CN110484519A - 毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用。本发明中发现毕赤酵母翻译相关因子Bcy1(注释为蛋白激酶A调节亚基)，可以显著提高细胞发酵过程中的生物量，提高增强型绿色荧光蛋白eGFP的表达量，提高植酸酶Phy的表达量，以及可促进毕赤酵母发酵稳定期的细胞生长，增加细胞生物量积累，说明毕赤酵母翻译相关因子Bcy1具有很强的通用性，其在增加发酵过程中生物量积累和提高外源蛋白的产量方面具有良好的应用前景。

Description

毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用。
背景技术
毕赤酵母表达系统是通用的、高效的外源蛋白表达系统，广泛地应用于表达和生产各种外源蛋白及研究蛋白的表达和分泌调控机制。除了毕赤酵母物质代谢模块研究外，目前基于蛋白质合成“中心法则”的外源蛋白合成调控模块主要集中在基因转录模块、蛋白质加工折叠模块及其转运分泌模块。然而，基因的转录水平和蛋白表达水平并不是完全一致的，从mRNA到蛋白质需要进行翻译和翻译后修饰等。翻译作为连接mRNA与蛋白质的桥梁，不仅决定多肽的生成速率与合成质量，还影响蛋白质的翻译后易位、折叠、修饰及分泌等。因此，翻译调控对外源蛋白表达至关重要，但是由于翻译调控的严谨性和复杂性，目前在毕赤酵母中发现可提高外源蛋白表达的翻译相关因子少之又少。
2009年毕赤酵母基因组信息被公开，毕赤酵母的5000多个基因得到完整的注释。通过序列同源比对和基因功能搜索发现有许多基因编码的蛋白质参与组成翻译系统，即称为翻译相关因子，主要有核糖体蛋白、翻译起始因子、翻译延伸因子、aa-tRNA合成酶、核糖体生物合成因子、核糖体相关的共翻译折叠分子伴侣等几大类。研究发现核糖体生物合成相关的信号因子可营养刺激下调控核糖体生物合成，影响细胞蛋白翻译活力从而改变细胞生长。其中，蛋白激酶A(PKA)信号途径在葡萄糖刺激下，激化核糖体蛋白表达，增加细胞核糖体含量，提高蛋白翻译活性，促进对数期细胞的快速生长。而PKA是cAMP-PKA营养感应信号途径中的关键蛋白，它是一个异源四聚体蛋白，包含两个催化亚基和两个调节亚基，前者由TPK1-3基因编码，后者由BCY1基因编码。环磷酸腺苷(cAMP)与调节亚基Bcy1结合使其与催化亚基解离，从而活化PKA。相反，未结合cAMP的Bcy1可与Tpk1-3紧密结合导致PKA的失活。研究表明PKA可负调控细胞稳定期，抑制二次生长相关基因和压力响应基因的表达。毕赤酵母中Bcy1注释为蛋白激酶A调节亚基，控制多种细胞过程的信号通路的组成部分，包括代谢、细胞周期、应激反应、稳定期和孢子形成等。但到目前为止，尚未有Bcy1促进毕赤酵母发酵稳定期的细胞生长、提高外源蛋白表达的相关报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用。
本发明的另一目的在于提供所述含有毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的重组载体或重组表达工程菌在外源蛋白表达中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用。
所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1来源于毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株，注释为蛋白激酶A(PKA)调节亚基，是控制多种细胞过程的信号通路的组成部分，包括代谢、细胞周期、应激反应、稳定期和孢子形成等，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
所述的外源蛋白为增强型绿色荧光蛋白(eGFP)和植酸酶(Phy)中的一种，毕赤酵母翻译相关因子Bcy1可以显著提高eGFP和Phy的表达量。
所述的增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，核苷酸序列如SEQ ID No.3。
所述的植酸酶(Phy)的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，核苷酸序列如SEQ IDNo.5。
编码所述毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用，是将所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1表达于毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株；具体通过如下步骤实现：
(1)以载体pPICZA为模板，以SEQ ID No.9和SEQ ID No.10为引物进行PCR扩增，得到pPICZA线性片段；然后将pPICZA线性片段与毕赤酵母翻译相关因子Bcy1进行同源重组，得到重组载体pPICZA-Bcy1；
(2)将重组载体pPICZA-Bcy1转化至大肠杆菌感受态中，用含Zeocin的培养基进行筛选，再提取质粒转化至毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株中，得到重组表达工程菌。
步骤(1)中所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1优选为从毕赤酵母GS115菌株基因组中扩增得到的Bcy1基因片段。
步骤(2)中所述的培养基优选为含有Zeocin的LBZ培养基；所述培养基中Zeocin的浓度优选为25μg/ml。
步骤(2)中所述的毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株为能够表达外源蛋白增强型绿色荧光蛋白(eGFP)或植酸酶(Phy)的毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株；优选为毕赤酵母GS115/pPIC9K-eGFP、毕赤酵母GS115/pPICZA-HKA-eGFP或毕赤酵母GS115/pPIC9K-Phy工程菌株。
所述的毕赤酵母GS115/pPIC9K-eGFP优选为通过如下方法构建得到：
(I)将eGFP基因和载体pPIC9K用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接，得到重组载体pPIC9K-eGFP；
