CN101624599A - 一种含cox-2基因启动子和报告基因的重组质粒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及一种含有COX－2基因启动子和报告基因的重组质粒及其构建方法和应用。本发明通过提取人COX－2基因启动子，以含萤火虫荧光素酶报告基因的pGL3－Basic的质粒为载体，插入COX－2基因启动子，构建一种含COX－2基因启动子和萤火虫荧光素酶报告基因的pGL3－Basic－COX－2 promoter重组质粒。将构建的重组质粒与海肾荧光素酶报告基因质粒共转染到肿瘤细胞中，使其稳定表达。通过检测荧光素酶的活性反映COX－2基因启动子启动转录的活性，用于靶向筛选抗肿瘤药物。本发明具有靶向性强、高效快速、反应灵敏等优点，适用于以COX－2基因为靶点的抗肿瘤药物大批量筛选。

Description

一种含COX-2基因启动子和报告基因的重组质粒及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种肿瘤基因靶点的重组质粒，具体涉及一种含COX-2基因启动子和荧光素酶报告基因的重组质粒及其构建方法和应用途径。

背景技术

环氧化酶(cyclooxygenase，COX)是前列腺素(PGs)合成过程中一个重要的限速酶，可将花生四烯酸代谢成各种前列腺素产物，从而维持机体的各种病理生理过程。目前发现哺乳动物的环氧化酶至少有COX-1和COX-2两个同工酶，COX-1在组织中的表达相当稳定，对维持胃和肾功能的平衡发挥重要的作用，而COX-2的表达在不同的组织、不同的状况下变动很大，它的主要产物是环前列腺素和PGE₂。

现有技术公开了COX-2基因全长8.3kb，由10个外显子和9个内含子组成，定位于第1号染色体1q^25.2～25.3，由5’端0.8kb的转录起始点上游区，6kb的蛋白质编码区以及1.5kb 3’端非编码区组成，其mRNA约4.5kb，基因编码603或604个氨基酸，含有17个氨基酸残基构成的信号肽，与COX-1有59％-61％的同源性。在其5’旁侧区，含有几个可能的转录调节序列，包括转录起始位点上游25bp位处共同的TATA框序列。一个C/EBP基序，两个AP-2位点，三个SP₁位点，两个NF-κB位点，一个CRE基序和一个EST-1位点。在蛋白质编码区，COX-2基因的ORF起始于CTGCGATGC序列，由10个外显子编码。在3’旁侧区，整个3’UTR包含于外显子10，其间无内含子存在，有三个富含腺嘌呤核苷酸的序列M TAAA，相互之间相隔280bp。

研究发现COX-2存在于某些细胞中，主要定位于核膜。因此，COX-2产生的PGs产物可进入核内，调节靶细胞基因的转录。研究表明cox-2不仅是启动炎症反应的关键酶，而且其表达和与肿瘤的发生、增殖、分化、浸润、转移及预后等方面有重要作用。COX-2主要通过以下途径导致胃癌的发生：：(1)COX作为一种刺激因子在静息状态下不表达，只有在某些恶性细胞中，可能由于癌基因的激活或抑癌基因的失活而被活化，COX-2的转录后失控，使COX-2过度表达，COX-2的过氧化酶活化可催化一系列异体氧化反应，参与氧化诱癌途径，从而形成致癌物。(2)COX-2通过催化形成PGs促进肿瘤的发生，COX-2通过催化反应可产生PGG、PGH、PGE，其中PGE为其主要代谢产物，可诱导细胞增殖，促进细胞粘附，抑制具有免疫调节功能的淋巴因子的产生，抑制T细胞和B细胞增殖，降低机体对肿瘤细胞的局部免疫反应。(3)COX-2过度表达可增加PGE2的合成，PGE2诱导细胞增殖并刺激bcl-2蛋白表达，降低介导凋亡的转化生长因子-β(TGF-β)2型受体水平，降低介导细胞间粘附的E-钙粘蛋白(E-cadherin)活性，从而抵抗各种刺激诱导的细胞凋亡，促进细胞增殖，引起肿瘤的发生。(4)COX-2促进PG合成的增加如PGE₁、PGE₂和15d-PGJ等作用于EP₂、EP₄及PPARr等，通过EP/cAMP等途径激活各种胞内激酶如PKA、Ras蛋白活性，诱导VEGF mRNA和蛋白表达水平上调，参与肿瘤新生血管的形成，促进肿瘤的转移。(5)COX-2可使细胞周期存在明显G₁期推迟，而且Czelin D₁蛋白激酶、Rb₁激酶和细胞周期依赖激酶(CDK4)活性明显下降，这样通过阻碍细胞周期，阻止延长细胞生存期，增强对胞外基质的粘附，而异常延长细胞生存期使一系列基因突变，促进肿瘤形成。另外，Cox-2可促进肿瘤细胞相关血管的生成，增加癌细肥的侵袭性，激活基质金居蛋白酶2降解细胞外基质，产生促血小板凝集的血栓烷等，从而有利于肿瘤的侵袭和转移。

