CN103145845A - Tat与人野生型P53融合蛋白在毕赤酵母中的表达 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种融合蛋白质的制备，特别是涉及蛋白转导结构域(Tat)与人野生型P53融合蛋白(Tat-p53)的制备，以及纯化Tat-p53融合蛋白的方法。

Description

Tat与人野生型P53融合蛋白在毕赤酵母中的表达

技术领域：

本发明涉及一种融合蛋白质的制备，特别是涉及蛋白转导结构域(Tat)与人野生型P53融合蛋白(Tat-p53)的制备，以及纯化Tat-p53融合蛋白的方法。

背景技术：

人类P53基因位于17p13.1染色体，全长16～20kb，由11个外显子和10个内含子组成，是研究得最广泛，最深入的抑癌基因，也是迄今发现的与肿瘤相关性最高的基因。P53基因编码产物即为P53蛋白，是一种核酸蛋白，由393个氨基酸组成，分子量为43.7KDa。由于富含大量脯氨酸，在SDS-PAGE中显示的分子量为53KDa，起初命名为P53，沿袭至今。P53分为野生型和突变型，野生型P53(wild-type P53，wtP53)是细胞中最重要的肿瘤抑制剂，在细胞生长过程中，以“分子警察”的身份监控细胞内DNA的状态，阻止受损DNA继续复制，抑制细胞恶性增殖，通过诱导生长停滞或细胞凋亡来抑制肿瘤细胞生长，维持细胞正常生长，保证遗传物质的稳定性。突变型P53是一种异常蛋白，能与人组织的各种病毒蛋白、热休克蛋白等结合成稳定的复合物，或通过突变、重排、丢失等形式失活，DNA损伤不能被修复，细胞遗传物质不稳定，导致细胞恶性增殖。P53基因是体内最重要的抑癌因子之一，人类恶性肿瘤中有一半以上存在P53基因的突变和缺失，它的结构改变和功能异常可能是这些肿瘤发生发展的重要环节之一。P53蛋白是一种磷酸化蛋白，半衰期短，只有20～30min，在正常细胞的细胞核中几乎检测不到。

在细胞生长过程中，wtP53蛋白是最重要的肿瘤抑制剂。因此，P53蛋白在肿瘤发生中作用机制的阐明，将为临床肿瘤的预防、诊断和治疗提供可靠的理论依据。通过导入wtP53来重建细胞内变异的P53已成为肿瘤治疗的新策略。大量的实验证实，野生型P53的导入对多类肿瘤产生明显的抑制作用。但是由于wtP53属于非分泌型蛋白，细胞膜上不存在P53受体或配体，P53很难穿透细胞膜进入细胞内发挥作用，进而达不到治疗目的。国内外大部分的研究主要集中在通过载体将P53基因导入到细胞内，缺点是导入的载体存在不安全性因素。因此如何能使P53基因编码产物P53蛋白进入细胞内发挥作用，避免导入载体的不安全性并且不影响P53蛋白的活性是应用wtP53治疗肿瘤需要解决的问题。

