CN109468253B - 一种高产雷帕霉素的吸水链霉菌 - Google Patents

一种高产雷帕霉素的吸水链霉菌 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高产雷帕霉素的吸水链霉菌。所述吸水链霉菌（Streptomyces rapamycinicus）是采用基因敲除使吸水链霉菌（Streptomyces rapamycinicus）NRRL 5491缺失基因组中4083721‑4085064位部分或全部序列的突变株。本发明的菌株可用于工业化生产雷帕霉素，与NRRL 5491菌株相比，雷帕霉素发酵产量达1567.27mg/L，提高125.13%。

Description

一种高产雷帕霉素的吸水链霉菌
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种吸水链霉菌及其产雷帕霉素的应用。
背景技术
链霉菌是放线菌纲中最大的一个属，具有复杂的形态分化和次生代谢途径，可产生多种具重要价值的天然代谢物，目前临床上应用的抗生素约2/3来源于链霉菌，如链霉素、红霉素、克林霉素等，另外链霉菌属产生的代谢物还包括抗肿瘤剂、免疫抑制剂等如阿霉素、环孢素、雷帕霉素等。其中雷帕霉素是1975年首次从吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）中分离获得一种大环内酯类抗生素，现已开发为一种新型强效免疫抑制剂，并广泛应用于临床研究。雷帕霉素（Rapamycin, C51H79NO13）又称西罗莫司，其免疫抑制作用相比目前临床使用的免疫抑制药物环孢素A和他克莫司（FK506），具口服剂量更小、抗排异作用更强，且副作用更少等优势。1999年美国FDA批准其作为新型临床抗肾移植排斥反应药物，2010年获中国食品药品监督管理局（CFDA）批准上市，雷帕霉素上市以后，迅速成为世界各地器官移植者的首选口服强效免疫抑制剂。近年来，在自然科学国际杂志Nature、Science、Cell等研究表明雷帕霉素在抗肿瘤（胰腺癌、肝癌、肺癌）、抗衰老、神经系统疾病（阿尔茨海默病、帕金森病）及代谢性疾病（糖尿病、肥胖症）等方面取得一系列进展。2016年国际杂志eLife新研究证实雷帕霉素可将小鼠寿命延长60%，这项研究中最“年长”的小鼠存活了1400天，对于一个人来说，相当于活了140岁。这些科研成果有效预示了雷帕霉素应用前景十分广阔。
目前提高雷帕霉素产量主要通过诱变育种、发酵条件优化等方法。但诱变筛选途径存在诱变不定向性和工作量大等缺点，发酵条件优化提升菌株产量的空间有限。现有技术中，国内雷帕霉素最高发酵水平不足1g/L，导致工业化生产成本较高，雷帕霉素原料药及药品零售价也相应较高。因此，发酵产量较低成为雷帕霉素普及应用的制约瓶颈，利用基因工程手段定向改造吸水链霉菌为提高雷帕霉素产量提供了一个新途径。
发明内容
针对目前缺少高产雷帕霉素菌株的问题，本发明提供一种吸水链霉菌突变株，通过基因敲除可以使突变株的雷帕霉素产量大幅提高。
本发明的另一目的在于提供一种敲除上述基因的吸水链霉菌在工业化生产雷帕霉素的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种吸水链霉菌（Streptomyces rapamycinicus），是采用基因敲除方法使吸水链霉菌（Streptomyces rapamycinicus）NRRL 5491缺失基因组中4083721-4085064位部分或全部序列的突变株。部分缺失的序列可以为连续一段或者相互间隔的几段。
所述吸水链霉菌（Streptomyces rapamycinicus）NRRL 5491的基因组序列为GenBank: CP006567.1。所述基因组中4083721-4085064位的序列，简称为A基因，如SEQ IDNo: 1所示。所述述吸水链霉菌NRRL 5491可以通过商业化购买获得。
一株吸水链霉菌（Streptomyces rapamycinicus）所述菌株为吸水链霉菌（Streptomyces rapamycinicus）NRRL 5491敲除基因组4084274-4084660位碱基的突变株。所述菌株的基因组中包含如SEQ ID No: 2所示的序列。所述菌株的保藏编号为CGMCC No.16009。
一种上述吸水链霉菌的制备方法，包括以下步骤：
（1）合成缺失4083721-4085064位部分基因的序列，获得截短基因；
（2）将截短基因插入含抗生素抗性基因的质粒，得到截短基因的重组质粒；
