CN117024611A - 寡糖类抗生素everninomicin高产菌株的构建及活性的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了寡糖类抗生素everninomicin高产菌株的构建及活性的应用。本发明构建了两株寡糖类抗生素everninomicin高产菌株，为重组菌株SCSIO07395‑plus和重组菌株ΔevmGT3‑plus，并从它们的发酵培养物中分离出具有强大抗菌活性的化合物EVND(1)、EVNE(2)、EVNF(3)、EVNG(4)和EVNM(5)，化合物1‑5对革兰氏阳性细菌显示出强大的抑制活性，对革兰氏阴性菌鲍曼弧菌、溶藻弧菌和霍乱弧菌也表现出较强的抑制活性，可以作为抗菌的潜力先导化合物。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及抗生素everninomicin D(1)、everninomicinE(2)、everninomicin F(3)、everninomicin G(4)和everninomicin M(5)高产菌株的构建及其制备方法和活性应用。
背景技术
由小单孢菌产生的everninomicin(EVN)类化合物具有强大的抗菌活性且靶向细菌的核糖体。EVN类化合物具有高度修饰的八糖支架及独特的核糖体结合位点，该位点与目前用于人类治疗的任何其他抗生素不同，从而使其成为一种缺乏交叉耐药性的潜力先导药物。然而，小单孢菌天然菌株中EVNs的产量极低，阻碍了此类化合物的有效制备和详细的构效关系分析。为了克服EVNs产量过低这一难题，
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供寡糖类抗生素everninomicin高产菌株的构建及活性的应用。
本发明的第一个目的是提供寡糖类抗生素everninomicin类化合物EVNs，其结构如式(I)所示：
其中化合物1为EVN D，化合物2为EVN E，化合物3为EVN F，化合物4为EVN G，化合物5为EVN M。
本发明的第二个目的是提供一株上述寡糖类抗生素everninomicin高产菌株，其特征在于，是将evm基因簇中的evmS9至evmM2基因簇片段的cosmid质粒pCSG3310转入到小单孢菌Micromonospora sp.SCSIO 07395中，得到重组小单孢菌SCSIO 07395-plus；或将evmS9至evmM2基因簇片段的cosmid质粒pCSG3310中的evmGT3基因缺失获得质粒pCSG3313，将质粒pCSG3313重复转入一次以上到小单孢菌Micromonospora sp.SCSIO 07395中，获得重组小单孢菌ΔevmGT3，所述evm基因簇序列如SEQ ID NO.1所示。
优选，是将evmS9至evmM2基因簇片段的cosmid质粒pCSG3310中的evmGT3基因缺失获得质粒pCSG3313，将质粒pCSG3313转入到小单孢菌Micromonospora sp.SCSIO 07395中，获得重组小单孢菌ΔevmGT3，再将质粒pCSG3313再次转入重组小单孢菌ΔevmGT3中获得ΔevmGT3-plus。
本发明的第三个目的是提供寡糖类抗生素everninomicin高产菌株SCSIO 07395-plus的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将包含evmS9至evmM2基因簇片段cosmid质粒pCSG3310的质粒通过大肠杆菌S17-1接合转移导入到野生型菌株SCSIO 07395中，得到菌株SCSIO 07395-plus。
优选地，将cosmid质粒pCSG3310转化导入大肠杆菌S17-1中，与野生型菌株SCSIO07395进行菌丝体接合转移，20h后使用萘啶酮酸和卡那霉素覆盖；6-9d后观察接合子，并利用抗性验证获得基因簇部分倍增的重组菌株后，在卡那霉素平板上扩培。
优选地，所述cosmid质粒pCSG3310的制备：利用MaxPlaxTM噬菌体包装试剂盒，构建SuperCos 1为载体的cosmid文库，通过07395_screen_1_F/R和07395_screen_2_F/R两对筛库引物，获得包含evmS9至evmM2片段的cosmid质粒pCSG3310；将pCSG3310转化导入大肠杆菌S17-1中，与SCSIO 07395进行菌丝体接合转移，20h后使用萘啶酮酸和卡那霉素覆盖；6-9d后观察接合子，并利用抗性筛选获得预期的基因簇部分倍增重组菌株，随后在卡那霉素平板上扩培菌种。
本发明的第四个目的是提供寡糖类抗生素everninomicin高产菌株ΔevmGT3-plus的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将evmS9至evmM2基因簇片段的cosmid质粒pCSG3310中的evmGT3基因缺失获得质粒pCSG3313，将质粒pCSG3313通过大肠杆菌S17-1接合转移导入到小单孢菌Micromonospora sp.SCSIO 07395中，获得重组小单孢菌ΔevmGT3，再将质粒pCSG3313通过大肠杆菌S17-1接合转移导入再次转入重组小单孢菌ΔevmGT3中获得ΔevmGT3-plus。
