CN102465145B - 一种大肠杆菌与副猪嗜血杆菌穿梭载体pSHK4及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，目的在于构建一种大肠杆菌与副猪嗜血杆菌之间的穿梭载体，该载体被命名为pSHK4，其包含有如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，它的编码区位于该序列的927-1742位序列对应的序列，编码271个氨基酸。本发明的载体的突出优点在于：首次利用副猪嗜血杆菌杆菌分离株中天然质粒的复制起始位点构建适用于该菌的穿梭载体，这种载体在该病原菌中具有稳定遗传的特点，可用于对副猪嗜血杆菌进行遗传操作，是研究副猪嗜血杆菌毒力因子的基本工具，对揭示该病原分子致病机理有重要意义。

Description

一种大肠杆菌与副猪嗜血杆菌穿梭载体pSHK4及制备方法与应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种大肠杆菌与副猪嗜血杆菌之间的穿梭载体及制备方法与应用，本发明的穿梭载体可用于对副猪嗜血杆菌进行遗传操作及对该病原的分子致病机理的探索。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，是一种重要的猪的条件致病菌，常在菌株寄生于猪的上呼吸道，致病菌株能突破上呼吸道屏障，引起猪的关节炎、脑膜炎、多发性浆膜炎，称为格拉泽氏病。该病常常在健康水平较高和免疫反应水平低下的猪群中发生流行，目前其流行在国内外有逐年上升的趋势，给全球养猪业造成一定经济损失。因此，该病原受到国内外研究者越来越多的关注，基因组学、转录组学、蛋白质组学相继应用于副猪嗜血杆菌，众多的潜在毒力因子被筛选出来。但是，这些高通量的组学研究，并不能确切的揭示出该病原的致病机理；相反，大量的初筛信息提出了更多需要解答的疑问和等待证实的猜想。要解答这些疑问、证实这些猜想，传统的遗传操作工具是必不可少的。

传统的遗传操作工具，包括用于基因克隆的穿梭载体、用于基因突变的自杀性载体以及相应的转化方法等等。而目前，研究者们在副猪嗜血杆菌的研究领域没有太大的进展，究其原因，主要是遗传操作工具的缺乏，成为深入研究副猪嗜血杆菌的重要限制因素。作为遗传操作的基础——用于副猪嗜血杆菌的高效可行的转化方法仍未建立起来。而要对转化方法进行系统详细的研究，在大肠杆菌和副猪嗜血杆菌中均能复制的穿梭载体则是必备条件。当前可以获得的载体中，无论是常用的商业化的广宿主范围的穿梭载体，还是针对巴斯德菌科其他菌种，如胸膜肺炎放线杆菌、睡眠嗜血杆菌等构建的载体，应用到副猪嗜血杆菌中，效果均不理想。因此，构建出一套适用于副猪嗜血杆菌的遗传操作系统是当前这一领域的重要任务，而大肠杆菌和副猪嗜血杆菌之间穿梭载体的构建则是实现这一任务的前提和基础。穿梭载体包括两个要素：适合于两种宿主菌的筛选标记；能在两种宿主菌中稳定遗传的复制子。大肠杆菌中常用的抗性筛选标记有些在巴斯德菌科的成员中并不能发挥作用。有研究报道(Susan E.H.West，Mary J.M.Romero，Laura B.Regassa，et al.Construction of Actinobacilluspleuropneumoniae-Escherichia coli shuttle vectors：expression of antibiotic-resistance genes.Gene，1995(160)：81-86.)，在胸膜肺炎放线杆菌和溶血性巴氏杆菌中，来源于Tn3的氨苄抗性基因与来源于Tn9的氯霉素抗性基因不能在原有启动子的作用下表达产物。另有研究(HerbertM.A.，Hood D.W.，Moxon E.R.，et al.Haemophilus influenzae Protocols，2003：56.)分析了能在流感嗜血杆菌中表达的抗性表达盒，在载体工具中常用的Tn5来源的卡那霉素抗性基因，在流感嗜血杆菌中不能发挥功能，而来源于Tn903的卡那霉素抗性基因则可以表达。基于这些已有的研究结论，由于副猪嗜血杆菌与胸膜肺炎放线杆菌、溶血性巴氏杆菌及流感嗜血杆菌的亲缘关系较近，我们可以推测，来源于Tn903的卡那霉素抗性基因可能会在副猪嗜血杆菌中发挥作用，从而作为穿梭载体的筛选标记。就第二个要素而言，穿梭载体可直接利用广宿主范围复制子，能在两种或多种细菌中复制；或是将来源于两种细菌的复制子组合到一个质粒骨架中，使各自的复制子在各自的宿主菌中发挥效用。在常用的广宿主范围复制子不能应用到副猪嗜血杆菌情况下，后一种方法成为更简单且直接的构建策略。本发明的目的便是利用这一策略，从副猪嗜血杆菌中分离出内源性质粒，利用其复制起始位点，以及ColE1复制子和来源于Tn903的卡那霉素抗性表达盒，构建一种能在大肠杆菌与副猪嗜血杆菌中稳定遗传的穿梭载体。

