CN111826355B

CN111826355B - 三分三p450酶及其在制备托品酮中的应用

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Publication number: CN111826355B
Application number: CN201910299176.4A
Authority: CN
Inventors: 肖友利; 尤文静; 平羽; 杨盟权
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2019-04-15
Publication date: 2021-11-26
Anticipated expiration: 2039-04-15
Also published as: CN111826355A

Abstract

本发明公开了一种三分三P450酶，该P450酶与细胞色素P450还原酶联合催化能够将4‑(1‑甲基‑2‑吡咯烷基)‑3‑氧代丁酸转化为托品酮。本发明的方法为环境友好型，反应条件温和，具有工业化开发前景。

Description

三分三P450酶及其在制备托品酮中的应用

技术领域

本发明属于生物合成和酶催化技术领域，具体地说，涉及一种三分三P450酶及其在制备托品酮中的应用。

背景技术

托品酮(Tropinone)是一个莨菪烷类生物碱，可用于合成阿托品硫酸盐等药物，其化学名称为8-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-酮，分子结构如式I所示。

托品酮目前主要从植物中提取得到。近年来发展的合成生物学技术，通过微生物菌株作为底盘细胞，将目标化合物生物合成途径相关基因导入，实现了植物来源的一些重要药用化合物的异源高效合成(Kotopka BJ,Li Y,Smolke CD.2018.Synthetic biologystrategies toward heterologous phytochemical production.Natural productreports.Li S,Li Y,Smolke CD.2018.Strategies for microbial synthesis of high-value phytochemicals.Nature chemistry 10(4):395-404.)，建立托品酮的生物合成方法不仅能弥补化学合成方法的不足之处，同时也为以托品酮为中间体的尼古丁及托品生物碱的途径解析及异源合成提供基础，对于大规模生产莨菪生物碱具有重要的经济意义。

茄科植物三分三(Anisodus acutangulus)是我国特有的产托品类生物碱的资源植物，又名三分七、野箊，其干燥品总生物碱含量高达1.2％，托品生物碱总含量比常见的一些茄科植物如颠茄、莨菪、曼陀罗等都要高(Kai G,Zhang A,Guo Y,Li L,Cui L,Luo X,LiuC,Xiao J.2012.Enhancing the production of tropane alkaloids in transgenicAnisodus acutangulus hairy root cultures by over-expressing tropinonereductase I and hyoscyamine-6β-hydroxylase.Molecular BioSystems 8(11):2883-2890.)，并且其转录组数据也被发表(Cui L,Huang F,Zhang D,Lin Y,Liao P,Zong J,KaiG.2015.Transcriptome exploration for further understanding of the tropanealkaloids biosynthesis in Anisodus acutangulus.Molecular Genetics&Genomics290(4):1367-1377.)，因此利用独特生物资源优势对于三分三中与托品酮的生物合成有关的酶类的研究非常重要。

众所周知，化学法合成存在环境污染大的问题，导致开发环境友好型的绿色制备工艺很有必要。因此具有反应条件温和、催化效率高、副产物少等优点的生物制备法比如生物酶催化法成为有吸引力和有前途的方法。

发明内容

我们对植物三分三中与托品酮的合成相关的酶类的功能进行了研究，发现一种三分三P450酶(命名为CYP82M3或者AaCYP82M3)分别和三种细胞色素P450还原酶(分别命名为CPR1、CPR2、CPR3或者AaCPR1、AaCPR2、AaCPR3)通过组合配对进行联合催化，可以高效地将式II所示的化合物4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸转化成托品酮I，其中P450酶与CPR1或CPR2的组合配对效果尤其突出。

这一发现丰富了现有的生物元件库，进一步完善了三分三莨菪生物碱的生物合成途径，可以为莨菪生物碱的途径解析及异源合成提供基础，促进重要药用生物碱的生物合成方法开发。

为了实现托品酮的生物合成，我们从三分三中筛选出一种氨基酸序列为SEQ IDNO:1的三分三细胞色素P450酶CYP82M3；三种细胞色素P450还原酶CPR1-3(氨基酸序列分别为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7)，进行体外联合催化底物4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的缩合反应，验证了其功能。由于大肠杆菌和酵母的遗传背景比较清晰，并且遗传操作容易，我们选其作为底盘细胞探究托品酮的体内合成，希望为工业生产托品酮及其衍生的重要生物碱的异源合成提供基础。

