KR101039596B1 - 새로운 인 비보 단백질 발현 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 새로운 인 비보 단백질 발현 방법에 관한 발명으로 더욱 상세하게는 a) 소스 오리지널 미생물 내에 존재하는 플라즈미드를 선정하고, E. coli와의 셔틀벡터를 제작하는 단계;b) 상기 셔틀 벡터에 타깃 유전자의 순수분리정제를 위해 고 친화 태그를 벡터에 접합하는 단계;c) 상기 특정 타깃 유전자를 그 원래 프로모터와 함께 제작된 발현 벡터에 클로닝하는 단계; 및 d) 상기 발현 벡터 내의 친화 태그를 이용한 타깃 단백질을 순수분리 정제하는 단계를 포함하는 새로운 인 비보 단백질 발현 방법에 관한 것이다.
단백질 발현 시스템, 인 비보

Description

새로운 인 비보 단백질 발현 방법{A NOVEL METHOD FOR EXPRESSING PROTEIN IN VIVO}
본 발명은 새로운 인 비보 단백질 발현 방법에 관한 발명이다.
현재까지 박테리아에서 많은 재조합 발현 시스템이 효과적으로 사용되어 왔다. 대부분의 발현 시스템은 타겟 유전자를 발현 벡터로 클로닝하고 그 발현벡터를 이미 타겟 단백질을 잘 발현하게 고안된 외래 생물체에 형질전환하는 기본 원리를 사용한다. 비록 다양한 발현 시스템들이 특정한 요구에 따라서 개발되었지만, 타겟 단백질을 생성하는 최적 조건을 달성하는데는 많은 시행착오들이 필요하다. 특히 포스트게놈 시대에 단일 생물체로부터 많은 타겟 단백질들을 체계적으로 발현하여야 하는 필요성이 있는 경우가 많다. 한 예로 새로운 기능의 유전자를 검색하기 위하여 많은 후보 유전자들을 발현하여야 하며, 이에 타겟 유전자들을 인 비보 상태로 발현하는 효율적인 시스템은 필수적이다. 그 정상적인 발현은 생성물들의 수율보다 보다 큰 중요성을 가진다.
여러 종류의 세균 발현 시스템이 미생물로부터 타겟 단백질의 발현에 자주 사용된다. 비록 그 발현 시스템들이 대부분의 경우 사용되지만 여전히 한계가 존재 한다. 미스-폴딩으로 야기된 발현된 단백질의 부적절한 폴딩, 필수적인 번역 후 변형의 부존재, 및 특정 단백질 폴딩에 필수적인 샤프론들의 결핍으로 인하여, 단백질들은 종종 불용성 봉입체로 발현된다. 현재 많은 연구자들이 산업적으로 유용한 기능을 가지는 새로운 유전자를 확보하기 위한 치열한 경쟁을 하고 있으며, 그 한 예가 메가-지노믹 연구이다. 이 연구에 새로운 기능의 유전자를 확보하기 위한 유전자 발현과정은 필수적이나, 정상 형태로 그 확보된 유전자를 발현하는 성공률은 매우 높지 않다. Xanthomonas oryzae pv. oryzae로부터 유래한 클론된 약 70 유전자들로부터 유래한 pET 세균 과발현 시스템에서 발현의 경험에 기초하면 단지 10%의 유전자들이 추천된 발현 프로토콜에서 수용성 단백질로 발현되었고: 배양 온도를 낮추고, 다양한 IPTG 농도 및 여러 세균 성장 단계에서 유도에 의한 발현의 조건을 최적화한 후에도 약 30% 정도가 수용성 단백질로 발현되었다. 따라서 더 효과적인 발현 시스템의 개발은 현재 단백질 수준 연구와 관련된 생물학적 연구 과정에 가장 중요한 요소 중의 하나이다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 새로운 인 비보 단백질 발현 시스템을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
a) 소스 오리지널 미생물 내에 증폭 가능한 플라즈미드를 선정하고, E. coli와의 셔틀벡터를 제작하는 단계;
b) 상기 셔틀 벡터에 타깃 유전자의 순수분리정제를 위해 고 친화 태그를 벡터에 접합하는 단계;
c) 상기 특정 타깃 유전자를 그 원래 프로모터와 함께 제작된 발현 벡터에 클로닝하는 단계; 및
d) 상기 발현 벡터 내의 친화 태그를 이용한 타깃 단백질을 순수분리 정제하는 단계를 포함하는 새로운 인 비보 단백질 발현 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 소스 오리저널 미생물은 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 등의 모든 미생물 및 세포주를 포함한다.
