KR100786514B1 - 유산균 내에서 복제가 가능한 대장균-락토바실러스 셔틀벡터 및 그 응용 - Google Patents

유산균 내에서 복제가 가능한 대장균-락토바실러스 셔틀벡터 및 그 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 새로운 유산균용 벡터에 관한 것으로 락토바실러스 플랜타럼 균주에서 분리한 플라스미드 유전자를 이용하여 락토바실러스에서 복제가 가능한 플라스미드의 제조 및 그 응용에 관한 것이다. 보다 상세하게 락토바실러스 플랜타럼 균주 유래 서열번호 1의 염기서열을 갖는 플라스미드 p84와 대장균 유래 pUC19-CAT 벡터를 연결하여 제조된, 대장균 및 락토바실러스에서 상호 복제가 가능한 셔틀벡터 및 상기 셔틀벡터로 형질전환된 락토바실러스 속 형질전환체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 셔틀벡터는 형질전환 효율이 우수할 뿐만 아니라 락토바실러스 속 균주에 형질 전환되어 안정하게 유지될 수 있는 특성을 지니고 있다. 이러한 특성을 이용하여 향후 락토바실러스 속 유산균에서 목적하는 외부 유전자 및 유용 유전자 발현에 이용될 수 있는 백본(backbone) 벡터로 이용될 수 있다.
유산균용 벡터, 락토바실러스, 대장균, 락토바실러스 플랜타럼, 락토바실러스 카제이, 셔틀벡터(shuttle vector)

Description

유산균 내에서 복제가 가능한 대장균-락토바실러스 셔틀 벡터 및 그 응용{Development of E.coli-lactobacillus shuttle vector and it's application}
도 1은 건강한 사람으로부터 분리된 여러 가지 유산균에 존재하는 플라스미드 DNA의 존재 유무를 확인한 실험결과를 나타낸 것이고,
도 2는 84균주에서 분리한 플라스미드를 blast search한 결과를 보이는 것이고,
도 3은 락토바실러스 플랜타럼 균주에서 유래된 p84 플라스미드의 개열지도를 나타낸 것이며,
도 4는 락토바실러스 플랜타럼 균주에서 유래된 p84 플라스미드의 복제인자를 분석한 결과를 나타낸 것이고,
도 5는 락토바실러스 플랜타럼 균주에서 유래된 p84 플라스미드 RepA 단백질 전사개시 서열을 분석한 결과를 나타낸 것이며,
도 6은 대장균과 락토바실러스 플랜타럼 내에서 상호 복제가 가능한 셔틀벡터(shuttle vector)의 제조과정을 나타낸 것이고,
도 7은 락토바실러스 플랜타럼 균주로부터 plasmid curing을 실시하여 플라스미드가 결손됨을 나타낸 것이고,
도 8은 3종의 대장균-락토바실러스 셔틀 벡터의 락토바실러스 플랜타럼 균주 및 락토바실러스 카제이 균주로의 형질전환 효율을 분석한 결과를 나타낸 것이며,
도 9와 도 10은 pELS 84-③ 셔틀벡터로 형질전환된 락토바실러스 플랜타럼 균주에서 셔틀벡터의 안정성을 나타낸 것이고,
도 11은 pELS 84-③ 셔틀벡터로 형질전환된 락토바실러스 카제이 균주에서 셔틀벡터의 안정성을 나타낸 것이고,
도 12는 플라스미드 p84와 pUC19-CAT을 연결하여 제조된 pELS 84-① 셔틀벡터 개열지도를 나타낸 것이고,
도 13은 플라스미드 p84와 pUC19-CAT을 연결하여 제조된 pELS 84-② 셔틀벡터 개열지도를 나타낸 것이고,
도 14는 플라스미드 p84와 pUC19-CAT을 연결하여 제조된 pELS 84-③ 셔틀벡터 개열지도를 나타낸 것이다.
본 발명은 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주 유래 신규 플라스미드를 함유하는 셔틀 벡터(shuttle vector) 및 그 응용에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 플라스미드 p84와 대장균 유래 pUC19-CAT 벡터를 연결하여 제조된, 대장균 및 락토바실러스에서 상호 복제가 가능한 셔틀벡터 및 상기 셔틀벡터로 형질전환된 락토바실러스 속 형질전환체에 관한 것이다.
유산균은 GRAS(Generally Accepted As Safe)로서 안정성이 인정되어 오랜 기간 동안 식품에 사용되어 왔으며 프로바이오틱(probiotic) 균주로서의 기능성을 널리 인정받고 있다. 특히, 락토바실러스 속에 속하는 젖산 간균(桿菌:락토바실루스 속) 중 하나인 락토바실러스 플랜타럼은 D-젖산과 L-젖산을 생성하고 김치·엔실리지 등에 항상 존재하며, 또 치즈의 풍미를 내는데 작용을 한다.
현재 유산균을 이용한 여러 가지 응용가능성이 제시되고 있으며 그 중 유산균을 이용한 유전자 발현 시스템이 새로운 발현 시스템으로 대두 되고 있다. 유산균 벡터 시스템은 최근 유럽과 미국을 중심으로 많은 연구가 진행 중이며 현재까지 락토코코스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주 등에서 유래된 플라스미드를 이용한 다양한 벡터 시스템이 개발되었으며 현재도 많은 연구자들이 새로운 벡터 시스템을 개발하고 있다.
여러 가지 유산균 중 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주는 아쥬반트(adjuvant)로써 작용할 수 있음이 보고된 바 있으며(Clin Exp Immunol. 1979 Aug;37(2):367-75) 이를 바탕으로 플랜타럼 균주내에서 안정하게 유지될 수 있는 벡터를 기반으로 하여 여러 가지 외부 유전자의 발현시스템을 개발할 경우 외부유전자를 발현하는 균 자체만으로도 효과적으로 면역반응을 유도할 수 있을 것으로 판단되어, 본 발명자들은 이를 위하여 유산균체내에서 안정하게 복제될 수 있는 벡터 시스템의 개발을 하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 대장균 및 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주에서 안정하게 상호 복제가 가능한 셔틀벡터를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 셔틀벡터로 형질 전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 플라스미드 p84와 대장균 유래 pUC19-CAT 벡터를 연결하여 제조된 대장균 및 락토바실러스 속에서 상호 복제가 가능한 셔틀벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 셔틀벡터로 형질전환된 락토바실러스 속 형질전환체를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 새로운 유산균용 벡터 제조에 관한 것으로, 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)에서 분리한 플라스미드의 염기서열을 확인하고 분석하여 락토바실러스 속에서 복제가 가능한 최소한의 유전정보를 결정하여, 이 염기서열을 대장균에서 널리 사용되는 pUC19 벡터와 결합하여 대장균-락토바실러스 속 유산균에서 안정하게 유지될 수 있는 셔틀벡터를 제조한다.
락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)에서 분리된 플라스미드는 이제까지 보고되지 않은 새로운 플라스미드로서 플라스미드 p84로 명명하였다. 상기 플라스미드 p84는 총 3,415 bp로 이루어져 있으며 서열번호 2의 염기서열을 갖는 복제 기점(Ori)과 3개의 ORF(open reading frame)로 구성되어 있다. 이 중 ORF1은 서열번호 3의 염기서열을 갖는 RepA 단백질 유전자로서 RepA 단백질은 플라스미드의 복제에 필수적인 단백질이며, ORF3은 서열번호 4의 염기서열을 갖는 Mob 단백질 유전자로서 Mob 단백질은 플라스미드의 이동성에 관련된 단백질이다. 한편, ORF2는 정확히 어떤 기능을 하는 유전자 인지는 현재까지 명확히 밝혀지지 않았으나, 지금까지 기능이 보고된 단백질과 염기서열상 연관성이 없는 것으로 나타났다.
특히, 본 발명의 새롭게 분리된 플라스미드 p84로부터 유래된 서열번호 2의 염기서열을 갖는 복제 기점(Ori)과 서열번호 3의 염기서열을 갖는 RepA 단백질 유전자 암호화 부위(ORF1)만을 이용함으로써 락토바실러스(Lactobacillus)에서 복제가 가능한 DNA의 크기를 최소화하여 제조한 대장균-락토바실러스 셔틀 벡터가 여러 가지 락토바실러스 속 균주에서 가장 안정하게 유지 될 뿐만 아니라 형질전환 효율이 가장 우수함을 확인하였다.
