺伝子は無傷のままであり、酵母はメタノールを迅速に利用する能力(Mut+表現型)を維持する。あるいは、AOX1カセットのいずれかの側の直鎖化により遺伝子置換を実施し、AOX1遺伝子をpPIC3.5kベクターで置換することもできる16。AOX1をもたない酵母はメタノール利用に弱いほうのAOX2遺伝子に依存し、表現型はmutSである。rHSAの発現は一般にmutS酵母で実施される22ので、pPIC3.5k−HSAE37Xを直鎖化してAOX1遺伝子に代用し、GS200−rHSAE37X(HIS4,arg4,GenR,mutS)を得た。成功した形質転換体はヒスチジン不含最少培地プレートと、0.25mg ml−1までのアミノグリコシド抗生物質ゲネチシンを含有するリッチ培地プレートで正常に増殖した。
マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)質量分析法によりペプチドによるrHSAE37pApaの誘導体化の程度を確認した(図10b)。同一条件下でrHSAWT(残基37のグルタミン酸)をアミノオキシ修飾ABT−510ペプチドで処理した場合にはMALDI質量分析法により結合は観測されなかった。
この直交対に由来する非天然LeuRSを新規P. pastoris発現システムに適応させるために、pREAV−PFLD1プラスミドのtRNA領域を改変した。PPGK1の下流の既存のtRNATyr CUAカセットを切除し、先述したように、5’CCAをもたず、SUP4セグメントにより分離されたtRNALeu5 CUAの3個のタンデム反復配列に対応するコーディング領域で置換し、pREAVleu−PFLD1を作製した。4,5−ジメトキシ−2−ニトロベンジルセリン(DMNB−S,フォトケージドセリン,図11,構造8)37と2−アミノ−3−(5−(ジメチルアミノ)ナフタレン−1スルホンアミド)プロパン酸(ダンシルアラニン,ダンシルフルオロフォア,図11,構造9)38に特異的なLeuRS突然変異体をPFLD1の後方に挿入し、pREAVleu−PFLD1−LeuRS(図11d〜f)を作製した。Mut+ GS200−rHSAE37Xに形質転換後に、選択したクローンを使用し、対応する変異体HSAE37Xを発現させた(図11f)。DMNB−Sに特異的なLeuRS突然変異体はDMNB−Sのシステインアナログ(DMNB−C)を受容することが最近示されており、これらの発現実験では合成し易いことからこのアナログを使用している。コグネイトアミノ酸の不在下でも少量の全長蛋白質が産生されたが、トリプシン消化物のLC−MS/MSの結果、対応する非天然アミノ酸の存在下におけるシステムの高い忠実度が確認された(図18)。抑圧効率は3日間発現後にrHSAE37DMNB−CではrHSAWTの効率の約37%であり、rHSAE37dansylではrHSAWTの効率の23%であった。
出芽酵母で非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の発現を最適化しようとする従来の試みの結果、モデルシステムで8〜15mg l−1の最大収率が得られたが、これは本発明で開発されたP. pastorisシステムで実証された収率よりも一桁以上低い。Wang研究所の研究の結果、酵母におけるナンセンス変異依存mRNA分解(NMD)経路のノックダウンにより蛋白質発現を2倍まで増加できることが最近明らかになった39。tRNACUA転写を誘導するためにSNR52に由来するプロモーターの使用と組合せると、出芽酵母で従来産生された約15mg l−1という突然変異体蛋白質収率の300倍の収率に達することができた39。このように、NMD経路のUPF1遺伝子のノックダウンとSNR52−tRNACUAプロモーターシステムの使用を組合せると、P. pastorisにおける収率を更に増加することができる。更に、Kobayashi研究所における研究の結果、P. pastorisからのrHSAWTの収率は標準振盪フラスコよりも流加発酵で発現させた場合のほうが一桁以上良好(>10g l−1)であることが判明した10。
pPIC3.5k−rHSAの構築。rHSA遺伝子は哺乳動物遺伝子コレクション(NIH)遺伝子アクセションBC034023から入手した。pPIC3.5k直鎖化16に適合できるように、プライマー(IDT)として、BglII(781)にはBglII 1F,5’−GAC AGA CCT TAC CAA AGT CCA CAC GGA ATG CTG CCA TG−3’及びBglII 1R,5’−GGT AAG GTC TGT CAC TAA CTT GGA AAC TTC TGC AAA CTC AGC TTT GGG−3’を使用し、BglII(817)にはBglII 2F,5’−CAT GGA GAC CTG CTT GAA TGT GCT GAT GAC AGG GCG G−3’及びBglII 2R,5’−CAA GCA GGT CTC CAT GGC AGC ATT CCG TGT GGA C−3’を使用し、改変Quik Change突然変異誘発(Stratagene)プロトコル40によりrHSAからBglII部位を除去し、rHSAWTを作製した。