CN115287243B - 一株变形假单胞菌flgK基因沉默菌株及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株变形假单胞菌flgK基因沉默菌株及其构建方法。所述菌株分类命名为Pseudomonas plecoglossicida flgK‑RNAi，已于2022年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022077。人工感染实验结果表明，本发明所构建的变形假单胞菌flgK基因沉默菌株对斜带石斑鱼的致病力显著下降，可用于研究变形假单胞菌的致病机理。

Description

一株变形假单胞菌flgK基因沉默菌株及其构建方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株变形假单胞菌flgK基因沉默菌株及其构建方法。
背景技术
变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是大黄鱼、香鱼等经济鱼类“内脏白点病”的病原，具有较高的感染率和死亡率，造成巨大的经济损失。
flgK基因是细菌众多鞭毛基因中的一个，位于细菌鞭毛钩和鞭毛丝之间，是两个钩丝连接蛋白之一。flgK基因是鞭毛组装所必需的，影响与细菌致病性相关的许多因素，如鞭毛形成、运动、粘附和生物膜发育。由flgK基因翻译转录得到的FlgK蛋白由两个或三个结构域组成，比较已知的FlgK蛋白结构发现，FlgK蛋白的细胞近端部分相对保守。在对许多细菌的研究过程中发现FlgK蛋白作为疫苗具有很大的研究潜力。
本发明通过基因沉默技术构建了一株变形假单胞菌flgK基因稳定沉默菌株，采用人工感染实验确定flgK基因稳定沉默菌株对斜带石斑鱼的致病性，结果表明，本发明所构建的变形假单胞菌flgK基因稳定沉默菌株对斜带石斑鱼的致病力显著下降，可用于研究变形假单胞菌的致病机理。
发明内容
本发明的目的在于提供一株变形假单胞菌flgK基因稳定沉默菌株及其构建方法，以揭示flgK基因对变形假单胞菌运动性、趋化等力因子以及在转录组、代谢组方面的影响，明确该变形假单胞菌flgK基因稳定沉默菌株的应用范围。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株变形假单胞菌flgK基因沉默菌株，所述菌株分类命名为Pseudomonas plecoglossicida flgK-RNAi，已于2022年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022077，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。
进一步的，上述一株变形假单胞菌flgK基因沉默菌株的构建方法包括如下步骤：
步骤一：通过比较分析变形假单胞菌感染斜带石斑鱼互作转录组数据，筛选到感染过程中表达量提高的flgK基因；
步骤二：根据flgK基因序列设计、合成shRNA引物，退火后与pCM130/tac载体进行连接，采用点击转化的方式导入变形假单胞菌感受态细胞，构建变形假单胞菌flgK基因稳定沉默菌株；利用qRT-PCR技术对沉默效果进行检验，最终获得变形假单胞菌flgK基因沉默突变株。
进一步的，上述flgK基因序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，上述一株变形假单胞菌flgK基因沉默菌株可应用于制备预防和治疗斜带石斑鱼脾脏白点病制剂。
本发明的显著优点在于：
本发明通过采用相同剂量的变形假单胞菌野生株和变形假单胞菌flgK基因沉默株分别感染斜带斜带石斑鱼，进一步确定了flgK基因是变形假单胞菌重要的毒力基因，本发明所提供的变形假单胞菌flgK基因稳定沉默菌株感染的斜带石斑鱼的死亡率为45%，而变形假单胞菌野生株感染后斜带石斑鱼的死亡率为100%，说明本发明所提供的变形假单胞菌flgK基因稳定沉默菌株的毒力显著低于变形假单胞菌野生株的毒力，在同等感染条件下不会引起斜带石斑鱼的死亡，具有研制预防和治疗斜带石斑鱼脾脏白点病制剂的潜力。
附图说明
图1：野生型菌株和flgK-RNAi菌株的毒力研究。(A)：4株flgK-RNAi沉默株的flgKmRNA水平。(B))野生型菌株和flgK-RNAi菌株的生长曲线。(C)：野生株和flgK-RNAi的菌落比较。（D）: 野生株和flgK-RNAi的菌落直径比较。**P＜0.01。（E）不同感染组在10dpi时的斜带石斑鱼存活率。(F)：变形假单胞菌感染斜带石斑鱼脾脏的症状。
具体实施方式
本发明实施例提供的变形假单胞菌flgK基因稳定沉默菌株的构建方法包括如下步骤：
S1：使用比较转录组学技术分析变形假单胞菌在斜带石斑鱼脾脏内的基因表达情况，发现flgK基因在感染过程中表达量显著提，因此锁定flgK基因为目标基因。
S2：使用Thermo-fisher Scientific公司在线shRNA设计工具，利用在线shRNA设计工具针对flgK基因序列（SEQ ID NO.1）设计并合成了4对shRNA引物，分别与pCM130/tac载体进行连接，以构建重组载体，使用电击转化的方法将各重组载体分别导入变形假单胞菌感受态细胞，成功构建4株变形假单胞菌flgK基因稳定沉默菌株；并利用qRT-PCR技术对沉默效果进行检验，上游引物为：5'-GAACACCGAGGTGATCGACG-3'，下游引物为：5'-ATAGTAGAACCCGTCGTGGC-3'。图1A显示了4株flgK-RNAi菌株的沉默效果，其中，flgK-RNAi-880的沉默效果最好，达到87.9%，即为变形假单胞菌flgK基因稳定高效沉默株；其中，4对shRNA引物序列如下：