또한 상기의 셔틀벡터는 락토바실러스 플랜타럼 균주 및 락토바실러스 카제이 균주에서 높은 효율로 형질 전환이 이루어지며 항생제 없이도 셔틀벡터가 안정하게 유지됨을 확인하였다.
이하 실시 예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시 예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.
실시예 1
락토바실러스 속 유산균으로부터 p84 플라스미드의 분리
건강한 대학생으로부터 분변을 수집하여 인산완충용액(Phosphate-buffered saline, PBS)으로 희석하고 배지에 도말한 후 배양하여 독립적인 콜로니의 생성여부를 확인하였다. 생성된 각각의 콜로니를 수차례의 분리과정을 수행하여 단일균체를 확보하였다.
상기의 분리한 각각의 균체를 MRS 배지나 BL 배지에서 배양하고 배양한 유산균체를 PBS로 세척한 후 라이소자임(lysozyme)과 뮤타놀리신(mutanolysin) 효소가 존재하는 완충용액에서 1시간동안 반응하였다. 원심분리 후 상층액을 제거한 후 100㎕의 Solution I (50 mM Glucose, 25 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, pH 8.0)으로 현탁한 후 200㎕의 0.2 M NaOH, 1% SDS를 첨가하여 잘 섞어주었다. 여기에 150㎕의 5 M 포타슘 아세테이트 용액(potassium acetate solution (pH 4.8))을 첨가하여 섞어주었다. 이를 15,000 x g에서 15분간 원심분리하여 상층액을 분리한 후 동일부피의 Phenol:chloroform:isoamyalcohol(25:24:1)을 첨가하여 볼텍싱(vortexing)한 후 다시 3분간 15,000 x g에서 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 여기에 1/10 부피의 3M NaOAc 및 2배 부피의 에틸알콜을 첨가한 후 -20oC에서 30분간 보관한 후 다시 15,000 x g에서 20분간 원심분리하여 플라스미드 DNA의 침전을 유도하였다. 이를 70% 에틸알콜로 세척한 후 건조(dry) 하고 적정량의 증류수를 첨가하여 플라스미드 DNA를 용해하였다. 그 다음, 이를 0.8% 아가로스 젤(agarose gel)에서 전기영동을 수행하고 에티디움 브로마이드(ethidium bromide; EtBr)로 염색하여 플라스미드 DNA의 존재 유무 및 크기를 확인하였다.
도 1은 대표적인 플라스미드 분석 결과이다.
여러 가지 유산균주 중 84 균주 유래 플라스미드(p84)에 관심을 가지고 시퀀싱(sequencing)을 통해서 서열번호1의 염기서열을 결정하였다. 염기서열 분석 결과 3,415 bp로 구성되어 있음을 확인하였다.
도 2는 상기 p84 플라스미드를 블라스트 서치(Blast search)한 결과를 나타내고 있다.
Blast 분석 결과에 의하면 p84 플라스미드와 상동성을 나타내는 유전자는 4가지 정도로 분석되었다. 각각에 대해서 설명하면 다음과 같다.
도 2의 ①은 상기 p84 플라스미드가 락토바실러스 플랜타럼 WCFS1(Lactobacillus plantarum WCFS1)에서 분리한 원형 플라스미드(Circular plasmid) pWCFS101과 95% 염기서열이 일치함을 나타낸 것이다. 상기 락토바실러스 플랜타럼 WCFS1은 2003년 2월 전체 게놈 서열(complete genome sequence)이 네덜란드 팀에 의해 PNAS 이라는 논문에 발표되었으며 상기 균주에서 분리한 플라스미드인 pWCFS101의 염기서열은 2004년 5월에 추가적으로 등록되었다. 상기 플라스미드 pWCFS101의 총길이는 1,917bp이다.
도 2의 ②는 상기 p84 플라스미드가 락토바실러스 플랜타럼 pLTK2(Lactobacillus plantarum plasmid pLTK2)와 90% 염기서열이 일치함을 나타낸 것이다.