(II)将重组载体pPIC9K-eGFP电转化至毕赤酵母GS115感受态，得到毕赤酵母GS115/pPIC9K-eGFP。
所述的毕赤酵母GS115/pPICZA-HKA-eGFP优选为通过如下方法构建得到：
(i)将eGFP基因和载体pPICZA用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接，得到重组载体pPICZA-eGFP；
(ii)将载体pPICHKA用限制性内切酶BamHⅠ和MluⅠ进行双酶切，回收HKA(His-Kan-AOX1片段，约5300bp)，然后与用限制性内切酶BamHⅠ和MluⅠ双酶切后的重组载体pPICZA-eGFP连接，得到重组载体pPICZA-HKA-eGFP；
(iii)将重组载体pPICZA-HKA-eGFP电转化至毕赤酵母GS115感受态，得到毕赤酵母GS115/pPICZA-HKA-eGFP。
所述的毕赤酵母GS115/pPIC9K-Phy优选为通过如下方法构建得到：
(a)将Phy基因和载体pPIC9K用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切，然后用T4DNA连接酶连接得到重组载体pPIC9K-Phy；
(b)将重组载体pPIC9K-Phy电转化至毕赤酵母GS115感受态，得到毕赤酵母GS115/pPIC9K-Phy。
所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用，在步骤(2)之后还包括诱导表达的步骤；具体为：将重组表达工程菌接种到培养基中培养至OD600为2.0～6.0，然后转至含有甲醇的诱导培养基中进行诱导表达，得到所述的外源蛋白。
所述的培养基优选为BMGY培养基，其组成成分为：1％(v/v)甘油，2％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)酵母提取物，1.34％(w/v)酵母氮源(无氨基酸)，100mM pH6.0磷酸钾缓冲液。
所述的培养基中培养的条件为：30℃震荡培养16～20小时。
所述的诱导培养基优选为BMMY培养基，其组成成分为：1％(v/v)甲醇，2％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)酵母提取物，1.34％(w/v)酵母氮源(无氨基酸)，100mM pH6.0磷酸钾缓冲液。
所述的诱导培养基中甲醇的浓度优选为体积百分比10％。
所述的诱导表达的条件为：在30℃下诱导表达24～120小时；优选为：菌株起始OD600＝1.0，在30℃下诱导表达24～120小时。
含有毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的重组载体或重组表达工程菌在外源蛋白表达中的应用。
所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1为蛋白激酶A(PKA)调节亚基，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
所述的外源蛋白为增强型绿色荧光蛋白(eGFP)和植酸酶(Phy)中的一种，毕赤酵母翻译相关因子Bcy1可以显著提高细胞生物量，同时可以显著提高eGFP和Phy的表达量。
编码所述毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
所述的含有毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的重组载体为将毕赤酵母翻译相关因子Bcy1连接到载体pPICZA获得。
所述的含有毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的重组表达工程菌为将含有毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的重组载体转化至毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株获得。
所述的毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株为能够表达外源蛋白增强型绿色荧光蛋白(eGFP)或植酸酶(Phy)的毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株；优选为将eGFP基因或Phy基因插入到载体pPICZA或pPIC9K中，然后转化毕赤酵母获得的毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株；更优选为毕赤酵母GS115/pPIC9K-eGFP、毕赤酵母GS115/pPICZA-HKA-eGFP或毕赤酵母GS115/pPIC9K-Phy工程菌株。
毕赤酵母翻译相关因子Bcy1、以及含有毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的重组载体或重组表达工程菌在促进毕赤酵母发酵稳定期的细胞生长、增加细胞生物量积累中的应用。
所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1为蛋白激酶A(PKA)调节亚基，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
编码所述毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明中的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1，注释为蛋白激酶A(PKA)调节亚基，可以显著提高细胞发酵过程中的生物量和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)表达量；同时过表达Bcy1提高植酸酶(Phy)表达量达20％，以及可促进毕赤酵母发酵稳定期的细胞生长，增加细胞生物量积累，说明具有很强的通用性。这些结果表明，毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在增加发酵过程中生物量积累和提高外源蛋白的产量方面具有良好的应用前景，为实现更高密度的发酵提供了一种切实有效的方法。