发明内容

本发明的目的在于获得一种大肠杆菌与副猪嗜血杆菌的穿梭载体，该穿梭载体是综合了商业化克隆载体pBlueScript SK(+)的复制起始点及多克隆位点、副猪嗜血杆菌内源性质粒pYC93的复制起始点和来源于转座子Tn903的卡那霉素抗性基因表达盒kan构建的。本发明中穿梭载体pSHK4的构建将为副猪嗜血杆菌的遗传学操作带来便利。

申请人构建得到一种大肠杆菌与副猪嗜血杆菌的穿梭载体pSHK4，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

一种大肠杆菌和副猪嗜血杆菌的穿梭载体pSHK4，它是通过如下步骤获得的：

1)以载体pBluescript II SK(+)为模板，进行两次PCR扩增，分别得到含有其多克隆位点的DNA片段MCS，其核苷酸序列如下所示：

CGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTGAGCAAAA(见序列表SEQ ID NO：3所示)；

2)以载体pBluescript II SK(+)为模板，进行PCR扩增，得到含有质粒复制起始点的DNA片段UC ori，其核苷酸序列如下所示：

GGGTTAATTGCGCGCTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACCCATGGCCACGGTTGA(见序列表SEQ ID NO：4所示)；

2)以质粒pLOF/TAG为模板，PCR扩增，得到质粒pLOF/TAG上的卡那霉素抗性基因表达盒kan：

CTTTTCTACCCATGGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGCATATGTTGCGGACA(见序列表SEQ ID NO：5所示)；

3)以副猪嗜血杆菌分离株YC0093中的内源性质粒pYC93(Genbank登录号HM486907)为模板，PCR扩增得到其最小复制区YC93 ori：

GAGTTGAAGGCATATGTTGCGGACACCTTTTCCAGCCTCGTTTGGAAAGTTTCATTGCCAGTAATACCAATGCTTTAGAAAGAAAAAGGGATCGAACTTTTGACATTCGATCCCTTTTTCTGTAATCTGTTTCGTGCGTTCTTTGCTAAGATACAGACCCTAGACAAGTCATATCTTAGCAAAGGGTAGCTAGTAATGCAAGAGATTGCGAAGCGTCCCTACTACCAAAAAACCATTCAACGACGTAAACAGACAAACGCAAACCTTAAATTAGACGGTCTTCAGCTCGGACTTCGGAAGAATAAACAGGCGTAGAAGTGATAACGTTCTTAATACGAAAATTAAGCTCTGTCTCCGTTTCGTGCTACGGTTAGAAAGGCGAAAGCCCCAAGAAATACAAGCACACCTGATAAGCGAGATTTAAGGATAACAGCGAAATTCAATAGGGTCTGAATTTCCAAACTAGGTTAAATGCCACGACGTTTTATTGTTGCCCCATTCAAGCAACATTTGAGAACCGAATAGAAATCTTTTAGTAAAAAGCGTTCTTTTTTGGGTCAGCGGTTAATGTGGACGGTTTAACGGTTTTTCCCCTGCGGGTCGTATTGGAAAGCCATTGAAAAGCTGATGGATAACTCTGCGAGTTACCCACGAGCTTTCCAACAGCTTTCCAACACTAAAAACCTACCGCCCACAATAACCACTTCCCTAATAATAAAATTTTTTTATTTTTATTTTGGTTCAAAGGCTCACGATGTTCGCCTAATAAAACGAAGTCGCCTATCGGCTCCGCTGATTTTTATATATCACTCTCGGGGCTTTTGGTGTACTATTGTCTTTTGTAATAGCAAGGACACAAAAAGGGTACTCTTCGAGTTTCCTTTTTGACCTTGCAAAAGGGCTTTGGGTACCGAG(见序列表SEQ ID NO：6所示)；

4)运用重叠PCR的方法，将以上三个步骤获得的四个DNA片段连接成一条DNA片段MUKO，其序列如下所示：

CGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACCCATGGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGCATATGTTGCGGACACCTTTTCCAGCCTCGTTTGGAAAGTTTCATTGCCAGTAATACCAATGCTTTAGAAAGAAAAAGGGATCGAACTTTTGACATTCGATCCCTTTTTCTGTAATCTGTTTCGTGCGTTCTTTGCTAAGATACAGACCCTAGACAAGTCATATCTTAGCAAAGGGTAGCTAGTAATGCAAGAGATTGCGAAGCGTCCCTACTACCAAAAAACCATTCAACGACGTAAACAGACAAACGCAAACCTTAAATTAGACGGTCTTCAGCTCGGACTTCGGAAGAATAAACAGGCGTAGAAGTGATAACGTTCTTAATACGAAAATTAAGCTCTGTCTCCGTTTCGTGCTACGGTTAGAAAGGCGAAAGCCCCAAGAAATACAAGCACACCTGATAAGCGAGATTTAAGGATAACAGCGAAATTCAATAGGGTCTGAATTTCCAAACTAGGTTAAATGCCACGACGTTTTATTGTTGCCCCATTCAAGCAACATTTGAGAACCGAATAGAAATCTTTTAGTAAAAAGCGTTCTTTTTTGGGTCAGCGGTTAATGTGGACGGTTTAACGGTTTTTCCCCTGCGGGTCGTATTGGAAAGCCATTGAAAAGCTGATGGATAACTCTGCGAGTTACCCACGAGCTTTCCAACAGCTTTCCAACACTAAAAACCTACCGCCCACAATAACCACTTCCCTAATAATAAAATTTTTTTATTTTTATTTTGGTTCAAAGGCTCACGATGTTCGCCTAATAAAACGAAGTCGCCTATCGGCTCCGCTGATTTTTATATATCACTCTCGGGGCTTTTGGTGTACTATTGTCTTTTGTAATAGCAAGGACACAAAAAGGGTACTCTTCGAGTTTCCTTTTTGACCTTGCAAAAGGGCTTTGGGTACCGAG(见序列表SEQ ID NO：7所示)；

