CN113403246A

CN113403246A - 溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株及其应用

Info

Publication number: CN113403246A
Application number: CN202110789559.7A
Authority: CN
Inventors: 郑风荣; 马景雪; 王宗兴; 郑明刚; 曲凌云; 王波
Original assignee: First Institute of Oceanography MNR
Current assignee: First Institute of Oceanography MNR
Priority date: 2021-07-13
Filing date: 2021-07-13
Publication date: 2021-09-17
Anticipated expiration: 2041-07-13
Also published as: CN113403246B

Abstract

本发明公开了溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株及其应用，属于基因工程技术领域。本发明公开的溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株在降低溶藻弧菌毒力中的应用。本发明利用CRISPR/Cas系统的高效性和准确性，构建溶藻弧菌的突变株，通过比较突变株与野生株对栉孔扇贝的致病性的强弱，证明了Hfq对溶藻弧菌毒性的重要作用，进一步研究了溶藻弧菌的致病机制。这些发现为进一步研究弧菌病奠定了基础。

Description

溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株及其应用。

背景技术

水产养殖业在全球范围内发展迅猛，而贝类养殖已经成为了水产养殖业的支柱产业，随着养殖规模的增加，弧菌病频发，导致大量贝类死亡，给养殖业造成了巨大的经济损失。溶藻弧菌是一种革兰氏阴性的人畜共患的条件性病原菌，它是海水养殖中最常见和危害最严重的细菌性病原之一，能引起鱼类及贝类细菌性败血症和腮溃烂，给人类的健康也带来了严重的威胁。溶藻弧菌常常作为鱼类的致病菌被发现，在贝类中，以九孔鲍、菲律宾蛤仔患病居多。

细菌体内具有群体感应系统(QS)，能够对环境信号变化及时做出反应。该系统中调节小核糖核酸(SRNAs)在基因表达的转录后调节和毒性中起着重要的作用，而该过程需要RNA伴侣蛋白Hfq的参与。但目前关于Hfq在溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)对扇贝的毒力调控中的研究不多，基于此，深入研究溶藻弧菌的分子致病机理，对扇贝的溶藻弧菌病害暴发的防控非常重要。

因此，提供溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株，其保藏编号为CCTCC NO：M 2021539，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期为2021年05月17日，分类命名为vibrio alginolyticus HD-1(Hfq缺失)。

进一步，靶向Hfq基因的pTargetF-Hfq重组质粒构建方法如下：

以pTargetF质粒为模板，用引物G2 F/G2 R构建含有20bp Hfq基因片段的pTargetF-Hfq载体；由于正反向引物具有反向互补位置，因此PCR产物为成环的结构，直接获得pTargetF-Hfq载体，经过胶回收过程，回收pTargetF-Hfq质粒；利用G1F/G1R进行16SrRNA测序；

其中，

G1 F/G1 R引物序列如下：

G1 F：5’-CCCCTGATTCTGTGGATA-3’；SEQ ID NO.4；

G1 R：5’-TTCAAGTTGATAACGGACTA-3’；SEQ ID NO.5；

引物G2 F/G2 R序列如下：

G2 F：5’-GCTACGTCGTGAGCGTATCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3’；SEQ ID NO.2；

G2 R：5’-GGATACGCTCACGACGTAGCCTAGTATTATACCTAGGACTG-3’；SEQ ID NO.3；

反应体系为：Taq酶25μL，ddH₂O 19μL，稀释1000倍的pTargetF质粒2μL，G2 F/G2 R引物各2μL；

反应程序为：初始变性步骤在94℃5分钟，随后在35个循环中94℃变性45秒，在68℃退火1分钟，在72℃延伸1分钟，最后在72℃延伸5分钟。

G1F单向测序结果：

TGTCCTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGCTGGATCCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGGCTACGTCGTGAGCGTATCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAA；SEQ ID NO.6；

加下划线部分为在pTargetF质粒插入的Hfq基因序列。

进一步，同源臂的构建方法如下：

以溶藻弧菌野生型菌株基因组为模板，分别用引物AF/BR和CF/DR来扩增目的基因前段基因片段AB与后段基因片段CD，进行16srRNA基因测序，测序结果验证成功后，以基因片段AB和基因片段CD为模板，用引物AF/DR进行扩增，将两段基因拼接得到同源臂；

