CN101671668B

CN101671668B - 一种肝癌靶向性基因表达元件ag及其应用

Info

Publication number: CN101671668B
Application number: CN2009101018143A
Authority: CN
Inventors: 曹江; 贾振宇; 陈萍; 毛晨宇
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2009-08-27
Filing date: 2009-08-27
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2029-08-27
Also published as: CN101671668A

Abstract

本发明提供一种肝癌靶向性基因表达元件AG，具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。本发明提供的表达元件AG在导入甲胎蛋白阳性的肿瘤细胞后，可以在细胞中表达针对GAPDH的人工microRNA，并有效抑制细胞内GAPDH的表达，进而影响到细胞内葡萄糖的代谢，最终阻断细胞内的主要能量供应，特异性地抑制AFP阳性的肝癌细胞的增殖，可在制备AFP阳性的肝癌的靶向基因治疗药物中的应用。

Description

一种肝癌靶向性基因表达元件AG及其应用

技术领域

本发明属生物技术，涉及基因表达调控，具体地说，涉及一种特异性针对甲胎蛋白阳性肝癌的靶向性基因表达元件AG的设计、制备及其在甲胎蛋白阳性的肝癌细胞内特异表达、其产物可以有效地阻断肝癌细胞内的能量供给，使细胞内各种生化反应因能量缺乏而无法进行，从而达到抑制细胞生长和增殖的作用。本发明可用于制备靶向性肿瘤基因治疗药物。

背景技术

恶性肿瘤是目前人类主要“杀手”之一，近年来随着人们生活方式及环境的改变，其发病率呈上升趋势，在许多城市已成为第一位死亡原因，在农村位列第二位。肝癌在我国是最常见的危害极大的恶性肿瘤之一，和肺癌、胃肠道肿瘤、乳癌等其它常见恶性肿瘤相比，目前的手术和化疗等常规方式的疗效和预后均不理想。

被称为肿瘤治疗新模式的生物治疗目前正显示出越来越良好的应用前景。在各种肿瘤生物治疗手段中，基因治疗始终是一个主要方向，我国研制的世界上第一个正式进入临床使用的基因药物、针对许多肿瘤细胞中发生突变的抑癌基因p53的、可表达野生型p53的腺病毒注射液“今又生”即是其代表。随着医学分子生物学技术和知识的飞速发展，各种先进的分子生物学手段都运用到肿瘤的基因治疗研究中。但是由于肿瘤的发生发展涉及众多基因，而目前的研究大都仅针对个别靶基因，因此，这些研究虽然都显示出较好的细胞水平的体外抑瘤效果甚至荷瘤动物模型的体内抑瘤效应，但实际效果并不理想。因此，探索、尝试新的肿瘤基因治疗手段具有十分重要的意义。

正常细胞在各种致癌因素的作用下逐渐发生变化直至最后发生癌变，有相当多的基因表现出过度表达的现象，尤其是一些促进细胞生长、侵袭等恶性表型的基因的过量表达。针对肿瘤中异常表达的基因，人们设计了许多靶向性基因治疗的方法，其中以封闭促进肿瘤生长、侵袭等相关基因的表达的研究是一个相当热门的领域。在以往大量的研究中，人们利用反义RNA(antisense RNA)对肿瘤细胞高表达基因进行封闭，但由于反义RNA本身存在的限制，这类研究在抑制肿瘤细胞生长、控制细胞侵袭迁移等方面虽然取得了较大的成绩，其封闭基因表达的效果仍不理想。

小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)的发现为人为干预细胞中基因的表达提供了一个有力的工具。利用化学合成的双链形式的siRNA，或是由III型启动子带动转录的结构类似的小发卡样RNA(small hairpin RNA，shRNA)，可以通过序列特异性匹配原则降解靶基因，从而对靶基因的表达进行有效的抑制，因此也被尝试应用于基因治疗。但是由于化学合成的siRNA代价太高，而shRNA的表达又不利于调控，这些因素大大地限制了这一技术的应用。

微小RNA(microRNA)是细胞内天然存在的一种小分子RNA，是在基因转录后水平进行表达调控的一种重要方式，能在序列完全匹配的情况下降解靶基因mRNA，也可以在序列非完全匹配的情况下抑制靶基因的翻译，是目前生命科学领域中的一个研究热点，在肿瘤相关microRNA方面也有大量研究，而且大都集中在正常细胞和肿瘤细胞之间表达有差异的各种天然microRNA的发现以及功能鉴定。