附图说明
图1为过表达翻译相关因子Bcy1对分泌型和胞内表达型eGFP表达量及细胞生长的作用；其中，A为过表达翻译相关因子Bcy1菌株发酵120小时分泌型eGFP表达量；B为分泌型eGFP表达菌株过表达翻译相关因子Bcy1发酵120小时细胞生长曲线；C为过表达翻译相关因子Bcy1菌株发酵120小时胞内表达型eGFP表达量；D为胞内表达型eGFP表达菌株过表达翻译相关因子Bcy1发酵120小时细胞生长曲线。
图2为过表达翻译相关因子Bcy1对植酸酶分泌表达和细胞生长的作用；其中，A为过表达翻译相关因子Bcy1菌株发酵120小时植酸酶Phy单位体积酶活力；B为植酸酶Phy表达菌株过表达翻译相关因子Bcy1发酵120小时细胞生长曲线；C为过表达翻译相关因子Bcy1菌株发酵120小时植酸酶Phy单位OD600酶活力；D为过表达翻译相关因子Bcy1菌株发酵120小时上清中植酸酶Phy SDS-PAGE分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明涉及的主要材料如下：
1、毕赤酵母GS115菌株(购于Invitrogen)及其基因组，大肠杆菌TOP10(购于生工生物工程(上海)股份有限公司)。
2、载体pPICZA(购于Invitrogen)，载体pPIC9K(购于Invitrogen)，载体pPICHKA(vectors pPICHKA参考文献获得：Li C,Lin Y,Zheng X,et al.Combined strategies forimproving expression of Citrobacter amalonaticus phytase in Pichia pastoris[J].BMC biotechnology,2015,15(1):88.)。
3、同源重组试剂盒：Seamless Assembly Cloning Kit(购于CloneSmartertechnologies)，T4 DNA连接酶(购于Thermo Fisher Scientific)。
4、培养基：
Zeocin(博来霉素；购于Invitrogen)母液浓度为：100mg/ml。
LBZ培养基：1％(w/v)氯化钠，1％(w/v)胰蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，25μg/ml Zeocin。
YPDZ平板：2％(w/v)葡萄糖，2％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)琼脂，100μg/ml Zeocin。
BMGY培养基：1％(v/v)甘油，2％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)酵母提取物，1.34％(w/v)酵母氮源(无氨基酸)，100mM pH6.0磷酸钾缓冲液。
BMMY培养基：1％(v/v)甲醇，2％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)酵母提取物，1.34％(w/v)酵母氮源(无氨基酸)，100mM pH6.0磷酸钾缓冲液。
本发明中所涉及的引物序列和eGFP及Phy基因序列均由上海捷瑞生物工程有限公司公司合成。
实施例1：表达增强型绿色荧光蛋白eGFP和植酸酶Phy重组毕赤酵母构建
委托上海捷瑞生物工程有限公司合成eGFP基因后，分别以EcoRI和NotI对eGFP基因片段和载体pPIC9K、pPICZA进行双酶切，回收纯化后，使用T4DNA连接酶分别连接得到载体pPIC9K-eGFP和pPICZA-eGFP；再使用BamHⅠ和MluⅠ分别对质粒pPICZA-eGFP和pPICHKA双酶切，分别回收纯化片段pPIC-eGFP和HKA(His-Kan-AOX1片段，约5300bp)，使用T4DNA连接酶连接得到载体pPICZA-HKA-eGFP；同时委托上海捷瑞生物工程有限公司合成Phy基因后，分别以EcoRI和NotI对Phy基因片段和载体pPIC9K进行双酶切，回收纯化后，使用T4DNA连接酶连接得到载体pPIC9K-Phy；分别将载体pPIC9K-eGFP、pPICZA-HKA-eGFP和pPIC9K-Phy电转化至毕赤酵母GS115感受态，得到分泌表达型eGFP重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-eGFP、胞内表达型eGFP重组毕赤酵母GS115/pPICZA-HKA-eGFP和Phy重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-Phy。
eGFP基因序列如下所示(SEQ ID No.3)：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA。
eGFP氨基酸序列如下所示(SEQ ID No.4)：
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK。
Phy基因序列如下所示(SEQ ID No.5)：
CAGTCCGAACCTGCGTTGAAACTGGAGTCTGTCGTTATCGTCTCCAGACATGGTGTCAGAGCACCTACCAAGGCTACTCAGCTGATGCAAGACGTTACTCCTGATGCTTGGCCTACTTGGCCTGTCAAACTGGGTTGGCTGACTCCTAGAGGTGGTGAGCTGATTGCTTACTTGGGTCACTACCAAAGACAGAGACTGGTTGCTGACGGTCTGTTGGCTAAGAAGGGTTGTCCTCAGTCTGGTCAGGTCGCTATCATCGCTGATGTTGACGAGAGAACCAGAAAGACTGGTGAAGCCTTCGCTGCTGGTCTGGCTCCTGACTGTGCTATCACTGTCCATACTCAGGCTGACACCTCCTCTCCTGATCCTCTGTTCAATCCTCTGAAGACTGGTGTCTGTCAACTGGACAACGCTAACGTCACTGACGCTATCCTGGAAAGAGCTGGTGGTTCCATTGCTGACTTCACTGGTCACTACCAAACTGCTTTCAGAGAACTGGAAAGAGTCCTGAACTTTCCTCAATCCAACTTGTGCTTGAAGAGAGAGAAACAGGACGAATCCTGTAACTTGACTCAGGCTCTGCCTTCTGAACTGAAGGTCTCTGCTGACTGTGTCTCCTTGACTGGTGCTGTCTCCTTGGCTTCCATGCTGACTGAAATCTTCTTGCTGCAACAAGCTCAAGGTATGCCTGAACCTGGTTGGGGTAGAATCACCGACTCTCATCAATGGAACACCTTGCTGTCCTTGCACAATGCTCAGTTCGACTTGCTTCAGAGAACTCCTGAAGTTGCTAGATCCAGAGCTACTCCTCTGTTGGACCTGATCAAGACTGCTCTGACTCCTCATCCTCCTCAGAAGCAAGCCTATGGTGTCACTCTTCCTACCTCTGTTCTGTTCATTGCTGGTCACGACACCAATCTTGCCAACTTGGGTGGTGCTCTGGAACTCAACTGGACCTTGCCTGGTCAGCCTGACAATACTCCTCCTGGTGGTGAACTGGTCTTCGAAAGATGGAGAAGACTGTCTGACAACTCTCAGTGGATTCAGGTCTCCTTGGTCTTCCAGACCTTGCAGCAGATGAGAGACAAGACTCCTCTGTCCTTGAACACTCCTCCTGGTGAAGTTAAGCTGACTCTGGCTGGATGTGAAGAGAGAAACGCTCAAGGTATGTGCTCCTTGGCTGGTTTCACTCAGATTGTCAACGAAGCCAGAATCCCTGCCTGTTCCCTGTAA。
Phy氨基酸序列如下所示(SEQ ID No.6)：
QSEPALKLESVVIVSRHGVRAPTKATQLMQDVTPDAWPTWPVKLGWLTPRGGELIAYLGHYQRQRLVADGLLAKKGCPQSGQVAIIADVDERTRKTGEAFAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPLKTGVCQLDNANVTDAILERAGGSIADFTGHYQTAFRELERVLNFPQSNLCLKREKQDESCNLTQALPSELKVSADCVSLTGAVSLASMLTEIFLLQQAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFDLLQRTPEVARSRATPLLDLIKTALTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALELNWTLPGQPDNTPPGGELVFERWRRLSDNSQWIQVSLVFQTLQQMRDKTPLSLNTPPGEVKLTLAGCEERNAQGMCSLAGFTQIVNEARIPACSL。
实施例2：毕赤酵母翻译相关因子Bcy1基因克隆和表达
(1)毕赤酵母翻译相关因子Bcy1基因克隆
根据毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的基因序列SEQ ID No.2设计Bcy1基因扩增引物ZA-Bcy1-S和ZA-Bcy1-A；其中：
毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的氨基酸序列如下(SEQ ID No.1)所示：
MTAYTDVVNDLSRELSLKKPKDVIQFCADYFNNKLAEDPARQQPSTATAPSSRPAQTASGAPLFKDQFGGDPHEPLSHHPHRGSIFKDSFTHPEDPQSNKIRPLDNASPGSGFAAHLAKVKFNPERRISVSAESVNPEIFATSSWQPPVHDLSDEQLQRLNNIVRKSFLFSQLEDEALRTVIYALEEKKVPRGTEIIKQGDEGDYFYVLESGEVTFVVNGETKGQGKSGSTFGELALMYNSPRAATVISSQDCVLWALDRMTFRRILLEGTAKRRAMYDGFLKDVPVLRCLNSYERNKLADALESETYNKGDTIIREGEPGENFYFIEQGEAEVFKEGEGHMATLGKGDYFGELALLNDLPRQATVVAKSDVIKVVTLDKNGFQRLLGPAIEVLKLQDPTKI。
毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的核苷酸序列如下(SEQ ID No.2)所示：
ATGACAGCATACACGGACGTCGTAAACGACTTGAGTAGAGAATTATCCTTGAAGAAACCCAAAGATGTGATCCAATTCTGTGCGGACTACTTCAACAATAAGTTAGCAGAGGATCCTGCCAGACAACAACCATCAACAGCAACAGCCCCCTCTTCACGCCCTGCTCAGACTGCTTCAGGCGCACCTCTGTTTAAAGACCAGTTTGGAGGTGATCCTCATGAACCATTGTCTCATCACCCTCATCGTGGTAGCATTTTTAAGGACTCATTCACTCATCCTGAAGACCCTCAAAGTAATAAAATAAGGCCTTTGGATAATGCCTCCCCTGGCTCAGGATTTGCCGCACATCTTGCTAAGGTTAAGTTCAACCCAGAGAGACGTATCTCTGTGAGTGCCGAATCTGTGAATCCAGAAATTTTTGCTACCAGTTCTTGGCAGCCACCTGTCCACGACCTGAGTGATGAGCAACTGCAACGTTTAAACAACATTGTCAGAAAGAGTTTCCTGTTTAGCCAGCTAGAAGATGAAGCACTACGAACAGTGATATATGCCTTGGAAGAGAAGAAAGTGCCACGCGGAACAGAGATAATCAAACAAGGCGACGAAGGTGATTACTTTTACGTTTTGGAAAGCGGTGAGGTCACATTTGTTGTCAATGGAGAGACTAAAGGCCAAGGAAAGTCTGGGTCAACCTTTGGTGAACTTGCACTGATGTATAACTCGCCGCGGGCGGCCACCGTGATTTCTAGTCAGGACTGTGTTCTTTGGGCACTTGATCGTATGACGTTTAGAAGAATTTTACTTGAAGGTACAGCCAAGAGACGTGCGATGTATGATGGGTTTCTCAAGGATGTTCCAGTGTTACGCTGTCTCAACTCCTATGAACGTAATAAGCTCGCTGATGCTTTAGAATCTGAGACTTACAACAAAGGCGACACGATCATCCGTGAAGGCGAACCAGGAGAAAACTTTTATTTTATTGAACAAGGTGAAGCTGAAGTGTTTAAAGAAGGTGAAGGACATATGGCAACATTGGGCAAAGGTGATTACTTTGGCGAACTCGCTCTGTTGAACGACCTTCCACGTCAAGCTACTGTCGTTGCTAAAAGTGACGTGATCAAGGTTGTTACCCTAGATAAGAATGGATTCCAGAGATTGCTTGGGCCAGCAATTGAGGTTCTCAAGCTGCAAGATCCCACCAAGATCTAG。