近年来发现一种蛋白转导结构域(Tat)，Tat蛋白是人类免疫缺陷病毒I型(HIV-I)的反式激活因子，它是一种正调控蛋白质，可以很大程度地提高HIV-I基因组的复制和转录水平，还能调节基因以及细胞的行为。作为新发现的一种蛋白转导结构域，Tat蛋白能高效地介导与其共价连接的DNA、多肽、蛋白质等分子进入几乎所有的组织和细胞，甚至可以通过血脑屏障，转导效率高且对细胞几乎没有损伤，并且能保持蛋白的生物活性。Tat融合蛋白系统被认为是一种很有前途的高效运载工具，在基础医学研究和临床治疗方面都有着非常广阔的应用前景。Tat蛋白可以引导多种多肽和蛋白质进入几乎所有的靶细胞，这即是Tat蛋白的转导作用，又称为内化作用。Tat蛋白的转导作用主要依赖于多肽或蛋白质的浓度，而不同于一般的通道、受体、内吞作用的的入胞方式。由于具有这一功能，Tat可被用来作为介导外源蛋白通过细胞膜的运载工具，因此日益受到人们的重视。Tat介导的蛋白转导过程不依赖于转运蛋白和受体，也不需要能量，即使在4℃下仍然可以顺利进行。目前，推测这一过程和蛋白转导域中碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)的存在有关，这些氨基酸带有很强的正电荷，可能通过直接与带负电荷的细胞膜脂类相互作用而介导穿膜过程。这也使得其可以导入几乎所有的细胞，甚至还可以通过血脑屏障。近来，应用这一技术已成功将分子量约15～120KD的数十种融合蛋白导入细胞内。操作中只需将与Tat-PTD融合的分子直接加入到组织培养介质中，15min内细胞内可达到最大浓度，且每个细胞内的蛋白浓度近乎相同。由此，应用Tat转导外源蛋白既可以通过控制作用时间精确控制细胞内的蛋白浓度，通常20～200μmol/L的蛋白终浓度即可产生生物学表型。因此，与将蛋白引入细胞的传统方法如微注射、穿孔蛋白及脂质体法等相比，Tat-PTD介导的蛋白转导有着显著的优越性。目前，对Tat蛋白能够有效的介导基因、多肽、蛋白质以及一些其它的物质进入细胞的机制还不是很清楚。相关研究推测，它以低亲和力与细胞上的受体相结合，通过破坏细胞质膜，以非内吞途径转导外源物质进入细胞内部。

本发明获得的Tat-p53融合蛋白可通过Tat介导野生型p53蛋白进入细胞发挥作用，既不影响p53蛋白的活性，又可避免通过载体导入p53到细胞内引起的不安全因素，为肿瘤的治疗开辟一个全新的设计思路与途径。

毕赤酵母表达系统作为新近发展起来的新型表达系统具有很多显著优点：(1)高表达：由于表达载体利用特有的AOX1启动子，是目前最强、调控机理最严格的启动子之一，用甲醇可以严格地调控表达。(2)高稳定：表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；完备的发酵方法，可以高密度连续培养，其转化子能够非常稳定地表达外源蛋白质，产量高。(3)高分泌：将白蛋白信号肽用于毕赤酵母表达载体，具有很好的分泌效果，大量外源蛋白被分泌到培养基中，而酵母本身只分泌少量蛋白，这样有利于产品的分离。(4)对表达的外源蛋白进行信号序列的加工、蛋白质折叠、二硫键形成、某些脂质的加入、糖基化等翻译后的修饰，更接近于哺乳动物细胞。(5)遗传背景清楚，生长繁殖迅速，工艺简单，生产成本低，适用于工业化生产。基于上述原因，我们选择适用于大规模工业化生产的毕赤酵母建立重组Tat-p53融合蛋白真核表达体系。

发明内容：

本发明旨在用分子克隆的方法制备一种蛋白转导结构域(Tat)与人野生型P53的融合蛋白，使P53突破细胞膜而进入细胞内发挥作用。

本发明的一个目的是提供一种集Tat与人野生型P53的特性于一体的Tat-p53融合蛋白。

本发明的Tat与人野生型P53融合蛋白是包括与天然Tat序列相同区域和与人野生型P53序列相同的另一区域。

在本发明的融合蛋白中，可以是与天然Tat同源的区域位于融合蛋白的N-端，与人野生型P53同源的区域位于融合蛋白的C-端；也可以是与天然Tat同源的区域位于融合蛋白的C-端，与人野生型P53同源的区域位于融合蛋白的N-端。

本发明的另一目的是提供编码本发明融合蛋白的DNA序列。

包括与天然Tat氨基酸残基序列相同的区域和与人野生型P53氨基酸残基序列相同的区域构成的融合蛋白的DNA序列。

本发明的又一个目的是提供用于表达本发明融合蛋白的DNA构建体，该构建体包括pPICZa质粒、pET系列载体、pcDNA3.1质粒等。

本发明的再一个目的是提供用于表达本发明融合蛋白编码基因的宿主。

本发明的宿主可以是被重组表达载体或重组表达载体的一部分转化，含有本发明融合蛋白编码基因的细菌、酵母、动物细胞或植物细胞；其中优选的是酵母，更优选的是毕赤酵母，最优选的是毕赤酵母X-33。