또 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 타깃 유전자는 AvrBs2 및 소스 오리지널 생물체의 모든 유전자가 대상으로 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 고 친화 태그는 TAP-태그, His-태그, MBP-태그, 또는 GST-태그 등인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명의 방법은 상기 c)단계의 클로닝 후 미생물 내 발현 레벨을 측정하는 단계를 더욱 포함하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 타깃 단백질은 TAP-tag와 IgG 레진 사이의 친화도에 의하여 정제되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
Xanthomonas oryzae pv. oryzae에서 증식이 가능한 pHM1 플라즈미드를 사용하였다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명의 목적 중 하나는 타 발현 시스템을 사용해서는 정상발현이 힘든 단백질을 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)단백질 중 Xoo 내에서 정상 발현하는 것이다. 타겟 단백질들을 효율적으로 정상 발현하기 위하여, 본 발명자들은 Xoo에 대하여 커스터마이즈된 새로운 발현 시스템을 개발하려 하였다.
첫 번째 예로서 AvrBs2 단백질은 본 발명자들에 의하여 개발된 커스터마이즈된 발현 시스템에 의하여 발현하였다. 식물병원성 세균은 광범위한 Effector(이펙터) 분자들을 가지고 그것은 타입 III 단백질 분비 시스템(TTSS)의 주지된 주사기 유사 구조를 통하여 전달된다 (Cornelis, G. R. and F. Van Gijsegem (2000). Annu Rev Microbiol 54: 735-74). 비록 이펙터 분자들이 병원체에 더 우호적인 그들의 자연 서식지를 만들기 위하여 숙주로 삽입되지만, 이펙터들은 저항성(R) 유전자들에 의하여 코드되는 식물감시 시스템에 의하여 종종 인지되고 신속하고 국소화된 프로그램된 세포 사멸인 숙주에서 과민반응(HR)을 야기한다(Klement, Z. and R. N. Goodman (1967). Annu . Rev . Phytopathol . 5: 17-44). 이 병원성-숙주 관계는 단지 식물과 병원체에 제한되는 것만이 아니라 심지어 인간과 병원체에서도 잘 보존되어 있다.
비록 병원체-숙주 관계에서 이펙터 분자들의 중요성이 있지만 그들을 발현하는 것이 매우 어렵다고 알려졌다. 현재까지 알려진 모든 발현시스템에서 Avr 단백질들의 정상 발현 및 분리 정제에 대한 보고가 없다. Avr 유전자들은 hrp 복합체를 통하여 숙주 생물체로 전달되어 병독성을 야기하고 특정 분비 시그널이 없는 친수성 단백질로 알려졌다. 현재 많은 avr 유전자들이 클로닝되고 연구되었지만 이용할 수 있는 구조정보는 없다. avrBs2의 아미노산 서열은 Agrobacterium tumefaciens 의 아그로시노핀 합성효소 및 대장균의 글리세로포스로릴 다이에스테르 포스포다이에스터레이즈 UgpQ와 유사성을 가진다. 그 유사성에 기초하여 추론하면 AvrBs2는 숙주에서 포스포다이에스테르 결합을 가수분해하거나 합성할 수 있다. 본 발명자들은 성공적으로 Xanthomonas oryzae pv. oryzae에 커스터마이즈된 새로운 발현 시스템을 통하여 Xanthomonas oryzae pv. oryzae로부터 AvrBs2를 성공적으로 발현하였다.