ZA-Bcy1-S(SEQ ID No.7)：
5’-AGGAATTCACGTGGCCCAGCATGACAGCATACACGGACG-3’；
ZA-Bcy1-A(SEQ ID No.8)：
5’-TTTTGTTCGGGCCCAAGCTGCTAGATCTTGGTGGGATCTTG-3’。
以毕赤酵母GS115基因组DNA为模板，以ZA-Bcy1-S和ZA-Bcy1-S为引物，通过PCR方法扩增出Bcy1基因序列，扩增条件为：预变性94℃2分钟，再进行30个以下循环：98℃变性10秒、55℃退火30秒、68℃延伸1分钟30秒，最后68℃延伸7分钟。
(2)毕赤酵母翻译相关因子Bcy1表达载体pPICZA-Bcy1的构建
根据载体pPICZA序列，设计载体扩增引物ZA-S和ZA-A。
ZA-S:5’-CAGCTTGGGCCCGAACAAAA-3’(SEQ ID No.9)；
ZA-A:5’-GCTGGGCCACGTGAATTCCT-3’(SEQ ID No.10)；
5’AOX1:GACTGGTTCCAATTGACAAGC(SEQ ID No.11)。
以质粒pPICZA为模板，通过PCR引物ZA-S和ZA-A PCR扩增得到pPICZA线性片段，使用同源重组试剂盒(Seamless Assembly Cloning Kit)，根据说明书把pPICZA线性片段和步骤(1)中得到的Bcy1基因片段在50℃下进行同源重组30分钟，然后把混合液转化到大肠杆菌TOP10感受态中，并涂布于LBZ平板(25μg/ml Zeocin)中，使用引物5’AOX1和ZA-Bcy1-A进行菌落PCR鉴定阳性转化子，接种于LBZ液体培养基中过夜培养，提取质粒，使用限制性内切酶EcoRI和SacII进行双酶切鉴定，再经过测序验证，结果表明构建获得了质粒pPICZA-Bcy1。
(3)毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在毕赤酵母中的表达
使用SacI限制性内切酶对质粒pPICZA-Bcy1进行线性化后，取0.5～1.0μg线性化片段通过LiCl法电转化至重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-eGFP感受态中，用YPDZ平板进行筛选，挑取转化子使用引物5’AOX1和ZA-Bcy1-A进行PCR验证获得阳性转化子。然后挑取阳性转化子于装有5ml BMGY培养基50ml摇瓶中培养16～20小时，OD600达到2～6后，转至装有25ml BMMY培养基的250ml摇瓶中，在30℃、250rpm条件下，1％(v/v)甲醇诱导发酵120小时，每24小时取样测定细胞生长曲线和荧光量曲线，并补加1％(v/v)甲醇。
实施例3：翻译相关因子Bcy1对分泌型和胞内表达型eGFP表达的作用
将质粒pPICZA-Bcy1分别转化于重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-eGFP(分泌型)、GS115/pPICZA-HKA-eGFP(胞内表达型)感受态中，用YPDZ平板进行筛选，挑取转化子使用引物5’AOX1和ZA-Bcy1-A进行PCR验证获得阳性转化子。然后挑取阳性转化子于装有5ml BMGY培养基50ml摇瓶中培养16～20小时，OD600达到2～6后，转至装有25ml BMMY培养基的250ml摇瓶中，菌株起始OD600＝1.0，在30℃、250rpm条件下，1％(v/v)甲醇诱导发酵120小时，每24小时补加1％(v/v)甲醇，每24小时取样测定细胞生长曲线和荧光量曲线。以未转化质粒的毕赤酵母GS115/pPIC9K-eGFP和GS115/pPICZA-HKA-eGFP为对照(WT)。
结果如图1所示：结果显示Bcy1可以显著提高细胞生物量约20％，同时提高eGFP(增强型绿色荧光蛋白)表达量，不管是分泌还是胞内表达eGFP，均可提高20％以上。
实施例4：以毕赤酵母GS115/pPIC9K-Phy菌株验证Bcy1提高外源蛋白表达的通用性
将质粒pPICZA-Bcy1转化于毕赤酵母GS115/pPIC9K-Phy菌株中，用YPDZ平板进行筛选，挑取转化子使用引物5’AOX1和ZA-Bcy1-A进行PCR验证获得阳性转化子。然后挑取阳性转化子于装有5ml BMGY培养基50ml摇瓶中培养16～20小时，OD600达到2～6后，转至装有25ml BMMY培养基的250ml摇瓶中，菌株起始OD600＝1.0，在30℃、250rpm条件下，1％(v/v)甲醇诱导发酵120小时，每24小时补加1％(v/v)甲醇，并取样测定细胞生长曲线，及通过比色法测定植酸酶酶活力，同时使用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳)分析植酸酶发酵120小时蛋白表达量。以未转化质粒的毕赤酵母GS115/pPIC9K-Phy菌株为对照(WT)。
结果如图2所示：发现过表达Bcy1提高细胞生物量约16％，且过表达Bcy1在摇瓶水平上提高Phy(植酸酶)产量约20％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 402
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 毕赤酵母翻译相关因子Bcy1
<400> 1
Met Thr Ala Tyr Thr Asp Val Val Asn Asp Leu Ser Arg Glu Leu Ser
1 5 10 15
Leu Lys Lys Pro Lys Asp Val Ile Gln Phe Cys Ala Asp Tyr Phe Asn
20 25 30