本发明将Tat与人野生型P53融合，所形成的融合蛋白既保留了Tat能高效地介导与其共价连接的多肽、蛋白质等分子跨膜组织和细胞的功能，又保留了野生型P53抑制肿瘤的活性。因此本发明的融合蛋白既可以通过Tat介导P53突破细胞膜而进入细胞内，又可以使进入细胞内的P53具有抑制肿瘤的活性。

编码天然Tat的多聚核苷酸和编码人野生型P53的多聚核苷酸可以用本领域周知的方法，如PCR、RT-PCR方法、人工合成的方法和构建筛选cDNA文库的方法等获得，用作PCR模板和用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织、细胞及文库等。也可以用人工合成的方法获得，人工合成时可选用宿主偏爱的密码子，这样可以提高产物的表达。若需要可采用本领域周知的方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入和与其它多聚核苷酸连接等。编码天然Tat和编码人野生型P53的多聚核苷酸的融合，在保持各自阅读框不变的前提下，可以用本领域周知的各种方法，如通过PCR的方法，在编码序列的两侧引入限制性内切酶位点，通过酶切产生粘性末端，或直接人工合成基因时引入适当的粘性末端，编码天然Tat和编码人野生型P53的多聚核苷酸的粘性末端用DNA连接酶连接，从而获得编码融合蛋白的基因。如果需要可在本发明的融合蛋白基因两侧引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸含有限制性内切酶识别位点。可用本领域公知的方法将含编码融合蛋白序列的基因序列克隆到各种表达载体中去。所用标准的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等《分子克隆试验指南》第三版，科学出版社，2002)的叙述。

许多表达载体和其对应的宿主可以从公司购得，如酵母表达载体pPICZa，pPIC9，pHIL-s1(Invitrogen Corp.San Diego，California，USA.)等。优选的方法是将编码本发明中的融合蛋白或多肽的核苷酸序列克隆至酵母表达载体，本发明的巴斯德毕赤酵母表达载体可以是胞内表达的，也可以是分泌表达的。这些载体都包括一个由0.9kb的5′醇氧化酶操纵子(AOX1)序列片段和约0.3kb的转录终止基因的3′序列组成的表达盒，用于方便编码目的蛋白的基因整合至酵母染色体和控制目的基因的表达。分泌型表达载体可以是pPIC9，pPIC9k、pHIL-Sl、pPICZα、pYAM75P6E6等；胞内表达的载体可以是pHIL-D2、pA0815、pPIC3K，pPICZ，pHWO10E121，pGAPZ、pGAPZα等。本发明优选的是pPICZα。

表达融合蛋白的宿主可以是酵母、细菌、动物细胞、植物细胞等，本发明优选的是酵母。融合蛋白或多肽可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，优选的是从宿主细胞中分泌出来。本发明优选的信号肽是白蛋白信号肽。编码融合蛋白的核酸序列，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒形式存在。

得到携带融合蛋白基因的重组表达载体后，可使用通常的方法，如：锂盐法、PEG法、原生质球法和电穿孔法等方法转化宿主细胞。其中，本发明优选的转化方法是电穿孔法。成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞，可通过人们熟知的技术加以鉴定，如收集并裂解细胞，提取DNA，然后用PCR方法鉴定。或者，细胞培养上清或细胞破碎液中的蛋白可用抗人p53抗体检测。

可以通过培养含有本发明DNA构建体的宿主，如重组酵母、重组细菌、重组动物细胞、转基因动植物等，生产本发明的融合蛋白。具体的培养方法，可以使用摇瓶或生物反应器等，生产时优选的是生物反应器。培养基应能提供菌体(或细胞)生长和产物表达所需的物质，包含氮源、碳源、pH调节成分等，培养基配方应根据不同培养对象，通过试验获得。培养可分为两个阶段，第一阶段主要用于菌体(或细胞)生长，第二阶段主要用于产物的合成。

可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细菌或细胞培养物中分离、纯化融合蛋白，如盐析、有机溶剂沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用分子筛、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。

进一步的生物学实验表明，按照本发明方法制备的融合蛋白Tat-p53对肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞SKOV3的增殖有明显的抑制作用，促进其凋亡。

