CN114277046B

CN114277046B - 一种合成四氢嘧啶的三基因串联表达载体及应用

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Publication number: CN114277046B
Application number: CN202111528674.5A
Authority: CN
Inventors: 徐书景; 鞠建松; 何广正; 罗素亚; 赵佳微; 吴志玮; 王伟宁; 赵宝华
Original assignee: Hebei Normal University
Current assignee: Hebei Normal University
Priority date: 2021-12-14
Filing date: 2021-12-14
Publication date: 2024-05-28
Anticipated expiration: 2041-12-14
Also published as: CN114277046A

Abstract

本发明公开了一种高效合成四氢嘧啶的三基因串联表达载体的构建及应用。根据同尾酶原理，将假坚强芽孢杆菌中L‑二氨基丁酸转氨酶、L‑二氨基丁酸乙酰转移酶和四氢嘧啶合成酶基因依次插入含相同或不同启动子的质粒pET‑22bNS上，构建三基因串联表达载体pET‑22bNS‑EctA/B/C。将串联表达载体转入大肠杆菌，经IPTG诱导，以重组菌体参与反应3h，其中含载体pET‑22bNS‑EctA_Lac/B_Tac/C_Tac的重组菌合成四氢嘧啶的产量最高达20.9mg/mL，其理论合成效率为167.2mg/mL/d。本发明所构建的三基因串联表达载体具有高效合成四氢嘧啶的能力，具有较好的应用价值。

Description

一种合成四氢嘧啶的三基因串联表达载体及应用

技术领域

本发明涉及一种合成四氢嘧啶的三基因串联表达载体的构建方法及应用，属于酶工程和化合物生物合成技术领域。

背景技术

四氢嘧啶类化合物是嗜盐以及耐盐菌胞内合成的一类能够抵御外界高盐胁迫的相容性溶质，四氢嘧啶类相容性溶质具有广泛的抗逆效果，能够稳定酶蛋白、DNA和细胞膜结构，帮助细胞抗冻、抗旱、抵抗高盐高渗辐射等各种逆境。目前，四氢嘧啶类化合物已被广泛应用于医药、美容、精细化工和生物制造等行业。传统的合成四氢嘧啶的方法主要是“细菌挤奶”(Sauer T,Galinski EA.(1998)Bacterial milking:A novel bioprocess forproduction of compatible solutes[J].Biotechnology and Bioengineering,57(3):306-313.)，该方法是高盐环境下合成和积累四氢嘧啶，低盐环境释放四氢嘧啶，通过渗透压的冲击完成四氢嘧啶的合成和释放。虽然“细菌挤奶”法是目前生产四氢嘧啶最成功的方法，但是由于该方法所需的高盐环境导致了生产设备易腐蚀、菌体生长速率低及下游加工困难等问题。

目前，在基因水平和酶蛋白水平上都对四氢嘧啶合成途径有了较为深入的研究和认识，研究者在嗜盐海球菌(Marinococcus halophilus)、伸长盐单胞菌(Halomonaselongate)、达坂嗜盐芽孢杆菌(Halobacillus dabanensis)等菌中发现了一条以天冬氨酸为前体的四氢嘧啶合成途径，其合成反应主要由3个基因(ectA、ectB、ectC)编码的酶蛋白参与，并且这3个基因串联构成一个操纵子，即二氨基丁酸转氨酶(EctB)催化天冬氨酸半醛转化为L-2，4-二氨基丁酸，该产物随后被L-二氨基丁酸转氨酶(EctA)催化生成N-γ-乙酰基-2，4-二氨基丁酸，最后在四氢嘧啶合酶(EctC)的催化作用下N-γ-乙酰基二氨基丁酸环化生成反应终产物——四氢嘧啶(Canovas D,Vargas C,Calderon MI.(1998)Characterization of the genes for the biosynthesis of the compatible soluteectoine in the moderately halophilic bacterium Halomonas elongata DSM3043[J].Systematic and Applied Microbiology,21:487-497.)。为了克服“细菌挤奶法”合成四氢嘧啶所面临的问题，当前普遍采用的方法是将嗜盐菌中合成四氢嘧啶的相关基因转入大肠杆菌等非嗜盐菌中重新构建四氢嘧啶合成途径。He等将从伸长盐单胞菌中克隆获得的ectABC基因导入大肠杆菌K-12/BW25113中，经过高密度发酵(20OD/mL)，四氢嘧啶的产率达25.1g/L/d(He YZ,Gong J,Yu HY,Tao Y,Zhang S,Dong ZY.(2015)High production ofectoine from aspartate and glycerol by use of whole-cell biocatalysis inrecombinant Escherichia coli[J].Microbial Cell Factories,14(1):55.)。不过，研究发现利用该基因合成四氢嘧啶的产量仍然受外界盐浓度的调节。Gieβelmann等对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)进行改造，从含有185193个突变体文库中筛选获得一株四氢嘧啶高产菌株C.glutamicum ectABC^opt，四氢嘧啶的产率为27.8g/L/d(GieβelmannG,Dietrich D,Jungmann L,Kohlstedt M,Jeon EJ,Yim SS,Sommer F,Zimmer,D,MühlhausT,Schroda M,Jeong KJ,Becker J,Wittmann C.(2019)Metabolic Engineering ofCorynebacterium glutamicum for high-level ectoine production:design,combinatorial assembly,and implementation of a transcriptionally balancedheterologous ectoine pathway[J].Biotechnology Journal,14(9):e1800417)。可以看出，采用重组方法所构建的工程菌株，其合成四氢嘧啶的产率并没有明显提升。因此，开发一种高效的四氢嘧啶合成方法，对于四氢嘧啶的生产和应用有着重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种合成四氢嘧啶的三基因串联表达载体。