Asn Lys Leu Ala Glu Asp Pro Ala Arg Gln Gln Pro Ser Thr Ala Thr
35 40 45
Ala Pro Ser Ser Arg Pro Ala Gln Thr Ala Ser Gly Ala Pro Leu Phe
50 55 60
Lys Asp Gln Phe Gly Gly Asp Pro His Glu Pro Leu Ser His His Pro
65 70 75 80
His Arg Gly Ser Ile Phe Lys Asp Ser Phe Thr His Pro Glu Asp Pro
85 90 95
Gln Ser Asn Lys Ile Arg Pro Leu Asp Asn Ala Ser Pro Gly Ser Gly
100 105 110
Phe Ala Ala His Leu Ala Lys Val Lys Phe Asn Pro Glu Arg Arg Ile
115 120 125
Ser Val Ser Ala Glu Ser Val Asn Pro Glu Ile Phe Ala Thr Ser Ser
130 135 140
Trp Gln Pro Pro Val His Asp Leu Ser Asp Glu Gln Leu Gln Arg Leu
145 150 155 160
Asn Asn Ile Val Arg Lys Ser Phe Leu Phe Ser Gln Leu Glu Asp Glu
165 170 175
Ala Leu Arg Thr Val Ile Tyr Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Pro Arg
180 185 190
Gly Thr Glu Ile Ile Lys Gln Gly Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Tyr Val
195 200 205
Leu Glu Ser Gly Glu Val Thr Phe Val Val Asn Gly Glu Thr Lys Gly
210 215 220
Gln Gly Lys Ser Gly Ser Thr Phe Gly Glu Leu Ala Leu Met Tyr Asn
225 230 235 240
Ser Pro Arg Ala Ala Thr Val Ile Ser Ser Gln Asp Cys Val Leu Trp
245 250 255
Ala Leu Asp Arg Met Thr Phe Arg Arg Ile Leu Leu Glu Gly Thr Ala
260 265 270
Lys Arg Arg Ala Met Tyr Asp Gly Phe Leu Lys Asp Val Pro Val Leu
275 280 285
Arg Cys Leu Asn Ser Tyr Glu Arg Asn Lys Leu Ala Asp Ala Leu Glu
290 295 300
Ser Glu Thr Tyr Asn Lys Gly Asp Thr Ile Ile Arg Glu Gly Glu Pro
305 310 315 320
Gly Glu Asn Phe Tyr Phe Ile Glu Gln Gly Glu Ala Glu Val Phe Lys
325 330 335
Glu Gly Glu Gly His Met Ala Thr Leu Gly Lys Gly Asp Tyr Phe Gly
340 345 350
Glu Leu Ala Leu Leu Asn Asp Leu Pro Arg Gln Ala Thr Val Val Ala
355 360 365
Lys Ser Asp Val Ile Lys Val Val Thr Leu Asp Lys Asn Gly Phe Gln
370 375 380
Arg Leu Leu Gly Pro Ala Ile Glu Val Leu Lys Leu Gln Asp Pro Thr
385 390 395 400
Lys Ile
<210> 2
<211> 1209
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 毕赤酵母翻译相关因子Bcy1
<400> 2
atgacagcat acacggacgt cgtaaacgac ttgagtagag aattatcctt gaagaaaccc 60
aaagatgtga tccaattctg tgcggactac ttcaacaata agttagcaga ggatcctgcc 120
agacaacaac catcaacagc aacagccccc tcttcacgcc ctgctcagac tgcttcaggc 180
gcacctctgt ttaaagacca gtttggaggt gatcctcatg aaccattgtc tcatcaccct 240
catcgtggta gcatttttaa ggactcattc actcatcctg aagaccctca aagtaataaa 300
ataaggcctt tggataatgc ctcccctggc tcaggatttg ccgcacatct tgctaaggtt 360
aagttcaacc cagagagacg tatctctgtg agtgccgaat ctgtgaatcc agaaattttt 420
gctaccagtt cttggcagcc acctgtccac gacctgagtg atgagcaact gcaacgttta 480
aacaacattg tcagaaagag tttcctgttt agccagctag aagatgaagc actacgaaca 540
gtgatatatg ccttggaaga gaagaaagtg ccacgcggaa cagagataat caaacaaggc 600
gacgaaggtg attactttta cgttttggaa agcggtgagg tcacatttgt tgtcaatgga 660
gagactaaag gccaaggaaa gtctgggtca acctttggtg aacttgcact gatgtataac 720