本发明中的融合蛋白可以有各种衍生物，这些衍生物可以是单不局限于其不同形式的盐、修饰后产物等。如在多肽的氨基、羧基、羟基、巯基上再进行修饰。所用的修饰剂可以是但不局限于聚乙二醇，葡聚糖等。

本发明中的融合蛋白及其衍生物可以单独使用，优选的为与一个或多个药学上可接受的载体一起组成药物制剂。药物载体一般应与融合蛋白相容且不能对受体自身有害，典型的载体为水、盐水、糖类、醇类或氨基酸，它们须无菌且无致热原。药物制剂可通过本领域已知的方法制备。这些方法包括将融合蛋白与一种或多种辅助成分混合的步骤。优选的药物制剂包括含水的液体制剂和含水量低于10％或不含水的冻干制剂。这些制剂可以含有缓冲剂，盐类，小分子糖类等。

本发明中的融合蛋白及其衍生物或其药物组合物可以通过任何已知的方法，包括注射(如皮下或肌肉)、静脉输注、透皮、吸入、口服等方法给药。优选的方法为静脉输注或注射给药。治疗包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1P53基因克隆的琼脂糖凝胶电泳图谱：泳道1为DL2000为DNA分子量标识物；泳道2为扩增的PCR产物。

图2真核表达重组质粒pPICZαC-Tat-p53酶切消化产物琼脂糖凝胶电泳图谱：泳道1为重组质粒pPICZα-Tat-P53；泳道2为重组质粒pPICZα-Tat-P53酶消化产物；DL2000为DNA分子量标识物。

图3重组质粒pPICZαC-Tat-p53PCR转化酵母菌DNA的PCR鉴定电泳图谱：DL2000为DNA分子量标识物；泳道1为pPICZαC转化的酵母菌基因组DNA的PCR产物；泳道2未转化的X-33酵母菌基因组DNA的PCR产物；泳道3～11为不同酵母菌转化子基因组DNA的PCR产物.

图4SDS-PAGE电泳筛选融合蛋白Tat-p53最佳诱导时间图谱：BM为宽分子量蛋白Marker；泳道1～7分别为筛选出的高表达转化子经甲醇诱导24h，48h，72，96h，120h，144h，168h后的电泳图谱。

图5SDS-PAGE电泳筛选融合蛋白Tat-p53最佳诱导pH值图谱：BM为宽分子量蛋白Marker；泳道1～9分别为筛选出的高表达转化子经不同pH3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0诱导后的电泳图谱。。

图6Tat-p53融合蛋白纯化的SDS-PAGE胶电泳图谱：泳道1为宽分子量蛋白Marker；泳道2为纯化后的Tat-p53融合蛋白。

图7纯化Tat-p53融合蛋白的Western blot结果；泳道1为宽分子量蛋白Marker；泳道2-3为转膜后经抗体孵育显色的Tat-p53融合蛋白。泳道4-5为R250染色后显色的Tat-p53蛋白(SDS-PAGE)。

图8流式细胞学分析结果；图A，左侧图为SKOV3细胞未加药物的空白对照组，右侧图为SKOV3细胞加药组，图中C3代表正常细胞数量，C4代表细胞凋亡数量。图B，左侧图为HepG2未加药物的空白对照组，右侧图为HepG2加药组，图中C3代表正常细胞数量，C4代表细胞凋亡数量。

具体实施方式

以下借助实施例描述本发明的最佳实施方式。这些实施例旨在进一步举例阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。

本发明利用基因工程方法将人野生型P53基因全长cDNA与近年来发现的一种蛋白转导结构域(Tat)融合。Tat能高效地介导与其共价连接的多肽、蛋白质等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞，转导效率很高而且对细胞没有损伤，并保持蛋白的生物活性。将其插入到真核表达载体pPICZαC的多克隆位点上，构建了pPICZαC-Tat-p53重组体，将其稳定转染毕赤酵母经甲醇诱导表达能表达Tat-p53融合蛋白，经离子交换层析纯化获得了Tat-p53融合蛋白，纯化的Tat-p53融合蛋白可溶于水，并可在-20℃长期保存。