引物对1：
K1F：5’-TGCGACTTGTTGATAGGCAAACTTCAAGAGAGTTTGCCTATCAACAAGTCGCTTTTTTT-3’，
K1R：5’-GTACAAAAAAAGCGACTTGTTGATAGGCAAACTCTCTTGAAGTTTGCCTATCAACAAGTCGCATGCA-3’；
引物对2：
K2F：5’-TGCCAATGGTATCAGGACATACTTCAAGAGAGTATGTCCTGATACCATTGGCTTTTTTT-3’，
K2R：5’-GTACAAAAAAAGCCAATGGTATCAGGACATACTCTCTTGAAGTATGTCCTGATACCATTGGCATGCA-3’；
引物对3：
K3F：5’-TGCACAAGCGTTGACGGAAATGTTCAAGAGACATTTCCGTCAACGCTTGTGCTTTTTTT-3’，
K3R：5’-GTACAAAAAAAGCACAAGCGTTGACGGAAATGTCTCTTGAACATTTCCGTCAACGCTTGTGCATGCA-3’；
引物对4：
K4F：5’-TGCAAGACAGTGCAGGCCAATATTCAAGAGATATTGGCCTGCACTGTCTTGCTTTTTTT-3’，
K4R：5’-GTACAAAAAAAGCAAGACAGTGCAGGCCAATATCTCTTGAATATTGGCCTGCACTGTCTTGCATGCA-3’；引物对1所对应的变形假单胞菌flgK基因稳定沉默菌株为flgK-RNAi-593，引物对2所对应的变形假单胞菌flgK基因稳定沉默菌株为flgK-RNAi-687，引物对3所对应的变形假单胞菌flgK基因稳定沉默菌株为flgK-RNAi-880，引物对4所对应的变形假单胞菌flgK基因稳定沉默菌株为flgK-RNAi-1292。
S3：开展野生株与flgK基因稳定高效沉默株flgK-RNAi-880的表型对比和人工感染实验，对变形假单胞菌野生株和flgK基因稳定高效沉默株flgK-RNAi-880的毒力进行对比。
变形假单胞菌野生菌株与flgK基因稳定高效沉默株flgK-RNAi-880在36h的培养时间内生长速度和最终菌浓度无明显差异（LB液体培养基，温度18℃）（图1B）。在半固体培养基（购自广东环凯微生物科技有限公司，货号：026050）培养16h后，与野生型菌株相比，flgK基因稳定高效沉默株flgK-RNAi-880的运动性显著下降（图1C），野生株菌落平均直径为9.6368±0.63060 mm，flgK基因稳定高效沉默株flgK-RNAi-880菌落的平均直径为6.8226±0.49702（图1D）。
分别使用flgK基因稳定高效沉默株flgK-RNAi-880、变形假单胞菌野生株和PBS（NaCl 0.8g、KCl 0.02g、Na2HPO4 0.36g、 KH2PO4 0.024g、H2O 1L，pH 7.0）对三组斜带石斑鱼（每组20尾鱼）进行胸腔注射感染，菌株感染浓度为104cfu/尾，在无致病性的实验室条件下（水温18±2℃），观察并记录各组鱼每天的存活状况。
注射10天后，对野生型菌株组、flgK基因稳定高效沉默株flgK-RNAi-880组和PBS组的生存率进行评估。结果表明，注射了flgK基因沉默株flgK-RNAi-880的斜带石斑鱼在死亡时间上表现出明显的延迟和明显的减少（图1E），注射野生型菌株后2.5dpi时鱼的存活率为95%，6dpi时存活率为0%。PBS组斜带石斑鱼在整个实验期间均存活。注射野生型菌株的斜带石斑鱼的脾脏表现出典型的症状(脾脏表面有许多白点覆盖)，但注射flgK基因沉默株flgK-RNAi-880的脾脏表面没有明显的白点（图1F）。
SEQUENCE LISTING
<110> 集美大学，福建天马饲料有限公司
<120> 一株变形假单胞菌flgK基因沉默菌株及其构建方法
<130>
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgatttcga tgagccagat cggctattca ggcatagctg ccggacagcg cgggttgcac 60
gcttcggcgc agaatgtcgc gaatttgaac accccagggt atagccgtct gactaccgtg 120
acggggtcgc ttgcagggcc gagcagcttg tcggcgggcg gcggcgtgga ggtctcggag 180
gtgcgtcgca ttgttgatga cttcaaaaat cggcagctat ggcacgcaac cactgaaatg 240
catcggtaca aggccgccca agagtacctg ggctcgctgg agtgcgccat ggacagcgag 300
ggggcaagcg tccgcactgg ccttgaccaa ttttttgctg ccctgagcga ggccagtagc 360
cgtcctgctg atctgccgca gcgtcagcag gttttggacg agacgaaaag tctcacccag 420
tgcgtcaatg gcttgaatag caacattgac gaccaactca aggcactgcg tgggcaacgt 480
tctgacattg tcaatgagat caatggtttg gcaggtaact tggcccgctt gaataagaaa 540
gtcgtagaaa cccagtccca tggcggtgac agttctgtgt tgcaggacga gcgcgacttg 600
ttgataggca aactgagcca gtacgtcgat atatgcgtta ccgaggctcg gacaggcgca 660