改変Quik Changeプロトコルと、プライマーとしてGlu37 F’,5’−GAT TGC CTT TGC TCA GTA TCT TCA GCA GTG TCC ATT TTA GGA TCA T−3’及びGlu37 R’,5’−GTT TTT GCA AAT TCA GTT ACT TCA TTC ACT AAT TTT ACA TGA TCC TAA AAT GG−3’を使用して37番目のGlu残基をアンバーコドンTAGで置換し、rHSAE37Xを作製した。プライマーとしてHSAフォワード,5’−ATC CGA GGA TCC AAA CGA TGA AGT GGG TAA CCT TTA TTT CCC TTC TTT TTC−3及びHSAリバース,5’−GCT AAC GAA TTC ATT ATA AGC CTA AGG CAG CTT GAC TTG CAG C−3’を使用してrHSAWTとrHSAE37XrHSAWTを増幅し、EcoRIとBamHI(NEB)で消化し、同様に消化したpPIC3.5kベクター(Invitrogen,ベクターマップはhttp://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/ppic3.5kpao man.pdfで閲覧可能)にライゲーションし、pPIC3.5k−rHSAWT又はpPIC3.5k−rHSAE37Xを作製した。構築物をDNAシーケンシングにより確認し、大腸菌DH10B(Invitrogen)で増幅した。
L−アルギニン(arg)4mg ml−1を添加した再生デキストロースバクト寒天(RDB)プレート(15cm)に回収した細胞250μlを撒き、30℃でインキュベートした。3日後に、酵母ペプトンデキストロース(YPD)培地1mlを加えた96ウェル2mlブロック(Nunc)にコロニーを釣菌し、一晩増殖させた(29.2℃,300r.p.m.)。培養液を100倍に希釈し、ゲネチシン(Invitrogen)0.25ml−1を添加したYPD寒天プレートに1〜2μlレプリカを撒き、30℃でインキュベートした。4日後に、コロニーG3は良好な増殖を示したので、釣菌し、コンピテントにした。回収した細胞をL−ヒスチジン(his)とargを含まないRDBプレートに撒いた以外はコンピテントG3で上記プロトコルを使用して形質転換を実施し、GS200−rHSAE37X/pREAV−PAOX1−pApaRSとGS200−rHSAE37X/pREAV−PAOX1−pApaRS(HIS4,ARG4,GenR,mutS)を作製した。3日後に、96ウェル2mlブロックにコロニーを釣菌し、0.25mg ml−1ゲネチシンに対する耐性について上記のように再スクリーニングした。同様にGS200−rHSAWT/pREAV−PADH1−pApaRS(HIS4,ARG4,GenR,mutS)を作製し、コロニーF2を単離した。pREAV−PAOX1−pApaRSをGS200に形質転換させることによりGS200−pREAV−PAOX1−pApaRS(his4,ARG4,GenR,mutS)を作製したが、his4mg ml−1を添加したRDBプレートに撒き、ゲネチシン耐性についてそれ以上スクリーニングしなかった。
クローンK5は最大の蛋白質発現を示したため、試験発現でG3−2と比較した(図14)。Photoshop CS2(Adobe)を使用してバンド密度により蛋白質の相対量を測定した。
Photoshop CS2を使用してバンド密度により相対蛋白質収率を測定した。
図6:真核生物におけるアンバー抑圧用ベクターであり、マーカー(栗色)、複製起点(黒)、標的蛋白質(オレンジ色)、制御因子(緑色)、及びサプレッサーtRNA(「tRNA(CUA)」,淡青色)を示す。(a)P. pastorisへのインビボマルチコピー組込み及び発現用の市販pPIC3.5kシャトルベクター16のマップ。rHSAE37X(オレンジ色)をAOX1プロモーター及びターミネーター間にサブクローニングする。(b)PADH1制御下のpApaRS/tRNAtyr CUA対を保有する出芽酵母の最適化アンバー抑圧ベクター23。tRNACUA反復配列はSUP4遺伝子に由来する領域(図示せず)により分離され、PPGK1により誘導される。(c)pREAV−PADH1−pApaRSを作製するように2μ真核起点とTRPマーカーをARG4で置換した改変型pPR1−PPGK1+3SUP4−tRNAプラスミド。(d)PADH1とTADH1をAOX1に対応するもので置換し、pREAV−PAOX1−pApaRSを作製した。(e)rHSAE37Xの最初から61個のアミノ酸。プレプロリーダーペプチド(青,緑)は培地へのrHSAE37Xの放出を可能にし、輸送中に開裂され、アスパラギン酸から開始する成熟蛋白質(rHSA,オレンジ色)を生じる。成熟rHSAの37番目の残基(X,赤)はアンバーコドンに応答して組込まれた非天然アミノ酸を表す。