其中，SEQ ID NO:1的序列为：

MYDNFPFYDLQIILGVLLTFVVSIILWTRNWKSPKLPPKIPGSWPIIGHLRGFGDGENVPLARTFGKLSDQYGPIFTIKLGMFRYCVINNWEAAKDCFTIHDKELAARPISLAAEHYGYNYARFSFANYGPYYCQVRKLVLQNVLSSTRLEKVKHVRISEVEISIKELYSESSKVINISQWFEKLTLNIIVKMIAGKRYGSLEKDEEAQCFRRAFAKIMYLAGQFILYDSIPFQIFKYLDFQGHIKTMKQIYKDLDDILQSWVNEHMEKNKKVADDDEEQDCIDAMLSVTKPDDFKAYGYTRDTVIKATVLSMILDGSDTTAVHLTWVMSLLLNNPHVMKHAQEEIDNKVGTEKWVEESDIKDLVYLQAIVKEALRLYPPAPLLVPHEAVEDCTVAGYNIPKGTRLFPNAWKIQRDPRVYSEPDKFMPERFLDKHSNVDARGQHFEFIPFGSGRRSCPGINFATQVAHLTISRLIQGFTYGTPSNLPVDMTEGQGITMPKANPVEVVITPRLNSVLYEL(SEQID NO:1)。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种分离的多肽，所述的多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；

(c)与(a)限定的多肽序列有95％以上同源性，优选地98％以上同源性，更优地99％以上同源性，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(d)序列中含有(a)或(b)或(c)中所述多肽序列的衍生多肽。

为表述方便起见，将氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽命名为“三分三细胞色素P450酶”或者“三分三P450酶”或者“CYP82M3”或者“AaCYP82M3”。

本发明的第二个目的在于提供编码上述多肽的多核苷酸(或称基因)。上述的多核苷酸选自：

(A)编码上述多肽的多核苷酸；

(B)编码如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；

(C)核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸；

(D)核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的同源性≥95％，优选地≥98％，更优地≥99％的多核苷酸；

(E)与(A)-(D)任一所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

其中，编码SEQ ID NO:1氨基酸序列的多核苷酸优选为SEQ ID NO:2。

本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的载体比如质粒。

本发明的第四个目的在于提供转化了上述载体比如质粒的微生物。

优选地，上述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、枯草杆菌。更优选为酿酒酵母。

本发明的第四个目的在于提供上述多肽(比如三分三细胞色素P450酶)、或者其表达微生物在制托品酮中的用途。具体而言，本发明提供了一种制备托品酮的方法，包括如下步骤：以4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸为底物原料，在上述多肽(比如三分三P450酶)和一种细胞色素P450还原酶的联合催化下进行分子内缩合反应来制备出托品酮。

在上述制备托品酮的方法中，更优选上述多肽(比如三分三P450酶)与CPR1或CPR2进行组合配对来催化4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的转化反应。

在一种实施方式中，反应体系中还添加有二硫苏糖醇(DTT)。二硫苏糖醇作为还原剂，用于打断二硫键，保持酶中巯基的还原态，保护蛋白的稳定性。

优选地，上述反应体系中还添加有NADPH(还原型辅酶II，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)。NADPH是一种辅酶，也叫作还原氢，在化学反应中起传递电子的作用。

在一种实施方式中，上述细胞色素P450还原酶优选是三种CPR1-3(或称AaCPR1-3)中的一种，其中CPR1(即AaCPR1)的氨基酸序列为SEQ ID NO:3：

MESTSEKLSAFDFMAAIVKGGNIFDRLNSSLDSGDSSSTALLMENKDLMMILTTSVAVLIGCAVVLMWRRSSTSAKKVVEPPKLVVPKSVIEPEEIDDGKKKITIFFGTQTGTAEGFAKALAEEAKARYDKATFKVIDMDDYAADDEEYEEKLKKETFAFFFLATYGDGEPTDNAARFYKWFVEGKERGDYFKNLQYGVFGLGNRQYEHFNKIAKVVDELLVEQGGQRLVPVGLGDDDQCIEDDITAWRELLWPELDKVLLDGDDATAATPYTAAVLEYRVVIHEKSSFDNDLTTANGHANGHVIVDAQHPCRANVAVRKELHTPASDRSCTHLEFDIPGTGLAYETGDHVGVYCENFIETVEEAERLLNISPDTFFSIHTDKEDGTPLGGSSLPSPFPPCTLRTALTRYADLLSSPKKSALLTLAAFASDPNEADRLRYLASPAGKEEYAQWIIASQRSLLEVMAEFPSAKPSVGVFFASVAPRLQPRFYSISSSPRMAPSRIHVTCALVYDKMPTGRVHKGVCSTWMKNAIPLEESLSCSTAPIFVRQSNFKLPADNKIPIIMIGPGTGLAPFRGFLQERLASKKEGAELGPAVLFFGCRNRQMDYIYQDELDNFLEAGALSELVVAFSREGPNKEYVQHKMSEKAADIWNMISQGGYVYVCGDAKGMARDVHRTLNTIAQNQGSLDSSKAESLVKNLQTTGRYLRDVW(SEQ ID NO:3)；