5)用限制性内切酶KpnI消化MUKO片段，再使MUKO片段自连环化；

6)将步骤5)得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取转化子，提取质粒，对质粒进行酶切鉴定，正确的为穿梭载体pSHK4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

更详细的技术方案及其应用参见《具体实施方式》。

本发明的积极效果是：

1、使用高拷贝的ColE1家族复制子作为穿梭载体的元件之一，使得在大肠杆菌中提取该穿梭载体时一次可获得较大量的质粒DNA，方便后续的DNA操作。

2、将来源于副猪嗜血杆菌的质粒复制子与大肠杆菌中的质粒复制子相结合，相比单独使用广宿主范围的复制子，获得的穿梭载体在副猪嗜血杆菌不同菌株的可用范围会更广泛。

3、构成穿梭载体的各个元件之间引入了单一的酶切位点，便于日后将该穿梭载体改造为具有特殊用途的载体时，添加其他功能元件。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是获得的穿梭载体pSHK4的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：2是卡那霉素抗性基因表达产物的氨基酸序列。

序列表SEQ ID NO：3是以载体pBluescript II SK(+)为模板，PCR扩增得到的DNA片段MCS的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：4是以载体pBluescript II SK(+)为模板，PCR扩增得到的质粒复制区DNA片段UC ori的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：5是以质粒pLOF/TAG为模板，PCR扩增得到的卡那霉素抗性基因表达盒kan的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：6是以副猪嗜血杆菌内源性质粒pYC93为模板，PCR扩增得到的质粒复制区YC93 ori的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO：7是用四个DNA片段MCS、UC ori、kan、YC93 ori进行重叠PCR扩增得到的DNA片段MUKO的核苷酸序列。

图1：是本发明获得的穿梭载体pSHK4构建示意图；

图2：是本发明获得的穿梭载体pSHK4核苷酸序列表，表中：含有下划线的序列为pBlueScript SK(+)复制起始位点；粗体字表示的序列为卡那霉素抗性基因表达盒kan，含有阴影的序列为卡那霉素抗性基因的开放读码框(ORF)；含有方框的序列为副猪嗜血杆菌内源性质粒pYC93的复制起始位点；斜体字表示的序列为间隔核苷酸序列。

图3：是本发明获得的穿梭载体pSHK4转化大肠杆菌HB101和Top10的质粒提取及酶切鉴定图。泳道1为15000bp的DNA ladder；泳道1、2、3分别为转化子DH5α/pSHK4、HB101/pSHK4和Top10/pSHK4提取的质粒；泳道4、5、6分别为转化子DH5α/pSHK4、HB101/pSHK4和Top10/pSHK4中提取的质粒用KpnI酶切后的DNA片段。

图4：是本发明获得的穿梭载体pSHK4电转化副猪嗜血杆菌HB7071，生长出转化子的平板。

图5：是本发明获得的穿梭载体pSHK4电转化副猪嗜血杆菌HB7071的质粒提取及酶切鉴定图。泳道1为15000bp的DNA ladder；泳道2、3分别为转化子DH5α/pSHK4和HB7071/pSHK4中提取到的质粒；泳道4、5分别为转化子DH5α/pSHK4和HB7071/pSHK4中提取到的质粒用KpnI酶切后的DNA片段。

图6：是本发明获得的穿梭载体pSHK4在大肠杆菌DH5α和副猪嗜血杆菌HB7071中的稳定性试验结果。横轴表示转化子DH5α/pSHK4和HB7071/pSHK4在未添加抗生素的培养基中传代次数；纵轴表示每代菌液在含50μg/mL卡那霉素的平板和无抗生素的平板上，长出的菌落数之比。

具体实施方式

实施例1  副猪嗜血杆菌分离株YC0093分离鉴定及菌学特征

1、副猪嗜血杆菌分离株YC0093的菌学特征

副猪嗜血杆菌分离株YC0093在TSA固体培养基上，37℃培养24～48h后，形成圆形、光滑湿润、无色透明、直径1～2mm的菌落。取上述菌落抹片革兰氏染色后在显微镜下观察，细菌为革兰氏阴性细小杆菌，从单个的球杆菌到长的、细长的、以致丝状的菌体，具有多形性。

副猪嗜血杆菌YC0093在绵羊鲜血琼脂平板上与金黄色葡萄球菌交叉划线，37℃培养24～48h后，呈现典型的“卫星生长现象”，即越靠近葡萄球菌的周围菌落生长越好，远离葡萄球菌的地方不生长，并且在鲜血琼脂平板上的副猪嗜血杆菌菌落周围不出现溶血现象。将副猪嗜血杆菌YC0093接种于微量生化鉴定管，37℃培养48h后，结果为脲酶试验阴性，氧化酶试验阴性，接触酶试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，吲哚试验阴性并发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麦芽糖等碳水化合物。

