CN106497827A

CN106497827A - 一种定向生产抗结核活性和抗肿瘤活性化合物的基因工程菌株及其应用

Info

Publication number: CN106497827A
Application number: CN201610885104.4A
Authority: CN
Inventors: 鞠建华; 马俊英; 黄洪波; 张春燕; 贾艳玺; 李岩
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2016-10-09
Filing date: 2016-10-09
Publication date: 2017-03-15
Anticipated expiration: 2036-10-09
Also published as: CN110218244B; CN106497827B; CN110218244A

Abstract

本发明公开了一种定向生产抗结核活性和抗肿瘤活性化合物的基因工程菌株及其应用。基因工程菌株，其是将链霉菌Streptomyces atratus SCSIO ZH16的基因组中的ialL基因或ilaR基因敲除后获得的基因工程菌株，所述的ialL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的ialR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。基因工程菌株能产生具有抗结核活性和抗肿瘤活性的化合物1、2、3、4、5，显示出其在抗结核药物开发中的重大价值。因此，定向生产具有抗结核和抗肿瘤活性化合物基因工程菌株的成功构建将会加速该类化合物的产业化进程，推动中国海洋药物的发展。

Description

一种定向生产抗结核活性和抗肿瘤活性化合物的基因工程菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程和代谢工程领域，具体涉及一种定向生产抗结核活性和抗肿瘤活性化合物环肽类抗生素ilamycins的基因工程菌株及其应用。

背景技术：

结核病是一个严重的并且是全球流行的传染性疾病，在感染性疾病引起的死亡中位居首位。目前，化疗依然是治疗成人结核病的主要手段。但是，由于结核分枝杆菌独特的致病机理和侵袭特征，能够有效对付结核分枝杆菌的药物依然有限并且药物的使用周期较长，同时伴随着非常严重的毒副作用，患者依从性较差或不能完全按疗程服用药物，致使多重耐药菌或泛耐药的出现和快速传播。另外，结核病与HIV的并发，使得人类对结核病的防控变得更加棘手和困难。我们迫切需要具有新的作用机理和更少毒副作用及不与其他药物发生交叉反应的新的抗结核药物。

另外，随着人口增长、生态环境的恶化和生活方式的改变、癌症已经成为危害人类健康的第一杀手。2008年全球有1270万癌症患者，到2030年，全球癌症病例可能增加75％，预计癌症患者达2220万人。而且现在，化疗药物依然是抗癌的主要手段。但是，现有药物的毒付作用和耐药性的迅速产生，我们迫切需要结构新颖、作用机制独特及具有较少毒副作用的抗肿瘤药物。

海洋微生物(尤其是放线菌)因其所处的独特的生存环境，造就了其进化出适应其极端环境的独特的酶系，具备了产生结构新颖、作用机制独特的化合物的潜能，已经成为了药物开发的新资源。有些菌株可以同时生产多个次级代谢产物，这对于化合物的多样性来说是个优点，但是对于定向的目标药物的开发而言，此优点则变成了缺点。因为药物开发公司更想针对性的拿到具有特定活性的化合物，这样不仅可以节约药物开发的成本，而且可以提高药物开发的效率，保证目标化合物的持续的、快速的供应。

抗生素的生物合成基因簇的发现和基因敲除技术的发展，为生产活性次级代谢产物的菌株的基因工程改造提供了可能和手段。已经有诸多研究通过生物合成和组合生物合成技术成功完成了较多结构复杂的天然产物的结构修饰、改造或某些目标成分的定向积累，构建了一系列活性相当或活性较强的衍生物，或高产突变株，为链霉菌的基因工程改造提供了有益的方法学的借鉴样本，为解决日益棘手的病原微生物的耐药问题和肿瘤疾病的治疗带来了新希望。

Ilamycins是一类结构新颖，成份复杂的环肽类抗生素。该环肽化合物的结构如式(Ⅰ)所示。体外活性分析显示其部分成份对结核分枝杆菌具有显著的抑制活性。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种能定向生产抗结核和抗肿瘤化合物的基因工程菌株。

本发明的定向生产抗结核和抗肿瘤化合物的基因工程菌株，其是通过以下方法构建的，是将链霉菌Streptomyces atratus SCSIO ZH16的基因组中的ialL基因或ilaR基因敲除后获得的基因工程菌株，所述的ialL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的ialR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供链霉菌Streptomyces atratus SCSIO ZH16的基因组中的ialL基因被敲除后的基因工程菌株在制备化合物1和/或化合物2中的应用；