本发明的目的还在于提供一种含合成四氢嘧啶的三基因串联表达载体的工程菌的培养和应用方法。

本发明的目的是这样实现的。一种合成四氢嘧啶的三基因串联表达载体，其核苷酸序列由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3及SEQ ID No.4中的一种或多种分别与SEQ ID No.5、SEQ ID No.7和SEQ ID No.9排列组合构成，其中：

(1)SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3及SEQ ID No.4所示为改造后表达载体pET-22bNS(T7)、pET-22bNS(Lac)、pET-22bNS(Tac)和pET-22bNS(Trc)表达区域的核苷酸序列，分别含有启动子T7、Lac、Tac和Trc的核苷酸序列；

(2)SEQ ID No.5所示序列为编码基因ectA的核苷酸序列；

(3)SEQ ID No.7所示序列为编码基因ectB的核苷酸序列；

(4)SEQ ID No.9所示序列为编码基因ectC的核苷酸序列。

本发明还提供三个编码基因ectA、ectB和ectC的氨基酸序列，如SEQ ID No.6、SEQID No.8和SEQ ID No.10所示。

本发明还提供含有上述三基因串联表达载体及宿主细胞。

本发明还提供含有上述三基因串联表达载体的工程菌。

本发明还提供上述三基因串联表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)根据商业载体pET-22b(+)中T7启动子和终止子待突变区域的核苷酸序列，设计定点突变引物，改造获得限制性内切酶NheI和SpeI的识别位点；所述突变引物为：

Nhe-F01：5′-GAGATCTCGATGCTAGCAAATTAATACGACTC-3′；

Spe-F01：5′-AGGAGGAACTAGTTCCGGATTGGC-3′；

Spe-R01：5′-GCCAATCCGGAACTAGTTCCTCCT-3′；

(2)以商业载体pET-22b(+)为模板，使用上述设计的引物进行PCR扩增，将T7启动子和终止子待突变区域分别突变获得限制性内切酶NheI和SpeI的识别位点，改造获得能够容纳多个基因串联表达的载体pET-22bNS(T7)；

(3)参照pET-22bNS(T7)中T7启动子上下游的基因序列结构，通过基因合成获得含Lac、Tac、Trc等启动子序列的DNA片段，所合成的基因两端分别含有限制性内切酶BglII和XhoI，利用限制性内切酶酶切处理目的DNA，并分别与经相同酶切处理的质粒pET-22bNS(T7)连接，构建含有不同启动子的质粒pET-22bNS(Lac)、pET-22bNS(Tac)和pET-22bNS(Trc)；

(4)根据NCBI数据库中公开的来自假坚强芽孢杆菌OF4的L-二氨基丁酸转氨酶、L-二氨基丁酸乙酰转移酶和四氢嘧啶合成酶的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对；所述引物对为：

EctA-F01:5′-GCATATGTGGGAATTAGTTAATC-3′

EctA-R01:5′-CCTCGAGCCTTAATGGTCCAATTC-3′

EctB-F01:5′-GCATATGAAACAAACTGATATG-3′

EctB-R01:5′-AGAGCTCGTTAGCAACAGGCTCAG-3′

EctC-F01:5′-GCATATGAAAGTAGTAGCTCT-3′

EctC-R01:5′-ACTCGAGTTCGTCATCAACTACTG-3′

(5)以假坚强芽孢杆菌OF4基因组DNA为模板，使用上述设计的引物进行PCR扩增，将扩增产物分别与经相同酶切处理的载体pET-22bNS(T7)、pET-22bNS(Lac)、pET-22bNS(Tac)和pET-22bNS(Trc)连接，构建含不同启动子的表达载体pET-22bNS-EctA、pET-22bNS-EctB和pET-22bNS-EctC；

(6)利用NheI和SpeI互为同尾酶的原理，通过限制性内切酶BglII和NheI或SpeI双酶切处理上述含不同启动子的表达载体pET-22bNS-EctA、pET-22bNS-EctB和pET-22bNS-EctC，逐一构建由相同启动子或不同启动子调控的三基因串联表达载体pET-22bNS-EctA/B/C；

