CN102423493B - 一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物。可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的T-VISA-BikDD治疗载体，其序列如SEQ ID NO.1所示。所述的可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物T-VISA-BikDD脂质体，包括脂质体和被脂质体包被的T-VISA-BiKDD治疗载体，所述的T-VISA-BiKDD治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的T-VISA-BikDD治疗载体经脂质体包裹输送后，在乳腺癌部位富集，可高效靶向乳腺癌BCL-2靶点，与Bcl-2结合，释放Bad和Bax，导致乳腺癌细胞凋亡，而对正常细胞无灭杀作用，可全身给药，基因表达量高、时间长、效率高，药效确切，毒副作用低，无肝肾毒性，在治疗乳腺癌的具有广阔的前景。
Description
技术领域：
本发明属于医药生物领域，具体涉及一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞治疗载体及其药物。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，发病率逐年增高，严重危害了身体健康。乳腺癌手术治疗主要针对早中期乳腺癌，术后和晚期一般需综合治疗。化放疗不能杀灭乳腺癌干细胞，导致复发转移。综合治疗后，预后仍不满意，中晚期患者5年生存率仅10％-30％。三阴乳腺癌预后更差。乳腺癌干细胞是乳腺癌复发、转移和耐药的主要原因。因此，迫切需要探索高效靶向杀灭乳腺癌的新药物。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种高效靶向乳腺癌BCL-2靶点，可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的T-VISA-BikDD治疗载体。
本发明克隆端粒酶启动子hTERT，长度为418bp，具有肿瘤细胞特异性，但其活性在肿瘤细胞中不到CMV启动子活性的1％，因此无法广泛应用，本发明首先将hTERT启动子控制Gal4-VP2(两个拷贝的VP16，具有强烈的转录激活特性)融合蛋白基因；再将Gal4-VP2融合蛋白与Gal4效应元件G5E4T结合，启动靶基因或目的基因的大量转录；然后将WPRE位于目的基因的3-UTR，增强mRNA稳定性的作用，由此构建得到hTERT-VP16-GAL4-WPRE(VP16-GAL4-WPRE Integrated Systemic Amplifier，VISA，整合性系统放大器)调控系统，简称为T-VISA(整合性系统放大器)系统，最后，结合BiKDD基因(突变的Bik自杀基因，与Bcl-2结合，释放Bad和Bax，导致细胞凋亡)作为治疗基因，建立T-VISA-BiKDD治疗载体，该T-VISA-BiKDD治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物T-VISA-BikDD脂质体，其特征在于，包括脂质体和被脂质体包被的T-VISA-BiKDD治疗载体，所述的T-VISA-BiKDD治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的脂质体可以使用按照常规方法制备的脂质体，优选是通过以下方法制备的脂质体：按照1摩尔胆固醇对应1.7摩尔磷脂酰胆碱的比例，秤取磷脂酰胆碱与胆固醇，用磷脂酰胆碱质量1/4的氯仿作为溶剂溶解磷脂酰胆碱与胆固醇，将上述溶液置于旋转烧瓶中，旋转烧瓶使其混合均匀，再用真空抽吸器吸干溶剂，得到一层附着在烧瓶壁上的脂膜；然后再用按8.9/100ml/g磷脂酰胆碱的量加入质量分数为5％的葡萄糖溶液溶解已干燥的脂膜，旋转真空干燥，然后再加入双蒸水至上述质量分数为5％的葡萄糖溶液的体积，在50℃的超声水浴箱中进行超声处理1min，再在50℃下收集通过0.1μm的聚碳酸酯膜滤膜的脂质体。通过该方法制备的脂质体粒径为180nm左右，容许其穿透肿瘤细胞中极细的毛细血管并被细胞摄取。
所述的药物T-VISA-BikDD脂质体优选通过以下方法制备的，将上述脂质体加入到5％的葡萄糖溶液中使脂质体的浓度为8mM，将T-VISA-BiKDD治疗载体加入到5％的葡萄糖溶液中使T-VISA-BiKDD治疗载体的浓度为1μg/μl，然后将脂质体溶液和T-VISA-BiKDD治疗载体溶液混合静置20min，由此得到药物T-VISA-BikDD脂质体。利用该方法制备得到的药物T-VISA-BikDD脂质体的粒径200～300nm，稳定性好，在4～8℃，1-2年无降解。
本发明的药物T-VISA-BikDD脂质体在体外能高效杀灭一般乳腺癌细胞、三阴乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞细胞系，而对正常细胞无杀灭作用，在动物模型中可抑制乳腺癌细胞的生长，延长小鼠的生存时间，对小鼠行为无明显影响，无死亡发生，无肝肾毒性。