所述的化合物1和2的结构式分别如式(I)中的1和2所示；

本发明的第三个目的是提供链霉菌Streptomyces atratus SCSIO ZH16的基因组中的ialR基因被敲除后的基因工程菌株在制备化合物1、3、4和/或化合物5中的应用；

所述的化合物1、3、4和化合物5的结构式分别如式(Ⅱ)中的1、3、4和5所示；

如式(Ⅲ)所示的化合物5：

如式(Ⅲ)所示的化合物5在制备抗结核药物或抗肿瘤药物中的应用。

所述的抗结核药物优选为抗M.semagamit或M.Tuberlucosis的药物。

一种抗结核药物，其特征在于，含有如式(Ⅲ)所示的化合物5作为活性成分。

本发明的原始菌株链霉菌Streptomyces atratus SCSIO ZH16是一株海洋链霉菌，其在含有3％的ISP2添加20mM的Mg²⁺的ISP2平板上能够生长良好，并且产生较多的孢子。在测试该菌株对不同抗生素的敏感性时发现，该菌株在添加了20mM的Mg²⁺及含有50μg/mL的阿普拉霉素或10μg/mL的硫链丝菌素的ISP2上并上不生长，该菌株在含有50μg/mL三甲氧苄胺嘧啶的培养基上生长良好；而E.coli ET12567/pUZ8002三甲氧苄胺嘧啶极为敏感，这样我们就可以利用阿普拉霉素和三甲氧苄胺嘧啶作为筛选标志，用于突变株的筛选。可以利用硫链丝菌素和三甲氧苄胺嘧啶作为基因回补时的回补突变株的筛选标志。利用大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒Pset152，进行大肠杆菌和链霉菌的种间接合转移，用阿普拉霉素和三甲氧苄胺嘧啶对接合后的链霉菌和大肠杆菌进行药物覆盖，大约4天后，平板上会长出较多的接合子，说明Streptomyces atratus SCSIO ZH16具有较好的接合转移性。该遗传操作体系的建立为该菌株的基因工程改造奠定了坚实的基础。

本发明的原始菌株链霉菌Streptomyces atratus SCSIO ZH16是一株海洋链霉菌，分别通过对其次级代谢产物的生物合成基因簇中的2个P450家族细胞色素氧化酶的基因ilaL和ilaR进行敲除得到了2株能定向生产抗结核活性的ilamycins的工程菌株ΔilaL和ΔilaR。用Am2ab培养基发酵菌株，用丁酮萃取发酵液，经过HPLC-DAD-UV的分析其次级代谢产物。以HPLC程序(待补充)进行分析，分析结果显示，在ΔilaL突变株中可以定向生产两个ilamycins同系物。经HRLCMS分析，在保留时间在24.25min处并有特征紫外吸收值(λ_max230nm,285nm和354nm)的峰，其m/z 1012.5880[M+H]⁺and m/z 1034.5702[M+Na]⁺，在保留时间为23.01min处并有特征紫外吸收值(λ_max230nm,285nm和354nm)的峰，其(m/z1028.5824[M+H]⁺and m/z1050.5654[M+Na]⁺)。为了确定这两个化合物的结构式，故采用8L的规模发酵，利用氯仿甲醇系统和石油醚乙酸乙酯系统进行过硅胶柱分离及HPLC-UV制备得到化合物2的纯品；经核磁共振分析及接合我们以前的两个专利对这两个化合物分离的相关经验，我们确定化合物1和化合物2分别是抗生素ilamycinB1和ilamycin B₂(图1)。利用上述同样的HPLC程序对ΔilaR的突变株进行分析，分析结果显示，该突变株可以生产4个ilamycins同系物，经过进一步的HRLCMS分析，在保留时间为24.25min处并有特征紫外吸收值(λ_max230nm,285nm和354nm)的峰，其，其m/z 1012.5880[M+H]⁺and m/z 1034.5430[M+Na]⁺，该化合物应为ilamycin B₁；在保留时间为23.6min，其m/z 1026.5669[M+H]⁺and m/z1048.5512[M+Na]⁺，在保留时间为23.0min，其m/z 1026.5645[M+H]⁺and m/z 1048.5564[M+Na]⁺，保留时间为21.8min，该化合物对应的m/z 1042.5616[M+H]⁺and m/z 1064.5428[M+Na]⁺。其中后三个化合物应为新化合物。为了确定这三个峰对应的化合物的结构，申请人采用8L的规模发酵处理，过氯仿甲醇系统和石油醚乙酸乙酯系统进行过硅胶柱分离及HPLC-UV制备分别得到化合物3-5的纯品；经核磁共振分析，确定化合物3-5的结构如图1所示，是抗生素ilamycin E1₁、ilamycin E₂和ilamycin F(图1)，其中ilamycin E2和ilamycin F为新化合物。