COX-2在肿瘤发生、发展和转移的整个过程中起着重要的作用，参与了肿瘤形成的多个环节。因此，对肿瘤组织或肿瘤细胞中COX-2活性检测可以作为监测肿瘤的发生发展的一个重要手段，同时COX-2在细胞中的基因表达水平也可以作为抗肿瘤药物筛选的一个重要指标。

发明内容

本发明的目的是提供一种含COX-2基因启动子和报告基因的重组质粒及其构建方法，该报告基因为萤火虫荧光素酶基因(luc⁺)。

本发明通过提取人COX-2基因启动子，以含萤火虫荧光素酶报告基因的pGL3-Basic的质粒为载体，插入COX-2基因启动子，构建一种含COX-2基因启动子和萤火虫荧光素酶报告基因的pGL3-Basic-COX-2 promoter重组质粒。

所述的重组质粒，其特征是含萤火虫荧光素酶报告基因luc⁺、多酶切位点和β-内酰胺酶基因；所述的β-内酰胺酶基因是氨苄青霉素抗性基因；

所述的重组质粒中的COX-2基因启动子序列中包含NF-κB、NF-IL6、SP-1、AP-2、CRE、E-Box转录位点和TATA框，其长度为252-700bp，优选序列长度为562bp；

所述的含萤火虫荧光素酶报告基因luc⁺的质粒选自pGL3-Basic Vector 4818bp、pGL3-enahncer Vector 5064bp、pGL3-promoter Vector 5010bp或pGL3-control Vector5256bp，优选pGL3-Basic Vector 4818bp；

本发明所述的含COX-2基因启动子和报告基因的重组质粒，其中的载体质粒和COX-2基因启动子都含有Bgl II和Hind III双酶切位点。

本发明通过下述方法和步骤构建所述的含有COX-2基因启动子和报告基因的重组质粒，

第一步制备含有COX-2基因启动子基因组DNA

(1)提取含有COX-2基因启动子基因组DNA；

(2)扩增、纯化COX-2基因启动子目的片段；

第二步大量制备pGL3-Basic载体质粒；

第三步构建稳定表达COX-2基因启动子的重组质粒

(1)含有COX-2基因启动子目的片段和pGL3-Basic载体质粒的双酶切；

(2)酶切后COX-2基因启动子目的片段和pGL3-Basic载体质粒的酶连；

(3)筛选连接后的重组质粒并大量扩增制备。

本发明的另一个目的是提供一种含上述COX-2基因启动子和萤火虫荧光素酶报告基因重组质粒的用途，所述的重组质粒主要应用于抗肿瘤药物的筛选和评价，尤其是以COX-2基因为作用靶点的抗肿瘤药物的筛选或评价，所述的抗肿瘤药物包括抗肿瘤的化学、生物类药物或中药复方、中药单体或单味中药提取物。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

将上述的含萤火虫荧光素酶的pGL3-Basic-COX-2 promoter重组质粒联合含海肾荧光素酶的pRL-SV40内参质粒共转染到肿瘤细胞中，使其能在细胞中表达转录，转染后，通过使用荧光素酶快速检测试剂盒检测两种荧光素酶活性，反映抗肿瘤药物对COX-2基因启动子转录活性的影响，评价药物的抗癌效能。