(7)将构建的所有三基因串联表达载体分别通过化学转化法转入可表达目的基因的工程菌中，随工程菌的复制表达L-二氨基丁酸转氨酶、L-二氨基丁酸乙酰转移酶和四氢嘧啶合成酶蛋白。

制备方法的优选条件：步骤(2)中所述表达载体为pET系列中的任意一种；

步骤(6)中所述三基因串联表达载体为由启动子(T7、Lac、Tac和Trc)与基因ectA、ectB和ectC排列组合串联而成的任意一种；

步骤(7)中所述工程菌为大肠杆菌BL21系列中的任意一种。

本发明进一步提供上述三基因串联表达载体的应用，具体是将三基因串联表达载体用于生物法生产四氢嘧啶，并赋予重组菌耐受高盐或碱性环境的能力。

具体地，本发明是从假坚强芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)OF4中获得L-二氨基丁酸转氨酶(GenBank:ADC50208.1)、L-二氨基丁酸乙酰转移酶(GenBank:ADC50207.1)和四氢嘧啶合成酶(GenBank:ADC50206.1)基因，通过PCR扩增获得目的基因，并将基因片段分别与质粒pET-22bNS_(T7)、pET-22bNS_(Lac)、pET-22bNS_(Tac)和pET-22bNS_(Trc)连接，构建含不同启动子的表达质粒pET-22bNS-EctA、pET-22bNS-EctB和pET-22bNS-EctC；利用NheI和SpeI互为同尾酶的原理，通过限制性内切酶BglII和SpeI双酶切获取带有启动子、核糖体结合位点、终止子等表达调控元件的目的基因片段，逐一与经BglII和NheI双酶切处理的相应表达载体相连接，最终构建由相同启动子或不同启动子调控的三基因串联表达载体pET-22bNS-EctA/B/C；将所有串联表达载体转化大肠杆菌感受态，构建含三基因串联表达的重组菌BL21(DE3)/pET-22bNS-EctA/B/C；经37℃和0.5mM IPTG诱导15h后收集菌体，以重组菌体全细胞催化反应，在60℃下200rpm振荡反应3h，经检测，所构建的22个串联表达载体中，含由相同启动子调控的串联表达载体pET-22bNS-EctA_T7/B_T7/C_T7的重组菌催化生成四氢嘧啶的含量为17.1mg/mL，理论合成效率为136.8mg/mL/d，而含由不同启动子调控的串联表达载体pET-22bNS-EctA_Lac/B_Tac/C_Tac和pET-22bNS-EctA_Trc/B_Lac/C_Trc的重组菌则呈现出更高的四氢嘧啶合成水平，其含量分别为20.9mg/mL和19.7mg/mL，二者的理论合成效率分别为167.2mg/mL/d和157.6mg/mL/d，比表达载体pET-22bNS-EctA_T7/B_T7/C_T7分别提高了22.2％和15.2％。此外，与空载体ET-22bNS(T7)相比，串联表达载体pET-22bNS-EctAT7/BT7/CT7所产生的四氢嘧啶在一定程度下能提高重组菌对高盐(6％)或碱性(pH 9.5)环境的耐受性。

本发明取得以下有益效果：本发明通过同尾酶的原理构建三基因串联表达载体，并使每个基因带有独立且可替换的表达调控元件；通过转化获得了含有三基因串联表达载体的基因工程菌，筛选获得四氢嘧啶的合成效率高的串联表达载体及四氢嘧啶合成方法，获得了具有耐受高盐或碱性环境的重组菌，具有较好的推广应用价值。

附图说明

图1为质粒pMD-22bNS双酶切电泳图谱。

图1中M：2000bp DNA marker；1：质粒pMD-22bNS的双酶切产物。

图2为质粒pET-22bNS-EctA双酶切电泳图谱。

图2中M：2000bp DNA marker；1：质粒pET-22bNS-EctA_Lac的双酶切产物；2：质粒pET-22bNS-EctA_Tac的双酶切产物；3：质粒pET-22bNS-EctA_Trc的双酶切产物；4：质粒pET-22bNS-EctA_T7的双酶切产物。

图3为质粒pET-22bNS-EctB双酶切电泳图谱。

图3中M：1.0kb DNA marker；1：质粒pET-22bNS-EctB_Lac的双酶切产物；2：质粒pET-22bNS-EctB_Tac的双酶切产物；3：质粒pET-22bNS-EctB_Trc的双酶切产物；4：质粒pET-22bNS-EctB_T7的双酶切产物。

图4为质粒pET-22bNS-EctC双酶切电泳图谱。

图4中M：2000bp DNA marker；1：质粒pET-22bNS-EctC_Lac的双酶切产物；2：质粒pET-22bNS-EctC_Tac的双酶切产物；3：质粒pET-22bNS-EctC_Trc的双酶切产物；4：质粒pET-22bNS-EctC_T7的双酶切产物。