本发明涉及到ilamycin生物合成基因簇中p450细胞色素氧化酶负责氧化后修饰作用的基因ilaL(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和ilaR(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，分别将其进行置换单独突变后可得到定向生产ilamycins同系物的工程菌株。在ilamycins的生物合成基因簇中，有两个分别命名为ilaL和ilaR的p450细胞色素氧化酶的基因，它们分别编码一个有402个氨基酸的多肽和一个399个氨基酸的多肽。为了确定ilaL和ilaR基因编码的蛋白质IlaL和IlaR在抗生素ilamycins的生物合成中的具体作用，用一个具有阿普拉霉素抗性的DNA片段分别进行阅读框内取代，使得ilaL(图2)和ilaR(图3)失活。将突变粘粒转入到甲基化缺陷的E.coli ET12567/pUZ8002菌株中，与野生型S.atratusSCSIO ZH16菌株进行种间接合转移，得到一些接合子，分别各选取3个抗性表型(阿普拉耐受，卡那霉素敏感)和基因型均正确ΔilaL，ΔilaR与野生型S.atratus SCSIO ZH16菌株同时同条件发酵，野生型菌株作为阳性对照。通过HPLC分析突变菌株ΔilaL的发酵液丁酮萃取，结果表明三个突变株一致地生产2个ilamycins同系物(图4)，ΔilaR突变株一致地生产4个ilamycins的同系物(图5)。这些数据证明了IlaL和IlaR蛋白在ilamycins的生物合成中具有重要作用。

本发明所提供的核苷酸列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明SEQ ID NO.1所示序列的第1～1209位的DNA或SEQ ID NO.2作为探针以Southern杂交等方法从其他生物体中得到与ilaL和ilaR相似的基因。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被体内体外修饰或进行突变，包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化，或通过紫外线或化学试剂诱变等。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性物质或产量。这些外源宿主包括大肠杆菌、链霉菌、小单孢菌、假单孢菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。

本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。

包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。

包含DNA片段或基因可以用来构建定向生产ilamycins或其衍生物的产量的突变株，本发明提供了在基因工程微生物中定向使用的途径。

本发明还提供了利用ilamycins生物合成基因簇中的p450细胞色素氧化酶IlaR在定向生产ilamycins同系物中的应用。

本发明还提供了如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列在制备化合物ilamycins同系物中的应用。

所述的应用是将如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列缺失后，可以定向生产ilamycins同系物中的四个化合物。

总之，本发明所提供的包含ilamycins生物合成相关的后修饰基因和蛋白信息，可以帮助人们理解环酯肽类天然产物生物合成机制，为进一步利用遗传改造的方式得到工程菌株提供了可能。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

本发明的出发菌株暗黑链霉菌Streptomyces atratus SCSIO ZH16，已于2016年3月10日保存到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101，菌株保藏编号为：CGMCCNo.12198。

附图说明：

图1是ilamycins的化学结构式。

图2是ΔialL双交换突变株的构建及PCR验证图，其中ΔialL1、ΔialL2、ΔialL3都为ΔialL双交换突变株，WT是野生型菌株，M为Marker。

图3是ΔilaR双交换突变株的构建及PCR验证图，其中ΔialR1、ΔialR2、ΔialR3都为ΔialR双交换突变株，WT是野生型菌株，M为Marker。

图4是ΔilaL双交换与野生型分别发酵后的HPLC分析结果其，中ΔialL1、ΔialL2、ΔialL3都为ΔialL双交换突变株，WT是野生型菌株。

图5是ΔilaR双交换与野生型分别发酵后的HPLC分析结果，其中ΔialR1、ΔialR2、ΔialR3都为ΔialR双交换突变株，WT是野生型菌株。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1.Streptomyces atratus SCSIO ZH16的培养和遗传操作体系的建立

1.S.atratus SCSIO Zh16的固体培养：

1.1海洋链霉菌S.atratus SCSIO Zh16是从南海深海沉积物中分离得到，该菌种保存于ISP-2培养基斜面，ISP-2培养基组成为：酵母提取粉4g，葡萄糖4g，麦芽提取粉10g，粗海盐30g，琼脂粉20g，水1000mL，pH 7.2-7.4，灭菌备用。