优选地，所述cosmid质粒pCSG3313的制备：将pCSG3310转入大肠杆菌BW25113/pIJ790中，利用PCR-targeting技术和大肠杆菌BT340获得基因evmGT3的同框缺失质粒pCSG3313。
本发明的第五个目的是提供寡糖类抗生素everninomicin类化合物EVNs中的化合物1-5中任一化合物在制备抗菌药物中的应用。
优选地，所述抗菌药物为抑制革兰氏阳性菌株Staphylococcus aureus ATCC29213、Staphylococcus aureus ATCC 43300、Enterococcusfaecalis ATCC 29212、Enterococcusfaecium CCARM 5203、Streptococcus pneumoniae D39、Streptococcuspneumoniae ATCC 49619、Streptococcuspneumoniae 63979、Streptococcuspneumoniae57840、Streptococcus suis SC-19、Streptococcus suis 0810、或革兰氏阴性菌株Acinetobacter baumannii ATCC 19606、Vibrio alginolyticus XSBZ14和Vibriocholerae ATCC 39315的药物。
本发明的第六个目的是提供高产菌株SCSIO 07395-plus或高产菌株ΔevmGT3-plus制备化合物1-5的方法，其特征在于，化合物1-5是从重组菌株SCSIO 07395-plus的发酵培养物中制备分离得到的，化合物5同时能够从重组菌株ΔevmGT3-plus的发酵培养物中制备分离得到。
优选地，具体步骤为：
a、分别制备重组菌株SCSIO 07395-plus和重组菌株ΔevmGT3-plus的发酵培养物，将发酵培养物切碎用乙酸乙酯提取，浓缩除去溶剂后分别得到重组菌株SCSIO 07395-plus的粗提物和重组菌株ΔevmGT3-plus的粗提物；
b、将重组菌株SCSIO 07395-plus的粗提物经Sephadex LH-20凝胶分离，用甲醇洗脱，经过HPLC制备纯化得到化合物1-4；
c、将重组菌株ΔevmGT3-plus的粗提物经Sephadex LH-20凝胶分离，用甲醇洗脱，经过HPLC纯化得到化合物5。
所述的制备重组菌株SCSIO 07395-plus和ΔevmGT3-plus的发酵培养物是将菌株在YD琼脂培养基上接种，在30℃下培养6d，得到发酵培养物，所述的YD琼脂培养基的配方为每升培养基中含有：酵母提取物5g、麦芽糖10g、葡萄糖4g、MgCl22 g、CaCl21.5 g、琼脂20g和水，pH 7.0-7.4。
本研究在EVNs的野生型产生菌株Micromonospora sp.SCSIO 07395中引入了含额外EVNs生物合成基因簇的cosmid质粒pCSG3310，获得重组菌株SCSIO 07395-plus，提高了EVN D-G(1-4)四种化合物的产量，并积累了生物活性中间体EVN M(5)。基于基因簇倍增这一理念，随后在ΔevmGT3突变株中引入硝基糖转移酶编码基因缺失的cosmid质粒pCSG3313，制备得到重组菌株ΔevmGT3-plus，成功高产化合物5，产量为98.6mg L-1。本研究同时系统比较了化合物1-5对耐多药的革兰氏阳性菌如：葡萄球菌、肠球菌和链球菌(纳摩尔效力)以及几种革兰氏阴性菌如：鲍曼不动杆菌、霍乱弧菌和溶藻弧菌的活性，并详细分析了构效关系。与常见商用抗生素比较后发现EVNs对多耐药细菌的抑菌能力与万古霉素、达托霉素和利奈唑胺相当，其中EVNs对肠球菌和链球菌的抑制能力优于万古霉素。总体而言，基因簇倍增的方法对于提升EVNs的产量、拓展其化学多样化及进行详细的构效关系分析具有显著效果。
本发明构建了重组菌株SCSIO 07395-plus和重组菌株ΔevmGT3-plus；并从它们的发酵培养物中分离出everninomicin类化合物化合物EVN D(1)、EVN E(2)、EVN F(3)、EVNG(4)和EVN M(5)；化合物1-5产量明显提高，且具有强大抗菌活性，可以作为抗菌的潜力先导化合物。
Micromonospora sp.SCSIO 07395公开于文献：田小杏.台勾霉素卤化酶缺失突变株ΔtiaM及一株海洋来源放线菌抗菌活性成分研究[D].河南大学。本申请人也持有，并保证自申请日起20年内向公众提供。
附图说明
图1是Micromonospora sp.SCSIO 07395中everninomicin生物合成基因簇evm的示意图。
图2是cosmid质粒pCSG3310的末端测序图。
图3是重组菌株SCSIO 07395-plus构建示意图。
图4是重组菌株SCSIO 07395-plus的发酵提取物质谱检测图及活性化合物物EVND(1)、EVN E(2)、EVN F(3)、EVN G(4)和EVN M(5)的结构。
图5是利用PCR-targeting构建质粒pCSG3313的构建图。
图6是重组菌株ΔevmGT3-plus的构建示意图。