其中，引物AF/BR和CF/DR的序列如下：

AF：5’-TTTATCTCGGGCATTGGA-3’；SEQ ID NO.7；

BR：5’-AGGTGATTTGACGCTTGG-3’；SEQ ID NO.8；

CF：5’-CCAAGCGTCAAATCACCTACGCAAGAAGGTGAATGG-3’；SEQ ID NO.9；

DR：5’-TACGGTTGAAGAGTGTCG-3’；SEQ ID NO.10；

CF中加下划线的序列为BR反向互补的额外末端引物，因此CD基因片段前端有一段与AB片段末端互补的基因片段，通过重合的基因片段进行拼接。

反应体系为：Taq酶25μL，ddH₂O 18μL，模板AB 1μL，模板CD 2μL，引物AF 2μL，引物DR2μL；

反应程序为：初始变性步骤在94℃5分钟，随后在35个循环中94℃变性45秒，在55℃退火1分钟，在72℃延伸1分钟，最后在72℃延伸5分钟。

AB基因片段位于目的基因上游286-639bp，CD基因片段位于目的基因下游93-687bp。

Hfq基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

ATGGCTAAGGGGCAATCTCTACAAGACCCATTTCTAAACGCGCTACGTCGTGAGCGTATCCCGGTATCTATCTACCTTGTGAATGGTATTAAACTACAAGGTCAGATCGAATCATTCGATCAATTTGTGATCCTGCTGAAGAATACTGTTAACCAAATGGTGTACAAGCACGCGATCTCAACAGTTGTGCCGGCTCGTCCAGTGAGCCATCACAGCGGTGAACGTCCACAAGGTGAGCGTCCACAAGAGAAATCTGAAGATTAA；SEQ ID NO.1。

进一步，所述的溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株在降低溶藻弧菌毒力中的应用。

进一步，所述Hfq基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株在降低溶藻弧菌毒力中的应用，降低对扇贝的致病性。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株及其应用，CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌和古菌的基因组中，利用该系统的高效性和准确性，构建溶藻弧菌的突变株，通过比较突变株与野生株对栉孔扇贝的致病性的强弱，来证明Hfq对溶藻弧菌毒性的重要作用，进一步研究了溶藻弧菌的致病机制。这些发现为进一步研究弧菌病奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明溶藻弧菌野生型菌株对壮观霉素和卡那霉素的抗性结果；

其中，1，不含抗性的2216E培养基；2，含有50μg/ml卡那霉素的2216E培养基；3，含有150μg/ml卡那霉素的2216E培养基；4，不含抗性的2216E培养基；5，含有50μg/ml壮观霉素的2216E培养基；6，含有150μg/ml壮观霉素的2216E培养基；

图2附图为本发明验证阳性克隆的电泳结果；

其中，M：DNA marker(50-500bp)；1-8为阴性克隆；9为阳性克隆；

图3附图为本发明菌株透射电镜图；

其中，1，野生型菌株；2，突变型菌株(溶藻弧菌v.△Hfq-)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

pCas质粒含有卡那霉素的抗性基因，pTargetF质粒含有壮观霉素的抗性基因。本发明所用引物在上海生物工程有限公司进行合成。

实施例1构建溶藻弧菌v.△Hfq-

(1)抗性试验

本研究所从患病的栉孔扇贝中筛选鉴定获得溶藻弧菌野生型菌株。

对溶藻弧菌野生型菌株进行抗生素实验，分别将100μl菌液(OD＝1.0)涂布于不含抗性的2216E培养基平板、含有50μg/ml壮观霉素的2216E培养基平板、含有150μg/ml壮观霉素的2216E培养基平板、含有50μg/ml卡那霉素的2216E培养基平板和含有150μg/ml卡那霉素的2216E培养基平板中，在28℃培养箱中培养24h，观察野生型菌株生长情况，结果见图1。

图1抗性实验结果表明，溶藻弧菌野生型菌株对150μg/ml的卡那霉素及壮观霉素无抗性或抗性极低。

(2)构建pTargetF-Hfq重组质粒

以pTargetF质粒(Jiang Yu,Chen Biao,Duan Chunlan,Sun Bingbing,YangJunjie,Yang Sheng.Multigene editing in the Escherichia coli genome via theCRISPR-Cas9 system.[J].Applied and environmental microbiology,2015,81(7).)为模板，用引物G2 F/G2 R构建含有20bp Hfq基因片段的pTargetF-Hfq载体，即获得靶向Hfq基因的pTargetF-Hfq重组质粒。其中，引物G2 F/G2 R序列如下：

G2 F：5’-GCTACGTCGTGAGCGTATCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3’；SEQ ID NO.2；