2、副猪嗜血杆菌分离株YC0093的分离鉴定

本发明过程中用到的生物材料副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)分离株YC0093分离自湖北省宜城市某猪场中诊断为格拉泽氏病的一病猪的肺组织。通过菌落形态观察，培养特性和生化检测，以及PCR鉴定确定为副猪嗜血杆菌。

细菌培养特性鉴定如下所述，在无菌操作台上，用接种环分别挑取上述可疑菌的单菌落，水平划线于无NAD的绵羊鲜血平板上，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，37℃培养24～48h，观察是否有“卫星生长现象”，即在葡萄球菌菌苔附近待测菌菌落生长较大，而远侧菌落生长较小甚至没有菌落生长，并观察是否具有溶血现象。取有“卫星生长现象”且不溶血的单菌落纯培养，后接种于脲酶、氧化酶、接触酶、硝酸盐还原、吲哚、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麦芽糖等微型生化鉴定管，按厂家说明书的方法操作。

PCR鉴定使用引物为5’-GGCTTCGTCACCCTCTGT和引物5’-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT，具体操作参照文献(Oliveira，S.，L.Galina，and C.Pijoan.Development of a PCRtest to diagnose Haemophilus parasuis infections.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2001，13：495-501)中的方法进行。

本发明获得的副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)YC0093菌株已于2010年10月14日送交用于专利程序保藏的位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M 2010264。

实施例2  本发明穿梭载体的制备

1.穿梭载体各个元件的PCR扩增

以商业化载体pBluescript II SK(+)(购自美国Strategene公司)DNA为模板，用引物Kpn(5’-CGACTCACTATAGGGCGAATTGGG)和OLF(5’-TTTTGCTCAGCGCGCAATTAACCCTCACTA)PCR扩增得到长176bp的产物，即带有多克隆位点的DNA片段(MCS)；采用同样的模板，用引物OLR(5’-GGGTTAATTGCGCGCTGAGCAAAAGGC)和UCR(5’-TCAACCGTGGCCATGGGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTG)扩增得到长699bp的DNA片段(UC ori)。以质粒pLOF/TAG(Paul R.Langford馈赠，提供遗传资源来源披露登记表)为模板，用引物KF5’-CTTTTCTACCCATGGCCACGGTTGATGAGAGCTTTG)和KR(5’-TGTCCGCAACATATGCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATT)扩增得到长1191bp的产物(kan)。以来源于副猪嗜血杆菌分离株YC0093的野生质粒pYC93(Genbank登录号HM486907)为模板，用引物OriF(5’-GAGTTGAAGGCATATGTTGCGGACACCTTTTCCAG)和OriR(5’-CTCGGTACCCAAAGCCCTTTTGCAAGGTC)PCR扩增得到长915bp的DNA片段(YC93 ori)。

PCR反应程序见表1，反应体系如下：

10×保真酶缓冲液II 5μL

2.5mM dNTP         4μL

上游引物(20μM)    2μL

下游引物(20μM)    2μL

模板DNA            2μL

Pyrobest保真酶     0.25μL

加去离子水补至     50μL。

表1.PCR扩增反应程序

2.穿梭载体四个元件的串联

将步骤1中四次PCR扩增得到的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳分离，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自美国Omega公司，按照该试剂盒的说明书操作)纯化，再用重叠PCR的方法将四个纯化的DNA片段连接成一条完整的DNA片段。重叠PCR的操作如下所示：

反应体系(1)：               反应体系(2)：

10×保真酶缓冲液II  5μL    10×保真酶缓冲液II    5μL

2.5mM dNTP          3μL    2.5mM dNTP            5μL

MCS片段           2μL        引物Kpn(20μM)    2μL

UC ori片段        2μL        引物OriR(20μM)   2μL

kan片段           2μL        Pyrobest保真酶    0.3μL

YC93 ori片段      2μL

Pyrobest保真酶    0.3μL

加去离子水补至    50μL。

其反应程序如下：

将体系(2)混入体系(1)，混匀后分为两管继续扩增；

3.本发明目标穿梭载体的获得

将步骤2中得到重叠PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，切取含有目的DNA片段的胶块，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自美国Omega公司，按照该试剂盒的说明书操作)纯化，得到长约2.8kb的线状DNA(MUKO)。为获得环状质粒，用KpnI限制性内切酶在37℃温育4h消化该线状DNA，对酶切产物用Cycle-Pure纯化试剂盒(购自美国Omega公司，按照该试剂盒的说明书操作)进行纯化，将纯化产物使用T4 DNA连接酶进行自连环化。取连接产物10μL转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取转化子进行培养，抽提质粒，酶切质粒鉴定出正确克隆。取鉴定正确的克隆，送上海英骏生物技术有限公司测序，进一步验证了获得的穿梭载体，将其命名为pSHK4。