本发明通过以下步骤实现含有COX-2基因启动子和报告基因重组质粒以COX-2基因为靶点的抗肿瘤药物的筛选用途：

第一步肿瘤细胞的铺板

(1)将肿瘤细胞按一定比例接种到细胞培养板中；

(2)使细胞继续培养至达到90％-95％汇板；

第二步质粒共转染细胞

(1)将培养板中细胞培养液换成无血清无抗菌素的培养基；

(2)将重组质粒、内参质粒、转染脂质体按一定比例加入到细胞中；

(3)转染3-5h后将培养液全部吸弃，加含血清和抗菌素的完全培养基继续培养；

第三步加入抗肿瘤药物处理转染后的细胞

(1)选择不同的时间点加入药物处理转染后的细胞；

(2)或加入不同的浓度的药物处理转染后的细胞；

第四步检测转染后细胞的双荧光素酶活性

(1)转染后2-96h后将细胞培养液吸弃，用细胞裂解液裂解细胞；

(2)按双荧光素酶检测试剂盒的方法检测转染后细胞的双荧光酶活性。

本发明构建的重组质粒具有以下优点：

(1)双荧光素酶报告基因法具有灵敏度高、检测速度快、费用低、不需使用放射性同位素等。

(2)双荧光素酶报告基因法同时具有靶向性的特点，能够特异性检测启动子中特定序列的启动活性。

(3)双荧光素酶报告基因克服了转染效率对结果的影响。

附图说明

图1.COX-2基因启动子扩增引物序列，

其中，上游引物27bp，含有1个HindIII酶切位点和3个保护碱基；下游引物28bp，含有1个BglII酶切位点和2个保护碱基。

图2.COX-2基因启动子片段的克隆，Marker为DL2000，

其中，1、2、3、4为COX-2基因启动子片段(562bp)。

图3.pGL3-Basic-COX-2 promoter重组质粒的HindIII和Bgl II双酶切检测，

其中，Marker为DL2000，

1为pGL3-Basic-COX-2-promoter重组质粒PCR扩增结果(562bp)；

2为pGL3-Basic-COX-2-promoter重组质粒双酶切结果(4818+562bp)；

3为pGL3-Basic-COX-2-promoter重组质粒(5380bp)。

图4.pGL3-Basic-COX-2 promoter重组质粒测序比对结果。

图5.pGL3-Basic-COX-2 promoter重组质粒构建图。

图6.不同质粒转染MKN45细胞后的萤火虫荧光素酶活性的比较。

图7不同药物对重组质粒转染人胃癌细胞后COX-2活性的影响。

具体实施方式

本发明采用PCR的方法，将从人外周血白细胞或人其它细胞中扩增出COX-2基因启动子序列和经大肠杆菌DH5α感受态细胞扩增出的pGL3-Basic载体质粒，经纯化、测序鉴定后，运用酶切、连接等基因重组手段，得到重组质粒PGL3-Basic-COX-2-promoter。然后将重组质粒转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行扩增，制备出的含有COX-2基因启动子和报告基因的重组质粒。将构建的重组载体质粒与海肾荧光素酶报告基因载体质粒pRL-SV40共转染肿瘤细胞，使其能在细胞中表达，通过检测双荧光素酶活性来反映抗肿瘤药物对COX-2基因启动子转录活性的影响，从而应用于靶向筛选抗肿瘤药物。

本发明实验所涉及的肿瘤细胞，如人胃癌细胞，大肠杆菌DH5α感受态细胞，MKN45细胞，含萤火虫荧光素酶报告基因的pGL3-Basic的质粒载体为现有技术，所涉及的基因组DNA纯化试剂盒，生化试剂均可市购。

实施例1

人基因组DNA的提取

含有COX-2基因启动子基因组DNA提取自正常人外周血白细胞或人其它细胞，采用基因组DNA纯化试剂盒或组织、细胞基因组DNA纯化试剂盒的操作方法通过下述步骤进行提取：

(1)贴壁培养的细胞，吸出培养基，用PBS清洗细胞1次，加入胰蛋白酶溶液(0.1-0.25％)消化处理。800rpm室温离心10min，收集10⁶-10⁷个细胞，去除上清，

(2)用200μl溶液PL重悬细胞，加入20μl蛋白酶K和200μl溶液BL，混匀，

(3)70℃水浴10min，混匀2-3次，

(4)加入200μl无水乙醇，混匀，

(5)将吸附柱放入收集管中，用移液器将步骤(4)所得溶液全部加入吸附柱中，12000rpm室温离心1min，倒掉滤液，

(6)向吸附柱中加入500μl溶液PP，12000rpm室温离心1min，倒掉滤液，

(7)向吸附柱中加入500μl漂洗液GW，12000rpm室温离心1min，倒掉滤液，

(8)将吸附柱于12000rpm室温离心2min，除去残留的漂洗液GW，将吸附柱室温放置数min，晾干吸附材料中的漂洗液，

(9)取出吸附柱，放入1.5ml离心管，加入60-100μl预热(70℃)的洗脱液EB(10mMTris-HCL PH 8.5)静置2min，12000rpm室温离心1min，收集DNA溶液，