（3）将重组质粒转化到感受态大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；
（4）将重组大肠杆菌中的截短基因导入吸水链霉菌；再通过抗性筛选得到包含截短基因的吸水链霉菌，即基因敲除的突变株。
步骤（1）中，截短基因缺失4084274-4084660位碱基。
步骤（2）中，所述质粒为pKC1139。优选为插入pKC1139的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点间。
步骤（3）中，利用热激转化法将截短基因的重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞。大肠杆菌优选为ET12567感受态细胞。
步骤（4）中，通过接合转移方式将截短基因导入吸水链霉菌。
步骤（4）中，抗性筛选方法为通过PCR的方法扩增抗性基因，能够扩增出相应条带的为阳性接合子。所述抗性基因优选为安普霉素抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID No: 3所示。
根据SEQ ID No: 3序列合成可以扩增安普霉素抗性基因的上游引物Apra-F和下游引物Apra-R，如SEQ ID No: 4和SEQ ID No: 5所示，通过PCR的方法扩增安普霉素抗性，能够扩增出条带的为阳性接合子。
作为优选，步骤（4）后还包括对基因敲除的突变株产雷帕霉素能力进行筛选的步骤。
所述筛选方法为以白色念珠菌作为生物检定菌，采用滤纸片扩散法进行高通量筛选；抑菌圈大的菌株即为目标菌株。或者将菌株作为摇瓶发酵，发酵液经2倍体积无水乙醇浸提后，取离心的上清液进行HPLC定量检测，产量最高的菌株即为目标菌株。或者先采用滤纸片扩散法进行高通量筛选；将抑菌圈大的菌株再进行摇瓶发酵，发酵液经2倍体积无水乙醇浸提后，取离心的上清液进行HPLC定量检测，产量最高的菌株即为目标菌株。
上述吸水链霉菌在生产雷帕霉素的用途。
本发明具有以下有益效果：
本发明利用基因敲除技术对吸水链霉菌NRRL 5491基因组位置为4083721-4085064的调控基因编码区进行了插入敲除。经试验证明，采用本发明的吸水链霉菌基因敲除突变株进行雷帕霉素的生产，与NRRL 5491菌株相比，雷帕霉素发酵产量达1567.27mg/L，提高125.13%。本发明首次将4083721-4085064位调控基因用于吸水链霉菌生产雷帕霉素的分子改造，是雷帕霉素高产育种的一个新方法。本发明构建的吸水链霉菌突变株，为雷帕霉素的工业化高产技术提供了菌种基础。
菌种保藏信息
吸水链霉菌（Streptomyces rapamycinicus），于2018年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO 16009。
附图说明
图1为实施例1吸水链霉菌A基因敲除突变株PCR鉴定电泳图；
图2为实施例1中滤纸片扩散法初筛吸水链霉菌A基因敲除突变株图；
图3为实施例1中HPLC定量检测吸水链霉菌A基因敲除突变株及NRRL 5491菌株对照图；
图4为实施例1中吸水链霉菌A基因敲除突变株与NRRL 5491菌株生产雷帕霉素产量对照。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 吸水链霉菌A基因敲除突变株的构建
（1）基因敲除片段合成
采用全基因合成方法合成缺失第553位至939位之间的编码基因的A基因，标记为A △，截短片段的核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示，该片段连接到pKC1139质粒的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点，构建得到A基因敲除质粒，标记为pKC1139-A △。
（2）大肠杆菌ET12567感受态的制备
将保存于-80℃的大肠杆菌ET12567菌种划线活化（25μg/mL 卡那霉素，25μg/mL氯霉素），37℃培养12 h；挑取单菌落接种于5 ml液体LB培养基，37℃，220 rpm振荡培养12h；按1:100转接于摇瓶扩大培养，37℃，220 rpm振荡培养至OD600=0.6；菌液冰浴30 min，无菌条件下倒入50 mL Beckman离心管中，4℃，4000 rpm离心10 min；弃上清，冰浴条件下加入10 mL预冷的0.1M CaCl2，轻悬细胞；冰浴30 min，4℃，4000 rpm，离心10 min；弃上清，冰浴条件下加入2 mL预冷的无菌0.1 M CaCl2和16%甘油水溶液，轻悬细胞，分装200 µL/管于-80℃保存备用。