实施例1：Tat-P53基因的克隆

1.1RNA的制备：

取肝脏组织放入液氮中速冻。使用Trizol试剂(Invitrogen Corp.SanDiego，California，USA.)，一步法方法提取肝组织的RNA。具体步骤如下：

1)取出冰冻的小块肝脏组织放入盛有液氮的研钵中，将其研磨至粉末状。

2)将碾碎的组织移入1.5ml无RNA酶EP管中，加入约1ml Trizol。

3)加入200μl氯仿，剧烈振荡摇匀，室温下放置30s。

4)4℃离心(12 000r/min)5min。

5)将上清液小心转移到另一个无RNA酶的EP管中。

6)加入等体积异丙醇，室温放置5min。

7)4℃离心(12 000r/min)5min，弃上清。

8)加入70％乙醇1ml洗涤沉淀两次，4℃离心(12 000r/min)5min。

9)室温下空气蒸发残存乙醇。

10)将总RNA沉淀溶于50μl DEPC水中，而后进行RNA的分析与定量。

11)取1μl样品稀释100倍后经紫外分光光度计测定OD₂₆₀和OD₂₈₀，计算其浓度和纯度。

RNA含量按下面公式计算：

RNA(μg/ml)＝40×OD₂₆₀×稀释倍数

OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.8～2.0表示纯度合格

12)琼脂糖凝胶电泳观察RNA的完整性。

1.2Tat-P53基因的克隆(RT-PCR法)

取如上提取的人肝脏组织总RNA 1μg，按如下比例建立逆转录(RT)反应体系：

人肝脏组织总RNA 1μg；10×RNA PCR缓冲液2μl；MgCl₂(25mmol/L)4μl；RNA酶抑制剂(40U/μl)0.5μl；dNTPs(各10mmol/L)2μl；AMV逆转录酶(200U/μl)1μl；Oligo dT(20pmol/μl)1μl；无RNA酶灭菌水加入至终体积20μl。于PCR仪上50℃反应30min，然后94℃2min灭活逆转录酶，合成cDNA后，按照如下比例建立PCR反应体系：

上述cDNA反应液20μl；MgCl₂(25mmol/L)6μl；10×LA PCR缓冲液8μl；上游引物：

5’-tcgcgaggtgtgtttcgtcgatacggtagaaagaagcgtcgacaacgtaggcgtatggaggagccgcagtcaga-3’(包含P53前端序列，全部Tat序列以及部分白蛋白信号肽序列)(SEQ ID NO：1)，1μl(20pmol/μl)；下游引物：

5’-caggtacctcagtctgagtcaggcc-3’(包含末端P53序列及酶切位点Kpn I)(SEQ ID NO：2)，1μl(20pmol/μl)；TaKaRa LA Taq(5U/μl)1μl；；灭菌超纯水至终体积100μl。PCR反应条件是：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，94℃30s，53℃30s，72℃1min，共16个循环；72℃5min。以上述PCR产物为模版进行第二步PCR反应，应用上游引物：5’-ggttcgaaacgatgaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattcgcgaggtgtgtttcgt-3’(包含另一部分白蛋白信号肽序列，酶切位点Bstb I)(SEQID NO：3)，1μl(20pmol/μl)；下游引物：5’-caggtacctcagtctgagtcaggcc-3’(SEQ ID NO：2)，PCR反应条件是：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，94℃30s，53℃30s，72℃1min，共16个循环；72℃5min。取PCR反应产物5μl，在1％琼脂糖凝胶中电泳检查扩增结果，并用DNA分子量标准检查特异性扩增条带大小(图1)。

1.3PCR产物的纯化

用DOUPSON琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒V3.0纯化回收，操作步骤严格按说明书进行。

实施例2：毕赤酵母分泌型表达载体Tat-P53-pPICZα表达载体的构建

2.1.2Tat-P53-pPICZα表达载体的构建

用Bstb I和Kpn I消化上述切胶回收的PCR产物Tat-P53和载体pPICZα，琼脂糖凝胶电泳定量后，16℃连接过夜。连接反应体系如下：目的基因0.1～0.3pmol；酶切后的载体pPICZα0.03pmol；10×连接缓冲液1μl；T4DNA连接酶(350U/μl)1μl；灭菌超纯水至终体积10μl。