(10)用1％琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA的大小及浓度，

(11)用10mM Tris-HCL PH 7.5稀释DNA，用紫外分光光度计测定260nm处吸光值A₂₆₀，用Tris-HCLPH 7.5作为空白对照，按如下公式计算双链DNA(dsDNA)或单链DNA(ssDNA)的浓度：

dsDNA浓度＝A₂₆₀×50×稀释倍数μg/ml

ssDNA浓度＝A₂₆₀×40×稀释倍数μg/ml

(12)用10mM Tris-HCL PH 7.5稀释DNA，用紫外分光光度计测定A₂₆₀和A₂₈₀，计算A₂₆₀/A₂₈₀比值；结果显示纯化得DNA片段1.8＜A₂₆₀/A₂₈₀＜2.0，则表明DNA无蛋白污染，纯度较高，对下游分子实验不产生影响。

实施例2

PCR扩增COX-2基因启动子

根据已知人的COX-2基因启动子序列设计并合成两端引物：

上游(5’端)引物：包含COX-2基因启动子互补碱基，一个HindIII识别位点，三个保护碱基，5’-CCCAAGCTTCCTGGACGTGCTCCTGAC-3’。

下游(3’端)引物：包含COX-2基因启动子互补碱基，一个Bgl II识别位点，二个保护碱基，5’-GAAGATCTTCCTCGACCCTCTAAAGACG-3’。

以基因组DNA为模板，利用常规PCR反应进行扩增，体系如下：

反应条件如下：

扩增产物取5μl用1％琼脂糖凝胶电泳检测；剩余PCR产物用DNA片段中量纯化试剂盒回收纯化备用。

实施例3

COX-2基因启动子和pGL3-Basic质粒的双酶切及酶连

将COX-2 promoter回收产物和pGL3-Basic载体质粒分别用Bgl II和Hind III进行双酶切。酶切体系如下：

37℃酶切过夜后，分别取5μl用1％琼脂糖凝胶电泳，观察双酶切的质粒分子量及浓度。并分别用DNA片段中量纯化试剂盒回收酶切后的pGL3-basic质粒和COX-2promoter目的片断。

将酶切回收后的pGL3-Basic载体质粒和COX-2基因启动子目的片段在200μl的离心管中进行连接反应，酶连体系如下：

16℃酶连5-8h，或酶连过夜。

实施例4

重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞及扩增

将DNA连接酶酶连产物直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过含有氨苄青霉素的LB平板固体培养基中选择培养，从转化子的平板上挑取单菌落，经不含氨苄青霉素的LB液体培养基扩增培养，培养后用试剂盒抽提法提取质粒备用，具体步骤如下：

(1)取-80℃保存的DH5α大肠杆菌感受态细胞悬液200μl，室温下解冻后，置于冰上，

(2)加入20μl连接产物溶液，摇匀，冰上放置30min，

(3)42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5min，热击后置冰上冷却3-5min，

(4)向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp)，混匀，37℃、250rpm振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)，

(5)将上述菌液摇匀后取300μl涂布于含Amp的筛选平板上，放置半h，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h，

(6)待培养皿长出的单菌落后，挑取4个单菌落加入4个装有10ml LB液体培养基(不含Amp)的三角瓶中，37℃、250rpm振荡摇菌过夜(约12-16h)，使含重组质粒的大肠杆菌在LB培养基中大量扩增，

(7)将上述4瓶菌液各取2μl做PCR克隆鉴定，方法及条件同实施例2，结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测，可见4个克隆均均出现560bp的目的片段，显示结果均为阳性。

实施例5

pGL3-Basic-COX-2 promoter重组质粒的提取

pGL3-Basic-COX-2 promoter重组质粒的提取按照质粒小量提取试剂盒的操作提取，所得质粒不含内毒素，可用于转染细胞和其它分子生物学实验，具体步骤如下：