1.2 Streptomyces atratus SCSIO ZH16遗传操作体系的建立

我们研究了Streptomyces atratus SCSIO ZH16在不同培养基上的生长和产孢情况，发现其在含有20nM的Mg²⁺的ISP2培养基上产孢良好。同时，研究了Streptomycesatratus SCSIO ZH16对多种抗菌药物的敏感性情况，被测试的抗菌药物包括：阿普拉霉素(Apramycin，Apm)、氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim,Tmp)、硫链丝菌素等的敏感性，发现S.atratus SCSIO ZH16对阿普拉霉素(50μg/mL)和硫链丝菌素(10μg/mL)敏感，对氨苄西林(100μg/mL)、氯霉素(25μg/mL)、卡那霉素(100μg/mL)有一定的耐药性。甲氧苄氨嘧啶(50μg/mL)对S.atratus SCSIO ZH16无毒性。E.coli ET12567/pUZ8002菌株对甲氧苄氨嘧啶(50μg/mL)非常敏感。此项工作说明，我们可以在基因置换突变时引入阿普拉霉素抗性基因，在接合转移时，可以用阿普拉霉素和三甲氧苄氨嘧啶来筛选获得接合子。利用含有整合型质粒pSET152的ET12567/pUZ8002的大肠杆菌与S.atratusSCSIO ZH16进行接合转移，通过用阿普拉霉素和三甲氧苄氨嘧啶覆盖接合平板，4天左右发现有较多的接合子出现，证明该遗传操作的可行性。为后续实验的开展奠定了良好的基础。

2.S.atratus SCSIO ZH16的基因组文库的构建及含有ilaL和ilaR的粘粒的获得。

2.1 S.atratus SCSIO ZH16的基因组文库的构建

基因组文库的构建方法参照SuperCos1 Cosmid Vector Kit和Gigapck III XLpacking Extract操作手册进行。对Streptomyces atratus SCSIO ZH16进行培养，1.5天后离心，收集菌体，按成熟方法提取其基因组DNA，取适量的高纯度DNA进行不同的酶切时间、不同Sau3AI酶浓度的酶切处理，确定出最佳的反应时间、酶反应浓度后进行同体系的多管酶切，后进行把酶切产物合并进行去磷酸化处理；与此同时用XbaI限制性内切酶处理SuperCos1载体，处理后进行去磷酸化处理；接着对SuperCos1载体进行BamHI的酶切，用酚氯仿抽提的方法进行载体的纯化回收，使之与经Sau3AI酶切处理和去磷酸化的基因组DNA进行连接、体外包装及侵染。把侵染后的菌株涂布在含有卡那霉素的抗性平板上，随机挑取1920个克隆保存在96孔板中，完成菌株的基因组文库的构建。

2.2含有基因ilaL和ilaR的Cosmid 201E的筛选及获得。

S.atratus SCSIO ZH16的基因组完成图的测序工作交由上海凌恩生物有限公司完成。根据凌恩生物有限公司提供的序列，结合在线生物信息学软件和ilamycins的结构特征，我们获得了ilamycins的生物合成基因簇，其中基因簇中的ilaL基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和IlaR基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)均编码细胞色素p450氧化酶。为了研究ilaL和IlaR基因在ilamycins生物合成过程中的功能，我们对其分别进行基因的敲除。根据PCR-targeting操作要求，为了得到能够对ilaL和IlaR进行敲除的粘粒，我们在ila L基因序列的上游和ilaR基因序列的下游设计了两对引物，SAF(5′-CCAGCCACCTCTTCGT AGC-3′)，SAR(5′-CGGTCCGGTCGATCTTTCC-3′)和SBF(5′-CGGAGCCAAGCAGGTCGTC-3′)，SBR(5′-GAGGTCAGGGAAGCGGTTCAG-3′)。分别利用这两对引物，从构建的基因组文库中利用PCR技术筛选阳性克隆。PCR程序如下：95℃5min；95℃45s，58℃45s，72℃60s，30个循环；72℃10min。其中筛选到多个阳性克隆，通过末端测序，我们选定第20号96孔板对应(1，E)位置的克隆(命名为Cosmid 201E)，进行下一步的ilaL和ila R基因的敲除。