rHSAWTバンドの密度(2×レーン7及びレーン8)は平均で83.33又は351.55mg ml−1であった。同一rHSAWTサンプルの百分率として非天然蛋白質(他の図ではrHSAE37X)の収率を求めた。
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Claims (61)
- a)非天然アミノ酸と;
b)メタノール資化性酵母細胞において直交tRNA(O−tRNA)を前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)と;
c)セレクターコドンを認識し、メタノール資化性酵母細胞においてO−RSにより前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される直交tRNA(O−tRNA)
を含むメタノール資化性酵母細胞。 - 非天然アミノ酸がp−(プロパルギルオキシ)フェニルアラニン、p−メトキシフェニルアラニン、ダンシルアラニン、DMNB−セリン、O−メチル−L−チロシン、L−3−(2−ナフチル)アラニン、O−4−アリル−L−チロシン、O−プロパルギル−L−チロシン、L−Dopa、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−L−フェニルアラニン、p−アジド−L−フェニルアラニン、p−アシル−L−フェニルアラニン、p−ベンゾイル−L−フェニルアラニン、L−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、p−ヨードフェニルアラニン、p−ブロモフェニルアラニン、p−アミノ−L−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体;グルタミンアミノ酸の非天然類似体;フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体;セリンアミノ酸の非天然類似体;スレオニンアミノ酸の非天然類似体;アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、スルホ、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、アルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノで置換されたアミノ酸、又はその任意組み合わせ;光活性化可能な架橋基を有するアミノ酸;スピン標識アミノ酸;蛍光アミノ酸;新規官能基を有するアミノ酸;別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸;金属結合性アミノ酸;金属含有アミノ酸;放射性アミノ酸;フォトケージド及び/又は光異性化可能なアミノ酸;ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸;グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸;ケト含有アミノ酸;ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸;重原子置換アミノ酸;化学分解性又は光分解性アミノ酸;延長側鎖を有するアミノ酸;毒性基を含むアミノ酸;糖置換アミノ酸(例えば糖置換セリン等);炭素結合糖含有アミノ酸;糖置換システイン;酸化還元活性アミノ酸;α−ヒドロキシ含有酸;アミノチオ酸;α,αジ置換アミノ酸;βアミノ酸;スルホチロシン、4−ボロノフェニルアラニン、又はプロリン以外の環状アミノ酸を含む請求項1に記載の細胞。
- O−RSが核酸から発現され、前記核酸がゲノムに組込まれた前記O−RSをコードするポリヌクレオチドを含む請求項1に記載の細胞。
- 核酸がARG4遺伝子、ADE1遺伝子、HIS4遺伝子、URA3遺伝子、AOX1遺伝子、AOX2遺伝子、又はMET2遺伝子をコードする遺伝子座でゲノムに組込まれている請求項3に記載の細胞。
- O−RSが誘導的プロモーターから発現される請求項1に記載の細胞。
- 誘導的プロモーターがAOX1プロモーター、AOX2プロモーター、ICL1プロモーター、又はFLD1プロモーターを含む請求項5に記載の細胞。
- O−RSが構成的プロモーターから発現される請求項1に記載の細胞。
- 構成的プロモーターがYPT1プロモーター又はGAPプロモーターである請求項7に記載の細胞。
- O−tRNAが核酸から発現され、前記核酸がゲノムに組込まれた前記O−tRNAをコードするか又は含むポリヌクレオチドを含む請求項1に記載の細胞。
- 核酸がARG4遺伝子、ADE1遺伝子、HIS4遺伝子、URA3遺伝子、AOX1遺伝子、AOX2遺伝子、又はMET2遺伝子をコードする遺伝子座でゲノムに組込まれている請求項9に記載の細胞。
- O−tRNAが高レベル構成的プロモーターから発現される請求項1に記載の細胞。