G2 R：5’-GGATACGCTCACGACGTAGCCTAGTATTATACCTAGGACTG-3’；SEQ ID NO.3；

其中，划下划线的部分为20bp Hfq基因片段。

反应体系为：Taq酶25μL，ddH₂O 19μL，稀释1000倍的pTargetF质粒2μL，G2 F/G2 R引物各2μL。

通过胶回收试剂盒回收pTargetF-Hfq载体，利用G1 F/G1 R引物，PCR扩增验证其是否正确插入Hfq基因片段序列。

其中，G1 F/G1 R引物序列如下：

G1 F：5’-CCCCTGATTCTGTGGATA-3’；SEQ ID NO.4；

G1 R：5’-TTCAAGTTGATAACGGACTA-3’；SEQ ID NO.5；

G1F单向测序结果：

加下划线部分为在pTargetF质粒插入的Hfq基因序列。

将验证正确的pTargetF-Hfq载体用化学转化法转入DH5α感受态中，在LB培养基中培养，使用质粒提取盒提取pTargetF-Hfq重组质粒，-20℃保存。

(3)构建同源臂

以溶藻弧菌野生型菌株基因组为模板，分别用引物AF/BR和CF/DR来扩增目的基因前段基因片段AB与后段基因片段CD，验证成功后，以基因片段AB和基因片段CD为模板，用引物AF/DR进行扩增，将两段基因拼接得到同源臂。

其中，引物AF/BR和CF/DR的序列如下：

AF：5’-TTTATCTCGGGCATTGGA-3’；SEQ ID NO.7；

BR：5’-AGGTGATTTGACGCTTGG-3’；SEQ ID NO.8；

CF：5’-CCAAGCGTCAAATCACCTACGCAAGAAGGTGAATGG-3’；SEQ ID NO.9；

DR：5’-TACGGTTGAAGAGTGTCG-3’；SEQ ID NO.10；

反应体系为：Taq酶25μL，ddH₂O 18μL，模板AB 1μL，模板CD 2μL，引物AF 2μL，引物DR2μL。

(4)基因敲除

以溶藻弧菌野生型菌株为敲除对象，先制备溶藻弧菌野生型菌株感受态细胞，利用电穿孔转化方法将pCas质粒转入溶藻弧菌野生型菌株感受态细胞中，通过测序，获得含有pCas质粒的阳性单克隆；验证成功后，将含有pCas质粒的溶藻弧菌继续制备感受态细胞v.△pcas+，再次利用电穿转化方法将pTargetF-Hfq重组质粒与同源臂同时转化进感受态细胞V.△pcas+中，将在2216E培养基中复苏的菌液涂布于同时含有150μg/ml卡那霉素、150μg/ml壮观霉素的2216E平板上，在28℃培养，挑取单克隆菌落进行核酸凝胶电泳及16SrRNA鉴定。

含有pCas质粒的阳性单克隆测序结果：

GGGGATCCGTGAGGTTGAGTAGTGCCACACAGCATAAAATTAGCTTGGTTTCATGCTCCGTTAAGTCATAGCGACTAATCGCTAGTTCATTTGCTTTGAAAACAACTAATTCAGACATACATCTCAATTGGTCTAGGTGATTTTAATCACTATACCAATTGAGATGGGCTAGTCAATGA；SEQ ID NO.11；

表明pCas质粒成功转入溶藻弧菌野生型菌株感受态细胞。

为了鉴定单克隆菌落Hfq基因是否敲除成功，利用HfqF/Hfq R引物对挑选出来的单克隆菌落的基因组进行PCR扩增。利用Hfq-1F/Hfq-1R进行16SrRNA测序。

其中，HfqF/HfqR引物序列如下：

Hfq F：5’-TTTGCATTGCACCACTAG-3’；SEQ ID NO.12；

Hfq R：5’-CTCACCGGATTCATAACG-3’；SEQ ID NO.13；

Hfq-1F：5’-TCCATACGATGCGTCGGTTA-3’；SEQ ID NO.14；

Hfq-1R：5’-CAGGAGAGAGGGCGTGATTA-3’；SEQ ID NO.15；

PCR产物经1.1％的琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图2。图2结果显示，9号单克隆菌株为阳性克隆子，未检测到Hfq基因片段的条带；同时16S rRNA测序结果显示，该菌株Hfq基因片段缺失。表明得到缺失Hfq基因片段的溶藻弧菌v.△Hfq-(突变型菌株)。

测序结果：

ATCAGCCAGTATTTAGATGGGGAGTGTACACGTGACGAAGCGGTATTTCGTGGCGTATGCGCGACTCGTCAATTGGCCAAGCGTCAAATCACCTCGCAAGAAGGTGAATGGGAAGATCTGGCTGAGTTCGAAATGCTGGTTTCTTCTGCTGGGGTAGAGGCGCTACAAGTGGTAACTGGTAGTCGTCAATCCCCACACCCGAAATACTATGTCGGAGAGGGTAAGGCCCAAGAGATTGCTACAGCGGTACAATCAACGGGTGCCGAAATTGTGATTTTTAA；SEQ ID NO.16；