图5为三基因串联表达载体的基因结构示意图。

图6为三基因串联表达载体双酶切电泳图谱。

图6中M：1.0kb DNA marker；1-4：含相同或不同启动子的串联表达载体的双酶切产物(部分)。

图7为生物合成四氢嘧啶含量和HPLC检测图；

图7A为四氢嘧啶的HPLC检测图；图7B为反应液中四氢嘧啶的含量图；1：pET-22bNS-EctA_T7/B_T7/C_T7；2：pET-22bNS-EctA_Lac/B_Tac/C_Tac；3：pET-22bNS-EctA_Trc/B_Lac/C_Trc。

图8为重组菌耐受盐碱耐受性分析图。

图8A为重组菌耐受高盐(6％)分析图；图8B为重组菌碱耐受性分析图；

图中“□”：含pET-22bNS-EctAT7/BT7/CT7的重组菌；“△”：含空载体pET-22bNS T7的重组菌。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明。需要说明，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1构建三基因串联表达载体

(1)改造载体pET-22b(+)

a,引物设计：根据商业载体pET-22b(+)中T7启动子和终止子附近待突变区域的核苷酸序列，设计PCR扩增反应引物：

Nhe-F01：5′-GAGATCTCGATGCTAGCAAATTAATACGACTC-3′；

Spe-F01：5′-AGGAGGAACTAGTTCCGGATTGGC-3′；

Spe-R01：5′-GCCAATCCGGAACTAGTTCCTCCT-3′；

b,增加SpeI识别位点：采用定点突变技术(Site-Directed Mutagenesis)，以质粒pET-22b(+)为模板，以Spe-F01和Spe-R01为引物对进行定点突变PCR，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性35sec，55℃退火1min，72℃延伸7min，循环16次；72℃充分延伸10min。

PCR产物经DpnI消化，转化至大肠杆菌E.coli DH5α，挑取单一菌落培养后提取质粒同时送样测序验证，获得含有SpeI识别位点的突变质粒pET-22bS。

c,增加NheI识别位点：以质粒pET-22bS为模板，以Nhe-F01和Spe-R01为引物对进行PCR扩增反应，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性35sec，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环22次；72℃延伸10min，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测、分离，将通过胶回收获得目的DNA与载体pMD18-T连接，转入大肠杆菌E.coli DH5α，挑取菌落培养后送样测序验证；

将测序正确的质粒pMD-22bNS经BglII和SpeI双酶切(图1)，酶切产物(约390bp的DNA片段)经胶回收后，与经同样双酶切处理的线性质粒pET-22bS混匀，以T4连接酶16℃过夜连接，连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α，筛选获得含有NheI和SpeI识别位点的质粒pET-22bNS_(T7)。

d,参照pET-22bNS_(T7)中T7启动子及其上下游基因的序列结构，通过基因合成获得含Lac、Tac和Trc等启动子序列及其上下游基因的DNA片段，通过限制性内切酶BglII和XhoI双酶切获得目的DNA，与经相同酶切处理的质粒pET-22bNS_(T7)连接，构建含不同启动子的质粒pET-22bNS_(Lac)、pET-22bNS_(Tac)和pET-22bNS_(Trc)。

(2)获得目的基因

依据假坚强芽孢杆菌OF4已知的L-二氨基丁酸转氨酶(EctA,GenBank:ADC50208.1)、L-二氨基丁酸乙酰转移酶(EctB,GenBank:ADC50207.1)和四氢嘧啶合成酶(EctC,GenBank:ADC50206.1)基因序列设计PCR引物，以B.pseudofirmus基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得对应的特异DNA片段。各基因扩增引物及PCR条件分别为：

EctA-F01:5′-GCATATGTGGGAATTAGTTAATC-3′(下划线为NdeI的识别位点)

EctA-R01:5′-CCTCGAGCCTTAATGGTCCAATTC-3′(下划线为XhoI的识别位点)

EctB-F01:5′-GCATATGAAACAAACTGATATG-3′(下划线为NdeI的识别位点)

EctB-R01:5′-AGAGCTCGTTAGCAACAGGCTCAG-3′(下划线为SacI的识别位点)

EctC-F01:5′-GCATATGAAAGTAGTAGCTCT-3′(下划线为NdeI的识别位点)

EctC-R01:5′-ACTCGAGTTCGTCATCAACTACTG-3′(下划线为XhoI的识别位点)

95℃预变性5min；95℃变性45sec，53℃退火1min，72℃延伸90sec，循环25次；72℃延伸10min。扩增得到的DNA片段经琼脂糖凝胶回收后，分别与载体pMD18-T连接，并将连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α，经蓝白斑筛选，挑选白色克隆提取质粒送样测序。序列比对发现测序基因与Genbank公布的序列一致。