实施例3：穿梭载体pSHK4的穿梭功能验证

1、验证pSHK4在大肠杆菌中的复制：

本发明的目的是获得能在常见克隆用大肠杆菌工程菌株和副猪嗜血杆菌中都能复制并表达抗性标记的穿梭载体。在构建穿梭载体的过程中，已验证该穿梭载体能在大肠杆菌菌株DH5α中复制并使宿主菌获得卡那霉素抗性。采用钙离子介导的转化方法(Sambrook J.，Russell DW.，2001.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，third ed.Cold Spring HarborPress，New York.)，将本发明获得的穿梭载体pSHK4引入另外两株大肠杆菌菌株HB101(购自美国invitrogen公司)、Top10(购自美国invitrogen公司)中，也能高效稳定的获得卡那霉素抗性表型的转化子，并能从转化子中抽提获得pSHK4的质粒DNA。具体步骤如下：

(1)挑取大肠杆菌HB101、Top10单菌落于3mL LB液体培养基中，37℃摇床200rpm振荡培养过夜。

(2)将大肠杆菌HB101和Top10过夜培养物按照体积比为1∶100的比例分别转接于100mL新鲜的LB液体培养基，37℃摇床200rpm振荡培养2h左右至OD₆₀₀值达到约0.4(该浓度相当于菌液浓度为4×10⁸CFU/mL)。

(3)将菌液转移至灭菌的50mL离心管，于4℃5000rpm离心5min收集菌体，如此重复3次，将100mL菌液收集到一个离心管中。

(4)用10mL冰浴预冷的100mM的CaCl₂重悬菌体，冰浴30min后于4℃5000rpm离心5min，弃上清。

(5)重复步骤(4)。

(6)每管加入2mL 100mM的CaCl₂重悬菌体，每100μL可用于一个样品的转化，或者加入15％浓度的甘油，100μL每管分装冻存于-80℃，转化时取出融化使用。

(7)每100μL HB101或Top10的感受态细胞中加入1μL穿梭载体质粒pSHK4，冰浴30min。

(8)42℃水浴热激90sec，迅速置于冰浴中冷却3～5min。

(9)每个转化样加入LB液体培养基400μL，37℃摇床200rpm复苏45min。

(10)复苏后的菌液取100μL涂布于卡那霉素终浓度为50μg/mL的LB琼脂平板，倒置于37℃温箱培养约12h后可见明显的单菌落长出。

(11)分别从步骤(10)得到的转化平板上挑取大肠杆菌HB101和Top10转化子，接种于卡那霉素终浓度为50μg/mL的液体LB培养基，37℃摇床200rpm振荡培养过夜，取过夜培养物，用质粒小提试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)进行质粒抽提，得到质粒DNA。

(12)将获得的质粒DNA用限制性内切酶KpnI消化，用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物后，使用凝胶成像系统分析，可见唯一一条长约2.8kb的亮带(如图3所示)，证明获得的质粒DNA为最初引入大肠杆菌HB101或Top10的穿梭载体pSHK4。

2、验证pSHK4在副猪嗜血杆菌中的复制：

穿梭载体pSHK4能否在副猪嗜血杆菌中复制并表达抗性标记是本发明的关键。目前，国外报道过的用于转化副猪嗜血杆菌的方法仅有电击穿孔法(Lancashire JF，Terry TD，Blackall PJ et al.Plasmid-encoded Tet B tetracycline resistance in Haemophilus parasuis.Antimicrob Agents Chemother，2005，49：1927-1931.)。运用这一报道所述的方法将穿梭载体pSHK4电转化进入副猪嗜血杆菌分离株HB7071(Liping C.，Xuwang C.，Xiangru W.et al.Characterization of plasmid-mediated lincosamide resistance in a field isolate of Haemophilusparasuis.Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2010，65(10)：2256-2258.)中，使转化子菌株HB7071/pSHK4获得卡那霉素抗性表型。方法如下：

(1)副猪嗜血杆菌培养基的制备

新生牛血清(购自杭州四季青生物工程材料有限公司)于56℃30min灭活其中的补体，置于4℃保存。称取适量烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，购自武汉天源生物技术有限公司)，用超纯水溶解，配制成10mg/mL的储存浓度，过滤除菌后于4℃保存。

准确称取胰蛋白胨大豆肉汤(简称TSB，购自美国BD公司Difco品牌)粉末30g溶于1L蒸馏水中，分装后于121℃高压蒸汽灭菌15min，待冷后室温保存。使用时，加入5-10％的新生牛血清和终浓度为10μg/mL的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，便可用于液体培养副猪嗜血杆菌。

准确称取胰蛋白大豆琼脂(TSA，购自美国BD公司Difco品牌)粉末6.4g溶于160mL蒸馏水中，121℃高压蒸汽灭菌15min，待冷却至50-60℃时，迅速加入5-10％的新生牛血清和终浓度为10μg/mL的NAD，筛选转化子的平板另需加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素，迅速混匀后倒入平皿中，待冷凝后可接种副猪嗜血杆菌。制备好的平板也可暂时保存于4℃(勿超过两周)。