将连接产物与感受态细胞XL1-blue轻轻混匀，常规方法转化。取200μl已转化的大肠杆菌细胞涂布于含Zeocin(25μg/ml)的低盐LB琼脂平板上，37℃培养箱培养12～16h。挑取不同的克隆，于LB液体培养基中培养过夜，而后，提取质粒，以Bstb I和Kpn I双酶切鉴定(图2)。

选取酶切鉴定正确的克隆，用质粒快速提取试剂盒提取质粒。进行DNA序列测定。测序结果显示插入pPICZα载体中的序列如下：ttcgaaacgatgaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattcgcgaggtgtgtttcgtcgatacggtagaaagaagcgtcgacaacgtaggcgtatggaggagccgcagtcagatcctagcgtcgagccccctctgagtcaggaaacattttcagacctatggaaactacttcctgaaaacaacgttctgtcccccttgccgtcccaagcaatggatgatttgatgctgtccccggacgatattgaacaatggttcactgaagacccaggtccagatgaagctcccagaatgccagaggctgctccccgcgtggcccctgcaccagcagctcctacaccggcggcccctgcaccagccccctcctggcccctgtcatcttctgtcccttcccagaaaacctaccagggcagctacggtttccgtctgggcttcttgcattctgggacagccaagtctgtgacttgcacgtactcccctgccctcaacaagatgttttgccaactggccaagacctgccctgtgcagctgtgggttgattccacacccccgcccggcacccgcgtccgcgccatggccatctacaagcagtcacagcacatgacggaggttgtgaggcgctgcccccaccatgagcgctgctcagatagcgatggtctggcccctcctcagcatcttatccgagtggaaggaaatttgcgtgtggagtatttggatgacagaaacacttttcgacatagtgtggtggtgccctatgagccgcctgaggttggctctgactgtaccaccatccactacaactacatgtgtaacagttcctgcatgggcggcatgaaccggaggcccatcctcaccatcatcacactggaagactccagtggtaatctactgggacggaacagctttgaggtgcgtgtttgtgcctgtcctgggagagaccggcgcacagaggaagagaatctccgcaagaaaggggagcctcaccacgagctgcccccagggagcactaagcgagcactgcccaacaacaccagctcctctccccagccaaagaagaaaccactggatggagaatatttcacccttcagatccgtgggcgtgagcgcttcgagatgttccgagagctgaatgaggccttggaactcaaggatgcccaggctgggaaggagccaggggggagcagggctcactccagccacctgaagtccaaaaagggtcagtctacctcccgccataaaaaactcatgttcaagacagaagggcctgactcagactga(SEQ ID NO：4)，此序列包括白蛋白信号肽序列、Tat序列和人wtP53基因序列。构建成功的表达载体成功转化毕赤酵母后，获得的融合蛋白序列为：

YGRKKRRQRRRMEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPRVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSD(SEQ ID NO：5)

实施例3：Tat-P53融合蛋白毕赤酵母表达体系的建立及筛选

3.1Tat-P53-pPICZα表达载体转化毕赤酵母

取测序正确的培养菌液，按质粒提取试剂盒说明书提取质粒DNA并用琼脂糖凝胶电泳法进行定量分析。取20～25μg表达载体Tat-P53-pPICZα经SacI酶消化(线性化)后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。线性化的质粒用10μl超纯水溶解后置冰上备用。

从毕赤酵母X-33的YPD阴性培养板上(不含抗生素的YPD琼脂平板)挑取单个菌落，接种于5ml YPD培养基中，250rpm，30℃震荡培养8小时，以常规制备酵母感受态细胞。

然后取80μl上述感受态菌，与5～10μg线性化的重组表达质粒混合，移入0.2cm电转化杯内进行电转化。取50～100μl转化后的菌液涂布于含Zeocin(100μg/ml)的YPD平板上，28℃培养箱培养2～3d，观察转化子的生长状况。