Xanthomonas oryzae pv. oryzae로부터 단백질들의 타 발현 시스템을 통한 발현의 어려움으로부터 본 발명자들은 Xanthomonas oryzae pv. oryzae에 대한 커스터마이즈된 단백질 발현 시스템을 발명하기 위하여 노력하였다. 그 고안은 발현 숙주로서 외래 생물체보다는 원래 생물체에서 타겟 유전자를 발현하는 것이 더 좋다는 점에서 유래하였다. 오리지널 생물체에서 유전자 발현은 많은 점에서 유리하다. 먼저, 본래 생물체는 정확한 폴딩, 번역 후 변형, 타겟팅되는 소기관, 폴딩을 돕는 샤프론 등 타겟 유전자를 정상 발현하는 모든 필요한 요소들을 가진다. 외래 세균 발현 시스템은 비록 높은 효율의 발현이 이루어지지만, 특정한 미생물 유전체 발현을 위한 모든 필요한 요소들을 가질 수는 없다. 두 번째 비록 적당한 세균 발현 시스템을 선택하고 발현 조건을 조절하여 타겟 단백질을 발현할 수 있지만, 그 과정에서 많은 시간과 돈과 노동력이 소요되는 시행착오가 필요하다. 본 발명자들은 적당한 친화도 태그를 가지는 유전자를 오리지널 생물체에서 발현시킴으로서 그 발현된 타겟 유전자를 용이하게 정제할 수 있다.
또 생체 내에서 많은 단백질들이 다른 단백질들과 복합체로서 작용한다. 만약 외래 발현시스템에 단일 유전자를 투여하고 다른 복합체의 구성요소인 결합 파트너 없이 발현 후 그 기능을 이해하려고 한다면 우리들은 그 기능을 올바르게 관찰할 수 없다. 만약 친화도로 태그된 단일 유전자를 원래 생물체에서 발현하고, 전체 단백질 복합체가 인 비보 상태로 얻어질 수 있다. 이 방법을 이용하여 인 비보 상태 그대로 단백질을 발현하는 방법은 미생물 유전체 유전자 기능분석에 일반적으로 적용될 수 있는 커다란 가치를 가진다.
본 발명의 한 예로서 병원성 토양미생물 Xanthomonas oryzae pv. oryzae의 유전체로부터 특정 목적 유전자의 in vivo 상태의 발현을 위해 위의 vector가 제작되었다 (도 5). 상기 벡터는 Xanthomonas oryzae pv. oryzae와 E. coli에서 동시에 증식 가능함에 따라 target gene의 cloning시에는 E. coli상에서 실험되어 질 수 있으며, 단백질의 발현과정에서는 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 내에서 존재 되어 질 수 있다. 클로닝된 유전자의 C-말단 부위에 affinity tag이 존재함으로 발현 된 유전자는 쉽게 분리 정제되어 질 수 있다. 또, 지노믹 DNA와 같은 오리지널 프로모터를 가지고 있으므로 세포내에서 지노믹 DNA로부터 유전자가 발현되어질 시 같이 발현되어 질 수 있고, 이 발현 벡터를 가지는 대상 미생물에는 native target protein 과 C-terminal에 Tag이 달린 타깃 단백질이 동시에 존재하게 된다.
본 발명에 따른 효과는 (1) 새로운 발현 시스템의 확립으로 신규 유전자 스크리닝 효율을 증대하고;
(2) 빠른 정상 단백질의 확보를 통한 신규 유전자 스크리닝 시간을 최소화하며;
(3) 정상적인 단백질 발현양 증가로 in vivo 상태의 단백질 대량확보가 가능하고;
(4) 시스템화된 한 번의 맞춤형 발현벡터 개발로 특정 미생물 내의 모든 유전자는 동일한 조건으로 최적화된 발현이 가능하며;
(5) 빠르고 효과적인 스크리닝 시스템에 적용 가능함에 따라 유전체 스크리닝 비용을 감소시키며;
(6) 기존의 20%내외의 정상 발현 효율이 획기적으로 증가시킴에 따라 특정 유용 활성을 가진 신규유전자 확보율을 증가하는 효과가 있다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예 1: 균주 및 배양 조건
Escherichia coli JM109 (RBC HIT)(ATCC53323, Stratagene.)를 재조합 플라즈미드 DNA의 증식을 위하여 사용하였다. Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) KACC10331(B. Lee, Y.Park. et al.(2005). Nucleic Acids Research, 33(2) 577-586)를 유전자 DNA 제조를 위하여 사용하였고 KACC10859(H. Cho, Y. Park, et al.(2007). Microb Pathog. 2008 Jun;44(6):473-83)는 형질전환을 위한 수용체이다. E. coli는 Luria-Bertani broth (1% bacto tryptone, 0.5% bacto yeast extract, 0.5% sodium chloride) 또는 LB agar plate (1.5% 아가)에서 37℃에서 배양하였다. Xoo는 PS broth (1% bacto-peptone, 1% sucrose, 0.1% mono sodium glutamate) 또는 PS agar plates (1.5% agar)에서 28℃에서 성장하였다. 형질전환된 미생물을 스크리닝 하기 위해서는 100 ml-1 ampicillin 또는 50 ml-1 spectinomycin을 배지에 보충하였다.