(2)电转化缓冲液(SG Buffer)的制备

准确称取蔗糖186.59g，按照总体积的15％加入甘油300mL，用超纯水定容至2000mL。在121℃高压蒸汽灭菌20min。使用前需冰浴预冷。

(3)副猪嗜血杆菌电转化感受态的制备

纯化培养副猪嗜血杆菌分离株HB7071，刮取新鲜生长的菌苔，均匀涂布于平板上，37℃温箱培养12～16小时。用预冷后的电转化缓冲液(SG buffer)将平板上的菌苔洗下，于4℃6000rpm离心6min，吸去上清。将菌体沉淀用预冷的SG buffer重悬洗涤，4℃6000rpm离心6min，弃上清。重复洗涤一次，最后用适量预冷的SG buffer重悬菌体。按此方法制备的感受态细胞可立即用于电转化，或分装后暂时保存于-80℃(勿超过一个月；用于电转化前仅能冻融一次)。

(4)副猪嗜血杆菌的电转化

取副猪嗜血杆菌电转化感受态细胞120μL，加入本发明的pSHK4穿梭载体(质粒)10μL，搅动混匀，冰浴30min。将混入质粒的感受态转入-20℃预冷的电转杯(Biorad，2mm杯径)中，擦干电转化杯的外壁，置于电转仪(Biorad)槽内电击穿孔(2500V，5ms)。取液体培养基900μL加入电击后的电转杯，吹吸混匀后吸出，装入2mL灭菌离心管内，37℃振荡培养复苏2小时。复苏后的菌液于室温5000rpm离心5min，弃去900μL上清，用剩余120μL上清重悬菌体，涂布于卡那霉素终浓度为50μg/mL的筛选平板(副猪嗜血杆菌专用培养基，详见步骤(1))，倒置于37℃温箱内培养36小时后观察结果，平板上长出约800个转化子(见图4)。

(5)转化子的鉴定

挑取转化子接种于卡那霉素终浓度为50μg/mL的液体培养基(副猪嗜血杆菌专用培养基，详见步骤(1))中，37℃振荡培养过夜。取过夜培养物抽提质粒，用限制性内切酶KpnI对质粒进行单酶切鉴定，结果如图5所示，可确认提取到的质粒即为最初引入副猪嗜血杆菌分离株HB7071中的穿梭载体pSHK4。

实施例4：穿梭载体pSHK4在大肠杆菌和副猪嗜血杆菌中的遗传稳定性

本实施例作为大肠杆菌与副猪嗜血杆菌间的穿梭载体，在两种宿主菌中的遗传稳定性是其重要性状之一。本实施例分析了穿梭载体pSHK4在大肠杆菌DH5α和副猪嗜血杆菌HB7071中遗传稳定性，具体步骤如下：

1、将实施例1中获得的大肠杆菌转化子DH5α/pSHK4，接种于无抗性LB液体培养基中，37℃振荡培养12小时作为一代，再取菌液转接于新鲜的无抗性LB液体培养基中，如此传代30次，每5代取新鲜菌液作倍比稀释，分别涂布于含卡那霉素50μg/mL的LB平板和无抗性LB平板，置于37℃温箱培养12小时后进行活菌菌落(CFU)计数。连续传30代，计算两种平板上CFU比值，每一代CFU比值在0.76-1.27之间(见附图6)，表明pSHK4在大肠杆菌DH5α中能稳定遗传。

2、将实施例2中获得的副猪嗜血杆菌转化子HB7071/pSHK4，按照步骤1中的程序(使用的培养基为副猪嗜血杆菌专用，培养基的配方见实施例2)，计算抗性平板与无抗性平板上CFU，每一代CFU比值在0.77-1.23之间(见图6)，结果表明pSHK4在副猪嗜血杆菌HB7071中能稳定遗传。

实施例5：用穿梭载体pSHK4研究副猪嗜血杆菌15株标准菌株的电转化效率

副猪嗜血杆菌的转化一直是困扰国内外研究者们的一个难题，本实施例中采用菌体总蛋白体外甲基化质粒的方法，利用本发明的穿梭载体，对副猪嗜血杆菌15株标准菌株的电转化进行尝试，尽管各个菌株之间转化效率差异显著，但已经能实现所有标准菌株的转化。具体步骤如下：

1、0.01M醋酸钠的配制

准确称取无水醋酸钠0.082g溶解于80mL蒸馏水中，加冰醋酸调pH值至5.2，转入100mL容量瓶加水定容。

2、1M二硫苏糖醇(DTT)的配制

准确称取3.09g DTT，加20mL 0.01M的醋酸钠(pH＝5.2)，溶解后使用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1mL每管保存于-20℃。

3、粗提总蛋白缓冲液(CFEs Buffer)的配制

分别称取Tris-Base 242.2mg，乙酸钾490.7mg，Na2EDTA 186.12mg，加入80mL超纯水溶解，醋酸调pH值至7.9，定容到100mL。使用前每1mL Buffer中加入2μL 0.5M的DTT。

4、副猪嗜血杆菌粗提总蛋白(CFEs)的制备

挑取新鲜平板生长的副猪嗜血杆菌单菌落3～5个于3mL液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将过夜培养物按照1∶100的比例转接于200mL新鲜的液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长后期(OD600＝0.6～0.9)，于4℃12000rpm离心2min收集菌体。菌体沉淀用10mL CFEs Buffer重悬洗涤后，离心弃上清。按照每1g湿重的菌体加入12.5mL CFEsBuffer的比例重悬菌体沉淀。将重悬后的菌液置于冰水混合物中，进行超声破碎，至菌液变清亮。4℃12000rpm离心5min，吸取上清，直接用于质粒的甲基化，或者分装成小份，冻存于-80℃(勿超过60天，使用前仅能冻融一次)。