(3)构建三基因串联表达载体

质粒pMB18-EctA、pMB18-EctB和pMB18-EctC经NdeI、XhoI或SacI双酶切，获得大小分别为430bp、1280bp和390bp的DNA片段。酶切产物经胶回收后，分别与经同样双酶切处理的线性质粒pET-22bNS_(T7)、pET-22bNS_(Lac)、pET-22bNS_(Tac)和pET-22bNS_(Trc)混合，用T4连接酶16℃过夜连接，连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α，通过菌落PCR筛选阳性克隆，获得含不同启动子的表达载体pET-22bNS-EctA(图2)、pET-22bNS-EctB(图3)和pET-22bNS-EctC(图4)；

将表达载体pET-22bNS_(T7)-EctB、pET-22bNS_(Lac)-EctB、pET-22bNS_(Tac)-EctB和pET-22bNS_(Trc)-EctB分别经限制性内切酶BglII和SpeI双酶切处理，酶切产物经胶回收获得约1.6kb的DNA片段(图3)，将DNA片段与经限制性内切酶BglII和NheI双酶切处理的质粒pET-22bNS_(T7)-EctA、pET-22bNS_(Lac)-EctA、pET-22bNS_(Tac)-EctA和pET-22bNS_(Trc)-EctA逐一连接，随后连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α，并通过菌落PCR筛选阳性克隆，获得带有相同启动子或不同启动子的双基因串联表达载体pET-22bNS-EctA/B；

利用限制性内切酶BglII和SpeI双酶切处理表达载体pET-22bNS_(T7)-EctC、pET-22bNS_(Lac)-EctC、pET-22bNS_(Tac)-EctC和pET-22bNS_(Trc)-EctC，酶切产物经胶回收获得约0.8kb的DNA片段(图4)，将DNA片段与经限制性内切酶BglII和NheI双酶切处理的含相同或不同启动子的双基因串联表达载体pET-22bNS-EctA/B相连接，随后连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α，通过菌落PCR筛选阳性克隆，共获得22个由相同启动子或不同启动子组合调控的三基因串联表达载体pET-22bNS-EctA/B/C(图5)，各载体中每个基因都带有独立的启动子、核糖体结合位点和终止子等表达调控元件；经限制性内切酶BglII和SpeI双酶切处理得到一个大小约为3100bp的DNA片段(图6)，说明三基因串联表达载体构建成功。

实施例2生物合成四氢嘧啶

(1)三基因共同表达

将所构建的22个由相同或不同启动子组合调控的三基因串联表达载体pET-22bNS-EctA/B/C分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑选转化子于37℃含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中过夜培养；次日将培养液以1:100比例接种于100mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液，于37℃180rpm下振荡培养至OD₆₀₀为0.5～0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG于28℃诱导15h，8000rpm离心收集菌体，用0.8％的NaCl溶液洗菌体；

(2)全细胞催化合成四氢嘧啶

分别称取1g菌体重悬于20mL反应液(50mM PBS缓冲液，pH 7.5；300mM L-Asparticacid，300mM Glycerol)中，于60℃200rpm振荡培养3h后离心去除菌体，采用HPLC检测反应液中四氢嘧啶的含量(图7A)。结果显示，所构建的22个串联表达载体中，含由相同启动子调控的串联表达载体pET-22bNS-EctA_T7/B_T7/C_T7的重组菌催化生成四氢嘧啶的含量为17.1mg/mL，其理论合成效率为136.8mg/mL/d，而含由不同启动子调控的串联表达载体pET-22bNS-EctA_Lac/B_Tac/C_Tac和pET-22bNS-EctA_Trc/B_Lac/C_Trc的重组菌则呈现出更高的四氢嘧啶合成水平，其含量分别为20.9mg/mL和19.7mg/mL，二者的理论合成效率分别为167.2mg/mL/d和157.6mg/mL/d，比表达载体pET-22bNS-EctA_T7/B_T7/C_T7分别提高了22.2％和15.2％，具有较高的合成水平。

实施例3重组菌抗逆性检测

将所构建空载体pET-22bNS_(T7)及三基因串联表达载体pET-22bNS-EctAT7/BT7/CT7分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中，分别挑取单菌落在含有氨苄青霉素的LB培养液中37℃振荡培养过夜，次日将菌液转接至100mL LB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达到0.5，加入诱导剂IPTG(终浓度0.1mM)和NaCl(终浓度为6％)，继续培养并检测菌体的生长情况(OD₆₀₀)。由图8A可见，含有串联表达载体pET-22bNS-EctAT7/BT7/CT7的重组菌的生长情况良好，而含空载体pET-22bNS(T7)的重组菌则基本呈停滞状态，说明串联表达载体所产生的四氢嘧啶能够提高重组菌对高盐环境的耐受性。