3.ilaL基因缺失突变菌株ΔilaL的构建

ilaL基因的阅读框内失活是采用了λ-RED介导的PCR-Targeting技术。包含有ilaL基因的Cosmid 201E被转化入E.coli BW25113/pIJ790中，得到E.coli BW25113/pIJ790/12H8。以已被EcoRI和HindIII酶解过的pIJ773质粒片段为模板，用与ilaL基因分别具有39bp同源臂的敲除引物(ilaLdelF:5'-CCCGAGGTGTTGCACAATCCGATTTCCGCCTATGGGCAGattccggggatccgtcgacc-3',ilaLdelR:5'-GAGGTCAGGGAAGCGGTTCAGCAGTGCGCCGAGCGCCACtgtaggctggagctgcttc-3'大写字母部分代表与ilaL基因同源)进行具有Apr抗性的aac(3)IV-or iT抗性片段的PCR扩增反应。将扩增好的aac(3)IV-oriT抗性片段电转化入E.coli BW25113/pIJ790/12H8感受态细胞中，通过λ-RED介导的同源重组得到改造后的重组cosmid，命名为p201E-ΔilaL。用ilaL基因的PCR验证引物(IDilaLF:5'-TCCTGTGCGGTGCTGCTGAT-3'，IDilaLR:5'-GCGATTCTGCGGGCTGCTTT-3')进行扩增反应确定重组cosmid的正确性。随后，重组p201E-ΔilaL被转入E.coli ET12567/pUZ8002中得到转入了重组p201E-ΔilaL的E.c oli ET12567/pUZ8002，命名为E.coliET12567/pUZ8002/pJu2014，与野生型菌株进行接合转移。

接合转移的过程如下：将野生型S.atratus SCSIO ZH16的孢子在TSB培养液中，28℃震荡培养6-10小时，使其孢子萌发；E.coli ET12567/pUZ8002/pJu2014在加有卡那霉素(Kan,终浓度为50μg/mL)、氨苄青霉素(Amp,终浓度为100μg/mL)、氯霉素(Cml,终浓度为25μg/mL)和阿伯拉霉素(Apm,终浓度为50μg/mL)的LB培养液中培养至光密度值OD＝0.6，离心收集细胞，用无菌的LB液体培养基洗涤两次，然后与萌发好的野生型孢子混合，将混合液平铺在加有20mM MgSO₄和3％的海盐的M-ISP₄固体培养基上；在28℃生长23小时后，每个固体培养基平板上涂布800μL加有三甲氧苄胺嘧啶和阿普拉霉素的抗生素药物的无菌水，其中含甲氧苄氨嘧啶(Tmp,50mg/mL)30μL，阿伯拉霉素(Apm,50mg/mL)30μL；让其在30℃培养箱下生长4-5天，直到接合子出现；双交换突变菌株ΔilaL通过其对抗生素的抗性表型(Kan^S&Apm^R)及基因型而被筛选及鉴定出来，其中ilaL基因缺失的PCR验证分别利用引物(IDilaLF,IDilaLR)的进行PCR扩增反应得到证实，由此得到ilaL基因缺失突变的S.atratus SCSIO ZH16，命名为双交换突变菌株ΔilaL。

ilaR基因缺失突变菌株的构建过程同ΔilaL，但是ilaR的基因缺失引物为delilaRF:5'-TATTCCAAGGACGACGGAAAAGCACTCCAGGACTGGTTCattccggggatccgtcgacc-3'，delilaRR:5'-CAGCACCGGGAACCGTCGCAGCAGCGCGGAGAGTGCGATtgtaggctggagctgcttc-3'大写字母部分代表与ilaR基因同源部分，验证引物IDilaRBF:5'-CGTTAGCAGCGGAGTCGGAATC-3'，IDilaRR:5'-GGTGGATGCGGTGAGGAGGAA-3'。由此得到ilaR基因缺失突变的S.atratus SCSIOZH16，命名为双交换突变菌株ΔilaR。

4.野生型菌株与双交换突变菌株ΔialL和ΔilaR的发酵及其HPLC分析

野生型菌株和双交换突变菌株都在含有20mM Mg²⁺的ISP₂(M-ISP₄)固体培养基平板上30℃培养7-9天，其中双交换突变株的平板同时含有终浓度为30μg/mL的阿普拉霉素；挑取适量孢子接种于装有50mL Am2ab(Am2ab配方：黄豆粉5g/L，可溶性淀粉5g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，酵母提取粉2g/L，MgSO4.7H₂O 0.5g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，NaCl 4g/L，CaCO₃ 2g/L，海盐30g/L，pH 7.2–7.4，其配制方法是将上述各成分按其含量溶于水中，灭菌备用)的培养基的三角瓶中，在30℃和200rpm转速的摇床上培养8-9天。发酵液用2倍体积的丁酮萃取，萃取出有机相液经旋蒸仪蒸干后溶于1mL甲醇中，12000rpm离心5min后，取上清液进行HPLC分析。HPLC分析所用流动相的组成如下：A相，15％乙腈+85％水+0.1％冰醋酸；B相，15％水+85％乙腈+0.1％冰醋酸。HPLC程序为：0～20min，B相10％～100％梯度洗脱；20.1～25.0min，100％B相恒梯度洗脱；25.1-30.0min，10％B相洗脱。UV检测波长(230nm，285nm和352nm)流速为1min/mL。HPLC分析结果见图4和图5。由图可以发现ΔialL突变株仅生产2个ilamycins同系物(图4)；ΔilaR仅生产4个ilamycins同系物(图5)，且每个峰峰之间的保留时间相差较多，极大的方便了化合物的分离。