도 2의 ③은 상기 p84 플라스미드가 락토바실러스 힐가디(Lactobacillus hilgardii)에서 분리한 플라스미드 pLAB1000(Plasmid pLAB1000)의 플라스미드의 복제에 필수적인 단백질(rep) 유전자 및 플라스미드의 이동성에 관련된 단백질 (mob) 유전자와 82% 염기 서열이 일치함을 나타낸 것이다.
도 2의 ④는 상기 p84 플라스미드가 락토바실러스 카제이 플라스미드 pLC88(Lactobacillus casei plasmid pLC88)의 플라스미드의 복제에 필수적인 단백질 유전자 및 플라스미드의 이동성에 관련된 단백질 유전자의 전체 서열과 96% 일치함을 나타낸 것이다.
따라서, 84 균주 유래 플라스미드 p84는 상기한 Blast search 한 결과 지금까지 알려지지 않은 새로운 플라스미드로서 상동성을 나타내는 유전자의 길이 및 유사성 등을 판단하였을 때, 84 균주는 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 균주에 속한다고 판단되었다.
실시예 2
락토바실러스 속 유산균 유래 p84 플라스미드의 유전정보 분석
실시예 1에서 확인한 p84 플라스미드의 염기 서열을 바탕으로 하여 유전정보 를 분석하였다. 유전정보 분석은 전체 플라스미드 DNA를 직접 시퀀싱을 수행하였다. 유전정보 분석 결과 p84 플라스미드는 3,415bp로 이루어져 있으며 37.8%의 G+C content를 가지고 있음을 확인하였다. 또한 p84 플라스미드는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 복제 기점(Ori)과 3개의 ORF(open reading frame)로 구성되어 있음을 알 수 있었다.
이 중 ORF1은 서열번호 3의 염기서열을 갖는 RepA 단백질 유전자, ORF3은 서열번호 4의 염기서열을 갖는 Mob 단백질 유전자 및 ORF2는 정확히 어떤 기능을 하는 유전자 인지는 현재까지 명확히 밝혀지지 않았으나, 지금까지 기능이 보고된 단백질과 염기서열상 연관성이 없는 것으로 나타났다.
실시예 1에서 분리된 p84 플라스미드의 복제 기점(Ori)과 3개의 ORF(open reading frame)유전자의 위치 및 제한효소 Dra Ⅰ, Hind Ⅲ, EcoRⅠ등의 제한부위를 도 3에 나타내었다.
또한 여러 가지 유산균 벡터에서 공통적으로 확인되는 복제개시 인자를 확인할 수 있었다[Critical Reviews in Biotechnology, 17(3): 227-272 (1997)] 그 결과를 도 4에 나타내었다.
또한 여러 가지 유전자의 전사 개시 시점에서 발견되는 -35/-10 box 서열(sequence)을 RepA 단백질 상류(upstream)에서 확인할 수 있었다. 그 결과를 도5에 나타내었다.
실시예 3
대장균-락토바실러스 셔틀벡터의 제조
실시예 1과 2에서 분석한 결과를 바탕으로 하여 대장균(E. coli)-락토바실러스(Lactobacillus) 셔틀 벡터(Shuttle vector)를 제조하고자 하였다. 이를 위하여 우선 pBES2((주)비피도)를 제한효소(restriction enzyme) XbaI/PstI으로 절단하여 1.2kb의 클로람페니콜 아세틸-트랜스퍼라아제(Chloramphenicol acetyl-transferase) 유전자 부위를 pUC19((주)RBC)의 XbaI/PstI 위치로 클로닝(cloning) 하였다. 이렇게 제조한 벡터를 pUC19-CAT으로 명명하였다.
락토바실러스 속 균주에서 복제가 가능한 최소 복제 인자를 결정하기 위하여 상기 실시예 1에서 분리한 p84 플라스미드(p84 plasmid)의 3개의 ORF에서 ORF 1개씩을 순차적으로 결손 시킨 셔틀벡터 총 3종을 제작하였다. 각각은 p84 플라스미드 전체에서부터 ORF 1개씩을 결손 되도록 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해서 유전자 증폭을 수행한 후 pUC19-CAT 벡터에 클로닝 하였다.
사용된 프라이머(primer)의 종류 및 염기서열은 다음과 같다.