由此可见，本发明的T-VISA-BikDD治疗载体经脂质体包裹输送后，在乳腺癌部位富集，可高效靶向乳腺癌BCL-2靶点，与Bcl-2结合，释放Bad和Bax，导致乳腺癌细胞凋亡，而对正常细胞无灭杀作用，可全身给药，基因表达量高、时间长、效率高，药效确切，毒副作用低，无肝肾毒性，在治疗乳腺癌的具有广阔的前景。
附图说明：
图1是T-VISA-BikDD结构示意图，它是以pUK-21为基本骨架，kana抗性的可治疗性载体；
图2是动态光散射测量实施例2制得的脂质体(Liposome)和实施例3的T-VISA-BikDD脂质体(Liposome+T-VISA-BikDD)的粒径及其分布；
图3是T-VISA-BikDD脂质体在体外杀灭一般乳腺癌细胞、三阴乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞细胞系的结果图，其中Ctrl表示没有做任何处理的空白对照，T-VISA-BikDD表示T-VISA-BikDD治疗载体的处理，Her-2，ER，EGFR分别是指人类表皮生长因子受体2，雌激素受体和表皮生长因子受体，-表示阴性，+、++、+++分别表示阳性，弱阳性和强阳性。±表示不确定。
图4是T-VISA-BikDD脂质体在动物模型中抑制乳腺癌生长的示意图，其中Ctrl表示没有做任何处理的空白对照；
图5是T-VISA-BikDD脂质体在动物模型中的肝肾毒性，其中Ctrl表示没有做任何处理的空白对照。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
一、T-VISA-BikDD脂质体的制备
实施例1：T-VISA-BikDD治疗载体的构建
(一)pCRII-TOPO-hTERT质粒克隆
1、常规方法提取乳腺癌MCF-7细胞(从美国ATCC公司购买)的DNA。
2、以该DNA作为模板，设计扩增hTERT的PCR引物，hTERT PCR上游(Forward)和下游(Reverse)引物：
Forward：5′-ata tct aga ggc ccc tcc ctc ggg tta ccc cac agc-3′(XbaI)
Reverse：5′-ata gat ctt atg cgg ccg ccc acg tgc gca gca gga cgc agc gc-3′。
3、以乳腺癌MCF-7细胞DNA为模板，hTERT PCR引物(Forward：5′-ata tct aga ggc ccc tcc ctc ggg tta ccc cac agc-3′；Reverse：5′-ata gat ctt atg cgg ccg ccc acg tgc gcagca gga cgc agc gc-3′)、Pfu DNA polymerase、dNTP和PCR反应液，扩增获得hTERT启动子(-416 to+1)产物，其序列如SEQ ID NO.2所示。其PCR反应体系：10×PCR buffer5μl，上游(Forward)和下游(Reverse)引物各1μl，MCF-7细胞DNA为模板100ng DNA，25mM MgCl2 3μl，10mM dNTPs 1μl，Pfu-Taq(1U/μl)，最后补水至50μl。PCR反应条件：94℃热变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共进行30次循环；最后72℃延伸10min。
4、PCR产物用Qiangen公司(美国)PCR DNA回收试剂盒回收，回收约418bp大小片断。方法参考其说明书。
5、将回收的PCR产物2μl，pCRII-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)1μl，DNA ligase buffer1μl，最后补水至10μl，4℃连接反应10min。
6、将2μl连接产物与50μl Ecoli DH5感受态细胞混合后，冰浴30min。42℃水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500μl，在37℃下250rpm震摇30min。
7、取200μl LB培养基细菌液，涂布ampicillin LB培养板上，在37℃下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。
8、酶切质粒鉴定，进行测序分析，证实hTERT启动子(其序列如SEQ ID NO.2所示)已经插入克隆载体pCRII-TOPO中，命名为pCRII-TOPO-hTERT。
(二)pGL3-hTERT-Luc质粒克隆
1、用KpnI/Xho1酶切pCRII-TOPO-hTERT质粒，用KpnI/Xho1酶切pGL-3-basic质粒(Promega公司，麦迪逊，WI)，该质粒中含有荧光素酶Luciferase基因。酶切体系：10×BufferA 2μl，KpnI/Xho11μl，质粒5μg，补水至20μl，37℃水浴1小时。
2、酶切产物在1×TAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收hTERT(418bp大小)片断和pGL-3-Basis(4792bp大小)片断。
3、酶切产物用Qiangen公司(美国)PCRDNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
4、回收的hTERT产物6μl，回收的pGL-3-basic产物2μl，DNA ligase 1μl，buffer 1μl，最后补水至10μl，4℃连接反应4小时。