由于天然microRNA是由II型启动子带动转录，因此如果人工设计类似的microRNA分子，也应该可以由II型启动子引导转录，而II型启动子的特点是其转录启动功能可以调控，所以其下游的人工miRNA的表达应该可以受到人为控制，而microRNA的作用方式最近的一些文献报道已证实这一设想。

在本发明中我们选择细胞中能量供应的代谢途径为靶点，设计人工microRNA的序列，抑制代谢途径中的关键蛋白的表达，从而阻断细胞内能量供应，使细胞内各种生化反应因能量缺乏而无法进行，从而抑制细胞的生长。由于细胞内提供能量的主要基本物质是葡萄糖，由葡萄糖通过不同的代谢途径分解并产生能量供体腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)。无论是葡萄糖的有氧代谢途径还是无氧代谢途径，都需要经过一个由一分子葡萄糖分解为两分子丙酮酸的过程，其中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)催化的甘油醛-3-磷酸氧化成1，3-二磷酸甘油酸的反应是很重要的一步反应，通过人工microRNA抑制GAPDH的表达，将有效抑制这一重要的生化反应，从而阻断葡萄糖代谢、无法给细胞提供能量。

为了达到对肿瘤细胞的靶向性作用，针对我国高发的、恶性程度高、疗效及预后均较差的肝癌这一瘤种，利用在正常细胞中不表达但在肝癌细胞中高表达的肝癌细胞特异性甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)的特点，重组了AFP基因上游的表达调控序列，用来调控人工设计的microRNA的表达。这一基因表达元件在导入正常细胞后不会有任何表达，而在导入AFP阳性的肝癌细胞后，可以表达出相应的microRNA并有效地阻断肝癌细胞内的能量供给，从而达到靶向性抑制肝癌细胞的生长。

基于本发明的思路，还可以以GAPDH基因的其它位点做为靶序列进行人工microRNA的设计，或是以细胞能量供应途径中其它重要基因作为靶基因来进行细胞能量供应阻断，进而抑制细胞生长和增殖。

发明内容

本发明的目的是提供一种肝癌靶向性基因表达元件AG，是一种DNA分子，具有如SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。其中第7位至第827位为人甲胎蛋白(AFP)基因转录起始点上游第-4113位至第-3292位，该区域含有多个转录增强因子和肝细胞核因子结合位点；第831位至第1012位为人AFP基因转录起始点上游第-182位至第-1位，该区域含有AFP的基本启动子功能；从第1位至第1012位的1012bp片段组成重组的AFP阳性细胞表达调控序列；第1019位至第1692位为5个串联连的针对人GAPDH基因的人工设计的microRNA；第1693位至第2041位为牛生长激素基因多聚腺苷酸信号区，为基因表达提供转录终止信号。

本发明的另一个目的是提供该表达元件AG在制备甲胎蛋白(AFP)阳性的肝癌的靶向基因治疗药物中的应用。所述的表达元件AG在导入AFP阳性的肿瘤细胞后，可以在细胞中表达针对GAPDH的人工microRNA，并有效抑制细胞内GAPDH的表达，进而影响到细胞内葡萄糖的代谢，最终阻断细胞内的主要能量供应，抑制细胞生长和增殖。

所述的表达元件AG可构建靶向性基因治疗药物载体，用于AFP阳性的肝癌的靶向基因治疗。该表达元件中的重组AFP表达调控元件可用于调控其它基因的表达、针对人GAPDH的人工microRNA序列可以用于其它表达载体达到抑制相应细胞中GAPDH的表达目的。

本发明同现有技术相比具有以下优点及效果：利用本发明提供的表达元件可以制备的基因治疗药物，其特点在于以肝癌细胞特异性表达的胚胎性抗原AFP为肿瘤细胞特异性表达调控手段、以肿瘤细胞快速生长所需的能量供应代谢途径中的关键蛋白GAPDH为作用靶点进行表达抑制，有效地阻断细胞内能量供应，特异性地抑制AFP阳性的肝癌细胞的增殖。