测序结果显示，目的基因已敲除。

将野生型与突变型菌株分别接种于2216E平板中28℃培养24h，在透射电子显微镜下观察菌落特征(JEM-1200EX，日本东京JOEL)。电镜结果如图3所示，野生型和突变型菌株均呈现椭圆状，野生型菌株具有周生鞭毛和端生鞭毛，而突变型菌株周生鞭毛脱落，仅生长端生鞭毛。

实施例2LD50的测定

将野生型菌株和突变型菌株在2216E培养基中28℃培养，离心后，将菌体用0.45μm滤膜过滤的海水(强业水产品批发部，青岛)稀释至1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴CFU/mL，共5个浓度梯度，分为三组(野生型、突变株、过滤海水对照组)，选取活性良好的扇贝，确保每组各梯度的实验对象数量一致，采用20℃浸泡浸染的方式，每24h记录死亡情况，用SPSS.22中回归分析计算LD50，结果见表1。

表1

表1结果表明，20℃浸泡浸染2天，突变株的LD50为2.98×10⁶CFU/mL，野生株的LD50为1.09×10⁵CFU/mL，LD50的浓度提高至27倍。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 自然资源部第一海洋研究所

<120> 溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 264

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggctaagg ggcaatctct acaagaccca tttctaaacg cgctacgtcg tgagcgtatc 60

ccggtatcta tctaccttgt gaatggtatt aaactacaag gtcagatcga atcattcgat 120

caatttgtga tcctgctgaa gaatactgtt aaccaaatgg tgtacaagca cgcgatctca 180

acagttgtgc cggctcgtcc agtgagccat cacagcggtg aacgtccaca aggtgagcgt 240

ccacaagaga aatctgaaga ttaa 264

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gctacgtcgt gagcgtatcc gttttagagc tagaaatagc a 41

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ggatacgctc acgacgtagc ctagtattat acctaggact g 41

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cccctgattc tgtggata 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ttcaagttga taacggacta 20

<210> 6

<211> 252

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tgtccttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt 60

gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat 120

ttcacaccgc atatgctgga tccttgacag ctagctcagt cctaggtata atactaggct 180

acgtcgtgag cgtatccgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt 240

tatcaacttg aa 252

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tttatctcgg gcattgga 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

aggtgatttg acgcttgg 18

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ccaagcgtca aatcacctac gcaagaaggt gaatgg 36

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tacggttgaa gagtgtcg 18

<210> 11

<211> 179

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ggggatccgt gaggttgagt agtgccacac agcataaaat tagcttggtt tcatgctccg 60

ttaagtcata gcgactaatc gctagttcat ttgctttgaa aacaactaat tcagacatac 120

atctcaattg gtctaggtga ttttaatcac tataccaatt gagatgggct agtcaatga 179

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

tttgcattgc accactag 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ctcaccggat tcataacg 18

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

tccatacgat gcgtcggtta 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

caggagagag ggcgtgatta 20

Claims

1.溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株，其特征在于，其溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株的保藏编号为CCTCCNO：M 2021539。

2.根据权利要求1所述的溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株，其特征在于，靶向Hfq基因的pTargetF-Hfq重组质粒构建方法如下：

以pTargetF质粒为模板，用引物G2 F/G2 R构建含有20bpHfq基因片段的pTargetF-Hfq载体；

其中，引物G2 F/G2 R序列如下：

G2 F：5’-GCTACGTCGTGAGCGTATCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3’；SEQ ID NO.2；

G2 R：5’-GGATACGCTCACGACGTAGCCTAGTATTATACCTAGGACTG-3’；SEQ ID NO.3；

3.根据权利要求1所述的溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株，其特征在于，同源臂的构建方法如下：

以溶藻弧菌野生型菌株基因组为模板，分别用引物AF/BR和CF/DR来扩增目的基因前段基因片段AB与后段基因片段CD，验证成功后，以基因片段AB和基因片段CD为模板，用引物AF/DR进行扩增，将两段基因拼接得到同源臂；

其中，引物AF/BR和CF/DR的序列如下：

AF：5’-TTTATCTCGGGCATTGGA-3’；SEQ ID NO.7；

BR：5’-AGGTGATTTGACGCTTGG-3’；SEQ ID NO.8；

CF：5’-CCAAGCGTCAAATCACCTACGCAAGAAGGTGAATGG-3’；SEQ ID NO.9；

DR：5’-TACGGTTGAAGAGTGTCG-3’；SEQ ID NO.10；

4.权利要求1所述的溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株在降低溶藻弧菌毒力中的应用。

5.根据权利要求4所述的溶藻弧菌Hfq基因敲除突变株在降低溶藻弧菌毒力中的应用，其特征在于，所述Hfq基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。