图7是工程菌株ΔevmGT3-plus的发酵提取物的高效液相色谱图及化合物的结构；
图8是化合物EVN D的HRESIMS谱图。
图9是化合物EVN E的HRESIMS谱图。
图10是化合物EVN F的HRESIMS谱图。
图11是化合物EVN G的HRESIMS谱图。
图12是化合物EVN M的HRESIMS谱图。
图13是化合物EVN M的关键2D NMR相关示意图。
图14是化合物EVN M的1H-NMR谱图。
图15是化合物EVN M的13C-NMR谱图。
图16是化合物EVN M的DEPT135谱图。
图17是化合物EVN M的COSY谱图。
图18是化合物EVN M的HSQC谱图。
图19是化合物EVN M的HMBC谱图。
图20是化合物EVN M的X-ray晶体结构。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是本发明的限制。
1.自杀型cosmid质粒pCSG3310的筛选
利用MaxPlaxTM噬菌体包装试剂盒，构建SuperCos 1为载体的cosmid文库，根据ever ninomicin生物合成基因簇(evm:GenBank ON513383，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)上的基因evmS9(5'-gtgagcgagctgcccgcgtt…gcctgcacagtctgtggtga-3'，即如SEQ IDNO.1的第12859位碱基到第14274位碱基所示)和evmM2(5'-tcacgaagcggtctccttcg…cggcctggcaggctgatca c-3'，即如SEQ ID NO.1的第50655位碱基到第51479位碱基所示)(图1)设计引物(表1)对Micromonospora sp.SCSIO 07395的cosmid文库进行筛选，通过07395_screen_1_F/R和07395_screen_2_F/R两对筛库引物，获得包含部分基因簇evmS9至evmM2片段的cosmid质粒pCSG3310。获得阳性克隆子后，对其进行末端测序(图2)，确定该cosmid质粒包含从基因evmS9到evmM2的evm生物合成基因簇，将其命名为pCSG3310。
2.重组菌株SCSIO 07395-plus的构建
通过两亲本接合转移的方法构建SCSIO 07395-plus，将包含部分生物合成基因簇片段(evmS9至evmM2)的cosmid质粒pCSG3310转化导入大肠杆菌S17-1中，与小单孢菌Micromonospora sp.SCSIO 07395进行菌丝体接合转移，20h后使用萘啶酮酸和卡那霉素覆盖；6-9d后观察接合子，利用卡那霉素抗性筛选得到重组菌株SCSIO 07395-plus后(图3)，在卡那霉素平板上扩培菌种。与野生型菌株SCSIO 07395的发酵检测结果比对后发现，重组菌SCSIO 07395-plus中化合物1-4的产量明显提高，此外，还产生了化合物5，经HRESIMS、1H、13C、DEPT135、HSQC、HMBC和COSY等数据分析，确认了这5个化合物的结构(图4)。
LC-HR-MS分析样本制备如下进行：将生长在两个YD培养皿(9cm)上的小单孢菌菌体收集到一个含有1mL 20％甘油的2mL离心管中，并在-80℃下储存；将20μL储存的冰冻菌液接种到一个培养皿中，在30℃下培养6d，用一个1mL枪头制备两个琼脂菌块(约0.5mL)，用1mL乙酸乙酯提取两次，蒸发后所得残留物用100μL乙腈溶解。以14000rpm离心10min后，对2μL上清液进行LC-HR-MS分析。
质谱分析条件：色谱柱为Kromasil 100-3.5-C18柱，直径：2.1×100mm，流动相包括A相和B相，流动相A相：100％的乙腈，流动B相：H2O+0.1％(体积分数)的甲酸；进样程序：0-12min，流动相比例为A相/B相(体积比)：5:95-90:10，12-15min，流动相比例为A相/B相(体积比)：90:10，15.01-20min，流动相比例为A相/B相(体积比)：5:95；流速为0.3mLmin-1，其中1代表化合物1，2代表化合物2，3代表化合物3，4代表化合物4，5代表化合物5；LC-HR-MS使用安捷伦6540UHD精确质量Q-TOF质谱仪和安捷伦1260二元泵LC系统进行。
3.基因evmGT3同框缺失质粒pCSG3313的构建
通过PCR-targeting的方法，设计引物(表1)，在质粒pCSG3310的基础上构建了evmGT3基因缺失的质粒pCSG3313(图5)，将质粒pCSG3313导入小单孢菌SCSIO 07395中，获得小单孢菌ΔevmGT3突变株，缺失菌株evmGT3的化合物5的产量提高。
4.工程菌株ΔevmGT3-plus的构建
将pCSG3310转入大肠杆菌BW25113/pIJ790中，利用PCR-targeting技术和大肠杆菌BT340获得基因evmGT3同框缺失质粒pCSG3313；同时制备小单孢菌ΔevmGT3突变株，将pCSG3313转化导入大肠杆菌S17-1中，通过两亲本接合转移与SCSIO 07395进行菌丝体接合转移，20h后使用萘啶酮酸和卡那霉素覆盖；6-9d后观察接合子，经抗性和PCR复筛验证正确后，松弛培养，梯度稀释获得单菌落，在卡那霉素和无抗平板上对点，获得的无抗菌株再次PCR验证后得到预期的ΔevmGT3基因中断突变株。