tcgccgcggg cggccaccgt gatttctagt caggactgtg ttctttgggc acttgatcgt 780
atgacgttta gaagaatttt acttgaaggt acagccaaga gacgtgcgat gtatgatggg 840
tttctcaagg atgttccagt gttacgctgt ctcaactcct atgaacgtaa taagctcgct 900
gatgctttag aatctgagac ttacaacaaa ggcgacacga tcatccgtga aggcgaacca 960
ggagaaaact tttattttat tgaacaaggt gaagctgaag tgtttaaaga aggtgaagga 1020
catatggcaa cattgggcaa aggtgattac tttggcgaac tcgctctgtt gaacgacctt 1080
ccacgtcaag ctactgtcgt tgctaaaagt gacgtgatca aggttgttac cctagataag 1140
aatggattcc agagattgct tgggccagca attgaggttc tcaagctgca agatcccacc 1200
aagatctag 1209
<210> 3
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> eGFP基因
<400> 3
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 4
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> eGFP
<400> 4
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 5
<211> 1233
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Phy基因
<400> 5
cagtccgaac ctgcgttgaa actggagtct gtcgttatcg tctccagaca tggtgtcaga 60
gcacctacca aggctactca gctgatgcaa gacgttactc ctgatgcttg gcctacttgg 120
cctgtcaaac tgggttggct gactcctaga ggtggtgagc tgattgctta cttgggtcac 180
taccaaagac agagactggt tgctgacggt ctgttggcta agaagggttg tcctcagtct 240
ggtcaggtcg ctatcatcgc tgatgttgac gagagaacca gaaagactgg tgaagccttc 300
gctgctggtc tggctcctga ctgtgctatc actgtccata ctcaggctga cacctcctct 360
cctgatcctc tgttcaatcc tctgaagact ggtgtctgtc aactggacaa cgctaacgtc 420
actgacgcta tcctggaaag agctggtggt tccattgctg acttcactgg tcactaccaa 480
actgctttca gagaactgga aagagtcctg aactttcctc aatccaactt gtgcttgaag 540
agagagaaac aggacgaatc ctgtaacttg actcaggctc tgccttctga actgaaggtc 600
tctgctgact gtgtctcctt gactggtgct gtctccttgg cttccatgct gactgaaatc 660
ttcttgctgc aacaagctca aggtatgcct gaacctggtt ggggtagaat caccgactct 720
catcaatgga acaccttgct gtccttgcac aatgctcagt tcgacttgct tcagagaact 780
cctgaagttg ctagatccag agctactcct ctgttggacc tgatcaagac tgctctgact 840
cctcatcctc ctcagaagca agcctatggt gtcactcttc ctacctctgt tctgttcatt 900
gctggtcacg acaccaatct tgccaacttg ggtggtgctc tggaactcaa ctggaccttg 960
cctggtcagc ctgacaatac tcctcctggt ggtgaactgg tcttcgaaag atggagaaga 1020
ctgtctgaca actctcagtg gattcaggtc tccttggtct tccagacctt gcagcagatg 1080
agagacaaga ctcctctgtc cttgaacact cctcctggtg aagttaagct gactctggct 1140
ggatgtgaag agagaaacgc tcaaggtatg tgctccttgg ctggtttcac tcagattgtc 1200
aacgaagcca gaatccctgc ctgttccctg taa 1233
<210> 6
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Phy
<400> 6
Gln Ser Glu Pro Ala Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Ser
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile
130 135 140
Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Tyr Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Asn Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Cys Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ZA-Bcy1-S