5、用CFEs对质粒pSHK4进行甲基化处理

(1)反应体系：

副猪嗜血杆菌CFEs      90μL

5×CFEs Buffer        2μL

腺苷甲硫氨酸          1μL

质粒pSHK4             5μL

加去离子水补齐至100μL；

置于37℃温箱温育4h。

(2)加入等体积的酚氯仿(体积比为平衡酚∶三氯甲烷∶异戊醇＝25∶24∶1)，剧烈涡旋1min，于4℃12000rpm离心10min，将上清转移至另一个干净的1.5mL离心管中。

(3)重复步骤(2)。

(4)加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀后置于-20℃沉淀30min，于4℃12000rpm离心10min，弃上清；再用75％的乙醇洗涤两次，弃上清后，使沉淀干燥，用20μL灭菌水重新溶解沉淀，即为甲基化处理后的pSHK4穿梭载体。

6、用pSHK4电转化副猪嗜血杆菌15个血清型的标准菌株

取甲基化处理后的pSHK4质粒10μL，分别对副猪嗜血杆菌15个血清型的标准菌株进行电转化，具体步骤参照实施例2中副猪嗜血杆菌的电转化。转化结果见表2。

表2.穿梭载体pSHK4电转化副猪嗜血杆菌标准菌株结果

说明：表2的菌株来源由澳大利亚，穆鲁卡Dr.P J Blackall教授惠赠。是评测本发明穿梭载体pSHK4效果的一个试验。

实施例6：利用穿梭载体pSHK4克隆抗性基因catAIII

1、利用穿梭载体pSHK4可筛选除卡那霉素以外的其他适用于副猪嗜血杆菌遗传操作的抗性标记。用引物catF(5’-ACTGCGGCCGCCTGACTGAGATACTCGACG)和catR(5’-AGTGAGCTCCAGGCAACCAGTCAGAATG)，以胸膜肺炎放线杆菌质粒pHB0503(Kang M.，Zhou R.，Liu L.et al.Analysis of an Actinobacillus pleuropneumoniaemulti-resistance plasmid，pHB0503.Plasmid 2009(61)：135-139.)为模板，扩增带有启动子区的catAIII基因。PCR过程如下：

2、用Cycle-Pure试剂盒(购自Omega公司，按该试剂盒的说明书操作)纯化PCR产物。

3、用Not I和Sac I对纯化产物进行双酶切，同时双酶切处理穿梭载体pSHK4，体系如下

10×K Buffer     2.5μL      10×K Buffer     2.5μL

BSA              5μL        BSA              5μL

Not I            2μL        Not I            2μL

Sac I            2μL        Sac I            2μL

catAIII(纯化产物)38.5μL     pSHK4            10μL

                             加去离子水补至   50μL

37℃温育4小时。

4、通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切后的PCR产物及穿梭载体，切取含目的DNA片段的胶块，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自Omega公司，按该试剂盒说明书操作)从胶块中回收DNA片段，用T4连接酶(购自Fermentas公司)连接这两个片段，体系如下：

10×Ligase Buffer    2μL

catAIII(外源片段)    8μL

pSHK4(载体)          4μL

T4 Ligase            0.2μL

加去离子水补至       20μL

22℃温育2小时

5、取上一步连接产物10μL转化DH5α感受态细胞，具体步骤参见实施例2。

6、挑取转化子，抽提质粒，酶切鉴定，选择酶切产物与预期一致的转化子送测序公司测序。经测序验证，鉴定正确的重组质粒命名为pSHK4-cat。

7、从大肠杆菌DH5α/pSHK4-cat中抽提质粒，用副猪嗜血杆菌SH0165(Min Y.，Fan Y.，JianY.et al.Complete Genome Sequence of Haemophilus parasuis SH0165.Journal of Bacteriology，2009，191(4)：1359-1360.)的总蛋白甲基化质粒pSHK4-cat，具体步骤见实施例4。

8、将步骤7得到的甲基化质粒pSHK4-cat电转化进入菌株SH0165中，方法参见实施例2，但筛选平板中不加卡那霉素，换用终浓度为5μg/mL的氯霉素。

9、挑取步骤8电转化得到的转化子用含5μg/mL氯霉素的液体培养基培养过夜，提取质粒pSHK4-cat，通过限制性内切酶酶切质粒验证转化子的正确性。

10、实验结果表明抗性基因catAIII在副猪嗜血杆菌SH0165中发挥了作用，成功筛选出了正确的转化子，可用于副猪嗜血杆菌遗传操作中的抗性筛选标记。

Claims (3)

1.一种大肠杆菌与副猪嗜血杆菌的穿梭载体pSHK4，其包含有如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的一种大肠杆菌和副猪嗜血杆菌的穿梭载体pSHK4，它是通过如下步骤获得的：

1)以载体pBluescript II SK(+)为模板，进行两次PCR扩增，分别得到含有其多克隆位点的DNA片段MCS，其核苷酸序列如下所示：

CGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTGAGCAAAA；

2)以载体pBluescript II SK(+)为模板，进行PCR扩增，得到含有质粒复制起始点的DNA片段UC ori，其核苷酸序列如下所示：

GGGTTAATTGCGCGCTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACCCATGGCCACGGTTGA；

3)以质粒pLOF/TAG为模板，PCR扩增，得到质粒pLOF/TAG上miniTn10转座子中的卡那霉素抗性基因表达盒kan，其核苷酸序列如下所示：

CTTTTCTACCCATGGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGCATATGTTGCGGACA；

4)以保藏号为CCTCC NO：M2010264的副猪嗜血杆菌菌株YC0093中的内源性质粒pYC93为模板，PCR扩增得到其最小复制区YC93ori，其核苷酸序列如下所示：

GAGTTGAAGGCATATGTTGCGGACACCTTTTCCAGCCTCGTTTGGAAAGTTTCATTGCCAGTAATACCAATGCTTTAGAAAGAAAAAGGGATCGAACTTTTGACATTCGATCCCTTTTTCTGTAATCTGTTTCGTGCGTTCTTTGCTAAGATACAGACCCTAGACAAGTCATATCTTAGCAAAGGGTAGCTAGTAATGCAAGAGATTGCGAAGCGTCCCTACTACCAAAAAACCATTCAACGACGTAAACAGACAAACGCAAACCTTAAATTAGACGGTCTTCAGCTCGGACTTCGGAAGAATAAACAGGCGTAGAAGTGATAACGTTCTTAATACGAAAATTAAGCTCTGTCTCCGTTTCGTGCTACGGTTAGAAAGGCGAAAGCCCCAAGAAATACAAGCACACCTGATAAGCGAGATTTAAGGATAACAGCGAAATTCAATAGGGTCTGAATTTCCAAACTAGGTTAAATGCCACGACGTTTTATTGTTGCCCCATTCAAGCAACATTTGAGAACCGAATAGAAATCTTTTAGTAAAAAGCGTTCTTTTTTGGGTCAGCGGTTAATGTGGACGGTTTAACGGTTTTTCCCCTGCGGGTCGTATTGGAAAGCCATTGAAAAGCTGATGGATAACTCTGCGAGTTACCCACGAGCTTTCCAACAGCTTTCCAACACTAAAAACCTACCGCCCACAATAACCACTTCCCTAATAATAAAATTTTTTTATTTTTATTTTGGTTCAAAGGCTCACGATGTTCGCCTAATAAAACGAAGTCGCCTATCGGCTCCGCTGATTTTTATATATCACTCTCGGGGCTTTTGGTGTACTATTGTCTTTTGTAATAGCAAGGACACAAAAAGGGTACTCTTCGAGTTTCCTTTTTGACCTTGCAAAAGGGCTTTGGGTACCGAG；

5)运用重叠PCR的方法，将以上四个步骤获得的四个DNA片段连接成一条DNA片段MUKO，其核苷酸序列如下所示：

CGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACCCATGGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGCATATGTTGCGGACACCTTTTCCAGCCTCGTTTGGAAAGTTTCATTGCCAGTAATACCAATGCTTTAGAAAGAAAAAGGGATCGAACTTTTGACATTCGATCCCTTTTTCTGTAATCTGTTTCGTGCGTTCTTTGCTAAGATACAGACCCTAGACAAGTCATATCTTAGCAAAGGGTAGCTAGTAATGCAAGAGATTGCGAAGCGTCCCTACTACCAAAAAACCATTCAACGACGTAAACAGACAAACGCAAACCTTAAATTAGACGGTCTTCAGCTCGGACTTCGGAAGAATAAACAGGCGTAGAAGTGATAACGTTCTTAATACGAAAATTAAGCTCTGTCTCCGTTTCGTGCTACGGTTAGAAAGGCGAAAGCCCCAAGAAATACAAGCACACCTGATAAGCGAGATTTAAGGATAACAGCGAAATTCAATAGGGTCTGAATTTCCAAACTAGGTTAAATGCCACGACGTTTTATTGTTGCCCCATTCAAGCAACATTTGAGAACCGAATAGAAATCTTTTAGTAAAAAGCGTTCTTTTTTGGGTCAGCGGTTAATGTGGACGGTTTAACGGTTTTTCCCCTGCGGGTCGTATTGGAAAGCCATTGAAAAGCTGATGGATAACTCTGCGAGTTACCCACGAGCTTTCCAACAGCTTTCCAACACTAAAAACCTACCGCCCACAATAACCACTTCCCTAATAATAAAATTTTTTTATTTTTATTTTGGTTCAAAGGCTCACGATGTTCGCCTAATAAAACGAAGTCGCCTATCGGCTCCGCTGATTTTTATATATCACTCTCGGGGCTTTTGGTGTACTATTGTCTTTTGTAATAGCAAGGACACAAAAAGGGTACTCTTCGAGTTTCCTTTTTGACCTTGCAAAAGGGCTTTGGGTACCGAG；

6)用限制性内切酶KpnI消化DNA片段MUKO，再使DNA片段MUKO自连环化；

7)将步骤6)得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取转化子，提取质粒，对质粒进行酶切鉴定，得到穿梭载体pSHK4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.权利要求1所述的穿梭载体pSHK4在副猪嗜血杆菌遗传学操作中的应用。

Images