5、将2μl连接产物与50μl E.coli DH5感受态细胞混合后，冰浴30min。42℃水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500μl，在37℃下250rpm震摇30min。
6、取200μl LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37℃下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。
7、酶切质粒鉴定，进行测序分析，证实hTERT启动子已经插入载体pGL-3-basic中，命名为pGL3-hTERT-Luc质粒。
(三)pGL3-Luc-WPRE质粒克隆
1、用Asp718/SalI酶切pGEM-3Z-WPRE质粒(Promega公司，麦迪逊，WI)，然后用DNA polymerase平端；用SmalI酶切pGL-3-basic质粒(Promega公司，麦迪逊，WI)。酶切体系：10X Buffer A 2μl，Asp7181μl/SalI 1μl，质粒5μg，补水至20μl，37℃水浴1小时。
2、酶切产物在1XTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收WPRE(590bp大小)片断和pG-L3-Basis(约4800bp大小)片断。
3、酶切产物用Qiangen公司(美国PCRDNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
4、回收的WPRE产物6μl，回收的pGL-3-basic产物2μl，DNA ligase 1μl，buffer 1μl，最后补水至10μl，4℃连接反应4小时。
5、2μl连接产物与50μl E.coli DH5感受态细胞混合后，冰浴30min。42℃水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500μl，在37℃下250rpm震摇30min。
6、取200μl LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37℃下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。
7、酶切质粒鉴定，进行测序分析，证实WPRE插入了pGL-3-basic中，命名为pGL3-Luc-WPRE质粒。
(四)pGL3-hTERT-TSTA-Luc质粒克隆
1、用HindIII/NotI酶切pCRII-TOPO-hTERT质粒(见上)，然后用DNA polymerase平端；用MSCI/NheI酶切pGL3-TSTA-Luc质粒(Invitrogen，Carlsbad，CA)，然后用DNA polymerase平端。酶切体系：10X Buffer A 2μl，HindIII/NotI or MSCI/NheI 1μl，质粒5μg，补水至20μl，37℃水浴1小时。
2、酶切产物在1XTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收hTERT(418bp大小)片断和pGL3-TSTA-Luc(7300bp大小)片断。
3、酶切产物用Qiangen公司(美国)PCRDNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
4、回收的hTERT产物6μl，回收的pGL33-TSTA-Luc产物2μl，DNA ligase 1μl，buffer 1μl，最后补水至10μl，4℃连接反应4小时。
5、2μl连接产物与50μl E.coli DH5α感受态细胞混合后，冰浴30min。42℃水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500μl，在37℃下250rpm震摇30min。
6、取200μl LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37℃下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。
7、酶切质粒鉴定，进行测序分析，证实hTERT启动子插入了载体pGL33-TSTA-Luc中，命名为pGL3-hTERT-TSTA-Luc质粒。
(五)T-VISA-Luc质粒克隆
1、用NotI/BglII酶切pGL3-Luc-WPRE质粒(见上)；用NotI/BglII酶切pGL3-hTERT-TSTA-Luc质粒(见上)。酶切体系：10X Buffer A 2μl，NotI 1μl，BglII 1μl，质粒5μg，补水至20μl，37℃水浴1小时。
2、酶切产物在1XTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收WPRE(590bp大小)片断和pGL3-hTERT-TSTA-Luc(7593bp大小)片断。
3、酶切产物用Qiangen公司(美国)DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