5.ΔialL和ΔilaR突变株规模化发酵及ilamcyins同系物的分离纯化及结构鉴定

5.1、首先，将突变株ΔialL接种到含有30μg/mL的阿普拉霉素和3％海盐的ISP2平板上，待7-9天孢子生长良好后，取部分孢子接种到含有50mL Am2ab的培养基中于30度摇床培养60小时，按照1:10的比例转接到Am3(黄豆粉5g/L，细菌学蛋白胨15g/L，可溶性淀粉15g/L，甘油15g/L，CaCO₃ 2g/L，海盐30g/L，pH 7.2–7.4，其配制方法是将上述成分按其含量溶于水中，调pH值，灭菌备用)培养基中，放在转速为200rpm的30℃摇床继续培养7-9天，共发酵8L。然后，用大型离心机离心分离菌丝体及上清，上清液用等体积的丁酮萃取3次，菌丝体用丙酮萃取3次，上层有机相40℃减压蒸馏，得到萃取物，根据对菌丝体萃取物和上清液萃取物的HPLC分析结果，把菌丝体萃取物和上清液萃取物进行合并拌样，进行目标化合物的富集和分离。

将菌丝体萃取物和上清液萃取物合并后，经硅胶(100-200目)柱层析分离，采用氯仿–甲醇(体积比100:0，98:2，96:4，94:6，92:8，90:10，80:20和50:50)梯度淋洗，经减压浓缩后，依次得到相应的馏分AFr.1～AFr.8。经HPLC分析，将馏分AFr.1(体积比为100:0的氯仿–甲醇洗脱的馏分)至AFr3(体积比为96:4的氯仿–甲醇洗脱的馏分)合并，经硅胶(100-200目)柱层析分离，采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇系统过B柱(体积比100:0:0，8:2:0，6:4:0，4:6:0，2:8:0，0:100:0,0:95:5和C:M(乙酸乙酯-甲醇)＝9:1)梯度洗淋，经减压浓缩后，依次得到馏分BFr.1-BFr.8。对BFr.5-BFr.8馏分(BFr.5、BFr.6、BFr.7、BFr.8是石油醚-乙酸乙酯-甲醇体积比2:8:0，0:100:0,0:95:5和C:M＝9:1洗脱的馏分)合并后用半制备HPLC进行分离(制备的系统是水(A)：乙腈(B)系统，检测波长是270nm和354nm，制备的程序是0min30％A；0.1-18min 30％-0％A；18.1-23min 100％B；23.1-25min 0％-30％A；25.1-30min30％A，制备柱的规格为5μM×21.2mm×250mm，innoval C18，流速10mL/min)，最终得到化合物2(232mg)和化合物1(89mg)。化合物1的保留时间为R_t＝24.25；m/z 1012.5880[M+H]⁺；m/z1034.5430[M+Na]⁺，HRESIMS确定其分子式为C₅₄H₇₇N₉O₁₀，化合物2的保留时间为R_t＝23.01，m/z 1028.5824[M+H]⁺；m/z 1050.5054[M+Na]⁺，HRESIMS确定其分子式为C₅₄H₇₇N₉O₁₁。通过C谱和H谱分析及与以前的化合物进行对比，确定这两个化合物即是已知化合物ilamycinB₁和ilamycinB₂。结构见图1中的1和2。

5.2、

ΔilaR突变株可以生产4个ilamycins同系物，经过进一步的HRLCMS分析，在保留时间为24.25min处并有特征紫外吸收值(λ_max230nm,285nm和354nm)的峰，其m/z 1012.5880[M+H]⁺and m/z 1034.5430[M+Na]⁺，该化合物为ilamycin B₁；在保留时间为23.6min，其m/z1026.5669[M+H]⁺and m/z 1048.5512[M+Na]⁺，其分子式为C₅₄H₇₅N₉O₁₁，该化合物为ilamycin E₁；在保留时间为23.0min，其m/z 1026.5645[M+H]⁺and m/z 1048.5564[M+Na]⁺，其分子式为C₅₄H₇₅N₉O₁₁，该化合物为ilamycin E₂；在保留时间为21.8min，该化合物对应的m/z 1042.5616[M+H]⁺and m/z 1064.5428[M+Na]⁺，其分子式为C₅₄H₇₅N₉O₁₂，该化合物为ilamycin F。其中后三个化合物应为新化合物。对ΔilaR突变株的发酵方法和萃取方法与ΔilaL突变株的处理方法相同。ΔilaR突变株中化合物的分离步骤如下：