（3）基因敲除质粒热激法转化大肠杆菌ET12567感受态细胞
将上一步骤获得的大肠杆菌ET12567感受态置于冰上融化，将pKC1139-A △质粒加至感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min；42℃热激90 s，迅速冰浴3-5 min；加入800 µL LB液体培养基，37℃振荡培养1 h；5000 rpm，离心1 min以浓缩菌液，用200 µL LB液体培养基重悬菌体，取适量菌液均匀涂布于含50 μg/mL安普霉素，25 μg/mL卡那霉素，25 μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，28 ℃培养过夜。
（4）大肠杆菌ET12567（含pKC1139-A △）的准备
挑取单菌落于试管，振荡培养过夜。按1:100转接至摇瓶培养基，28 ℃培养至OD600=0.6，5000 rpm收集菌体，等体积LB培养基洗涤2次，洗净抗生素，重悬于LB培养基中至大肠杆菌培养浓度为108 cfu/mL。
（5）吸水链霉菌的准备
吸水链霉菌NRRL 5491菌株于燕麦固体培养基划线，28℃培养14d，加无菌水刮取新鲜成熟孢子悬浮于三角烧瓶（含玻璃珠），28℃摇床振荡培养1h；50℃水浴热激10min，迅速冰浴冷却，加等体积孢子预萌发培养基，28℃摇床培养2h；离心收集孢子，弃上清，重悬于无菌水中至孢子浓度为108 cfu/mL。
上述燕麦培养基成分（g/L）：燕麦粉20，pH 7.0；固体培养基添加1.5%琼脂粉，pH7.0；
预萌发培养基成分（g/L）：酵母膏10，蛋白胨10，CaCl2 1，pH 7.0。
（6）接合转移
按1:1将步骤（4）中的大肠杆菌与步骤（5）中的吸水链霉菌孢子悬液混匀，4000rpm，离心30 s收集菌体，重悬菌体于少量上清液中，涂布于燕麦固体培养基，28 ℃培养16h，取1 mL无菌水（含25 μg/mL萘啶酮酸、25 μg/mL卡那霉素、25 μg/mL安普霉素）涂布平板，28 ℃继续培养3 d至接合子可见。
（7）抗性基因的PCR验证
根据安普霉素抗性基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，合成可以扩增安普霉素抗性基因的引物Apra-F和Apra-R，引物序列如下：
Apra-F: 5’-GCAATACGAATGGCGAAAA-3’（SEQ ID NO. 4）
Apra-R: 5’-CAGTTGACCCAGGGCTGTC-3’（SEQ ID NO. 5）
用细菌基因组提取试剂盒提取NRRL 5491菌株和步骤（6）中得到的接合子的基因组基因，提取步骤参照OMEGA公司的细菌基因组提取试剂盒说明书。
以上述基因组基因为模板，用Apra-F/Apra-R引物进行PCR扩增鉴定，DNA电泳结果如图1所示，其中，M：DNA Ladder，1：阳性对照（安普霉素抗性基因），2：阴性对照（NRRL 5491菌株），3-11：获得的不同接合子的PCR产物。由图1可知，阳性接合子能够扩增到695 bp的片段，经DNA测序验证该片段为安普霉素抗性基因，而NRRL 5491菌株结果为阴性，表明pKC1139- A △重组质粒已整合到链霉菌基因组。
（8）滤纸片扩散法高通量初筛
将接合子于燕麦培养基划线培养4 d，标记编号，转移至高通量筛选管（ZL201720837826.2），28 ℃培养4 d，取发酵液400 μL并加入800 μL无水乙醇，60 ℃浸提2 h，12000 rpm，离心10 min，上清液即为雷帕霉素待测液。以白色念珠菌作为雷帕霉素生物检定菌，采用滤纸片扩散法进行初筛：检定菌培养基灭菌后倒于φ90 mm平板，每平板20 mL。将5 mL 0.8%的琼脂水溶液冷却至50 ℃时加入约0.1 %检定菌悬液，用倾注法在检定菌培养基平板上铺成均匀薄层制备成双层平板，待凝固后使用。将灭菌后的φ6 mm滤纸片均匀分布贴于平板表面，每种待测样品液吸取2 μL滴于滤纸片，28 ℃培养2 d。利用游标卡尺测量透明抑菌圈的大小，挑选抑菌圈大的菌株作为复筛摇瓶发酵对象，阳性接合子与NRRL5491菌株透明抑菌圈对照结果如图2所示，其中，1：NRRL 5491菌株，2-6：阳性接合子。
上述白色念珠菌培养基成分（g/L）：葡萄糖5；蛋白胨2，pH7.0，固体培养基添加1.5%琼脂粉pH7.0。
将得到的抑菌圈最大的阳性接合子4，命名为Sr-A △，进行菌种保藏，保藏号为CGMCC NO 16009。