挑取含有空载体pET-22bNS(T7)及三基因串联表达载体pET-22bNS-EctAT7/BT7/CT7的重组菌，在含有氨苄青霉素的LB液体培养液中37℃振荡培养至OD600达0.5，加入IPTG(终浓度0.1mM)，调节培养液pH值至9.5，继续培养并测定重组菌的生长情况(OD600)。图8B可见，含有pET-22bNS-EctAT7/BT7/CT7的重组菌呈现先抑制后逐渐恢复的生长态势，而含空载体的重组菌则一直处于停滞状态，说明串联表达载体所产生的四氢嘧啶在一定程度下能提高重组菌对碱性环境的耐受性。

虽然，以上已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

本发明的技术方案已经进行过小试，小试完成后在小范围开展了用户调研，结果表明，用户满意度较高。现在已经开始着手准备中试(包括知识产权风险预警调研)。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北师范大学

<120> 一种合成四氢嘧啶的三基因串联表达载体及应用

<130> 2021

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 397

<212> DNA

<213> 质粒pET-22bNS表达区域

<400> 1

agatctcgat gctagcaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggttaacaa 60

ttcccctcta gaactaattt tgtttaactt taagaaggag atatacatat gaaatacctg 120

ctgccgaccg ctgctgctgg tctgctgctc ctcgctgccc agccggcgat ggccatggat 180

atcggaatta attcggatcc gaattcgagc tccgtcgaca agcttgcggc cgcactcgag 240

caccaccacc accaccactg agatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg 300

gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg 360

aggggttttt tgctgaaagg aggaactagt tccggat 397

<210> 2

<211> 250

<212> DNA

<213> Lac启动子

<400> 2

agatctcgat gctagcaaat tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt 60

gtgagcggat aacaactcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacatat 120

gaaatacctg ctgccgaccg ctgctgctgg tctgctgctc ctcgctgccc agccggcgat 180

ggccatggat atcggaatta attcggatcc gaattcgagc tccgtcgaca agcttgcggc 240

cgcactcgag 250

<210> 3

<211> 248

<212> DNA

<213> Tac启动子

<400> 3

agatctcgat gctagcaaat ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt 60

gagcggataa caactctaga aataattttg tttaacttta agaaggagat atacatatga 120

aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag ccggcgatgg 180

ccatggatat cggaattaat tcggatccga attcgagctc cgtcgacaag cttgcggccg 240

cactcgag 248

<210> 4

<211> 249

<212> DNA

<213> Trc启动子

<400> 4

agatctcgat gctagcaaat ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg 60

tgagcggata acaactctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tatacatatg 120