3.2PCR方法筛选Tat-p53-pPICZαC阳性转化菌株

离心回收9个不同菌体，用煮-冻-煮法提取酵母基因组DNA做PCR鉴定。用5’AOX1(5’-gactggttccaattgacaagc-3’)(SEQ ID NO：6)和3’AOX1(5’-gcaaatggcattctgacatcc-3’)(SEQ ID NO：7)为引物进行PCR反应。PCR反应条件为：94℃2min；94℃30s，60℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min；扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，观察是否得到预期大小的基因片段。(图3)

实施例4：Tat-p53融合蛋白的表达和纯化

4.1Tat-p53融合蛋白的表达

取上述鉴定结果阳性的克隆接种于10ml BMGY(pH6.0)培养基中，30℃震荡培养24h，至OD₆₀₀达到2.0～6.0时收集细胞。用等体积(10ml)BMMY(pH6.0)重悬细胞沉淀，30℃震荡培养，诱导表达。诱导过程中，每24h补充一次甲醇至终浓度0.5％，同时补充灭菌超纯水，使发酵液总体积保持不变。在培养的第0、24、48、72、96、120、144和168小时等时间点各取0.5ml发酵液，离心取上清用于蛋白质分析(SDS-PAGE，Western Blot等)。

分别取不同工程菌液用于SDS-PAGE分析，在凝胶分析系统观察电泳结果，筛选高表达量的Tat-p53工程菌。

4.2确定毕赤酵母分泌表达Tat-p53的最佳诱导时间

(1)选择高表达Tat-p53工程菌接种于10mlBMGY培养基中，28℃振荡培养24h，至OD₆₀₀达2.0～6.0收集细胞；

(2)等体积(10ml)BMMY重悬细胞沉淀，30℃振荡培养，诱导表达。在诱导过程中，每24h补充一次甲醇至终浓度0.5％，同时补充灭菌二蒸水，使发酵液总体积保持不变；

(3)在培养0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h时间点各取1ml发酵液，离心菌体，上清用于蛋白分析；

(4)SDS-PAGE确定最佳诱导时间为120h(图4)。

4.3筛选毕赤酵母分泌表达Tat-p53的最佳pH值

(1)选取Tat-p53表达量较高的毕赤酵母工程菌，在10ml YPD培养基中28℃、225r/min振荡培养24h；

(2)将扩增的毕赤酵母工程菌接种于100ml BMGY中，pH值为6.0、28℃、225r/min振荡培养30h左右，使其OD₆₀₀＝5。此做法的优点是：使酵母扩增的起始条件相同，为以后确定诱导最佳pH值奠定基础；

(3)室温离心(3000r/min)5min，弃去上清，加入前述未加缓冲液的BMMY 9ml，按下表的量加入1mol/L Na₂HPO₄和0.5mol/L柠檬酸配制成不同pH值的BMMY，30℃、225r/min振荡培养，诱导过程中每24h补充一次甲醇至终浓度0.5％，同时补充灭菌蒸馏水，使发酵液总体积保持不变；

表2.1不同pH的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液配方

(4)取诱导第4d各个pH值样品上清，进行SDS-PAGE，确定毕赤酵母分泌表达Tat-p53的最佳pH值为7.0(图5)。

实施例5：Tat-p53融合蛋白的纯化

5.1Tat-p53融合蛋白摇瓶水平表达

1)冻存的Tat-p53毕赤酵母工程菌在YPD琼脂板上(含Zeocin 100μg/ml)划线，28℃孵箱内倒置培养48h～72h；

2)至菌落长到2mm左右，挑取单克隆菌落加入到10ml BMGY培养液中，28℃、225r/m振荡培养16～24h；

3)将上述培养物加到2L BMGY培养液中，228℃、225r/m振荡培养36h左右。

4)加入终浓度为0.5％的甲醇，28℃、225r/m振荡培养。在诱导过程中，每24h补充一次甲醇至终浓度0.5％，同时补充灭菌二蒸水，使发酵液总体积保持不变；

5)甲醇诱导培养72h时，3000r/m、4℃离心，收集发酵上清用于蛋白纯化。

5.2重组Tat-p53融合安白离子交换层析纯化

1)用1MNaOH将收集的发酵液调PH至7.0

2)用Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液62.5mM稀释到3倍

3)Q Sepharose XL柱料约180ml，用Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液平衡，上样，流速每分钟小于等于10ml。