通过两亲本接合转移的方法构建ΔevmGT3-plus，将基因evmGT3的同框缺失质粒pCSG3313转化导入大肠杆菌S17-1中，与ΔevmGT3中断突变株进行菌丝体接合转移，20h后使用萘啶酮酸和卡那霉素覆盖；6-9d后观察接合子，利用卡那霉素抗性筛选得到工程菌株ΔevmGT3-plus(图6)，并再次利用抗性筛选获得基因簇部分倍增的重组菌株后，在卡那霉素平板上扩培菌种。与对照ΔevmGT3基因中断突变株的发酵检测结果比较后发现，重组菌株ΔevmGT3-plus中化合物5的产量明显提高(图7)。
高效液相色谱分析样本制备如下进行：将菌株ΔevmGT3和ΔevmGT3-plus在YD琼脂平板上培养；将生长在两个培养皿(9cm)上的小单孢菌菌体收集到一个含有1mL 20％甘油的2mL离心管中，并在-80℃下储存；将20μL储存的菌液接种到一个培养皿中，在30℃下培养6d，用一个1mL枪头制备两个琼脂菌块(约0.5mL)，用1mL乙酸乙酯提取两次，蒸发后所得残留物用100μL乙腈溶解，以14000rpm离心10min。
高效液相分析条件：
高效液相色谱仪为Waters 1525，色谱柱为Luna C18(Phenomenex，250×4.6mm，5μm)，流动相包括A相和B相，流动相A相：100％的乙腈，流动B相：5％(体积分数)的乙腈，溶剂为水，用5mM乙酸铵调节pH至8.0；进样程序：0-20min，流动相比例为A相/B相(体积比)：5:95-90:10，20-25min，流动相比例为A相/B相(体积比)：90:10，25.01-30min，流动相比例为A相/B相(体积比)：5:95，紫外检测波长为300nm，流速为1mLmin-1，随后用氯仿反萃除去铵盐。通过蒸发除去氯仿获得化合物5。
表1.本发明中使用的引物
本发明成功实现了everninomicin生物合成基因簇evm在野生型菌株SCSIO 07395和同框缺失菌株ΔevmGT3中的基因簇部分倍增，并提高一系列EVNs类似物1-5的产量。
5.化合物1-5对致病性细菌的活性评估
测量化合物1-5对13株细菌抑制率达到80％时的最小抑制浓度(MIC80)，包括革兰氏阳性菌株Staphylococcus aureusATCC 29213、Staphylococcus aureusATCC 43300、Enterococcus faecalis ATCC 29212、Enterococcusfaecium CCARM 5203、Streptococcuspneumoniae D39、Streptococcus pneumoniae ATCC 49619、Streptococcuspneumoniae 63979、Streptococcus pneumoniae 57840、Streptococcus suis SC-19、Streptococcus suis 0810和革兰氏阴性菌株Acinetobacter baumannii ATCC 19606、Vibrio alginolyticus XSBZ14和Vibrio cholerae ATCC39315；化合物1-5对所用的革兰氏阳性菌具有较强的活性，包括两株葡萄球菌、两株肠球菌和六株链球菌；化合物1-5对所用的革兰氏阴性菌株鲍曼不动杆菌和两种弧菌菌株也表现出中等抑制活性(表2)。
表2.化合物1-5的抗菌活性(MIC80，μgmL-1)
阿维拉霉素(Avilamycin)、利奈唑啉(Linezolid)和万古霉素(Vancomycin)这三种商用抗生素与EVNs的抗菌谱相似，通过比较EVNs与这3种市售抗生素的体外抗菌活性，进一步评估化合物1-5的活性；化合物1-5对葡萄球菌和肠球菌菌株等多株革兰氏阳性菌的抑制活性优于或与三种商用抗生素相当；化合物1-5对链球菌菌株表现出极其显著的活性，MIC80值计算后达到纳摩尔浓度，优于三种商用抗生素；化合物2能有效抑制三种用于测试的多耐药革兰氏阴性病原菌株，即鲍曼弧菌、溶藻弧菌和霍乱弧菌(表2)。
目前尚未有化合物1-5体外抑菌活性比较详细和系统的评估。以上活性测试实验显示出化合物1-5和三种商用抗生素相比，对革兰氏阳性细菌显示出强大的抑制活性，对革兰氏阴性菌株也具有较强的活性，有助于进一步了解EVNs的结构-活性关系。
以下进一步提供实施例，这些实施实例有助于理解本发明，仅用作说明而不限。
实施例1：重组菌株SCSIO 07395-plus的构建
依据基因组信息和生物信息学分析，设计引物07395_screen_1_F/R和07395_screen_2_F/R(引物序列如表1所示)，从菌株Micromonospora sp.SCSIO 07395的cosmid文库中筛选出克隆子pCSG3310，经末端测序，确认pCSG3310包含everninomicin生物合成基因簇上基因evmS9至evmM2。将pCSG3310转化导入大肠杆菌S17-1中，获得供体菌E.coli S17-1/pCSG3310，通过与小单孢菌Micromonospora sp.SCSIO 07395的菌丝体进行两亲本接合转移。