aaatacctgc tgccgaccgc tgctgctggt ctgctgctcc tcgctgccca gccggcgatg 180

gccatggata tcggaattaa ttcggatccg aattcgagct ccgtcgacaa gcttgcggcc 240

gcactcgag 249

<210> 5

<211> 432

<212> DNA

<213> 假坚强芽孢杆菌（Bacillus pseudofirmus）

<400> 5

atgtgggaat tagttaatca ttctacattg gatcaaaatt ctgcttacaa gtacattatg 60

atgtgcgaat tttttgcaga aacatgtgtc gttgcaaaag atgaagatcg tgtcgttggc 120

ttcatcaccg cttttatccc tcccacaaaa ccagatgtcg tttttgtgtg gcaaattgga 180

gtggatgcct cacagcgagg acggggcctt gcctctcaaa tgctaaacga attagtaaaa 240

agagaaggtt gtaaggacgt tcaatatgta gaggctacag tcaccccatc caacaaagcg 300

tcacaatcct tgttcaaaag gttagcacgt gatcacaaca cagagtgtga agtcctagag 360

tgttttcctg aagaattatt ccctggagat aaccatgaaa aagagttaac ttttcgaatt 420

ggaccattaa gg 432

<210> 6

<211> 144

<212> PRT

<213> 假坚强芽孢杆菌（Bacillus pseudofirmus）

<400> 6

Met Trp Glu Leu Val Asn His Ser Thr Leu Asp Gln Asn Ser Ala Tyr

1 5 10 15

Lys Tyr Ile Met Met Cys Glu Phe Phe Ala Glu Thr Cys Val Val Ala

20 25 30

Lys Asp Glu Asp Arg Val Val Gly Phe Ile Thr Ala Phe Ile Pro Pro

35 40 45

Thr Lys Pro Asp Val Val Phe Val Trp Gln Ile Gly Val Asp Ala Ser

50 55 60

Gln Arg Gly Arg Gly Leu Ala Ser Gln Met Leu Asn Glu Leu Val Lys

65 70 75 80

Arg Glu Gly Cys Lys Asp Val Gln Tyr Val Glu Ala Thr Val Thr Pro

85 90 95

Ser Asn Lys Ala Ser Gln Ser Leu Phe Lys Arg Leu Ala Arg Asp His

100 105 110

Asn Thr Glu Cys Glu Val Leu Glu Cys Phe Pro Glu Glu Leu Phe Pro

115 120 125

Gly Asp Asn His Glu Lys Glu Leu Thr Phe Arg Ile Gly Pro Leu Arg

130 135 140

<210> 7

<211> 1281

<212> DNA

<213> 假坚强芽孢杆菌（Bacillus pseudofirmus）

<400> 7

atgaaacaaa ctgatatgaa tatattcgct caattagaat ctgaggtaag aagttattgc 60

cgtagttttc caacggtctt cactaaagca aaagggtaca aaatgtggga tgaatctgga 120

aaggaatatt tagatttctt ctctggtgcc ggcgccctta attacggaca caatgaagac 180

agcatgaaag aaaagctggt taattatatt atgagtgacg gtattaccca ctctcttgat 240

atggctacac agccgaaagc tgaattcctt gagacattca atgaagtcat attaaaacca 300

cgcaatttag agtacaaagt catgttccca ggaccgactg gtacgaatac agttgagagt 360

gccctaaagc ttgctcgtaa ggtaacgggc cgcacagata ttattagttt cactaacggt 420

ttccacggca tgacgattgg ttcactttcc gtaactggta acgcctttaa acgtaaaggt 480

gcaggaatac cattacaaaa tgtagtaaca atgccatacg acagctttgt aaacgaaggc 540

ctcgacactc tggagtatct cgaacgcttc ctagaggatg gcggcagtgg agttgacatt 600

cctgctgcga tgattctcga gacagtccaa ggtgaaggcg gtattaatgc tgcaagtttc 660

gagtggttac aacgaatcga agcgatttgt aagcgttggg gcattttact cattgtcgac 720

gatgttcaag ctggtgtcgg ccgtacaggt acgttcttca gttttgagaa agcaggaatt 780

aaaccagata tcgtatgtat gtctaaatca atcggcggtt atggtctacc tcttgctatc 840

actcttattc gtccagactt agacatctgg gcaccaggtg aacataatgg taccttccgc 900

ggaaacaatc atgcattcgt aactgcaact gcagcattag agttctggaa agaccctgaa 960

tttgaacaaa acattcaaaa acgttctgag cttatttact cgttcttaga aagtattgta 1020

gagaaatacc ctgaagtgaa aggtgaagta cgcggacgcg gctatatggt cggtattgga 1080

tctgaagtgg aagggttgtc tgaaaaaatt gctgcggaag catttaatcg cggtttaatt 1140

atggaaacat ccggaccaaa agatgaggta ttcaagctct tcccaccatt aattattgat 1200

gatgcaggtc ttgaggctgg ctttgaaatc attgaagcaa gtgttaaaac agctcttgaa 1260

gcagctgagc ctgttgctaa c 1281

<210> 8

<211> 427

<212> PRT

<213> 假坚强芽孢杆菌（Bacillus pseudofirmus）

<400> 8

Met Lys Gln Thr Asp Met Asn Ile Phe Ala Gln Leu Glu Ser Glu Val

1 5 10 15

Arg Ser Tyr Cys Arg Ser Phe Pro Thr Val Phe Thr Lys Ala Lys Gly

20 25 30

Tyr Lys Met Trp Asp Glu Ser Gly Lys Glu Tyr Leu Asp Phe Phe Ser

35 40 45

Gly Ala Gly Ala Leu Asn Tyr Gly His Asn Glu Asp Ser Met Lys Glu

50 55 60

Lys Leu Val Asn Tyr Ile Met Ser Asp Gly Ile Thr His Ser Leu Asp

65 70 75 80

Met Ala Thr Gln Pro Lys Ala Glu Phe Leu Glu Thr Phe Asn Glu Val

85 90 95