실시예 2: XTAP 서열 코돈 최적화의 합성
pBS1479(Puig, O., F. Caspary, et al. (2001). Methods 24(3): 218-29)의 TAP 태그 코돈은 세 번째 뉴크레오타이드에서 피리미딘의 선호도를 가지고, Xoo는 C 또는 G를 가진다. 따라서 559 중에서 101bp가 번역을 위한 최적 코돈으로 바뀌었다(Puig, O., F. Caspary, et al. (2001). Methods 24(3): 218-29). (도 2). 그것은 소위 절편-절편 확장 또는 인공적인 유전자 합성에 의하여 달성되었다. 간단하게 설명하면 8 롱-뉴크레오타이드들(42mer-85mer)가 합성되었다. 363 bp-절편(도 3에서 절편 A)의 구축을 위하여 각 긴-뉴크레오타이드는 주형없는 PCR을 사용하여 단계별로 다른 것들과 연결되었다(도 3B). 217 bp-절편(도 3에서 절편 B)을 위하여, 6 롱-뉴크레오타이드들(40mer-72mer)이 역시 합성되었다. 롱-뉴크레오타이드들이 또 주형없는 PCR을 사용하여 단계별로 연결되었다(도 3C). 결국 559 bp 롱 TAP-태그 절편이 21 bp 길이 오버래핑에 의존하는 절편-절편 확장을 사용하여 A 및 B절편의 연결에 의하여 합성되었다(도 3A).
이름 서열(5'→3')
KJK-ANF4 (42mer)서열번호 1 CCA TGG AGA AGC GCC GGT GGA AGA AGA ACT TCA TCG CCG TCT
KJK-AF3 (85mer)서열번호 2 AGA AGA ACT TCA TCG CCG TCT CGG CGG CCA ACC GCT TCA AGA AGA TCT CGT CCT CCG GGG CCC TGG ACT ACG ACA TCC CCA CCA C
KJK-AF2 (56mer)서열번호 3 GAC TAC GAC ATC CCC ACC ACC GCC AGC GAG AAC TTG TAC TTC CAG GGC GAG CTC AA
KJK-AF1 (81mer)서열번호 4 CTT CCA GGG CGA GCT CAA GAC CGC GGC CCT CGC GCA GCA CGA CGA GGC CGT GGA CAA CAA GTT CAA CAA GGA GCA GCA GAA
KJK-AR4 (58mer)서열번호 5 CGT TCA AGT TGG GCA AGT GCA AGA TCT CGT AGA ACG CGT TCT GCT GCT CCT TGT TGA A
KJK-AR3 (59mer)서열번호 6 TCG TCC TTC AAG CTC TGG ATG AAG GCG TTC CGC TGC TCC TCG TTC AAG TTG GGC AAG TG
KJK-AR2 (71mer)서열번호 7 GCG TCG TTC AGC TTC TTG GCC TCC GCC AAG AGG TTG GCG CTC TGG CTC GGG TCG TCC TTC AAG CTC TGG AT
KJK-AR1 (48mer)서열번호 8 TGA ACT TGT TGT CCA CCT TCG GCG CCT GGG CGT CGT TCA GCT TCT TGG
표 1은 절편 A의 롱-뉴크레오타이드의 서열을 나타낸다.
