JP3746556B2 - プラスミド及びプラスミドベクター - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)由来に代表される新規なプラスミド、及びこの新規なプラスミドを用いて調製されるところの、微生物の形質転換に利用でき、例えばラクトバチルス・ヘルベティカスと他の宿主とのシャトルベクターとして使用することができる新規なプラスミドベクターに関する。
【0002】
【従来の技術】
ラクトバチルス・ヘルベティカスは、古くから代表的な酪農用乳酸菌スターターとして発酵乳の製造に用いられている。ラクトバチルス・ヘルベティカスの特徴の1つとして、強い蛋白質分解活性が認められている(Yamamoto, N., et al.,Biosci. Biotech. Biochem., 58, 776-778(1994))。またラクトバチルス・ヘルベティカスの発酵乳中には、血圧上昇作用に主要な役割を果たすアンギオテンシン変換酵素に対して、阻害作用を示す生理活性ペプチドが含まれることが(Nakamura, Y. et al., J. Dairy Sci., 78, 777-783(1995))、更にはこれらのペプチドに起因する強い血圧降下作用が認められることが報告されている(Nakamura, Y., et al., J. Dairy Sci., 78, 1253-1257(1995))。このような菌株を有効利用する方法としては、従来から遺伝子組換え技術を応用して、分子育種する方法等が知られている。既に、乳酸菌について多くのプラスミドが報告されているが、乳酸桿菌ラクトバチルス・ヘルベティカスのプラスミドについての報告例は少ない。従って、ラクトバチルス・ヘルベティカスの宿主−ベクター系についての報告例も少ない。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
分子育種を遺伝子組換え技術に基づいて行うには、目的の菌株に合ったベクター、導入効率が高い形質転換法、及び安定にプラスミドを保持する宿主、即ち宿主−ベクター系の開発が重要課題である。特に、宿主当たりのコピー数が少ないと有効物質生産性も低くなり、実用性に問題が生じる。また、菌体自体を発酵乳として食する場合には、発酵に使用する微生物の安全性が問題となる。しかし、既に古くから発酵乳製造に用いられてきたラクトバチルス・ヘルベティカスの安全性については、これまで長年の食経験から実証されている。
【0004】
従って、本発明の課題は、ラクトバチルス属乳酸菌、特にラクトバチルス・ヘルベティカス由来に代表され、高コピー数を有する新規なプラスミド及びその新規なプラスミドを改変したシャトルベクターとして使用できる新規なプラスミドベクターを提供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ラクトバチルス・ヘルベティカス等に属する菌株のプラスミドの有無及びその分子量を検討した結果、ラクトバチルス・ヘルベティカスCP53株から、安定に保持され高コピー数である新規なプラスミドを見い出し、さらにこの新規なプラスミドを改変することにより、効率的に形質転換を行うことができる有用なプラスミドベクターを得、本発明を完成した。
【0006】
即ち、本発明によれば、下記式化3で示される制限酵素認識部位を有し、約11.5kb長である、受託番号FERM P−15387として寄託されたラクトバチルス・ヘルベティカスCP53株(特許生物寄託センター)から分離したプラスミドpCP53が提供される。
【0007】
【化3】
【0008】
また本発明によれば、前記プラスミドpCP53の複製開始領域、細菌由来の複製開始領域、及びマーカー遺伝子を含むプラスミドベクターが提供される。
【0009】
さらに本発明によれば、前記プラスミドpCP53のHindIII断片に含まれる約2kb長の複製開始領域、大腸菌由来のpACYC177の複製開始領域、及びストレプトコッカス・フェカリス由来テトラサイクリン耐性遺伝子を含み、下記式化4に示される制限酵素認識部位を有し、約4.7kb長であるプラスミドベクターpCP53Dが提供される。
【0010】
【化4】
【0011】
【発明の実施の形態】