附图说明

图1为重组AFP阳性细胞表达调控序列构建PCR产物电泳图。

图2为针对GAPDH的人工microRNA构建PCR产物电泳图。

图3为pDC312-AG酶切鉴定电泳图。

图4为Western blot法检测AG对GAPDH表达的抑制。

图5为MTT法检测结果。

图6为带AG的腺病毒作用后对细胞产生ATP的影响。

图7为动物实验结果。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。这些实施例仅用于说明，但不限制本发明。

实施例1：

重组AFP阳性细胞表达调控序列的克隆

首先从GenBank检索得到人AFP基因的mRNA序列(GenBank登录号：NM_001134)，然后再经网上基因组比对分析方法从GenBank中得到人包括AFP基因在内的第4号染色体的基因组序列(GenBank登录号：NT_006216.14)，并以AFP基因mRNA序列为基准，将其5’端作为AFP基因转录起始点，根据其上游的基因组序列设计合成引物1：5’-AGA TCT CAG ATT GAA TTA TTTGCC TGT CA-3’、引物2：5’-GGA TCC TAG GAA GTT TTC GCA ATA ATAC-3’、引物3：5’-AGA TCT GCC CCA AAG AGC TCT GTG T-3’和引物4：5’-GGATCC AAA TCA TGC TGA AAT TCT TTT ATA CTC-3’，利用聚合酶链反应技术(Polymerase Chain Reaction，PCR)以人肝癌细胞SMMC7721的基因组DNA为模板，用上述引物进行核酸扩增(引物1与引物2、引物3与引物4)，获得扩增产物A(821bp)和B(180bp)，参见图1，其中泳道1，4为1kb DNA Ladder，泳道2为扩增产物A(821bp)，泳道3为扩增产物B(180bp)。

将扩增产物A、B以T-A克隆的方式分别克隆至pGEM T-easy载体(Promega公司，美国)，经DNA序列测定并与基因组序列(NT_006216.14)核对验证其正确性。然后将A经限制性内切酶BamH I和Bgl II双酶切后连至B的5’端的Bgl II位点，成为重组的AFP阳性细胞表达调控序列。

实施例2：

针对人GAPDH的人工microRNA的克隆

从GenBank检索得到人GAPDH基因的mRNA序列(GenBank登录号：NM_002046)，利用网上软件分析该mRNA序列上合适的位点，确定人工microRNA的作用靶点，设计合成引物1：5’-TGC TGT TGA CAG TGA GCGCGC TCA TTT CCT GGT ATG ACA ATA GTG AAG CCA CAG ATG TA-3’、引物2：5’-TCC GAG GCA GTA GGC AAG CTC ATT TCC TGG TAT GAC AAT ACATCT GTG GCT TCA CTATT-3’、引物3：5’-AGATCT GAT CCA AGA AGG TATATT GCT GTT GAC AGT GAG CG-3’和引物4：5’-GGA TCC ATC GTA GCCCTT GAA GTC CGA GGC AGT AGG CA-3’。先将引物1和引物2进行重叠延伸PCR，得到97bp的扩增产物C，再以此扩增产物C为模板，用引物3和引物4进行PCR扩增，得到142bp的扩增产物D，参见图2，其中泳道1为DL2000DNALadder，泳道2为扩增产物C(97bp)，泳道3为扩增产物D(142bp)。

以T-A克隆的方式克隆至pGEM T-easy载体，经DNA测序验证其正确性。此即针对人GAPDH的人工microRNA序列。为了加强其作用效果，用限制性内切酶BamH I和Bgl II双酶切后回收该人工microRNA序列并重新插入同一载体的BamH I位点，获得5个串联连接的人工microRNA序列。

实施例3：

肝癌靶向性基因表达元件AG的构建及腺病毒载体的制备

首先构建pDC312-BGHpA载体：将腺病毒穿梭质粒pDC312载体(Microbix公司，美国)用限制性内切酶Xba I单酶切开，用Klenow酶补平，再用限制性内切酶HindIII单酶切，去掉Xba I到HindIII之间的部分(从HindIII、Sac I、Ecl136 II、Acc I、Sal I到Xba I)，回收部分一端为平端，另一端为HindIII粘性末端。pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen公司，美国)用限制性内切酶PvuII和HindIII双酶切，回收包括HindIII、Asp718、Kpn I、BamH I、BstXI、EcoR I、EcoRV、BstXI、Not I、Xho I、Xba I、Dra II、Apa I和Pme I多克隆位点和牛生长因子基因多聚腺苷酸信号(BGHpA)的片段，一端为HindIII粘性末端，另一端为PvuII的平端。将上述两个片段连接起来，即成pDC312-BGHpA载体，可在多克隆位点上插入启动子和目的基因编码区。