- プロモーターがPGK1プロモーターを含む請求項9に記載の細胞。
- O−RSとO−tRNAが非真核生物に由来する請求項1に記載の細胞。
- O−RSとO−tRNAが大腸菌に由来する請求項13に記載の細胞。
- 該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、前記ポリヌクレオチドがO−tRNAにより認識されるセレクターコドンを含む請求項1に記載の細胞。
- 該当ポリペプチドがHSA、ヒト中性エンドペプチダーゼ(NEP)、抗体、Fab、Fv、α1アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、C−X−Cケモカイン、T39765、NAP−2、ENA−78、gro−a、gro−b、gro−c、IP−10、GCP−2、NAP−4、SDF−1、PF4、MIG、カルシトニン、cキットリガンド、サイトカイン、CCケモカイン、単球化学誘引蛋白質−1、単球化学誘引蛋白質−2、単球化学誘引蛋白質−3、単球炎症性蛋白質−1α、単球炎症性蛋白質−1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40リガンド、cキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子(CSF)、補体因子5a、補体阻害剤、補体受容体1、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−78、GROα、MGSA、GROβ、GROγ、MIP1−α、MIP1−β、MCP−1、ヒト表皮増殖因子(hEGF)、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン(EPO)、剥離毒素、第IX因子、第VII因子、第VIII因子、第X因子、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、FGF21、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、G−CSF、GM−CSF、ヒトグルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン変異体、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグ蛋白質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子(HGF)、ヒルジン、ヒト血清アルブミン(HSA)、ICAM−1、ICAM−1受容体、LFA−1、LFA−1受容体、ヒトインスリン、ヒトインスリン様増殖因子(hIGF)、hIGF−I、hIGF−II、ヒトインターフェロン、IFN−α、IFN−β、IFN−γ、インターロイキン、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子(NIF)、ヒトオンコスタチンM(OSM)、骨形成蛋白質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、PD−ECSF、PDGF、ペプチドホルモン、ヒト成長ホルモン(hGH)、プレイオトロピン、プロテインA、プロテインG、発熱外毒素A、発熱外毒素B、発熱外毒素C、リラキシン、レニン、SCF/cキット、可溶性補体受容体I、可溶性I−CAM1、可溶性インターロイキン受容体、可溶性TNF受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα1、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子(TGF)、TGF−α、TGF−β、ヒト腫瘍壊死因子(hTNF)、ヒト腫瘍壊死因子α、ヒト腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)、VLA−4蛋白質、VCAM−1蛋白質、ヒト血管内皮増殖因子(hVEGEF)、hVEGF165、ウロキナーゼ、Mos、Ras、Raf、Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、LDL受容体、炎症性分子、シグナル伝達分子、転写アクチベーター、転写サプレッサー、ヒアルリン、CD44、コルチコステロン、ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ(hTPO)、破傷風毒素Cフラグメント、ウシ膵臓トリプシンインヒビター(BPTI)、ヒトアミロイド前駆体蛋白質(APP)、ヒトアンチトロンビンIII、BP320抗原、ヒトカスパーゼ3、B型肝炎表面抗原、ヒト性ステロイド結合蛋白質(hSBP)、ヒトエンドスタチン、又はgp120を含む請求項15に記載の細胞。
- 核酸がゲノムに組込まれている請求項15に記載の細胞。
- 核酸がシングルコピーとしてゲノムに組込まれている請求項17に記載の細胞。