(1)收菌：取5ml上述过夜培养的大肠杆菌菌液，13000rpm室温离心1min，用移液器小心的吸弃上清，

(2)重悬菌液：将250μl Resuspension Buffer(已加RNase A)加入菌液沉淀，Vortex充分悬浮细菌沉淀，

(3)碱裂解：将250μl Lysis Buffer加入重悬菌液，上下翻转6-10次，使菌体裂解不超过5min，至溶液变得清亮，

(4)中和：加入400μl Nentralization Buffer，上下翻转混合6-10次，室温静置5min，13000rpm室温离心10min，

(5)柱预处理：在柱中加入500μl Column Preparation Buffer 13000rpm室温离心1min，弃滤液，

(6)柱结合：将上述步骤(4)的上清液转移至预处理过的Spin Column中，13000rpm室温离心1min，弃滤液，

(7)去蛋白：将500μl的Protein remove Buffer加入柱中，13000rpm室温离心30-60s，弃滤液，

(8)漂洗：将600μl的Wash Buffer加入柱中，13000rpm室温离心30-60s，弃滤液，

(9)重复漂洗：重新加600μl的Wash Buffer加入柱中，13000rpm室温离心30-60s，弃滤液，空柱13000rpm室温离心2min，室温下放置3-5min，除去残留的漂洗液，

(10)洗脱：将柱按置于新的1.5ml的离心管上，在柱膜的中央加入60-100μl 60℃预热的ddH₂O或Elution Buffer，室温静置1min，13000rpm室温离心1min洗脱DNA，

(11)用1％琼脂糖凝胶电泳检测提取的质粒DNA的大小及浓度。

实施例6

重组质粒共转染细胞及双荧光素酶的检测

常规培养人胃上皮癌MKN45细胞：将培养于含有10％新生牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素RPMI-1640完全培养基(37℃5％CO2、饱和湿度)中人胃癌MKN45细胞株，按1-5×10⁵个细胞/孔的量在96孔板中接种指数生长期的细胞，在37℃5％CO₂培养箱中过夜培养，至细胞密度达到90％-95％。

将上述常规培养的人胃上皮癌MKN45细胞随机分为空白组、阴性对照组、重组质粒组和阳性对照组，分别按如下剂量加入不同的质粒进行转染：

(1)空白组：等剂量培养液+pRL-SV40(0.2μg)，n＝3，

(2)阴性对照组：pGL3-Basic(0.2μg)+pRL-SV40(0.2μg)，n＝3，

(3)重组质粒组：pGL3-Basic-COX-2 promoter(0.2μg)+pRL-SV40(0.2μg)，n＝3，

(4)阳性对照组：pGL3-Basic-MDR1(0.2μg)+pRL-SV40(0.2μg)，n＝3，

在1.5ml的离心管中配制待转染质粒和内参质粒pRL-SV40、转染脂质体Liprofectamine^TM2000复合物如下：

将待转染质粒、内参质粒pRL-SV40各0.2μg/孔稀释至25μl/孔不含血清和抗菌素的RPMI-1640中，用100μl的枪混合均匀，然后将转染脂质体悬液(0.5μl/孔)加入25μl/孔不含血清和抗菌素的RPMI-1640中，在室温温育5min，，将两者混合，混匀，静置20min，使质粒与脂质体结合；

分别吸去96孔板中的完全培养基，用不含血清和抗菌素的RPMI-1640润洗一次，每孔加入100μl无血清无抗菌素的RPMI-1640培养基后，在每孔加入62.5μl对应的质粒/脂质体混合物，37℃5％CO₂培养箱培养3-5h后，吸弃孔中培养液，加入100μl含血清含抗菌素的RPMI-1640完全培养液，继续培养44h后收集样品，进行双荧光素酶检测；

按照Ken Real试剂盒说明书指导配制工作液[工作液1：A液(2ml)+B液(40μl)+C液(10μl)混合均匀，用于测定萤火虫荧光素酶活性；工作液2：D液(2ml)+E液(10μl)混合均匀，用于测定海肾荧光素酶活性]。将各组共转染后的细胞培养48h后收集；

细胞的裂解：取出培养基，用PBS洗一次，加入裂解液20μl/孔(96孔)，室温摇动15min，取15-20μl细胞裂解液于1.5ml的离心管中，加入工作液1，设定延迟2sec，发光仪测读10sec加入工作液2，设定延迟2sec，发光仪测读10sec，进行不同质粒转染MKN45细胞后的萤火虫荧光素酶活性比较。

表1是不同质粒转染MKN45细胞后的萤火虫荧光素酶活性实验结果。

表1.