再将实施例1中的重组AFP阳性细胞表达调控序列从载体上用限制性内切酶BamH I和Bgl II双酶切后回收，并插入pDC312-BGHpA的BamH I位点，得到带有重组AFP阳性细胞表达调控序列和BGHpA的腺病毒穿梭质粒。最后将5个串联连接的针对人GAPDH的人工microRNA序列从载体上用限制性内切酶BamH I和Bgl II双酶切后回收，插入此穿梭质粒的BamH I位点，得到带有完整肝癌靶向性表达元件AG的腺病毒穿梭质粒，酶切鉴定结果与预期完全相符，参见图3，其中泳道1为1Kb Plus DNAMarker；泳道2为pDC312-AG经BamH I、Bgl I、EcoR I酶切。

将上述带有完整肝癌靶向性表达元件AG的腺病毒穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E1，3cre(Microbix公司，美国)共转染腺病毒包装细胞293细胞，得到带有表达元件AG的腺病毒载体。

实施例4：

基因表达元件AG对AFP阳性肝癌细胞的靶向性抑制

A、Western blot法检测AG对GAPDH表达的抑制

取对数生长期的AFP阳性的肝癌细胞Hep3B细胞，按3×10⁵细胞/孔的密度接种于6孔板中，培养24小时使其贴壁并达到80％的汇合度。用培养基稀释上述带有表达元件AG的腺病毒，以感染复数(multiplicity of infection，MOI)为100pfu/cell和10pfu/cell感染细胞，48hr后中止作用，提取细胞总蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(10％分离胶，5％浓缩胶)，然后将蛋白转至PVDF膜，封闭后与1∶10000稀释HRP标记的GAPDH抗体(上海康成生物技术有限公司)结合，室温2hr后，用TBST洗膜3次，然后用化学发光试剂盒(Roche公司，美国)显影，X光片暴光。用带绿荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的腺病毒感染和无腺病毒感染的细胞作对照。参见图4，感染带有表达元件AG的腺病毒的AFP阳性肝癌细胞Hep3B中的GAPDH表达明显受到抑制。图中G：带AG腺病毒MOI分别为100和10感染Hep3B肝癌细胞后GAPDH表达；GFP：带GFP腺病毒MOI分别为100和10感染Hep3B肝癌细胞后GAPDH表达；N：未感染腺病毒的Hep3B肝癌细胞中GAPDH表达。

B、体外细胞生长抑制试验(MTT法)

取对数生长期的肝癌细胞Hep3B、HepG2、SMMC7721和乳癌细胞Bcap37(非肝癌细胞)，按2×10³细胞/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时使其贴壁。将带AG的腺病毒以MOI为200pfu/cell、100pfu/cell、50pfu/cell、10pfu/cell、1pfu/cell和0pfu/cell感染细胞。在病毒感染4天后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20ul，37℃继续培养4hr，中止培养。弃去培养上清液，每孔加入DMSO 200ul，振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上测定各孔570nm波长OD值。细胞存活率＝(病毒作用组OD值/病毒未作用组OD值)×100％。每组设立5复孔，重复3遍。从图5可以看出，不同MOI的带AG的腺病毒对不同的肝癌细胞Hep3B、HepG2和SMMC7721的生长均有不同程度的抑制，而对乳癌细胞(非肝癌细胞)Bcap37则无明显抑制。C、带AG的腺病毒作用后对细胞的能量产生ATP的影响