84-1-F : 5'-GACGTC ATT TGG TCT ATG GCT TTA ATT TAA-3'(GACGTC: AatII site)
84-1-R : 5'-TCTAGA TCA AAG GCT TGG ACC ATC TAA-3'(TCTAGA: XbaI site)
84-2-R : 5'-TCTAGA TTC ACC ACT CCA TTC CCA AA -3'(TCTAGA: XbaI site)
84-3-R : 5'-TCTAGA AAC AAA AAC ACA TCA CTT TCA AAA-3'(TCTAGA: XbaI site)
상기 실시예 1에서 분리한 p84 플라스미드를 주형으로 하여 84-1-F/84-1-R 프라이머를 이용한 PCR 반응을 통해서 3.4kbp의 PCR 반응물을 얻고 이를 AatII/XbaI으로 절단하여 pUC19-CAT의 AatII/XbaI 위치로 클로닝하여 pELS 84-① 셔틀벡터(p84 플라스미드의 ORF1,2 및 3 포함)를 제조하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
비슷한 방법으로 상기 실시예 1에서 분리한 p84 플라스미드를 주형으로 하여 84-1-F/84-2-R 프라이머를 이용한 PCR 반응을 통해서 2.3kbp의 PCR 반응물을 얻고 이를 AatII/XbaI으로 절단하여 pUC19-CAT의 AatII/XbaI 위치로 클로닝하여 pELS 84-② 셔틀벡터(p84 플라스미드의 ORF1,2포함)를 제조하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.
또한 p84 플라스미드를 주형으로 하여 84-1-F/84-3-R 프라이머를 이용한 PCR 반응을 통해서 1.6kbp의 PCR 반응물을 얻고 이를 AatII/XbaI으로 절단하여 pUC19-CAT의 AatII/XbaI 위치로 클로닝하여 pELS 84-③ 셔틀벡터(p84 플라스미드의 ORF1 포함)를 제조하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.
한편, 상기의 셔틀벡터의 제조과정은 도6에 나타내었다.
실시예 4
p84 플라스미드 결손 락토바실러스 속 균주 제조
p84 플라스미드가 유래한 락토바실러스 플랜타럼 균주에서 p84 플라스미드의 결손을 유도하였다. 이를 위하여 MRS 배지에서 37℃에서 밤샘 배양한 락토바실러스 플랜타럼 균주의 1/100을 취하여 신선한 MRS 배지에 0.25㎍/㎖의 노보비오신(novobiocin)을 첨가하여 30℃에서 72시간 동안 배양하였다. 배양된 락토바실러스 플랜타럼 균주를 순차적으로 희석하여 MRS-아가 플레이트(MRS-Agar plate)에 도말하여 독립적인 콜로니의 생성을 유도하였다. 각각의 독립된 콜로니를 새로운 MRS 배지에서 배양하여 각 락토바실러스 플랜타럼 균체로부터 p84 플라스미드 DNA의 존재유무를 84-1-F/84-3-R 프라이머를 이용한 콜로니 PCR로 확인하였다. 즉, p84 플라스미드가 결손 되지 않은 경우에는 84-1-F/84-3-R 프라이머를 이용한 PCR로 p84 플라스미드의 일부가 증폭되지만, 반면에 p84 플라스미드가 결손된 경우에는 PCR 증폭물을 확인할 수 없기 때문에 p84 플라스미드 DNA의 존재유무를 확인할 수 있다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 그 결과 6번 클론이 선택적으로 플라스미드가 결손된 균주임을 확인하였다.