- 組込みが非必須遺伝子をコードする遺伝子座で遺伝子置換により行われる請求項17に記載の細胞。
- 非必須遺伝子がAOX1である請求項19に記載の細胞。
- 細胞がメタノール利用表現型を示し、メタノール利用表現型がmutSである請求項20に記載の細胞。
- 核酸がマルチコピーとしてゲノムに組込まれている請求項17に記載の細胞。
- 細胞がメタノール利用表現型を示し、メタノール利用表現型がMut+である請求項17に記載の細胞。
- 該当ポリペプチドが誘導的プロモーターから発現される請求項15に記載の細胞。
- 誘導的プロモーターがAOX1プロモーター、AOX2プロモーター、ICL1プロモーター、又はFLD1プロモーターを含む請求項24に記載の細胞。
- 該当ポリペプチドが構成的プロモーターから発現される請求項15に記載の細胞。
- 構成的プロモーターがYPT1プロモーター又はGAPプロモーターである請求項26に記載の細胞。
- メタノール資化性酵母細胞がCandida細胞、Hansenula細胞、Pichia細胞、又はTorulopsis細胞である請求項1に記載の細胞。
- メタノール資化性酵母細胞がPichia pastoris細胞である請求項1に記載の細胞。
- 選択位置に非天然アミノ酸を組込んだ該当ポリペプチドをメタノール資化性酵母細胞で生産する方法であって、
a)i)非天然アミノ酸と;
ii)メタノール資化性酵母細胞において直交tRNA(O−tRNA)を前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルtRNAシンテターゼ(O−RS)と;
iii)O−RSにより前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される直交tRNA(O−tRNA)と;
iv)該当ポリペプチドをコードし、O−tRNAにより認識される少なくとも1個のセレクターコドンを含む該当核酸
を含むメタノール資化性酵母細胞を準備する段階と;
b)セレクターコドンに応答して該当ポリペプチドの翻訳中に該当核酸の選択位置に非天然アミノ酸を組込むことにより、選択位置に非天然アミノ酸を組込んだ該当ポリペプチドを生産する段階を含む前記方法。 - 非天然アミノ酸を準備する段階が、p−(プロパルギルオキシ)フェニルアラニン、p−メトキシフェニルアラニン、ダンシルアラニン、DMNB−セリン、O−メチル−L−チロシン、L−3−(2−ナフチル)アラニン、O−4−アリル−L−チロシン、O−プロパルギル−L−チロシン、L−Dopa、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−L−フェニルアラニン、p−アジド−L−フェニルアラニン、p−アシル−L−フェニルアラニン、p−ベンゾイル−L−フェニルアラニン、L−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、p−ヨードフェニルアラニン、p−ブロモフェニルアラニン、p−アミノ−L−フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の非天然類似体;グルタミンアミノ酸の非天然類似体;フェニルアラニンアミノ酸の非天然類似体;セリンアミノ酸の非天然類似体;スレオニンアミノ酸の非天然類似体;アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、スルホ、セレノ、エステル、チオ酸、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、アルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ケト、もしくはアミノで置換されたアミノ酸、又はその任意組み合わせ;光活性化可能な架橋基を有するアミノ酸;スピン標識アミノ酸;蛍光アミノ酸;新規官能基を有するアミノ酸;別の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸;金属結合性アミノ酸;金属含有アミノ酸;放射性アミノ酸;フォトケージド及び/又は光異性化可能なアミノ酸;ビオチン又はビオチン類似体含有アミノ酸;グリコシル化又は糖鎖修飾アミノ酸;ケト含有アミノ酸;ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸;重原子置換アミノ酸;化学分解性又は光分解性アミノ酸;延長側鎖を有するアミノ酸;毒性基を含むアミノ酸;糖置換アミノ酸(例えば糖置換セリン等);炭素結合糖含有アミノ酸;糖置換システイン;酸化還元活性アミノ酸;α−ヒドロキシ含有酸;アミノチオ酸含有アミノ酸;α,αジ置換アミノ酸;βアミノ酸;スルホチロシン、4−ボロノフェニルアラニン、又はプロリン以外の環状アミノ酸を準備する段階を含む請求項30に記載の方法。
- O−RSを準備する段階がプロモーターの下流でO−RSをコードするO−RSポリヌクレオチドを細胞のゲノムに組込む段階と、コードされるO−RSを発現させる段階を含む請求項26に記載の方法。