本试验用ATP检测试剂盒(Promega)来测定细胞ATP酶含量。

取对数生长期的肝癌细胞Hep3B，按3×104细胞/孔的密度接种于24孔板中，培养24小时使其贴壁并达到80％的汇合度。将Ad5-miRNA5G以MOI为50pfu/cell感染细胞。病毒作用48hr后，中止培养。用0.25％胰酶消化收集细胞(包括贴壁细胞和已经悬浮的细胞)，用预冷的PBS洗两遍。用血球计数板对每个孔内的细胞进行计数。弃尽PBS，每管加50ul 1％三氯乙酸，用枪头吹打数次至细胞全部悬浮。每管加入500ul的0.5M Tris-醋酸(pH7.75)，混匀，使管内的三氯乙酸浓度降至0.1％以下，pH值中和至7.75。用ReconstitutionBuffer充分溶解rL/L Reagent冻干粉、用试剂盒中提供的ATP-Free的水稀释ATP标准品(10^-7M)至8个浓度梯度(各为10^-9M至10^-16M)。所有试剂在临用之前需保持室温。参数设置：将GloMax TM发光检测仪的读数时间设置为10sec/sample。空白对照：将50ul 1％三氯乙酸和500ul的0.5M Tris-醋酸(pH7.75)混匀作为空白对照样本。1.5ml EP管中加入100ul rL/L Reagent溶液，再加10ul的空白对照样品，用枪头吹打2-3下，将该EP管置入测定仪中，读数，记录数据，此即为背景信号。标准曲线的绘制：用已稀释好的ATP标准液作为样本，读数并记录。以ATP标准品的摩尔数为横坐标，实际测定值为纵坐标制作图表，此即为标准曲线。将待测定的样本稀释1000倍检测，读数并记录。根据标准曲线，计算出ATP含量×1000即为实际的ATP含量。将所测得的ATP含量除以每孔的细胞计数，即可得到单个细胞的ATP含量，同时也使样本之间的数值具有可比性。每组设立5复孔，重复3遍。从图6可以看出，带AG的腺病毒感染后肝癌细胞Hep3B中ATP的产生具有明显下降，而带GFP的对照腺病毒感染肝癌细胞后则无明显变化。图中AG：带AG的腺病毒感染细胞；GFP：带GFP的腺病毒感染细胞；N：未感染细胞。

D、动物试验

收集对数生长期的Hep3B细胞，1000rpm室温离心5min，用PBS洗两遍。细胞计数板计数后，用适量的PBS调整细胞浓度至2.5×10⁷/ml。在BALB/c-nu裸鼠(六周龄，雄性)右背部皮下注射Hep3B细胞悬液1，200ul/只。瘤体长至4～5mm随机分为AG治疗组、GFP组和PBS对照组，每组8只。在首次病毒注射前记录瘤体初始大小。以首次治疗时间记为第1天，分别在第1天、第4天、第7天注射2×10⁸pfu/100ul/只的病毒量，PBS对照组在相同时间点注射100ul/只的PBS。在首次病毒注射后，每3天测量瘤体大小一次。瘤体体积计算公式：V＝(a×b2)/2(a：瘤体长径，b：瘤体短径)。从图7可以看出，带AG的腺病毒对动物皮下种植的肝癌细胞有明显的抑制作用。