接合转移过程具体说明如下：小单孢菌SCSIO 07395在YD培养基平板上划线培养5-7d，菌丝体用无菌棉签收集于含20％甘油的菌种保藏管中。接合转移时，取1mL菌丝体保藏液，用1mLTSB培养基清洗一次，离心去上清(10000rpm，10min)，用枪头吹吸分散悬浮于1mL的TSB培养基中，50℃热激10min，然后于28℃萌发4-6h后，离心弃上清，悬浮于500μLTSB中作为接合转移的受体菌。供体菌E.coli S17-1/pCSG3310(即是将质粒pCSG3310转入到E.coli S17-1中获得)在50mL含50μg mL-1卡那霉素的LB液体培养基中于37℃生长至OD600值约为0.6，离心收集菌体(4000rpm，10min)，用LB清洗菌体3遍，悬浮于1mL LB培养基中，作为接合转移的供体菌。取上述受体菌200μL和供体菌250μL混合均匀，涂布于含30mM MgCl2且不含任何抗生素的ISP4固体培养基上，吹干后，于28℃培养20-22h。然后将平板取出，用含有抗生素的无菌水覆盖平板，抗生素终浓度为25μg mL-1萘啶酮酸和50μg mL-1卡那霉素，吹干后，置于28℃培养箱中，培养6-9d后观察接合子。
当接合子长出后，用无菌牙签将其在含25μg mL-1萘啶酮酸和50μg mL-1卡那霉素的1号培养基平板上划线，28℃培养3d后，挑取单菌落在卡那霉素平板上扩培，即利用卡那霉素抗性筛选得到工程菌株SCSIO 07395-plus。
实施例2：evmGT3同框缺失质粒pCSG3313的构建
pCSG3310中编码硝基糖糖基转移酶的基因evmGT3(5'-tcaccgcgcctgcccggtgc…ggcagaaag agtatcttcat-3'，即如SEQ ID NO.1的第34242位碱基到第35384位碱基所示)通过PCR-targe ting的方法被抗性盒aadA和oriT所置换后得到evmGT3缺失的突变质粒pCSG3313。具体的PCR-targeting方法如下：(1)将质粒pCSG3310转入大肠杆菌E.coliBW25113/pIJ790中获得E.coli BW25113/pIJ790/pCSG3310，用10mM的L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统表达，并将其制备成为化转感受态细胞待用。(2)用内切酶EcoRI和HindIII酶切质粒pIJ778，回收其中约1.4kb含有转移原点和壮观霉素抗性基因的DNA片段，以此作为PCR模板，用引物EvmGT3_targeting_F/R通过PCR扩增出1.4kb的PCR产物，50μL的PCR反应体系：高保真DNA聚合酶3U，10×Buffer 5μL，dNTPs 0.5mmol L-1，DMSO 2.5μL，引物各0.5μmolL-1，DNA模板约1ng，加水补至50μL。PCR反应条件为：预变性94℃5min；扩增循环为94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min。将1.4kb的PCR产物回收纯化待用。(3)将PCR产物化转入(1)步骤中制备的感受态细胞使其发生重组，涂布于LB筛选平板(含100μg mL-1壮观霉素和50μg mL-1卡那拉霉素)上，37℃过夜培养。从平板上挑取菌落形态较大单克隆，用含100μg mL-1壮观霉素和50μg mL-1卡那拉霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养，抽提质粒转化大肠杆菌E.coli DH5α，涂布于LB筛选平板(含100μg mL-1壮观霉素)上，37℃过夜培养。从平板上挑取菌落形态较大单克隆，用含100μg mL-1壮观霉素的LB液体培养基37℃过夜培养后，抽提质粒转化能够表达FLP重组酶的大肠杆菌BT340，涂布于LB筛选平板(含100μg mL-1壮观霉素)上，30℃过夜培养后，用引物EvmGT3_TEST_F/R进行PCR验证，将验证正确单克隆在无抗LB平板上划线培养，42℃丢失BT340质粒，利用无抗和含100μg/mL壮观霉素的LB平板进行对点验证，对壮观霉素敏感的菌株再次进行PCR验证，阳性克隆即为基因evmGT3同框缺失的质粒pCSG3313。
实施例3：突变菌株ΔevmGT3的构建
将pCSG3313转化导入大肠杆菌S17-1中，通过与小单孢菌SCSIO 07395的菌丝体进行两亲本接合转移。其接合转移的过程同实施例1中pCSGS3310导入SCSIO 07395的过程一致。
当接合子长出后，用无菌牙签将其在含有25μg mL-1萘啶酮酸和50μg mL-1卡那霉素的1号培养基平板上划线，28℃培养3d后，挑取少量菌体PCR验证获得阳性候选菌株，在1号培养基平板上扩培，用棉签收取菌丝体后于1mL含20％甘油的菌种管中，于1号培养基平板上稀释涂布，6-8d后挑取单菌落分别在无抗和含50μg mL-1卡那霉素的1号培养基平板上对点，对卡那霉素敏感的菌株重新PCR验证，阳性菌落即为硝基糖糖基转移酶基因同框缺失的突变株ΔevmGT3。
1号培养基的组分为：可溶性淀粉10g、yeast extract 4g、蛋白胨2g、CaCO32 g、琼脂20g(固体培养基情况下)加入到1000mL水中，调pH 7.2-7.4，灭菌制得。