실시예 5
대장균-락토바실러스 셔틀벡터에 의한 락토바실러스 속 균주의 형질전환
<5-1> 대장균-락토바실러스 셔틀벡터에 의한 락토바실러스 플랜타럼 균주의 형질전환
실시예 3에서 제조한 3종의 셔틀벡터(pELS 84-① 셔틀벡터, pELS 84-② 셔틀벡터 및 pELS 84-③ 셔틀벡터)를 실시예 4에서 제조한 p84 플라스미드 결손 락토바실러스 플랜타럼 균주에 형질전환을 유도하였다. 형질전환을 위해서 락토바실러스를 밤샘 배양한 후 이 중 1/1000을 취하여 1% 글리신(glycine)이 함유된 새로운 MRS 배지에 접종하여 OD660=0.5에 도달하면 얼음(ice)에 10분간 방치하였다. 그런 다음, 이를 5mM 소디움 포스페이트[Sodium phosphate(pH7.4)] 1mM MgCl2 의 완충액으로 2회 세척한 후 1mM 수크로오스(Sucrose), 3mM MgCl2 (pH7.4) 80㎕로 희석하고 1㎍씩 각각 pELS 84-① 셔틀벡터, pELS 84-② 셔틀벡터 및 pELS 84-③ 셔틀벡터를 넣어준 후 5분간 얼음(ice)에 방치한 후 18.8KV/cm, 25uFD의 파우워(power)로 전기천공(electroporation)을 하였다. 새로운 MRS 배지 500㎕를 상기 전기천공한 균체에 첨가한 후 37℃에서 3시간 배양하고 세포를 침전 시킨 후 10㎍/㎖ 클로람페니콜(chloramphenicol)이 함유된 MRS 아가 플레이트(agar plate)에 도말하여 37℃에서 48~72시간동안 배양하여 콜로니의 생성유무를 확인 하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, p84 플라스미가 존재하는 락토바실러스 플랜타럼 균주나 혹은 p84를 결손한 락토바실러스 플랜타럼 균주 모두 클로람페니콜 함유 배지에선 살아남을 수 없고, 단지 CAT 유전자를 가지는 셔틀벡터로 형질전환된 락토바실러스 플랜타럼 균주만이 클로람페니콜 함유 배지에서 살아남을 수 있으므로 콜로니의 수가 많을수록 형질 전환 효율이 뛰어남을 알 수 있으므로, 셔틀벡터의 크기가 가장 작은 pELS 84-③ 셔틀벡터가 콜로니의 수가 가장 많아 형질 전환 효율이 104 colony 수/ ㎍ DNA로 가장 우수함을 확인할 수 있었다.
<5-2> 대장균-락토바실러스 셔틀벡터에 의한 락토바실러스 카제이 균주의 형 질전환
또한 상기의 셔틀벡터에 의해서 플랜타럼 균주이외의 락토바실러스 속에 속하는 카제이 균주에도 형질전환 되는지 유무를 확인하기 위하여, 실시예 3에서 제조한 3종의 셔틀벡터를 락토바실러스 카제이(ATCC 393) 균주에 실시예 <5-1>의 방법과 동일한 방법으로 형질 전환하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 실시예 3의 3종의 셔틀벡터가 락토바실러스 플랜타럼 균주에서와 같이 락토바실러스 카제이 균주에서도 똑같은 형질전환효율을 보임을 확인 할 수 있었다.
실시예 6
형질전환체 내에서의 셔틀벡터의 안정성 확인
<6-1> 형질전환된 락토바실러스 플랜타럼 균에서의 셔틀벡터의 안정성 확인
상기의 실시예 5에서 pELS 84-③ 셔틀벡터로 형질전환된 락토바실러스 플랜타럼 균에서의 셔틀벡터의 안정성을 확인하였다. 이를 위하여 형질전환된 1개의 콜로니를 선정하고 MRS 배지에서 배양하였으며 계대시 1/1000의 균체을 취하여 10계대 연속배양을 실시하였다. 계대 배양시 한 군은 10㎍의 클로람페니콜(chloramphenicol)이 함유된 배지에서 10계대 배양을 수행하였으며, 다른 한 군은 항생제가 함유되지 않은 MRS 배지에서 10계대 배양을 수행하였다. 이러한 각 계대 배양체로부터 셔틀벡터의 손실 유무를 84-1-F/84-3-R 프라이머를 이용한 콜로니 PCR로 확인하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, pELS 84-③ 셔틀벡터로 형질 전환된 락토바실러스 플랜타럼 균체내에서 안정하게 항생제 없이도 pELS 84-③ 셔틀벡터가 유지됨을 확인할 수 있었다.