实施例2 雷帕霉素产量比较
（1）雷帕霉素粗提液获得
分别将NRRL 5491菌株和突变株Sr-A △接种于种子培养基，28℃振荡培养2d，转接至发酵培养基，28℃振荡培养5d，发酵液12000rpm离心10min收集菌体，加入2倍体积的无水乙醇，60℃，2h浸提雷帕霉素，12000rpm离心10min，收集上清液即得雷帕霉素粗提液。
所述种子培养基的组成为（g/L）：葡萄糖30，蛋白胨6，酵母粉6，酪蛋白水解物1.5，K2HPO4 1，MgSO4 0.25，pH 6.5。
发酵培养基的组成为（g/L）：葡萄糖30，甘露醇10，黄豆粉30，(NH4)2SO4 0.2，K2HPO40.2，L-Lys 2，复合氨基酸6，pH 7.0。
（2）HPLC测定雷帕霉素含量
安捷伦高效液相色谱仪A1200，包括色谱工作站、四元泵、真空脱气机、可变波长检测器、自动进样器；
色谱柱：Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
检测波长：278 nm；
流动相：85 %甲醇；流速：1.0 mL/min；
进样量：20 μL；
检测器灵敏度：0.02 AnFs；柱温：45 ℃。
雷帕霉素标样、NRRL 5491菌株和突变株Sr-A △粗体液的HPLC谱图如图3所示，其中，1：雷帕霉素标准品（20 μg/mL），2：突变株Sr-A △粗提液，3：NRRL 5491菌株粗提液。根据HPLC实验雷帕霉素峰面积，计算突变株Sr-A △与NRRL 5491菌株生产雷帕霉素的差别，结果如图4所示，实施例1中获得的吸水链霉菌A基因敲除突变株与NRRL 5491菌株相比，雷帕霉素发酵产量高达1567.27mg/L，较NRRL 5491菌株提高125.13%。
序列表
<110> 山东省药学科学院
<120> 一种高产雷帕霉素的吸水链霉菌
<130> 20181101
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1344
<212> DNA
<213> Streptomyces hygroscopicus
<400> 1
gtgcgccgct ggctggacgg cgagcagccc cgcgagccga ttccgcagat cctctccgag 60
cttttctccg agcgcttcgg ctgtgtggtc ggcatcgagg acctcgggct gcgcgccgtc 120
caccggtcac cgtccgtgtc cggggtggac cttccctggg ccgggcccga aaccgtcgcg 180
ctgatcggcg agttctcccg cagcgatctg atgctggccc gccgcggctt cctcggcacc 240
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<210> 2
<211> 957
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sr-A△
<400> 2
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caccggtcac cgtccgtgtc cggggtggac cttccctggg ccgggcccga aaccgtcgcg 180
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<223> Unknown
<400> 3
gtgcaatacg aatggcgaaa agccgagctc atcggtcagc ttctcaacct tggggttacc 60
cccggcggtg tgctgctggt ccacagctcc ttccgtagcg tccggcccct cgaagatggg 120
ccacttggac tgatcgaggc cctgcgtgct gcgctgggtc cgggagggac gctcgtcatg 180
ccctcgtggt caggtctgga cgacgagccg ttcgatcctg ccacgtcgcc cgttacaccg 240
gaccttggag ttgtctctga cacattctgg cgcctgccaa atgtaaagcg cagcgcccat 300
ccatttgcct ttgcggcagc ggggccacag gcagagcaga tcatctctga tccattgccc 360