本発明のプラスミドpCP53は、前記式化3で表わされる約11.5kb長のプラスミドであって、例えばラクトバチルス・ヘルベティカスCP53株から分離することができる。このラクトバチルス・ヘルベティカスCP53株は、ラクトバチルス・ヘルベティカスに属し、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM−15387として寄託されている。このCP53株は、本願出願人が保有する菌株コレクションの中から得たものであり、下記の菌学的性質を有する。
【0012】
(形態学的性質)
1)細胞の形状:桿菌、2)運動性:無、3)胞子の有無:無、4)グラム染色性:陽性
(生理学的性質)
1)カタラーゼ:陰性、2)インドール生成:陰性、3)硝酸塩の還元:陰性、4)酸素に対する態度:通性嫌気性、5)グルコースからホモ乳酸発酵によりDL乳酸を生成、ガス産生無し。
【0013】
6)各種炭水化物の分解性
グルコース: + マルトース: −
ラクトース: + セルビオース: −
マンノース: + トレハロース: −
フラクトース: + メルビオース: −
ガラクトース: + ラフィノース: −
シュークロース: − スタキオース: −
マルトース: + マンニトール: −
アラビノース: − ソルビトール: −
キシロース: − ユースクリン: −
ラムノース: − サリシン: −
本発明のプラスミドpCP53は、ラクトバチルス・ヘルベティカス菌体中で、高コピー数が産生され回収率が高い。例えば、pCP53を保有するラクトバチルス・ヘルベティカスCP53株をMRS培地にて一晩培養した場合、1mlの培養液から約1μgのプラスミドを精製することができる。
【0014】
本発明のプラスミドpCP53は、例えば前記ラクトバチルス・ヘルベティカスCP53株を培養し、培養後菌体を回収し、アガロースゲル電気泳動方法等の公知な方法で分離することができる。前記培養は、通常この菌種に用いられる培地や培養条件により行うことができる。菌体の回収も公知の遠心分離法等により行うことができる。またプラスミドpCP53は、制限酵素による切断、リガーゼによるライゲーションも公知のプラスミドと同様に行うことができる。
【0015】
本発明のプラスミドベクターは、プラスミドpCP53の複製開始領域に、細菌由来の複製開始領域及びマーカー遺伝子を連結したものであって、前記プラスミドpCP53のHindIII断片を含む約2kb長の複製開始領域、大腸菌由来のpACYC177の複製開始領域、及びストレプトコッカス・フェカリス由来テトラサイクリン耐性遺伝子を含み、前記式化4に示される制限酵素認識部位を有し、約4.7kb長であるプラスミドベクターpCP53D等を挙げることができる。
【0016】
前記細菌由来のプラスミドとしては、大腸菌由来のpACYC177の複製開始領域の他に、公知のpBR322、pBR329等の複製開始領域を用いることが可能である。更に、pUB110、YEp24、pVA838等の、枯草菌や酵母由来ベクターの複製開始領域等の使用も可能である。
【0017】
前記マーカー遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、あるいは乳酸菌又は枯草菌由来のβ−ガラクトシダーゼや菌体外プロテアーゼ等の酵素を産生する遺伝子等を挙げることができる。
【0018】
前記プラスミドベクターpCP53Dは、図2に示す手順により、本発明のプラスミドpCP53に、pHY300PLKプラスミド(宝酒造(株)製品)を利用し、大腸菌由来プラスミドpACYC177の複製開始領域及びストレプトコッカス・フェカリス由来のプラスミドpAMα1のテトラサイクリン耐性遺伝子を連結することにより得ることができる。図2に示す本発明以外のプラスミドは、公知であり、市場で購入することができる。このプラスミドベクターpCP53Dは、大腸菌及びラクトバチルス・ヘルベティカスやラクトバチルス・パラカゼイ等ラクトバチルス属乳酸菌へ導入できるシャトルベクターとして使用可能である。
【0019】
【発明の効果】
本発明のプラスミドpCP53は、ラクトバチルス・ヘルベティカス中に安定に保持されかつ高コピー数を示す。また本発明のプラスミドベクターpCP53Dは、ラクトバチルス・ヘルベティカスの形質転換を効率的に行うことができる有用なシャトルベクターである。従って、これらは遺伝子組換え技術を用いたラクトバチルス・ヘルベティカスの分子育種等に有用である。
【0020】
【実施例】
以下実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0021】