- ポリヌクレオチドを細胞のゲノムに組込む段階が、ARG4遺伝子、ADE1遺伝子、HIS4遺伝子、URA3遺伝子、AOX1遺伝子、AOX2遺伝子、又はMET2遺伝子をコードする遺伝子座にポリヌクレオチドを組込む段階を含む請求項32に記載の方法。
- O−RSを準備する段階が誘導的プロモーターからO−RSを発現させる段階を含む請求項32に記載の方法。
- 誘導的プロモーターがAOX1プロモーター、AOX2プロモーター、ICL1プロモーター、又はFLD1プロモーターを含む請求項35に記載の方法。
- O−RSを準備する段階が構成的プロモーターからO−RSを発現させる段階を含む請求項32に記載の方法。
- 構成的プロモーターがYPT1プロモーター又はGAPプロモーターである請求項36に記載の方法。
- 細胞がアンバーサプレッサーtRNA、オーカーサプレッサーtRNA、オパールサプレッサーtRNA、又は4塩基コドン、レアコドンもしくは非コーディングコドンを認識するtRNAであるO−tRNAを含み、前記O−tRNAが高レベル構成的プロモーターの転写制御下のO−tRNAポリヌクレオチドによりコードされ、前記O−tRNAポリヌクレオチドがゲノムに組込まれている請求項30に記載の方法。
- O−tRNAポリヌクレオチドを細胞のゲノムに組込む段階が、ARG4遺伝子、ADE1遺伝子、HIS4遺伝子、URA3遺伝子、AOX1遺伝子、AOX2遺伝子、又はMET2遺伝子をコードする遺伝子座に前記ポリヌクレオチドを組込む段階を含む請求項38に記載の方法。
- 高レベル構成的プロモーターがPGK1プロモーターを含む請求項38に記載の方法。
- ポリペプチドをコードする該当核酸を準備する段階が、HSA、ヒト中性エンドペプチダーゼ(NEP)、抗体、Fab、Fv、α1アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、C−X−Cケモカイン、T39765、NAP−2、ENA−78、gro−a、gro−b、gro−c、IP−10、GCP−2、NAP−4、SDF−1、PF4、MIG、カルシトニン、cキットリガンド、サイトカイン、CCケモカイン、単球化学誘引蛋白質−1、単球化学誘引蛋白質−2、単球化学誘引蛋白質−3、単球炎症性蛋白質−1α、単球炎症性蛋白質−1β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40リガンド、cキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子(CSF)、補体因子5a、補体阻害剤、補体受容体1、サイトカイン、上皮好中球活性化ペプチド−78、GROα、MGSA、GROβ、GROγ、MIP1−α、MIP1−β、MCP−1、ヒト表皮増殖因子(hEGF)、上皮好中球活性化ペプチド、エリスロポエチン(EPO)、剥離毒素、第IX因子、第VII因子、第VIII因子、第X因子、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、FGF21、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、G−CSF、GM−CSF、ヒトグルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン変異体、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグ蛋白質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子(HGF)、ヒルジン、ヒト血清アルブミン(HSA)、ICAM−1、ICAM−1受容体、LFA−1、LFA−1受容体、ヒトインスリン、ヒトインスリン様増殖因子(hIGF)、hIGF−I、hIGF−II、ヒトインターフェロン、IFN−α、IFN−β、IFN−γ、インターロイキン、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子(NIF)、ヒトオンコスタチンM(OSM)、骨形成蛋白質、腫瘍遺伝子産物、副甲状腺ホルモン、PD−ECSF、PDGF、ペプチドホルモン、ヒト成長ホルモン(hGH)、プレイオトロピン、プロテインA、プロテインG、発熱外毒素A、発熱外毒素B、発熱外毒素C、リラキシン、レニン、SCF/cキット、可溶性補体受容体I、可溶性I−CAM1、可溶性インターロイキン受容体、可溶性TNF受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンα1、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍増殖因子(TGF)、TGF−α、TGF−β、ヒト腫瘍壊死因子(hTNF)、ヒト腫瘍壊死因子α、ヒト腫瘍壊死因子β、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