이름 서열(5'→3')
KJK-BF3 (68mer)서열번호 9 CGA AGG TGG ACA ACA AGT TCA ACA AGG AGC AGC AGA ACG CGT TCT ACG AGA TCT TGC ACT TGC CCA AC
KJK-BF2 (68mer)서열번호 10 GAG ATC TTG CAC TTG CCC AAC TTG AAC GAG GAG CAG CGG AAC GCC TTC ATC CAG AGC TTG AAG GAC GA
KJK-BF1 (45mer)서열번호 11 ATC CAG AGC TTG AAG GAC GAC CCG AGC CAG AGC GCC AAC CTC TTG
KJK-BR3 (72mer)서열번호 12 GGA GTT CGC GTC CAC CTT CGG CGC CTG GGC GCC GTT CAG CTT CTT GGC CTC CGC CAA GAG GTT GGC GCT CTG
KJK-BNR2 (40mer)서열번호 13 AAG CTT CAG GTC GAC TTC CCC GCG GAG TTC GCG TCC ACC T
KJK-BNR1(20mer)서열번호 14 AAG CTT CAG GTC GAC TTC CC
표 2는 절편 B의 롱-뉴크레오타이드의 서열을 나타낸다.
주형없는 PCR은 기본적으로 0.5pmol (각)의 두 롱-뉴크레오타이드들(또는 DNA 절편들), 10uM dNTP 및 2.5 유닛의 Taq-polymerase로 수행되었다. 25 주기 PCR에서, 각 주기는 94℃에서 30초 변성, 68℃ 또는 계산된 Tm 값보다 0.5℃ 더 낮은 온도에서 120초 어닐링 및 72℃에서 120초 중합으로 구성되었다.
증폭된 DNA들은 T-벡터에 직접 또는 상황에 따라서는 T4 polynucleotide kinase에 의하여 변형 또는 제한효소에 의하여 절단 후에 적당한 벡터로 클로닝되었다.
새롭게 합성된 Tap-tag 절편의 DNA 서열은 BigDye 터미네이터에 기초한 DNA 시퀀싱에 의하여 결정되었다. 지정된 서열이 정확하게 합성되었는지를 확인하였다.
실시예 3: Xoo 로부터 지노믹 DNA , 전체 DNA , 및 플라즈미드 DNA 제조
지노믹 DNA는 MagExtractor 핵산 정제 키트(Toyobo)로 제조하였다. 전체 DNA는 Bacillus (Yasbin, Wilson et al. 1975)에 대한 방법으로 분리하였고, 플라즈미드 DNA는 WizardPlus SV Minipreps DNA 정제 시스템(Promega)으로 정제하였다.
실시예 4: Xoo0168 - XTAP 돌연변이체의 생성
Sambrook et al (Sambrook and Russell 2001)에 기재된 표준 방법들을 플라즈미드 제조 및 제한 효소들로 처리하는 동안 DNA 조작에 사용되었다. avrBs2 및 (His)6-XTAP의 코딩 서열과 프로모터 부위는 AccuPower HF PCR premix (Bioneer)를 사용한 PCR방법에 의하여 합성되었다. avrBs2 의 코딩 서열과 프로모터 부위를 증폭하기 위하여 사용된 프라이머 서열은 5'GGGTACCACGCGGTGTGAAACGCA-3(forward primer;서열번호 15) 및 5'GGGGAGCTCCGGCTCGGTCTGGTTGG-3(reverse primer;서열번호 16)이고 (His)6-TAP를 증폭하기 위한 것은 5'TTGAGCTCCACCACCACCACCACCACATGGAGAAGCGCCGGTGGAAGAAG-3 (forward primer;서열번호 17) 및 5TTTGTCGACTCAGGTCGACTTCCCCGCGGA-3(reverse primer;서열번호 18)이었다. PCR 절편들은 pGEM-T easy 벡터(Promega)로 연결되었다. 그 삽입된 서열들은 BigDye터미네이터 ver. 3.1 (Applied Biosystems)을 사용한 서열 분석을 통하여 확인한 후 avrBs2의 코딩 서열과 프로모터 부위에 대해서는 KpnI 및 SacI , (His)6-TAP에 대해서는 SacI 및 SalI 그리고 T gapA 에 대해서는 SalI 및 HindIII인 제한 효소를 사용하여 절단하였다. 다음 이들 절편들을 pHM1 벡터(Seiko Makino, Akiko sugio, et al.(2006) MPMI 19(3)240-249.로 삽입하고 전기천공법을 사용하여 X. oryzae pv. oryzae KACC10859 균주 속으로 삽입하였다. 전기천공법은 0.2 cm 갭 쿠벳으로 12.5 kV cm-1에서 Gene PulserII (Bio-Rad) electroporator를 사용하여 수행되었다. 펄스 전달 후, 세포들을 즉시 1ml SOC 배지(2% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.05% NaCl, 2.5mM KCl, 10nM MgCl2, 20mM D-glucose, pH 7.0)로 희석하고 2 시간 동안 교반하면서 28℃에서 배양하였다. 리커버리 후, 세포 배양체를 spectinomycin을 함유한 PSA에 플레이트하고 플레이트들을 28℃에서 4일간 배양하였다.