ctgccacctc actcgcctgc aagcccggtc gcccgtgtcc atgaactcga tgggcaggta 420
cttctcctcg gcgtgggaca cgatgccaac acgacgctgc atcttgccga gttgatggca 480
aaggttccct atggggtgcc gagacactgc accattcttc aggatggcaa gttggtacgc 540
gtcgattatc tcgagaatga ccactgctgt gagcgctttg ccttggcgga caggtggctc 600
aaggagaaga gccttcagaa ggaaggtcca gtcggtcatg cctttgctcg gttgatccgc 660
tcccgcgaca ttgtggcgac agccctgggt caactgggcc gagatccgtt gatcttcctg 720
catccgccag aggcgggatg cgaagaatgc gatgccgctc gccagtcgat tggctga 777
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 4
gcaatacgaa tggcgaaaa 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<400> 5
cagttgaccc agggctgtc 19

Claims (7)

1.一株吸水链霉菌（Streptomyces rapamycinicus），其特征在于，所述菌株为吸水链霉菌NRRL 5491敲除基因组4084274-4084660位碱基的突变株；其基因组中包含如SEQ IDNo: 2所示的序列；所述菌株的保藏编号为CGMCC NO 16009。
2.一种如权利要求1所述吸水链霉菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）按照吸水链霉菌NRRL 5491基因组4083721-4085064位碱基序列合成缺失第553位至939位碱基的序列，获得截短基因；
（2）将截短基因插入含抗生素抗性基因的质粒，得到截短基因的重组质粒；
（3）将重组质粒转化到感受态大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；
（4）将重组大肠杆菌中的截短基因导入吸水链霉菌；再通过抗性筛选得到包含截短基因的吸水链霉菌，即基因敲除的突变株。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述质粒为pKC1139；所述截短基因插入pKC1139的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点间；
步骤（4）中，抗性筛选方法为通过PCR的方法扩增抗性基因，能够扩增出相应条带的为阳性接合子；所述抗性基因为安普霉素抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID No: 3所示。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，利用热激转化法将截短基因的重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞；大肠杆菌为ET12567感受态细胞；
步骤（4）中，通过接合转移方式将截短基因导入吸水链霉菌。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）后还包括对基因敲除的突变株产雷帕霉素能力进行筛选的步骤。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述筛选步骤为以白色念珠菌作为生物检定菌，采用滤纸片扩散法进行高通量筛选；抑菌圈大的菌株即为目标菌株；
或者将菌株作为摇瓶发酵，发酵液经2倍体积无水乙醇浸提后，取离心的上清液进行HPLC定量检测，产量最高的菌株即为目标菌株；
或者先采用滤纸片扩散法以白色念珠菌作为生物检定菌进行高通量筛选；将抑菌圈大的菌株再进行摇瓶发酵，发酵液经2倍体积无水乙醇浸提后，取离心的上清液进行HPLC定量检测，产量最高的菌株即为目标菌株。
7.如权利要求1所述吸水链霉菌在生产雷帕霉素中的用途。
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