4、回收的WPRE产物6μl，回收的pGL3-hTERT-TSTA-Luc产物2μl，DNA ligase 1μl，buffer1μl，最后补水至10μl，4℃连接反应4小时。
5、2μl连接产物与50μl E.coli DH5感受态细胞混合后，冰浴30min。42℃水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500μl，在37℃下250rpm震摇30min。
6、取200μl LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37℃下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。
7、酶切质粒鉴定，进行测序证实，命名为pGL3-hTERT-TSTA-Luc-WPRE质粒，简称pGL3-hTERT-VISA-Luc质粒，即T-VISA-Luc质粒。
(六)pGL3-T-VISA-BikDD质粒
1、用BamHI/EcoRV酶切pUK21-CMV-BikDD质粒(购自美国MD.Anderson癌症中心)平端，酶切体系：10X Buffer A 2μl，BamHI 1μl，EcoRV 1μl，质粒5μg，补水至20μl，37℃水浴1小时。用BglII/NheI酶切pGL3-hTERT-VISA-Luc质粒平端，酶切体系：10X Buffer A2μl，BglII 1μl，NheI 1μl，质粒5μg，补水至20μl，37℃水浴1小时。
2、酶切产物在1XTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收BikDD片段(493bp)和pGL3-hTERT-VISA片断(1650bp)(酶切去除了荧光素酶基因)。
3、酶切产物用Qiangen公司(美国)DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
4、回收的BikDD产物6μl，回收的pGL3-hTERT-VISA产物2μl，DNA ligase 1μl，buffer1μl，最后补水至10μl，4℃连接反应4小时。
5、2μl连接产物与50μl E.coli DH5α感受态细胞混合后，冰浴30min。42℃水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500μl，在37℃下250rpm震摇30min。
6、取200μl LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37℃下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。
7、酶切质粒鉴定，进行测序证实，BikDD基因插入到pGL3-hTERT-VISA中，命名为pGL3-T-VISA-BikDD质粒。
(七)pUK21-T-VISA-BikDD治疗载体
1、用NotI/SalI酶切pGL3-T-VISA-BikDD质粒，酶切体系：10X Buffer A 2μl，NotI 1μl，SalI 1μl，质粒5μg，补水至20μl，37℃水浴1小时。用NotI/SalI酶切pUK21质粒，酶切体系为：10X Buffer A 2μl，NotI 1μl，SalI 1μl，质粒5μg，补水至20μl，37℃水浴1小时。
2、酶切产物在1XTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收T-VISA-BikDD片段(5641bp)和pUK21片段(816bp)。
3、酶切产物用Qiangen公司(美国)DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。
4、回收的T-VISA-BikDD产物6μl，回收的pUK21产物2μl，DNA ligase 1μl，buffer 1μl，最后补水至10μl，4℃连接反应4小时。
5、2μl连接产物与50μl E.coli DH5α感受态细胞混合后，冰浴30min。42℃水浴热激动反应45sec，然后冰上放置3min。加入预热的LB培养基500μl，在37℃下250rpm震摇30min。
6、取200μl LB培养基细菌液，涂布Kanamycin LB培养板上，在37℃下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。
7、酶切质粒鉴定，进行测序证实，T-VISA-BikDD片段插入到pUK21质粒的NotI/SalI位点，命名为pUK21-T-VISA-BikDD治疗载体，简称T-VISA-BikDD治疗载体，经测序其序列如SEQ ID NO.1所示。
pUK21-T-VISA-BikDD治疗载体是pUK21-CMV-BikDD经BamHI/EcoRV/酶切平端后，BikDD片段插入到pGL3-hTERT-TSTA-Luc-WPRE质粒的Bgl II/NheI/平端位点，产生pGL3-T-VISA-BikDD质粒。pGL3-T-VISA-BikDD质粒NotI/SalI酶切后，T-VISA-BikDD片段插入到pUK21质粒的NotI/SalI位点，产生pUK21-T-VISA-BikDD治疗载体，简称为T-VISA-BikDD治疗载体，其结构如图1所示。