首先，将突变株ΔilaR接种到含有30μg/mL的阿普拉霉素和3％海盐的ISP2平板上，待7-9天孢子生长良好后，取部分孢子接种到含有50mL Am2ab的培养基中于30度摇床培养60小时，按照体积比1:10的比例转接到Am3(黄豆粉5g/L，细菌学蛋白胨15g/L，可溶性淀粉15g/L，甘油15g/L，CaCO₃ 2g/L，海盐30g/L，pH 7.2–7.4)培养基中，放在转速为200rpm的30℃摇床继续培养7-9天，共发酵8L。然后，用大型离心机离心分离菌丝体及上清，上清液用等体积的丁酮萃取3次，菌丝体用丙酮萃取3次，上层有机相40℃减压蒸馏，得到萃取物，根据对菌丝体萃取物和上清液萃取物的HPLC分析结果，把二者的粗提物进行合并拌样，进行目标化合物的富集和分离。

将菌丝体萃取物和上清液萃取物合并后，经硅胶(100-200目)柱层析分离，采用氯仿–甲醇(体积比100:0，98:2，96:4，94:6，92:8，90:10，80:20和50:50)梯度淋洗，经减压浓缩后，依次得到相应的馏分AFr.1～AFr.8。经HPLC分析，将馏分AFr.1(体积比为100:0的氯仿–甲醇洗脱的馏分)至AFr3(体积比为96:4的氯仿–甲醇洗脱的馏分)合并，经硅胶(100-200目)柱层析分离，采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇系统过B柱(体积比100:0:0，8:2:0，6:4:0，4:6:0，2:8:0，0:100:0,0:95:5和C:M(乙酸乙酯-甲醇)＝9:1)梯度洗淋，经减压浓缩后，依次得到馏分BFr.1-BFr.8。通过HPLC分析，对BFr.5进行拌样，以石油醚-乙酸乙酯-氯仿-甲醇系统，过C柱(体积比100:0:0，8:2:0，6:4:0，4:6:0，2:8:0，0:100:0,0:95:5和C:M(乙酸乙酯-甲醇)＝9:1)梯度洗淋，用小瓶接收，通过TLC检测分析表明，CFr.6-CFr.19中含有不同的目标产物，根据TLC的结果进一步合并及制备型HPLC的分离制备。同样对含有目标组份的BFr.7进行拌样过D柱，用与C柱相同的溶液及体系进行洗脱，HPLC分析表明，DFr.6-DFr.8含有化合物4-5；对DFr.5、DFr.6和BFr.8进行合并用氯仿甲醇系统过E柱(体积比100:0，98:2，96:4，94:6，92:8，90:10，80:20)，得到7个馏份，EFr.1-EFr.7，HPLC分析结果表明，EFr.3-EFr.6含有目标化合物5，然后把该三个馏份进行合并用半制备HPLC进行制备。利用(制备的系统是水(A)：乙腈(B)系统，检测波长是270nm和354nm，制备的程序是0min 30％A；0.1-18min 30％-0％A；18.1-23min 100％B；23.1-25min 0％-30％A；25.1-30min 30％A，制备柱的规格为5μM×21.2mm×250mm，innoval C18，流速10mL/min)，得到化合物5(234mg，保留时间为21.8min)，取部分化合物5进行1维和2维的NMR分析，结果表明化合物5是一个新化合物。利用上述同样的半制备方法，分别对馏分CFr.6-CFr.19进行制备，得到化合物1(保留时间为24.25min)，3(保留时间为23.6min)和4(保留时间为23min)，经1维和2维的NMR分析，确定了化合物3-5的化学结构，如图1所示。化合物3、4和5的核磁数据见表1。

表1，化合物3-5的核磁数据。

化合物1-5的结构式分别如图1中的1、2、3、4、5所示。

6.化合物1-5的抗结核活性分析及抗肿瘤分析

6.1、利用肉汤二倍稀释法测试了化合物1-5对分枝杆菌M.smegmatis mc² 155和M.tuberculosis H37R_V的抗菌活性。其中对M.smegmatis mc² 155的抗菌活性测试操作步骤简要描述如下：1)把M.smegmatis mc² 155复苏36小时，使用时稀释1000倍作为待测菌液；2)把化合物1-5用DMSO进行溶解配成浓度为3200μg/mL的储存液；3)按照一定的比例把药物储存液与7H9肉汤(添加了0.2％glycerol，0.05％Tween 80)进行稀释，最后稀释成256-0.125μg/mL的终浓度，每孔的药物肉汤体积为100μL；4)用排枪向96孔板的每个孔中添加100μL稀释好的菌液，使得每行各孔的终浓度依次为128-0.0625μg/mL；用稀释好的菌液和空白肉汤分别作为阳性和阴性对照，每个化合物设3个重复。5)把96孔板放在37℃培养箱进行培养，24小时左右进行结果观察和记录。