本发明涉及的序列

<120>一种新型肝癌靶向性基因表达元件AG及其应用

<160>9

<210>1

<211>2041

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>甲胎蛋白阳性肝癌细胞特异性表达元件AG序列

<400>1

agatctcaga ttgaattatt tgcctgtcat acagctaata attgaccata agacaattag 60

atttaaatta gttttgaatc tttctaatac caaagttcag tttactgttc catgttgctt 120

ctgagtggct tcacagactt atgaaaaagt aaacggaatc agaattacat caatgcaaaa 180

gcattgctgt gaactctgta cttaggacta aactttgagc aataacacat atagattgag 240

gattgtttgc tgttagtata caaactctgg ttcaaagctc ctctttattg cttgtcttgg 300

aaaatttgct gttcttcatg gtttctcttt tcactgctat ctatttttct caaccactca 360

catggctaca ataactgtct gcaagcttat gattcccaaa tatctatctc tagcctcaat 420

cttgttccag aagataaaaa gtagtattca aatgcacatc aacgtctcca cttggagggc 480

ttaaagacgt ttcaacatac aaaccgggga gttttgcctg gaatgtttcc taaaatgtgt 540

cctgtagcac atagggtcct cttgttcctt aaaatctaat tacttttagc ccagtgctca 600

tcccacctat ggggagatga gagtgaaaag ggagcctgat taataattac actaagtcaa 660

taggcataga gccaggactg tttgggtaaa ctggtcactt tatcttaaac taaatatatc 720

caaaactgaa catgtactta gttactaagt ctttgacttt atctcattca taccactcag 780

ctttatccag gccacttatt tgacagtatt attgcgaaaa cttcctagga tctgccccaa 840

agagctctgt gtccttgaac ataaaataca aataaccgct atgctgttaa ttattggcaa 900

atgtcccatt ttcaacctaa ggaaatacca taaagtaaca gatataccaa caaaaggtta 960

ctagttaaca ggcattgcct gaaaagagta taaaagaatt tcagcatgat ttggatctga 1020

tccaagaagg tatattgctg ttgacagtga gcgcgctcat ttcctggtat gacaatagtg 1080

aagccacaga tgtattgtca taccaggaaa tgagcttgcc tactgcctcg gacttcaagg 1140

gctacgatgg atctgatcca agaaggtata ttgctgttga cagtgagcgc gctcatttcc 1200

tggtatgaca atagtgaagc cacagatgta ttgtcatacc aggaaatgag cttgcctact 1260

gcctcggact tcaagggcta cgatggatct gatccaagaa ggtatattgc tgttgacagt 1320

gagcgcgctc atttcctggt atgacaatag tgaagccaca gatgtattgt cataccagga 1380

aatgagcttg cctactgcct cggacttcaa gggctacgat ggatctgatc caagaaggta 1440

tattgctgtt gacagtgagc gcgctcattt cctggtatga caatagtgaa gccacagatg 1500

tattgtcata ccaggaaatg agcttgccta ctgcctcgga cttcaagggc tacgatggat 1560

ctgatccaag aaggtatatt gctgttgaca gtgagcgcgc tcatttcctg gtatgacaat 1620

agtgaagcca cagatgtatt gtcataccag gaaatgagct tgcctactgc ctcggacttc 1680

aagggctacg atggatccac tagtccagtg tggtggaatt ctgcagatat ccagcacagt 1740

ggcggccgct cgagtctaga gggcccgttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt 1800

ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg 1860

ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt 1920

gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca 1980

atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct 2040

g 2041

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据AFP基因组序列设计的AFP上游表达调控序列扩增用引物1

<400>2

agatctcaga ttgaattatt tgcctgtca 29

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据AFP基因组序列设计的AFP上游表达调控序列扩增用引物2

<400>3

ggatcctagg aagttttcgc aataatac 28

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据AFP基因组序列设计的AFP上游表达调控序列扩增用引物3

<400>4

agatctgccc caaagagctc tgtgt 25

<210>5

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据AFP基因组序列设计的AFP上游表达调控序列扩增用引物4

<400>5

ggatccaaat catgctgaaa ttcttttata ctc 33

<210>6

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对GAPDH设计的人工microRNA扩增用引物1

<400>6

tgctgttgac agtgagcgcg ctcatttcct ggtatgacaa tagtgaagcc acagatgta 59

<210>7

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对GAPDH设计的人工microRNA扩增用引物2

<400>7

tccgaggcag taggcaagct catttcctgg tatgacaata catctgtggc ttcactatt 59

<210>8

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对GAPDH设计的人工microRNA扩增用引物3

<400>8

agatctgatc caagaaggta tattgctgtt gacagtgagc g 41

<210>9

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>针对GAPDH设计的人工microRNA扩增用引物4

<400>9

ggatccatcg tagcccttga agtccgaggc agtaggca 38

Claims

1.一种肝癌靶向性基因表达元件AG，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，其中第7位至第827位为人甲胎蛋白基因转录起始点上游第-4113位至第-3292位，该区域含有多个转录增强因子和肝细胞核因子结合位点，第831位至第1012位为人甲胎蛋白基因转录起始点上游第-182位至第-1位，该区域含有AFP的基本启动子功能，从第1位至第1012位的1012bp片段组成重组的AFP阳性细胞表达调控序列，第1019位至第1692位为5个串联连接的针对人GAPDH基因的人工设计的microRNA，第1693位至第2041位为牛生长激素基因多聚腺苷酸信号区，为基因表达提供转录终止信号。

2.根据权利要求1所述的一种肝癌靶向性基因表达元件AG在制备甲胎蛋白阳性肝癌的靶向基因治疗药物中的应用。