实施例4：重组菌株ΔevmGT3-plus的构建
将pCSG3313转化导入大肠杆菌S17-1中，通过与小单孢菌突变株ΔevmGT3的菌丝体进行两亲本接合转移。其接合转移的过程同实施例1中PCSGS3310导入SCSIO 07395。
当接合子长出后，用无菌牙签将其在含有25μg mL-1萘啶酮酸和50μg mL-1卡那霉素的1号培养基平板上划线，28℃培养3d后，挑取单菌落在含50μg mL-1卡那霉素的1号培养基平板上扩培，即利用卡那霉素抗性筛选得到重组菌株ΔevmGT3-plus。
实施例5：化合物1-5的发酵和制备
1、放大发酵培养：
种子培养基的组分为：酵母提取物5g、麦芽糖10g、葡萄糖4g、MgCl22 g、CaCl21.5g、琼脂20g加入到1000mL水中，调pH 7.2-7.4，灭菌制得。发酵培养基和种子培养基相同。
将重组菌株SCSIO 07395-plus和ΔevmGT3-plus储存在-80℃的菌丝体在含YD琼脂培养基的培养皿中接种，在30℃下培养6-8d后将两个YD培养皿上的菌体收集到含有1mL20％甘油的2mL离心管中，于-80℃储存，为小单孢菌冷冻菌体种子；将储存在-80℃的菌丝体20μL接种在一个含有25mLYD琼脂培养基的培养皿上，在28℃下培养6d，分别制得重组菌株SCSIO 07395-plus和ΔevmGT3-plus的发酵培养物。
2、固体发酵物的萃取：
固体发酵培养物先进行切碎处理，加入5L乙酸乙酯在室温下浸提2次，每次3小时，合并提取液，乙酸乙酯减压蒸馏，合并得到固体提取物浸膏。
3、化合物的分离：
将SCSIO 07395-plus发酵培养物得到的浸膏用甲醇溶解并离心，经Sephadex LH-20凝胶分离，用甲醇等度洗脱，每15mL接收1瓶，顺序收集馏分；对所有馏分进行抑制金黄色葡萄球菌的生物活性测定，具体步骤如下：在LB平板上划线金黄色葡萄球菌29213，37℃过夜培养；从平板上挑取单菌落，在LB液体培养基中37℃过夜培养，取100μL菌液于15mL的1％LB固体培养基混匀制备生物测试平板；从每个馏分中取5μL样品，滴加在滤纸片上，在超净台内风干后，用镊子放置于平板上，37℃过夜培养后观察结果。同时对馏分进行TLC检测，并挑选不同Rf值的组分进行HPLC分析，确定含有不同EVNs的馏分，根据生测、TLC和HPLC检测结果，分别合并有活性的馏分；利用高效液相色谱(HPLC)半制备进行纯化；高效液相色谱条件：高效液相色谱仪为Waters 1525，色谱柱为Kromasil 100-5-C18,250×10mm,5μm，流动相包括A相和B相，流动相A相：100％的乙腈，流动B相：5％(体积分数)的乙腈，溶剂为水，用5mM乙酸铵调节pH至8.0；进样程序：0-30min，流动相比例为A相/B相(体积比)：5:95-90:10，30-35min，流动相比例为A相/B相(体积比)：90:10，35-36min，流动相比例为A相/B相(体积比)：90:10-5:95，36-40min，流动相比例为A相/B相(体积比)：5:95，检测波长300nm，流速2.5mLmin-1，随后用氯仿反萃除去铵盐。通过蒸发除去氯仿获得纯EVNs化合物，其中化合物1为EVN D，R1为a(Rt＝14.50min)；化合物2为EVN E，R1为b(Rt＝11.96min)；化合物3为EVN F，R1为c(Rt＝11.0min)；化合物4为EVN G，R1为d(Rt＝14.93min)；化合物5为EVN M，R1为H(Rt＝10.80min)。
将重组菌株ΔevmGT3-plus的浸膏经Sephadex LH-20凝胶分离，用甲醇洗脱，顺序收集馏分；对所有馏分进行抑制金黄色葡萄球菌的生物活性测定，并进行HPLC分析含有EVNs的馏分后，分别合并有活性的馏分；利用高效液相色谱(HPLC)半制备进行纯化；高效液相色谱条件：高效液相色谱仪为Waters 1525，色谱柱为Kromasil 100-5-C18,250×10mm,5μm，流动相包括A相和B相，流动相A相：100％的乙腈，流动B相：5％(体积分数)的乙腈，溶剂为水，用5mM乙酸铵调节pH至8.0；进样程序：0-30min，流动相比例为A相/B相(体积比)：5:95-90:10，30-35min，流动相比例为A相/B相(体积比)：90:10，35-36min，流动相比例为A相/B相(体积比)：90:10-5:95，36-40min，流动相比例为A相/B相(体积比)：5:95，检测波长300nm，流速2.5mLmin-1，随后用氯仿反萃除去铵盐。通过蒸发除去氯仿获得化合物5，化合物5为EVN M，R1为H(Rt＝10.80min)。
化合物1、2、3、4、5的结构式如式(I)所示：
4、化合物的鉴定：
化合物1-4的结构经HRESIMS鉴定，化合物5的结构经HRESIMS、1H、13C、DEPT135、HSQC、HMBC、COSY和X-ray晶体衍射鉴定，其核磁数据归属见表3，化合物EVN D(1)的HRESIMS谱图见图8，化合物EVN E(2)的HRESIMS谱图见图9，化合物EVN F(3)的HRESIMS谱图见图10，化合物EVN G(4)的HRESIMS谱图见图11，化合物EVN M(5)的谱图见图12-20。