실시예 5: Xoo 에서 Xoo0168 - TAP 컨스트럭트의 확인
전체 DNA, 지노믹 DNA, 및 플라즈미드 DNA를 여덟 형질전환체로부터 각각 분리하고 그 형질전환 DNA가 에피조말적으로 존재하는지 또는 염색체에 통합되었는지를 결정하기 위하여 각 DNA 샘플을 AccuPower HF PCR premix (Bioneer)을 사용하여 TAP 서열의 증폭을 수행하였다.
실시예 6:세균 균주 및 성장 조건
Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) 균주 KACC10859를 플라즈미드를 위한 숙주로 사용하였고 NB (nutrient broth) 배지에서 배양하였다.
실시예 7: 도트 블럿 및 웨스턴 블럿 분석
재조합 벡터(TAP-pHM1-XooAvrBs2)를 함유하는 Xoo (KACC10859)를 NB (100㎖ with spectinomycin (50㎍랫1)에서 배양하고 28℃에서 3일간 배양하였다. 1㎖의 배양체를 샘플링하고 세포들을 12,000rpm에서 10분간 4℃에서 원심분리하여서 모아서, 100㎕ PBS (phosphate-buffered saline)에서 재부유하였다. 세균 세포들을 초음파분쇄(Ultrasonic generator, Korea)하여서 파쇄하고 15,000rpm에서 10분간 4℃에서 원심분리를 수행하였다. 그 후 상등액을 모으고 펠렛을 100㎕ PBS로 재부유하였다. 단백질 농도를 확인하기 위하여 도트 블럿을 위한 단백질 샘플들을 여러 비율로 2M Urea/PBS로 처리하여 96-웰 플레이트의 각 웰에 100㎕ 씩 적용하였다. (뒤의 8-웰 열 내의 웰들은 앞 8-웰 열 내의 단백질 농도의 반을 함유). 단백질 샘플들을 적용한 후, 바닥에 polyvinylidene fluoride 막(PVDF, 단백질 블럿팅용 Immuno-BlotTM PDVF 막, 0.2㎛, BIO-RAD)을 가진 플레이트를 진공 장치(BIO-RAD, BIO-DOTTM APPARATUS)로 수행되었고 PBS로 세척하고, 5% 탈지 분유로 PBS에서 막을 블록킹하였다. 항체(Peroxidease Anti-peroxidase 수용성 복합체, 토끼에서 생성된 항체, Sigma)를 PBS에서 1:3,000 희석하였고 그 막을 30분 배양한 후 PBS로 3회 세척하였다. 화학발광(Chemiluminescence) 기술을 신호를 검출하기 위하여 사용하였다. 단백질을 위한 웨스턴 블럿을 먼저 8% 폴리아크릴아마이드 젤을 통한 전기영동을 사용하여 수행하고, 염색 전 중량 크기를 마커로 사용하였다. 그 후 그 단백질들을 polyvinylidene fluoride 막(PVDF, 단백질 블럿팅용 Immuno-BlotTM PDVF 막, 0.2㎛, BIO-RAD)으로 전달 쎌(Mini Trans-Blot　 Electrophoretic Transfer Cell, BIO-RAD)을 사용하여 전달하였다. 그 막을 5%의 탈지 분유가 제공된 PBS에서 30분간 블록킹하였다. 항체(Peroxidease Anti-peroxidase 수용성 복합체, 토끼에서 생성된 항체, Sigma)를 PBS에서 1:2,500 희석하였고 그 막을 30분 배양한 후 PBS로 3회 세척하였다. 화학발광 기술을 신호 검출에 사용하였다.