【実施例1】
(プラスミドの分離)
ラクトバチルス・ヘルベティカスCP53株を、GAM培地(ニッスイ(株)製)に植菌後、37℃で一晩培養した。培養終了後、遠心分離(10,000rpm、5分間)により集菌した。菌体を10mMリン酸緩衝液−150mM NaCl(pH6.8)で洗浄後、上記遠心分離条件にて菌体を回収した。
【0022】
次に以下の方法でプラスミドの精製を行った。回収した菌体を10mg/mlリゾチーム(シグマ社製)、1mg/ml N−アセチルムラミダーゼ(生化学工業(株)製)を含む25%シュークロース、10mMトリス塩酸緩衝液0.2ml(pH7.0)に懸濁後、37℃で30分間インキュベートした。次に3%SDS−0.2N NaOH溶液0.4mlを添加し室温にて約5分間放置した。次に、3M酢酸ナトリウム(pH4.8)溶液を0.3ml添加し、氷上で5分間放置後、遠心分離(15,000rpm、5分間)により上清液を回収した。約2倍量のエタノールを上清液に添加し、−80℃にて約20分間放置した。続いて、遠心分離(15,000rpm、15分間)にて沈殿物を回収し、70%エタノールにて洗浄後、沈殿物を乾燥した。沈殿物を0.1mlの10mMトリス塩酸緩衝液−1mM EDTA(pH7.0)に溶解し、プラスミドの粗精製物を得た。この粗精製プラスミドについて、1%アガロースゲル電気泳動によりプラスミドの有無及び分子サイズの確認を行った。比較のためプラスミドpBR322保有の大腸菌HB101株をLB培地(バクトトリプトン10g、イ−ストイクストラクト5g、NaCl 10g:pH7.5)で培養し、同様にプラスミドの回収量を比較した。その結果、ラクトバチルス・ヘルベティカスCP53株は、極めて高い回収率でプラスミドの存在が確認され、これをpCP53と命名した。pCP53の回収量は、大腸菌用プラスミドであるpBR322の約20%程度(1μg/ml培養液)であり、ラクトバチルス・ヘルベティカスプラスミドとしては、極めて高い回収率であった。
【0023】
pCP53の制限酵素認識部位を探る目的で、6塩基認識の制限酵素9種類について、切断断片を1%アガロース電気泳動により分析した。その結果、pCP53は分子量約11.5kbで、図1に示す制限酵素認識部位を有することが確認された。また、PstI、BglII、あるいはSalIに対する認識部位は認められなかった。
【0024】
【実施例2】
(プラスミドベクターpCP53Dの構築)
図2に示す操作手順に従って、プラスミドpCP53の複製開始領域、大腸菌由来のpACYC177の複製開始領域、及びストレプトコッカス・フェカリス由来テトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドベクターを構築した。
【0025】
1)複製開始領域検索用ベクターの構築
図2に示される、大腸菌由来プラスミドpACYC177の複製開始領域(Ori-177)、ストレプトコッカス・フェカリス由来のプラスミドpAMα1の複製開始領域(Ori-pAMα1)、ならびにアンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含んだプラスミドpHY300PLK(宝酒造(株)製)1μgを、HaeIIIで部分分解し、T4DNAリガーゼでセルフライゲーションした。このDNAを大腸菌HB101株にマニアチスの方法(Molecular Cloning)に従って形質転換し、20μg/mlのテトラサイクリンを含むLB寒天培地で生育株を選択した。図2に示す通りpHY300PLKのグラム陽性菌用複製開始点欠損株はアンピシリン感受性となるために、上記選択株を50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地で生育性を調べた。アンピシリン感受性株数株から前述の方法に従いプラスミドを分離し、その制限酵素認識部位を調べたところ、図2記載のpHYD(2.7kb)が構築されていることが確認された。
【0026】
2)pCP53プラスミド複製開始領域のクローニング
前述のグラム陽性菌複製開始点検索用ベクターpHYD 1μgをHind IIIで切断したものと、pCP53 1μgをHindIIIで切断したものとを混合し、T4DNAリガーゼにより連結した。このDNAを大腸菌HB101に形質転換し、20μg/mlのテトラサイクリンを含むLB寒天培地で生育株を選択した。得られた形質転換体から得られたDNAを1%アガロースゲル電気泳動で分析した結果、pCP53由来と思われる様々の大きさのHindIII断片がpHYDベクターに挿入されていることを確認した。