4)洗脱，用0.4MNaCl洗脱然后用0.7MNaCl洗脱

5)组分经超滤后，浓缩为200ml，电导0.3左右，留部分定量。

6)经SDS-PAGE，凝胶分析系统观察结果(图5)。

Bradford法计算纯化回收率为66％，纯度为87％。经阴离子交换层析及超滤纯化后获得高纯度融合蛋白。

Western blot工程菌表达纯化后标本有明显的棕色条带，说明Tat-p53可以与p53抗体特异性结合。(图7)

实施例6：重组Tat-p53融合蛋白的生物学活性和应用

6.1Tat-p53融合蛋白对癌细胞的增殖抑制作用

供试细胞：肝癌HepG2、宫颈癌Hela及乳腺癌SKOV3均为本室保存。

分别消化上述供试细胞，调整浓度至2000个/孔，种96孔板，37℃、5％CO₂、饱和湿度培养。镜下观察细胞数达50％左右时，按终浓度80μg/ml、60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml加Tat-p533融合蛋白，每个浓度3个平行孔，空白对照加等体积培养液，继续按上述条件培养，72小时后每板每孔加20μlMTT(5mg/ml)，相同条件继续培养4小时，去培养液，每孔加入DMSO150μl，震荡10分钟充分溶解孔内沉淀物，492nm波长检测各孔OD值。结果统计学处理。

结果见表1、表2：

表1MTT检测wtP53融合蛋白的细胞增殖抑制作用结果

表2wtP53融合蛋白的细胞增殖抑制作用结果(抑制率)

^*P＜0.05  ^**P＜0.01

由细胞增殖实验结果表1、2可以看出：重组Tat-p53融合蛋白对HepG2、SKOV3细胞的增殖有明显的抑制作用。

6.2Tat-p53融合蛋白对癌细胞的促进凋亡作用

1)分别消化HepG2细胞和SKOV3细胞，调整细胞密度至2×10⁵个/ml，种于6孔板中，每孔2ml细胞悬液，37℃、5％CO₂、饱和湿度过夜培养后加药，加入Tat-p53融合蛋白，终浓度40μg/ml，加药后继续培养48小时。未加药组作为对照组。

2)消化并收集细胞，用冷PBS洗两次后用1×Annexin V Bing Buffer重悬，加入5μlFITC Annexin V和PI，25℃避光孵育15分钟，操作严格按照FITCAnnexin V Kit(BD Biosciences)说明上进行。

3)加入400μl1×Annexin V Bing Buffer后上机(Epics XL，Beckman Coulter)结果应用Expo32ADC XL 4Color和CXP Analysis(Beckman)进行分析。结果表明：与未加药组相比，HepG2和SKOV3加药组有明显的细胞凋亡，其中SKOV3加药组培养48小时细胞凋亡率达到43％，Tat-p53融合蛋白的转导能够促进HepG2细胞和SKOV3细胞的凋亡(图8)。

Claims (6)

1.一种集天然Tat与人野生型P53的特性于一体的Tat-P53融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包括与天然Tat氨基酸残基序列相同的区域和与人野生型P53氨基酸残基序列相同的另一区域，或上述二区的功能同等物。

2.根据权利要求1所述的集Tat与野生型P53的特性于一体的Tat-P53融合蛋白，其特征在于：所述与天然Tat氨基酸残基序列同源的区域位于融合蛋白的N-末端，所述与人野生型P53氨基酸残基序列同源的另一区域位于融合蛋白的C-末端。

3.根据权利要求1所述的集Tat与野生型P53的特性于一体的Tat-P53融合蛋白，其特征在于：所述与天然Tat氨基酸残基序列同源的区域位于融合蛋白的C-末端，所述与人野生型P53氨基酸残基序列同源的另一区域位于融合蛋白的N-末端。

4.编码权利要求1-3中任意一项限定的融合蛋白的DNA序列。

5.携带权利要求4中所述DNA序列的重组表达载体。

6.含权利要求5所述DNA的细菌、酵母、动物细胞和植物细胞等，其中优选的是酵母细胞，更优选的是毕赤酵母，最优选的是毕赤酵母X-33。

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