상기 실시예의 결과는 다음과 같다.
pRCJ008 구축과 그 형질전환의 확인
pRCJ008의 세 부분을 클로닝하였고, 그들의 뉴크레오타이드 서열을 결정하였다. 그 pRCJ008 DNA를 EcoRI, HindIII, HindIII+SalI, KpnI, 및 SacI로 처리하였다. 모든 제한 패턴을 맵으로 구성하였다(도 4). 형질전환체는 4회의 서브컬쳐 후에 스펙티노마이신 저항성이었다.
DNA rescue 및 확인
E. coli를 Xoo 돌연변이체로부터 분리한 플라즈미드 DNA로 형질전환하였다. 그 플라즈미드를 분리하고 KpnI 또는 HindIII를 처리하였다. 절편의 크기들은 맵과 일치하였다(도 7).
AvrBs2 발현
AvrBs2 단백질들은 유도없이 내생 프로모터로부터 발현되었다. Xoo 돌연변이체에는 지노믹 DNA 및 발현 벡터 플라즈미드로부터 발현된 적어도 다른 두 종류의 AvrBs2이 있다. 발현 벡터로부터 유래한 AvrBs2 단백질들은 그것의 유전자 생성물의 C-말단에 Tendem Affinity Purification (TAP) 태그를 가진다. 그 발현은 TAP-tag의 단백질 A에 특이적으로 결합하는 IgG 항체로 웨스턴 블럿팅을 하여 확인하였다. 세포에서 AvrBs2의 발현 수준은 도트 블럿으로도 측정하였다. 효모에서 RNA pol II의 발현 수준 레퍼런스로 AvrBs2는 약 30,000 분자/세포의 발현 수준을 가지고 수용성 단백질로 발현되었다.
도 1은 특정 미생물 유전체 맞춤형 발현 벡터의 개발 모식도를 나타낸다.
도 2는 Xoo에 대하여 최적화된 것과 pBS1479의 TAP-태그 서열의 코돈을 나타낸 것. 밑줄 친 101 뉴크레오타이드가 변경되었다.
도 3은 TAP-tag 서열 최적화된 코돈의 합성 전략을 나타낸 그림.
도 4는 avrBs2 및 (His)6-XTAP의 PCR산물을 나타낸 사진. 레인 1, 1kb ladder (NEB); 레인 3~4, avrBs2에 대한 PCR산물; 레인 6~11, (His)6-XTAP에 대한 PCR산물; 레인 13, 100bp ladder (NEB)
도 5는 pRCJ008의 제한 효소 맵. E, EcoRI; H, HindIII; K, KpnI; S, SalI; Sa, SacI. P avrBs2 , avrBs2의 프로모터; avrBs2, avrBs2의 코딩 서열; (His)6, 여섯 반복적인 히스티딘 잔기를 코드하는 서열; XTAP, Xoo에 대하여 최적화된 코돈 선호도의 TAP 태그; T gapA , Xoo gapA (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 터미네이터.
도 6은 전체 DNA, 지노믹 DNA 또는 플라즈미드 DNA를 가지는 PCR amplification of the Xoo0168-TAP 서열의 PCR 증폭을 나타내는 사진.
두 젤의 레인 1, 1kb ladder (NEB); 레인 17 (A) 및 레인 11 (B), 100bp ladder (NEB); 레인 2~9 (A), Xoo0168-TAP 형질전환체로부터 유래한 전체 DNA로 증폭된 것; 레인 10(A)~16(A) 및 2(B), 동일한 형질전환체로부터 유래한 지노믹 DNA로 증폭된 것; 레인 3(B)~10(B), 플라즈미드 DNA로 증폭된 것. XTAP 서열은 플라즈 미드 DNA로만 증폭되고 그것은 그 형질전환된 DNA가 에피조말하게 존재한다는 것을 나타낸다.