Ile Leu Lys Pro Arg Asn Leu Glu Tyr Lys Val Met Phe Pro Gly Pro

100 105 110

Thr Gly Thr Asn Thr Val Glu Ser Ala Leu Lys Leu Ala Arg Lys Val

115 120 125

Thr Gly Arg Thr Asp Ile Ile Ser Phe Thr Asn Gly Phe His Gly Met

130 135 140

Thr Ile Gly Ser Leu Ser Val Thr Gly Asn Ala Phe Lys Arg Lys Gly

145 150 155 160

Ala Gly Ile Pro Leu Gln Asn Val Val Thr Met Pro Tyr Asp Ser Phe

165 170 175

Val Asn Glu Gly Leu Asp Thr Leu Glu Tyr Leu Glu Arg Phe Leu Glu

180 185 190

Asp Gly Gly Ser Gly Val Asp Ile Pro Ala Ala Met Ile Leu Glu Thr

195 200 205

Val Gln Gly Glu Gly Gly Ile Asn Ala Ala Ser Phe Glu Trp Leu Gln

210 215 220

Arg Ile Glu Ala Ile Cys Lys Arg Trp Gly Ile Leu Leu Ile Val Asp

225 230 235 240

Asp Val Gln Ala Gly Val Gly Arg Thr Gly Thr Phe Phe Ser Phe Glu

245 250 255

Lys Ala Gly Ile Lys Pro Asp Ile Val Cys Met Ser Lys Ser Ile Gly

260 265 270

Gly Tyr Gly Leu Pro Leu Ala Ile Thr Leu Ile Arg Pro Asp Leu Asp

275 280 285

Ile Trp Ala Pro Gly Glu His Asn Gly Thr Phe Arg Gly Asn Asn His

290 295 300

Ala Phe Val Thr Ala Thr Ala Ala Leu Glu Phe Trp Lys Asp Pro Glu

305 310 315 320

Phe Glu Gln Asn Ile Gln Lys Arg Ser Glu Leu Ile Tyr Ser Phe Leu

325 330 335

Glu Ser Ile Val Glu Lys Tyr Pro Glu Val Lys Gly Glu Val Arg Gly

340 345 350

Arg Gly Tyr Met Val Gly Ile Gly Ser Glu Val Glu Gly Leu Ser Glu

355 360 365

Lys Ile Ala Ala Glu Ala Phe Asn Arg Gly Leu Ile Met Glu Thr Ser

370 375 380

Gly Pro Lys Asp Glu Val Phe Lys Leu Phe Pro Pro Leu Ile Ile Asp

385 390 395 400

Asp Ala Gly Leu Glu Ala Gly Phe Glu Ile Ile Glu Ala Ser Val Lys

405 410 415

Thr Ala Leu Glu Ala Ala Glu Pro Val Ala Asn

420 425

<210> 9

<211> 387

<212> DNA

<213> 假坚强芽孢杆菌（Bacillus pseudofirmus）

<400> 9

atgaaagtag tagctcttaa agacattatc ggatcagatc aagaagtaaa aggtgaaaac 60

tggacgagcc gccgtctgct tttaaagaaa gatggcatgg ggtattctgt ccatgatacg 120

gttattaaag caggtacaga aactcatatt tggtatcaaa accacctaga agcggtttac 180

tgcattgaag gtgaaggaga agtagaaacg cttaaagata ataaagtttg gccgatcaaa 240

aaagacgaga tatatgcgtt agatgaaaat gatgagcacc ttcttcgtgc aaagacagat 300

atgcgcatgg tatgtgtatt caaccctcct attacaggaa aagaaacaca tgatgaaaat 360

ggtgtatatc cagtagttga tgacgaa 387

<210> 10

<211> 129

<212> PRT

<213> 假坚强芽孢杆菌（Bacillus pseudofirmus）

<400> 10

Met Lys Val Val Ala Leu Lys Asp Ile Ile Gly Ser Asp Gln Glu Val

1 5 10 15

Lys Gly Glu Asn Trp Thr Ser Arg Arg Leu Leu Leu Lys Lys Asp Gly

20 25 30

Met Gly Tyr Ser Val His Asp Thr Val Ile Lys Ala Gly Thr Glu Thr

35 40 45

His Ile Trp Tyr Gln Asn His Leu Glu Ala Val Tyr Cys Ile Glu Gly

50 55 60

Glu Gly Glu Val Glu Thr Leu Lys Asp Asn Lys Val Trp Pro Ile Lys

65 70 75 80

Lys Asp Glu Ile Tyr Ala Leu Asp Glu Asn Asp Glu His Leu Leu Arg

85 90 95

Ala Lys Thr Asp Met Arg Met Val Cys Val Phe Asn Pro Pro Ile Thr

100 105 110

Gly Lys Glu Thr His Asp Glu Asn Gly Val Tyr Pro Val Val Asp Asp

115 120 125

Glu

Claims

1.一种合成四氢嘧啶的三基因串联表达载体，其特征在于，所述三基因串联的基因的核苷酸序列由SEQ ID No.2和SEQ ID No.3与SEQ ID No.5、SEQ ID No.7和SEQ ID No.9排列组合构成，其中：

(1)SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示分别为含有启动子Lac和Tac的核苷酸序列；

(2)SEQ ID No.5所示为L-二氨基丁酸转氨酶(EctA)基因的核苷酸序列；

(3)SEQ ID No.7所示为L-二氨基丁酸乙酰转移酶(EctB)基因的核苷酸序列；

(4)SEQ ID No.9所示为四氢嘧啶合成酶(EctC)基因的核苷酸序列；

所述排列组合为Lac-EctA-Tac-EctB-Tac-EctC。

2.一种含有如权利要求1所述三基因串联表达载体的工程菌的培养方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将构建的串联表达载体通过化学转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)中，37℃于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基过夜培养，即得工程菌；

(2)挑取单菌落，37℃于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养至OD₆₀₀达0.5-0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，于28℃诱导15h，离心收集菌体。

3.根据权利要求1所述三基因串联表达载体的应用，其特征在于用于生物合成四氢嘧啶。

4.根据权利要求1所述的载体在制备抗逆性工程菌中的应用，其特征在所述抗逆性指耐受高盐、高碱的能力。