)、VLA−4蛋白質、VCAM−1蛋白質、ヒト血管内皮増殖因子(hVEGEF)、hVEGF165、ウロキナーゼ、Mos、Ras、Raf、Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、LDL受容体、炎症性分子、シグナル伝達分子、転写アクチベーター、転写サプレッサー、ヒアルリン、CD44、コルチコステロン、ヒト甲状腺ペルオキシダーゼ(hTPO)、破傷風毒素Cフラグメント、ウシ膵臓トリプシンインヒビター(BPTI)、ヒトアミロイド前駆体蛋白質(APP)、ヒトアンチトロンビンIII、BP320抗原、ヒトカスパーゼ3、B型肝炎表面抗原、ヒト性ステロイド結合蛋白質(hSBP)、ヒトエンドスタチン、又はgp120をコードする核酸を準備する段階を含む請求項30に記載の方法。
- 該当核酸を準備する段階がプロモーターの転写制御下の核酸を細胞のゲノムに組込む段階を含む請求項30に記載の方法。
- 核酸をゲノムに組込む段階が、核酸をシングルコピーとしてゲノムに組込む段階を含む請求項42に記載の方法。
- 核酸をゲノムに組込む段階が、AOX1遺伝子、ADE1遺伝子、HIS4遺伝子、URA3遺伝子、ARG4遺伝子、AOX2遺伝子、又はMET2遺伝子をコードする遺伝子座に核酸を組込む段階を含む請求項43に記載の方法。
- 核酸を準備する段階が、核酸をマルチコピーとしてゲノムに組込む段階を含む請求項42に記載の方法。
- 核酸をゲノムに組込む段階が、核酸をAOX1の遺伝子座5’に組込む段階を含む請求項45に記載の方法。
- プロモーターが誘導的プロモーターである請求項42に記載の方法。
- 誘導的プロモーターがAOX1プロモーター、AOX2プロモーター、ICL1プロモーター、又はFLD1プロモーターを含む請求項47に記載の方法。
- プロモーターが構成的プロモーターである請求項42に記載の方法。
- 構成的プロモーターがYPT1プロモーター又はGAPプロモーターである請求項49に記載の方法。
- メタノール資化性酵母細胞を準備する段階がCandida細胞、Hansenula細胞、Pichia細胞、又はTorulopsis細胞を準備する段階を含む請求項30に記載の方法。
- メタノール資化性酵母細胞を準備する段階がPichia pastoris細胞を準備する段階を含む請求項30に記載の方法。
- 選択位置に非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産する段階が、適切に作製したメタノール資化性酵母細胞を1:9比の緩衝複合メタノール培地(BMMY):緩衝最少メタノール(BMM)中で培養する段階と、培養液を振盪フラスコで増殖させ、ポリペプチドの発現を誘導する段階を含む請求項30に記載の方法。
- 適切に作製したメタノール資化性酵母細胞を培養する段階がCandida細胞、Hansenula細胞、Pichia細胞、又はTorulopsis細胞を培養する段階を含む請求項53に記載の方法。
- 適切に作製したメタノール資化性酵母細胞を培養する段階がPichia pastoris細胞を培養する段階を含む請求項53に記載の方法。
- 選択位置に非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産する段階が、ペーストのコンシステンシーに達するまで培養液を増殖させてポリペプチドを産生させる段階を含む請求項54に記載の方法。
- 産生されるポリペプチドが硫酸化されている請求項30に記載の方法。
- 産生されるポリペプチドがグリコシル化されている請求項30に記載の方法。
- 産生されるポリペプチドがジスルフィド結合を含む請求項30に記載の方法。
- 産生されるポリペプチドが10mg/Lまでの濃度で前記細胞から発現される請求項30に記載の方法。
- 選択位置に非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産する段階が、
a)YPD培地に適切なPichia pastoris株のコロニーを接種し、第1の培養液を作製する段階と;
b)第1の培養液を振盪フラスコに入れ、振盪フラスコを29℃〜30℃の温度にて280rpmの速度で振盪し、飽和付近まで増殖させる段階と;
a)緩衝グリセロール酵母エキス培地(BMGY)1リットルに第1の培養液を接種し、第2の培養液を作製する段階と;
b)OD600が8.0になるまで第2の培養液を増殖させる段階と;
c)第2の培養液を1500×gで5分間遠心し、ペレットを形成する段階と;
d)1:9比の緩衝複合メタノール培地(BMMY):緩衝最少メタノール(BMM)200mlにペレットを再懸濁し、第3の培養液を作製する段階と;
e)その後、24時間おきに第3の培養液にメタノールを終濃度0.5%まで120〜144時間添加し、ポリペプチドの発現誘導を維持する段階
を含む請求項25に記載の方法。
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