도 7은 형질전환된 Xoo로부터 유래한 레스쿠된 pRCJ008 DNA의 (A) KpnI- 및 (B) HindIII-처리를 나타낸 사진. 첫 번 레인은 1kb ladder (NEB); 마지막 레인은 100bp ladder (NEB).
도 8은 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 상에서 발현된 XooAvrBs2단백질을 dot-blot으로 확인한 결과. Xanthomonas oryzae pv. oryzae 상에서 약 30,000개의 XooAvrBs2 분자가 in vivo상태로 soluble하게 발현됨, 즉 기존에 soluble하게 발현이 힘들어 insoluble하게 발현되던 AvrBs2 단백질이 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 맞춤형 발현 벡터의 사용으로 soluble하게 정상적으로 발현되어진 모습을 보여준다
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> A NOVEL METHOD FOR EXPRESSING PROTEIN IN VIVO <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KJK-ANF4 <400> 1 ccatggagaa gcgccggtgg aagaagaact tcatcgccgt ct 42 <210> 2 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KJK-AF3 <400> 2 agaagaactt catcgccgtc tcggcggcca accgcttcaa gaagatctcg tcctccgggg 60 ccctggacta cgacatcccc accac 85 <210> 3 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KJK-AF2 <400> 3 gactacgaca tccccaccac cgccagcgag aacttgtact tccagggcga gctcaa 56 <210> 4 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KJK-AF1 <400> 4 cttccagggc gagctcaaga ccgcggccct cgcgcagcac gacgaggccg tggacaacaa 60 gttcaacaag gagcagcaga a 81 <210> 5 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KJK-AR4 <400> 5 cgttcaagtt gggcaagtgc aagatctcgt agaacgcgtt ctgctgctcc ttgttgaa 58 <210> 6 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KJK-AR3 <400> 6 tcgtccttca agctctggat gaaggcgttc cgctgctcct cgttcaagtt gggcaagtg 59 <210> 7 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KJK-AR2 <400> 7 gcgtcgttca gcttcttggc ctccgccaag aggttggcgc tctggctcgg gtcgtccttc 60 aagctctgga t 71 <210> 8 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KJK-AR1 <400> 8 tgaacttgtt gtccaccttc ggcgcctggg cgtcgttcag cttcttgg 48 <210> 9 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KJK-BF3 <400> 9 cgaaggtgga caacaagttc aacaaggagc agcagaacgc gttctacgag atcttgcact 60 tgcccaac 68 <210> 10 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KJK-BF2 <400> 10 gagatcttgc acttgcccaa cttgaacgag gagcagcgga acgccttcat ccagagcttg 60 aaggacga 68 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KJK-BF1 <400> 11 atccagagct tgaaggacga cccgagccag agcgccaacc tcttg 45 <210> 12 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KJK-BR3 <400> 12 ggagttcgcg tccaccttcg gcgcctgggc gccgttcagc ttcttggcct ccgccaagag 60 gttggcgctc tg 72 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KJK-BNR2 <400> 13 aagcttcagg tcgacttccc cgcggagttc gcgtccacct 40 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KJK-BNR1 <400> 14 aagcttcagg tcgacttccc 20 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 15 gggtaccacg cggtgtgaaa cgca 24 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 16 ggggagctcc ggctcggtct ggttgg 26 <210> 17 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 17 ttgagctcca ccaccaccac caccacatgg agaagcgccg gtggaagaag 50 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 18 tttgtcgact caggtcgact tccccgcgga 30

Claims (6)

  1. Xanthomonas oryzae pv oryzae 유래 AvrBs2 유전자를 Xanthomonas oryzae pv oryzae 유래 프로모터를 가지는 셔틀벡터에 삽입하여 제조된 도 5의 개열지도로 표시되는 Xanthomonas oryzae pv oryzae에서 AvrBs2 단백질의 인 비보 발현을 위한 발현벡터 pRCJ008.
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