实施例7

COX-2启动子报告基因重组质粒筛选抗肿瘤中药复方和单体的研究

将上述的重组质粒与内参质粒共转染人胃癌MKN45细胞4h后，将共转染MKN45细胞分别加入下述中药复方、单体等药物，并与疗效确切的抗化疗药物5-Fu对照，继续培养24h后，收集各组的细胞，按照实施例7的方法，进行双荧光素酶检测，通过检测COX-2启动子重组质粒荧光素酶活性的判断被检测药物的抗肿瘤作用。

结果显示：与对照组相比，丹参注射液组，黄芪注射液组COX-2启动子重组质粒荧光素酶活性无明显变化(P＞0.05)，中药有效成分华蟾素组、去甲斑蝥素组、丹参酮IIA组、化疗药5-Fu荧光素酶活性明显降低(P＜0.05)，提示所述药物有较好的抗肿瘤活性。在等剂量情况下，抗癌效应强度依次为：化疗药5-Fu、丹参酮IIA、去甲斑蝥素、华蟾素组。实验结果表明，本发明的COX-2启动子报告基因重组质粒能用于筛选抗肿瘤药物，尤其是用于筛选抗肿瘤中药复方和单体。

表2是不同药物对重组质粒转染人胃癌细胞后COX-2活性的影响(×10^-2)。

表2.

Claims (10)

1、一种含COX-2基因启动子和报告基因的重组质粒，其特征是含萤火虫荧光素酶报告基因luc⁺、多酶切位点和β-内酰胺酶基因，通过以含萤火虫荧光素酶报告基因的pGL3-Basic的质粒为载体，插入COX-2基因启动子，构建得含COX-2基因启动子和萤火虫荧光素酶报告基因的pGL3-Basic-COX-2 promoter重组质粒

2、按权利要求1所述的含COX-2基因启动子和报告基因的重组质粒，其特征是所述的重组质粒中的COX-2基因启动子序列中包含NF-κB、NF-IL6、SP-1、AP-2、CRE、E-Box转录位点和TATA框，其长度为252-700bp。

3、按权利要求2所述的含COX-2基因启动子和报告基因的重组质粒，其特征是所述的COX-2基因启动子序列长度为562bp。

4、按权利要求1所述的含COX-2基因启动子和报告基因的重组质粒，其特征是所述的含萤火虫荧光素酶报告基因luc⁺的质粒选自pGL3-Basic Vector4818bp、pGL3-enahncer Vector 5064bp、pGL3-promoter Vector 5010bp或pGL3-control Vector 5256bp。

5、按权利要求4所述的含COX-2基因启动子和报告基因的重组质粒，其特征是所述的含萤火虫荧光素酶报告基因luc⁺的质粒为pGL3-Basic Vector4818bp。

6、按权利要求1所述的含COX-2基因启动子和报告基因的重组质粒，其特征是所述的β-内酰胺酶基因是氨苄青霉素抗性基因。

7、按权利要求1所述的含COX-2基因启动子和报告基因的重组质粒，其特征是其中的载体质粒和COX-2基因启动子都含有Bgl II和Hind III双酶切位点。

8、权利要求1所述的含COX-2基因启动子和报告基因的重组质粒的制备方法，其特征是包括以下步骤：

1)制备含有COX-2启动子基因组DNA

(1)提取含有COX-2启动子基因组DNA；

(2)扩增、纯化COX-2基因启动子目的片段；

2)大量制备pGL3-Basic载体质粒

3)构建稳定表达COX-2基因启动子的重组质粒

(1)含有COX-2基因启动子目的片段和pGL3-Basic载体质粒的双酶切；

(2)酶切后COX-2基因启动子目的片段和pGL3-Basic载体质粒的酶连；

(3)筛选连接后的重组质粒并大量扩增制备。

9、权利要求1的重组质粒在筛选或评价抗肿瘤药物中的用途。

10、按权利要求9的用途，其中所述的筛选或评价是以COX-2基因为作用靶点的抗肿瘤药物的筛选或评价，所述的抗肿瘤药物包括抗肿瘤的化学、生物类药物或中药复方、中药单体或单味中药提取物。

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