由此确定化合物1-5的结构式如下所示：
表3.化合物EVN M(5)的NMR(700MHz)核磁数据归属
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实施例6:化合物1-5抗菌活性MIC80值的测定
使用96孔板微量稀释法测定MIC80来评估化合物1-5和阿维拉霉素(Avilamycin)、利奈唑啉(Linezolid)和万古霉素(Vancomycin)三个商用抗生素的抗菌活性；测定了化合物1-5和三种商用抗生素对13种指示菌：革兰氏阳性菌株Staphylococcus aureusATCC29213、Staphylococcus aureus ATCC 43300、Enterococcusfaecalis ATCC 29212、Enterococcusfaecium CCARM 5203、Streptococcus pneumoniae D39、Streptococcuspneumoniae ATCC 49619、Streptococcuspneumoniae 63979、Streptococcuspneumoniae57840、Streptococcus suis SC-19、Streptococcus suis 0810和革兰氏阴性菌株Acinetobacter baumannii ATCC 19606、Vibrio alginolyticus XSBZ14和Vibriocholerae ATCC 39315的抑制活性。将化合物溶解在合适的溶剂中以制备浓度为1.28mg/mL的抗生素储备液(DMSO：1-5、AVIA、利奈唑胺；H2O：万古霉素)。从平板上分别挑取13种指示菌的新鲜细菌菌落，在合适的培养基中于37℃培养，200rpm培养16h[Mueller-Hinton肉汤用于金黄色葡萄球菌ATCC 29213、金黄色葡萄球菌ATCC 43300，鲍曼不动杆菌ATCC 19606，溶藻弧菌XSBZ14，霍乱弧菌ATCC 39315；LB用于粪肠球菌ATCC 29212；胰蛋白酶大豆肉汤(包括10％新生小牛血清)用于猪链球菌SC-19、猪链球菌0810、屎肠球菌CCARM 5203；胰蛋白酶大豆肉汤(包括5％新生小牛血清和2.5％羊血)用于肺炎链球菌D39、肺炎链球菌ATCC49619、肺炎链球菌63979和肺炎链球菌57840]。通过离心(5000rpm/min，10min)收集细胞并重新悬浮在各自的新鲜培养基中以达到0.5的OD600值。将这些细胞悬浮液添加到新鲜培养基(0.1％，v/v)中来制备细菌储备液，加入到96孔板中；在两个并排放置的标准96孔板(共24列)中分别在第2至18列的每个孔中加入100μL细菌原液，在第1列的孔中分别加入190μL细菌原液；96孔板上第18列为不含化合物的菌液对照，第19列是不含化合物和细菌的空白培养基对照，其余5列未使用；将不同的10μL抗生素原液分别添加到第1列的孔中，并将100μL液体转移到下一列，然后充分混合等倍稀释到终浓度64-0.000977μg/mL，丢弃从第17列中取出的100μL混合物；用于MIC80测定的96孔板在37℃下孵育40h，在测量吸光度值之前，使用移液器将细菌培养物彻底混合，以避免测量不准确；用酶标仪测定各孔的吸收值；本研究采用的MIC80值定义为化合物抑制生长80％的最低浓度。抑制率计算如下：
抑制率(％)＝[1-(A样品-A样品背景)/(A阴性对照-A空白对照)]×100％，抑制率>80％为MIC值。其结果见表2。
SEQ ID NO.1(基因簇evm核苷酸序列)
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Claims (10)
1.寡糖类抗生素everninomicin类化合物EVNs，其结构如式(I)中的任一所示：
其中化合物1为EVN D，化合物2为EVN E，化合物3为EVN F，化合物4为EVN G，化合物5为EVN M。
2.寡糖类抗生素everninomicin高产菌株，其特征在于，是将evm基因簇中的evmS9至evmM2基因簇片段的cosmid质粒pCSG3310转入到小单孢菌Micromonospora sp.SCSIO07395中，得到重组小单孢菌SCSIO 07395-plus；或将evmS9至evmM2基因簇片段的cosmid质粒pCSG3310中的evmGT3基因缺失获得质粒pCSG3313，将质粒pCSG3313重复转入一次以上到小单孢菌Micromonospora sp.SCSIO 07395中，获得重组小单孢菌ΔevmGT3，所述evm基因簇序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求2所述的寡糖类抗生素everninomicin高产菌株，其特征在于，是将evmS9至evmM2基因簇片段的cosmid质粒pCSG3310中的evmGT3基因缺失获得质粒pCSG3313，将质粒pCSG3313转入到小单孢菌Micromonospora sp.SCSIO 07395中，获得重组小单孢菌ΔevmGT3，再将质粒pCSG3313再次转入重组小单孢菌ΔevmGT3中获得ΔevmGT3-plus。