ttgagcgttt ccctggctga tgggctgcca atggtatcag gacatacggc agggcagctg 720
tcgatcatgg cccttgccgg aggagggcag gaggtttcgc tgagttttac cgatagccac 780
ttcgtcttgg ggcagagcgc gctgggtggc gctttaggtg gcttgcacaa tgtcgagcat 840
ggcgaactgt tggaggcacg agaacgccta ggggaaatgg cacaagcgtt gacggaaatg 900
gtcaatgagt cccagtcgcg aggttatggc ctcgatggcc tggttggcct ggaattgttg 960
acttgcaatc ccggcaatgt caccaagttg ctgcagatga acgacctcag gcctgagggg 1020
ctggcgtttg ctgataagcc ggacgaaaag ggcagcaata ccgttttgtt gggcatgatc 1080
gagttgaaaa acaaaaaagt tcaaatccag ggcaaccggg tcacattgag tgaggccttc 1140
agctcgatgc tggggcaagt cgccagcgtc agccgatgta atcaagcaga tctcaaaact 1200
gccaccgatg ttgccatgca ggcacaggca cagcgcgata gtgtcagcgc cgtgagcgac 1260
agcgaagaag cgctggcgat aatggattac agcaagacag tgcaggccaa tatgaaggta 1320
atccaggtcg acaacgagtt gttcggctac ctcctagcgt gcttttga 1368
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaacaccgag gtgatcgacg 20
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<212> DNA
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<400> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgcgacttgt tgataggcaa acttcaagag agtttgccta tcaacaagtc gcttttttt 59
<210> 5
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<400> 5
gtacaaaaaa agcgacttgt tgataggcaa actctcttga agtttgccta tcaacaagtc 60
gcatgca 67
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
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<400> 6
tgccaatggt atcaggacat acttcaagag agtatgtcct gataccattg gcttttttt 59
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gtacaaaaaa agccaatggt atcaggacat actctcttga agtatgtcct gataccattg 60
gcatgca 67
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<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 9
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
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gcatgca 67
<210> 10
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tgcaagacag tgcaggccaa tattcaagag atattggcct gcactgtctt gcttttttt 59
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<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gtacaaaaaa agcaagacag tgcaggccaa tatctcttga atattggcct gcactgtctt 60
gcatgca 67

Claims (1)

1.一株变形假单胞菌flgK基因沉默菌株，其特征在于：所述菌株分类命名为Pseudomonas plecoglossicida flgK-RNAi，已于2022年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022077，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。
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