<400> 7
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<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ZA-Bcy1-A
<400> 8
ttttgttcgg gcccaagctg ctagatcttg gtgggatctt g 41
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ZA-S
<400> 9
cagcttgggc ccgaacaaaa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ZA-A
<400> 10
gctgggccac gtgaattcct 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 5’AOX1
<400> 11
gactggttcc aattgacaag c 21

Claims (10)

1.一种毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用，其特征在于：
所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1为蛋白激酶A调节亚基，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
2.根据权利要求1所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用，其特征在于：
编码所述毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用，其特征在于：
所述的外源蛋白为增强型绿色荧光蛋白和植酸酶中的一种。
4.根据权利要求1～3任一项所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用，其特征在于：是将毕赤酵母翻译相关因子Bcy1表达于毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株，具体通过如下步骤实现：
(1)以载体pPICZA为模板，以SEQ ID No.9和SEQ ID No.10为引物进行PCR扩增，得到pPICZA线性片段；然后将pPICZA线性片段与毕赤酵母翻译相关因子Bcy1进行同源重组，得到重组载体pPICZA-Bcy1；
(2)将重组载体pPICZA-Bcy1转化至大肠杆菌感受态中，用含Zeocin的培养基进行筛选，再提取质粒转化至毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株中，得到重组表达工程菌。
5.根据权利要求4所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用，其特征在于：
步骤(2)中所述的毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株为能够表达外源蛋白增强型绿色荧光蛋白或植酸酶的毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株。
6.根据权利要求4所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1在外源蛋白表达中的应用，其特征在于：在步骤(2)之后还包括诱导表达的步骤；具体为：
将重组表达工程菌接种到培养基中培养至OD600为2.0～6.0，然后转至含有甲醇的诱导培养基中进行诱导表达，得到所述的外源蛋白；
所述的培养基为BMGY培养基，其组成成分为：1％(v/v)甘油，2％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)酵母提取物，1.34％(w/v)酵母氮源，100mM pH6.0磷酸钾缓冲液；
所述的培养基中培养的条件为：30℃震荡培养16～20小时；
所述的诱导培养基为BMMY培养基，其组成成分为：1％(v/v)甲醇，2％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)酵母提取物，1.34％(w/v)酵母氮源，100mM pH6.0磷酸钾缓冲液；
所述的诱导培养基中甲醇的浓度为体积百分比10％；
所述的诱导表达的条件为：在30℃下诱导表达24～120小时。
7.含有毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的重组载体或重组表达工程菌在外源蛋白表达中的应用，其特征在于：
所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1为蛋白激酶A调节亚基，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示；
所述的外源蛋白为增强型绿色荧光蛋白和植酸酶中的一种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
编码所述毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述的含有毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的重组载体为将毕赤酵母翻译相关因子Bcy1连接到载体pPICZA获得；
所述的含有毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的重组表达工程菌为将含有毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的重组载体转化至毕赤酵母外源蛋白表达工程菌株获得。
10.毕赤酵母翻译相关因子Bcy1、以及含有毕赤酵母翻译相关因子Bcy1的重组载体或重组表达工程菌在促进毕赤酵母发酵稳定期的细胞生长、增加细胞生物量积累中的应用，其特征在于：
所述的毕赤酵母翻译相关因子Bcy1为蛋白激酶A调节亚基，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
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