利用二倍稀释法测定化合物1-5对M.tuberculosis H37R_V的抗菌活性的测试操作步骤简要描述如下：1)将-80度冻存的自主发光M.tuberculosis H37Rv(UAlRa)以2ml接种至含有50ml 7H9(含有0.1％twin80)培养基的锥形瓶中，培养至OD值达到0.3～1.0之间；2)把化合物1-5用DMSO配置为10mg/mL的母液，再按照一定比例对各化合物稀释至5120-2.5μg/mL，以RIF(10ug/mL，1ug/mL)为阳性对照，DMSO为阴性对照，将相应化合物以每孔5μL加入到96孔酶标板中，每个化合物设三个重复；3)将菌液原液稀释，取发光值达到3000～5000/200μL的稀释菌液为检测用菌液；4)在96孔酶标板中用排枪每孔加入195μL稀释好的菌液，使各化合物的终浓度依次为128-0.0625μg/mL，于37度孵箱内培养，并于第0-7d检测发光值。抗结核活性测试结果见表2。结果显示，化合物2-5具有显著的抗结核活性，在抗结核药物开发领域显示出巨大的经济价值和优越的市场前景。

表2，化合物1-5的抗结核活性。

6.2、化合物1-5对肿瘤细胞生长抑制作用的测试。

实验使用的正常细胞系为LO2和HumV12；肿瘤细胞株为HeLa(人宫颈癌细胞)、HepG2(人肝癌细胞)、A549(人小细胞肺癌细胞)、CNE-2(人鼻咽癌细胞)和MCF-7(人乳腺癌细胞)。

实验方法采用常规的四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)。实验设计空白对照组、阳性对照组、处理组1、处理组2和处理组3。将化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5和阿霉素分别用DMSO配制成不同浓度。将LO2、HumV12、HeLa、HepG2、A549、CNE-2和MCF-7这7种细胞用1640培养基(含10％小牛血清)在含5％CO₂的培养箱中培养，然后稀释成浓度为2×10³个/100μL的细胞悬浮液，将细胞接种于96孔板中，每孔接种100μL，置37℃培养箱孵育12h。空白对照加入50μL DMSO，阳性对照组加入不同浓度的阿霉素，处理组1加入不同浓度的的化合物1，处理组2加入不同浓度的化合物2，处理组3加入不同浓度的化合物3，每个药物浓度3孔。暴露于ophiobolin O中48h，再加入50μL MTT溶液(1mg/mL in PBS)，在37℃下孵育4h后，加入200μL DMSO，用酶标仪测定550nm处吸光值。按公式计算化合物1、2、3、4和5对肿瘤细胞处理后的细胞生存率及半数抑制浓度(IC₅₀)，结果见表3。

表3化合物1-5的抗肿瘤活性测试分析结果。

从表3可以看出，化合物2、3、4具有较好的肿瘤抑制活性，可以用于制备抗肿瘤药物。

Claims

1.一种基因工程菌株，其特征在于，其是将链霉菌Streptomyces atratus SCSIO ZH16的基因组中的ialL基因或ilaR基因敲除后获得的基因工程菌株，所述的ialL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的ialR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1中的链霉菌Streptomyces atratus SCSIO ZH16的基因组中的ialL基因被敲除后的基因工程菌株在制备化合物1和/或化合物2中的应用；

所述的化合物1和2的结构式分别如式(I)中的1和2所示；

3.权利要求1中的链霉菌Streptomyces atratus SCSIO ZH16的基因组中的ialR基因被敲除后的基因工程菌株在制备化合物1、3、4和/或化合物5中的应用；

4.如式(Ⅲ)所示的化合物5：

5.权利要求4所述的如式(Ⅲ)所示的化合物5在制备抗结核药物或抗肿瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抗结核药物为抗M.semagamit或M.Tuberlucosis的药物。

7.一种抗结核药物，其特征在于，含有如式(Ⅲ)所示的化合物5作为活性成分。

8.根据权利要求7所述的抗结核药物，其特征在于，所述的抗结核药物为抗M.semagamit或M.Tuberlucosis的药物。