또한 항생제 없이 10계대 배양한 상기의 pELS 84-③ 셔틀벡터로 형질전환된 락토바실러스 플랜타럼 균주의 배양액을 희석하여 MRS-아가 플레이트(Agar plate)에 도말한 후 독립적인 99개의 콜로니를 무작위로 선정하여 각각 항생제가 포함되지 않은 MRS 배지와 10㎍/㎖의 클로람페니콜(chloramphenicol)이 함유된 배지에서 배양하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 균체가 성장하여 무게로 인하여 아래로 가라앉음으로써 각각의 well의 중심에 하얀색 침전체를 볼 수 있으므로 모든 콜로니가 성장하여 균체 침전이 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
<6-2> 형질전환된 락토바실러스 카제이 균에서의 셔틀벡터의 안정성 확인
상기 실시예 5에서 pELS 84-③으로 형질전환된 락토바실러스 카제이 균에서의 셔틀벡터의 안정성을 확인하였다. 이를 위하여 형질전환된 1개의 콜로니를 선정하고 MRS 배지에서 배양하였으며 계대시 1/1000의 균체을 취하여 3계대 연속배양을 실시하였다. 계대 배양시 한 군은 10㎍의 클로람페니콜(chloramphenicol)이 함유된 배지에서 3계대 배양을 수행하였으며 다른 한 군은 항생제가 함유되지 않은 MRS 배지에서 3계대 배양을 수행하였다. 이러한 각 계대 배양체로부터 셔틀벡터의 손실 유무를 84-1-F/84-3-R 프라이머를 이용한 콜로니 PCR로 확인하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, pELS84-③ 셔틀벡터로 형질전환된 락토바실러스 카제이균체 내에서 안정하게 항생제 없이도 pELS84-③ 셔틀벡터가 유지됨을 확인할 수 있었다.
상기에서 확인된 바와 같이, 본 발명에 따른 셔틀벡터는 형질전환 효율이 우수할 뿐만 아니라 락토바실러스 속 균주에 형질 전환되어 안정하게 유지될 수 있는 특성을 지니고 있다. 이러한 특성을 이용하여 향후 락토바실러스 속 유산균에서 목적하는 외부 유전자 및 유용 유전자 발현에 이용될 수 있는 백본(backbone) 벡터로 이용될 수 있다.
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Claims (17)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 구성되며 도 3에 기재된 개열지도를 갖는 플라스미드 p84와 대장균 유래 pUC19-CAT 벡터를 연결하여 제조된 대장균 및 락토바실러스에서 상호 복제가 가능한 셔틀벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 플라스미드 p84는 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) 에서 유래된 것을 특징으로 하는 셔틀벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 플라스미드 p84는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 복제 기점(Ori), 서열번호 3의 염기서열을 갖는 RepA 유전자 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 Mob 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 셔틀벡터.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 셔틀벡터는 플라스미드 p84와 pUC19-CAT을 연결하여 제조된 도12에 기재 된 개열지도를 갖는 셔틀벡터.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 플라스미드 p84는 서열번호 2의 염기서열을 갖는 복제 기점(Ori)과 서열번호 3의 염기서열을 갖는 RepA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 셔틀벡터.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 셔틀벡터는 플라스미드 p84와 pUC19-CAT을 연결하여 제조된 도 13에 기재된 개열지도를 갖는 셔틀벡터.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 셔틀벡터는 플라스미드 p84와 pUC19-CAT을 연결하여 제조된 도 14에 기재된 개열지도를 갖는 셔틀벡터.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 RepA 유전자의 전사조절부위로서 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴 리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 셔틀벡터.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 RepA 유전자의 전사조절부위로서 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 셔틀벡터.
  10. 상기 제1항 내지 제2항 중 어느 하나의 셔틀벡터로 형질전환된 락토바실러스 속 형질전환체.
  11. 상기 제3항의 셔틀벡터로 형질전환된 락토바실러스 속 형질전환체.
  12. 상기 제4항의 셔틀벡터로 형질전환된 락토바실러스 속 형질전환체.
  13. 상기 제5항의 셔틀벡터로 형질전환된 락토바실러스 속 형질전환체.
  14. 상기 제6항의 셔틀벡터로 형질전환된 락토바실러스 속 형질전환체.
  15. 상기 제7항의 셔틀벡터로 형질전환된 락토바실러스 속 형질전환체.
  16. 상기 제8항의 셔틀벡터로 형질전환된 락토바실러스 속 형질전환체.
  17. 상기 제9항의 셔틀벡터로 형질전환된 락토바실러스 속 형질전환체.
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