4.寡糖类抗生素everninomicin高产菌株SCSIO 07395-plus的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将包含evmS9至evmM2基因簇片段cosmid质粒pCSG3310的质粒通过大肠杆菌S17-1接合转移导入到野生型菌株SCSIO 07395中，得到菌株SCSIO 07395-plus。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将cosmid质粒pCSG3310转化导入大肠杆菌S17-1中，与野生型菌株SCSIO 07395进行菌丝体接合转移，20h后使用萘啶酮酸和卡那霉素覆盖；6-9d后观察接合子，并利用抗性验证获得基因簇部分倍增的重组菌株后，在卡那霉素平板上扩培；
所述cosmid质粒pCSG3310的制备：利用MaxPlaxTM噬菌体包装试剂盒，构建SuperCos1为载体的cosmid文库，通过07395_screen_1_F/R和07395_screen_2_F/R两对筛库引物，获得包含evmS9至evmM2片段的cosmid质粒pCSG3310；将pCSG3310转化导入大肠杆菌S17-1中，与SCSIO 07395进行菌丝体接合转移，20h后使用萘啶酮酸和卡那霉素覆盖；6-9d后观察接合子，并利用抗性筛选获得预期的基因簇部分倍增重组菌株，随后在卡那霉素平板上扩培菌种。
6.寡糖类抗生素everninomicin高产菌株ΔevmGT3-plus的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将evmS9至evmM2基因簇片段的cosmid质粒pCSG3310中的evmGT3基因缺失获得质粒pCSG3313，将质粒pCSG3313通过大肠杆菌S17-1接合转移导入到小单孢菌Micromonospora sp.SCSIO 07395中，获得重组小单孢菌ΔevmGT3，再将质粒pCSG3313通过大肠杆菌S17-1接合转移导入再次转入重组小单孢菌ΔevmGT3中获得ΔevmGT3-plus；
所述cosmid质粒pCSG3313的制备：将pCSG3310转入大肠杆菌BW25113/pIJ790中，利用PCR-targeting技术和大肠杆菌BT340获得基因evmGT3的同框缺失质粒pCSG3313。
7.权利要求1中的寡糖类抗生素everninomicin类化合物EVNs中的化合物1-5中任一化合物在制备抗菌药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗菌药物为抑制革兰氏阳性菌株Staphylococcus aureusATCC 29213、Staphylococcus aureusATCC 43300、Enterococcusfaecalis ATCC 29212、Enterococcusfaecium CCARM 5203、Streptococcuspneumoniae D39、Streptococcus pneumoniaeATCC 49619、Streptococcuspneumoniae 63979、Streptococcuspneumoniae 57840、Streptococcussuis SC-19、Streptococcus suis 0810、或革兰氏阴性菌株Acinetobacter baumanniiATCC 19606、Vibrio alginolyticus XSBZ14和Vibrio cholerae ATCC 39315的药物。
9.寡糖类抗生素everninomicin高产菌株SCSIO 07395-plus或高产菌株ΔevmGT3-plus制备化合物1-5的方法，其特征在于，化合物1-5是从重组菌株SCSIO 07395-plus的发酵培养物中制备分离得到的，化合物5同时能够从重组菌株ΔevmGT3-plus的发酵培养物中制备分离得到。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，具体步骤为：
a、分别制备重组菌株SCSIO 07395-plus和重组菌株ΔevmGT3-plus的发酵培养物，将发酵培养物切碎用乙酸乙酯提取，浓缩除去溶剂后分别得到重组菌株SCSIO 07395-plus的粗提物和重组菌株ΔevmGT3-plus的粗提物；
b、将重组菌株SCSIO 07395-plus的粗提物经Sephadex LH-20凝胶分离，用甲醇洗脱，经过HPLC制备纯化得到化合物1-4；
c、将重组菌株ΔevmGT3-plus的粗提物经Sephadex LH-20凝胶分离，用甲醇洗脱，经过HPLC纯化得到化合物5；
所述的制备重组菌株SCSIO 07395-plus和ΔevmGT3-plus的发酵培养物是将菌株在YD琼脂培养基上接种，在30℃下培养6d，得到发酵培养物，所述的YD琼脂培养基的配方为每升培养基中含有：酵母提取物5g、麦芽糖10g、葡萄糖4g、MgCl22 g、CaCl21.5 g、琼脂20g和水，pH 7.0-7.4。
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