【0027】
次に、これら各種のプラスミドをラクトバチルス・パラカゼイに導入し、4μg/mlのテトラサイクリンを含むGAM培地で生育株をスクリーニングした。ラクトバチルス・パラカゼイJCM−8130を1.5mMのグリシンを含むGAM培地で、37℃、20時間培養後、この培地をさらに新しい1.5mMのグリシン含有GAM培地で10倍に希釈し、37℃で濁度1.0になるまで培養した。菌体を集菌後、エレクトロポレーション用緩衝液(7mM HEPES、272mMシュークロース、1mM MgCl2:pH7.4)で洗浄し、1/20容の同緩衝液に懸濁した。前記各種プラスミド0.1μgと前記懸濁菌体0.1mlを混合後、バイオラッド社製ジーンパルサー用キュベット(0.1cmキュベット)に入れ氷上で30分間インキュベートした。その後、ジーンパルサーで4.0kV/cm、25μFの条件でエレクトロポレーションした。菌体を10倍量のGAM培地で希釈後、37℃で1時間インキュベートし、4μg/mlのテトラサイクリンを含むGAM寒天培地で陽性クローンを選択した。得られた形質転換体についてプラスミドを1%アガロースゲル電気泳動により分析したところpCP53の約2kbの断片を含む4.7kbのプラスミドの存在が確認された。従って、pCP53の約2.0kbDNA断片にpCP53の複製開始領域(Ori-pCP53)が含まれることが明らかとなった。このベクターは大腸菌あるいはラクトバチルス属での複製可能なシャトルベクターとしての利用が可能であり、pCP53Dと命名した。一方、この2.0kbDNA断片を含まないpHYD(2.7kb)ベクターのみではテトラサイクリン形質転換体は得られなかった。
【0028】
【実施例3】
(ラクトバチルス・ヘルベティカス株のpCP53Dによる形質転換)
ラクトバチルス・ヘルベティカスCP611株(工業技術院生命工学工業技術研究所受託番号FERM−15418)へ前記pCP53Dを用いての形質転換を検討した。ラクトバチルス・ヘルベティカスCP611株を1.5mMのグリシンを含むGAM培地で、37℃、20時間培養後、この培地をさらに新しい1.5mMのグリシン含有GAM培地で10倍に希釈し、37℃で濁度1.0になるまで培養した。菌体を集菌後、エレクトロポレーション用緩衝液(7mM HEPES、272mMシュークロース、1mM MgCl2:pH7.4)で洗浄し、1/20容の同緩衝液に懸濁した。pCP53D 0.1μgと前記懸濁菌体0.1mlとを混合後、前記と同様の条件にてエレクトロポレーションした。菌体を10倍量のGAM培地で希釈して37℃で1時間インキュベート後、4μg/mlのテトラサイクリンを含むGAM寒天培地で陽性クローンを選択した。約6日後、5000個/μgDNAの割合で形質転換体が得られた。この形質転換体は、10μg/mlのテトラサイクリン濃度において、50%生残性を示した。
【0029】
得られた形質転換体について、プラスミドを1%アガロースゲル電気泳動により分析したところpCP53の約2kbの断片を含む4.7kbのプラスミドの存在が確認された。さらに、ここで得られた形質転換体を繰り返し継代しても、プラスミドが安定に保持されることが確認された。従って、このベクターはラクトバチルス・ヘルベティカス種の形質転換において有用なシャトルベクターであり、ラクトバチルス・ヘルベティカスCP611株を用いることで効率的形質転換が可能であった。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、本発明のプラスミドpCP53の制限酵素地図である。
【図2】図2は、本発明のプラスミドpCP53Dの構築経路の説明図である。
Claims (3)
- 請求項1記載のプラスミドpCP53の複製開始領域、細菌由来の複製開始領域、及びマーカー遺伝子を含むプラスミドベクター。
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JPS6221515B2 (ja) | ||
JPH0427392A (ja) | G6アミラーゼ遺伝子 |
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