pUK21-T-VISA-BikDD治疗载体主要包括hTERT启动子(其序列如SEQ ID NO.2所示)、WPRE(其序列如SEQ ID NO.3所示)、G5E4T(其序列如SEQ ID NO4所示)和Gal4-VP2基因(其序列如SEQ ID NO.5所示)和BikDD基因(其序列如SEQ ID NO.6所示)。hTERT启动子控制Gal4-VP2(两个拷贝的VP16，具有强烈的转录激活特性)融合蛋白基因；Gal4-VP2融合蛋白与Gal4效应元件G5E4T结合，启动BikDD基因的大量转录，BikDD基因与Bcl-2结合，释放Bad和Bax，导致细胞凋亡。
实施例2：脂质体的制备：
将脂质从冰箱中取出(DOTAP储存于-20℃、胆固醇储存于-4℃)，恢复至室温。水浴加热2个旋转蒸发仪分别至30℃，50℃。称取68.75mg胆固醇，放入1000ml圆底烧瓶。向圆底烧瓶中加入100mg DOTAP和25mg Choroform。转动烧瓶，使其充分混合。在30℃的水浴箱中旋转圆底烧瓶2min，使其混合均匀，在烧瓶壁上形成一层薄膜。打开真空抽吸器，30℃下30min。加入8.9ml预热的5％葡萄糖溶液溶解已干燥的薄膜，50℃下以105转/min快速旋转45min。然后降低温度至35℃旋转10min。用保鲜膜(或石蜡)封口烧瓶，室温下过夜，避光。测量体积，加双蒸水至8.9ml。在50℃的超声水浴箱中(200W)对烧瓶进行超声处理1分钟。在50℃下依次通过1.0μm，0.45μm，0.22μm，0.1μm的滤膜(1.0μm，0.45μm为Whatman的polysufone滤膜，货号分别为#6780-1310和#6780-1304；0.22μm，0.1μm为Whatman的Anotop滤膜，货号分别为#6808-1122和#6809-1112)，最后通过0.1μm的脂质体放入洁净的玻璃瓶中。用氮气填充试管10秒，将脂质体保存于试管中置于4℃避光保存备用(同时防止空气进入)。
实施例3：T-VISA-BiKDD脂质体的制备
T-VISA-BikDD治疗载体溶于5％葡萄糖溶液，使其终浓度为1ug/ul，同时将存储浓度(20mM)的实施例2的脂质体用5％葡萄糖溶液稀释为工作浓度(8mM)。1μg DNA/ul的T-VISA-BikDD治疗载体缓慢加入8mM的脂质体中，在室温中静置20分钟，反应，形成T-VISA-BikDD脂质体。
然后再检定、生物特性检测和内毒素等质控，无菌分装。成品检定，包装，4-8℃保存；使用前先放室温20分钟，可直接用于体外研究，也可用于体内研究，也可用5％葡萄糖溶液稀释后使用。
二、效果实验：
1、T-VISA-BiKDD脂质体的生物特性：
对实施例3获得的T-VISA-BiKDD脂质体进行生物特性测定，其生物特性如下：
脂质体大小：经动态光散射所测的脂质体粒径在180nm左右，包裹质粒后粒径约为200nm-300nm(见图2)。
脂质体稳定性：在4-8度1-2年无降解。
浓度：4mM。
2、T-VISA-BiKDD脂质体的抗乳腺癌活性：
2.1体外实验：
将T-VISA-BiKDD脂质体共转染乳腺癌细胞、三阴乳腺癌细胞、乳腺癌干细胞系和正常细胞系，48小时后，收集细胞、裂解，计算细胞存活率，以未做任何处理的癌细胞作为空白对照(即图中的ctrl)，结果如图3所示，由图3中可以看出，T-VISA-BikDD脂质体可高效杀灭乳腺癌细胞、三阴乳腺癌细胞(231和468细胞)和乳腺癌干细胞细胞系(BCSLC、BCSC1和BCSC2)，对正常细胞没有明显杀伤作用。
2.2体内实验：
2.2.1T-VISA-BikDD脂质体在动物模型中可抑制乳腺癌生长
在Balb/c裸鼠中原位接种三阴乳腺癌细胞(468-luc细胞系，稳定表达luciferase蛋白)，三周后，通过尾静脉注射T-VISA-BikDD脂质体15ug/只，每周两次，连续三周，用XenogenIVIS活体成像仪动态观察靶基因Luciferase表达，动态观察肿瘤发生发展和生存时间。结果如图4所示，由图4(活体成像监测肿瘤生物信号强弱)表明，T-VISA-BikDD有效抑制肿瘤的生长，并延长小鼠生存时间。
2.2.2T-VISA-BikDD脂质体在动物模型中无肝肾毒性
50μg/只T-VISA-BikDD脂质体通过尾静脉注射Balb/c鼠，观察小鼠行为和生存状况，并在注射后第二天和第四天采血，生化自动分析仪检测AST(谷草转氨酶)、ALT(谷丙转氨酶)和CRE(肌酐)等。结果如图5所示，由图5表明，T-VISA-BikDD脂质体与CMV-BikDD脂质体(其制备方法同T-VISA-BikDD脂质体)相比较，T-VISA-BikDD脂质体对小鼠行为无明显影响，无死亡发生，对肝功能和肾功能无影响，无肝肾毒性。
Claims (2)
1.一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的T-VISA-BikDD治疗载体，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物T-VISA-BikDD脂质体，其特征在于，包括脂质体,和被脂质体包被的T-VISA-BiKDD治疗载体，所述的T-VISA-BiKDD治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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