CPR2(即AaCPR2)的氨基酸序列为SEQ ID NO:5：

MESTSEKLSPFDFMAAIFKGGKIFDKLNSSLDSGDSSSSASLAALLMENKDLMMILTTSVAVLIGCAVVLMWRRSSTSAKKVMEPTKLVVPKSVIEPEDINDGKKKITIFFGTQTGTAEGFAKALAEEAKARYDKATFKVIDMDDYAADDEEYEEKLKKETFAFFFLATYGDGEPTDNAARFYKWFVEGKERGDYFKNLQYGVFGLGNRQYEHFNKIAKVVDELLVEQGGQRLVPVGLGDDDQCIEDDITAWRELLWPELDKVLLDGDDATAATPYTAAVLEYRVVIHEKSSFDNDLTTANGHANGHVIVDAQHPCRANVAVRKELHTPASDRSCTHLEFDIPGTGLAYETGDHVGVYCENFIETVEEAERLLNISPDTFFSIHTDKEDGTPLGGSSLPSPFPPCTLRTALTRYADLLSSPKKSALLTLAAFASDPNEADRLRYLASPAGKEEYAQWIIASQRSLLEVMAEFPSAKPSVGVFFASVAPRLQPRFYSISSSPRMAPSRIHVTCALVYDKMPTGRVHKGVCSTWMKNAIPLEESLSCSTAPIFVRQSNFKLPADNKIPIIMIGPGTGLAPFRGFLQERLASKKEGAELGPAVLFFGCRNRQMDYIYQDELDNFLEAGALSELVVAFSREGPNKEYVQHKMSEKAADIWNMISQGGYVYVCGDAKGMARDVHRTLHIIAHDQGSLDNSKAESLVKNLQTTGRYLRDVW(SEQ ID NO:5)；

CPR3(即AaCPR3)的氨基酸序列为SEQ ID NO:7：

MESSSELVRSVESAIGVSLGSDTVLVLLTTSFAVIVGLIVLFFKRSSDRSKEVKPVVFPKSLQVEPEEETEPEPGKVKVTVFFGTQTGTAEGFAKALSEEIKARYEKAVVKVVDMDDYAADDELYEEKLKKETVAFFMVATYGDGEPTDNAARFYKWFTEGQERGAWLQHLTYGVFGLGNRQYEHFNKIGKVIDEQLSEQGAKRLVPVGLGDDDQCIEDDFAAWREQLWPELDQILKDEDDANSAATPYTAAIPEYRLVIHDTTMSLEDKHANMANGNTTYDIHHPCKVNVAIQRELHTPESDRSCLHLEFDISGTGISYETGDHVGVYAENSEETVEEAARLLGQSLDLVFSIHTDKEDGTSVGGSLPPPFPGPCTLRAALARYTDLLNPPRKATLVALAAHAAEPSEAEKLKFLASPQGKDEYSQWIVASQRSLVEVMAEFPSAKPPLGVFFAAVAPRLQPRYYSISSSPRFAPARVHVTCALVYGPTPTGRIHKGVCSTWMKNAVPLKKSHNCSSAPIFIRPSNFKLPADPSIPIVMVGPGTGLAPFRGFLQERAALKEDGAQLGPALLFFGCRNRRTDFIYEEELQSFVDQGVISELIIAFSREGPQKEYVQHKMMEKASQVWSSISQEGYLYVCGDAKGMARDVHRTLHTIVQEQEKADSTKAEAIVKKLQMDGRYLRDVW(SEQ ID NO:7)。

本发明还提供了编码上述三分三细胞色素P450还原酶CPR1-3的基因。

在一种优选的实施方式中，编码上述CPR1的基因是SEQ ID NO:4；编码上述CPR2的基因是SEQ ID NO:6；编码上述CPR3的基因是SEQ ID NO:8。

本发明还提供了用于表达上述三分三细胞色素P450还原酶CPR1-3的微生物。

优选地，上述微生物选自大肠杆菌和酿酒酵母。更优选为酿酒酵母。

在一种优选的实施方式中，上述多肽(比如三分三P450酶)和一种细胞色素P450还原酶CPR1-3在同一个微生物中共表达。

可选地，上述多肽(比如三分三P450酶)和一种细胞色素P450还原酶CPR1-3也可以在不同的微生物中分别表达。

相应地，就催化体系而言，上述多肽(比如三分三P450酶)和一种细胞色素P450还原酶CPR1-3的组合可以是酶+酶的形式、酶+菌体的形式、或者菌体+菌体的形式。

上述的酶催化反应的反应温度优选为25-35℃、优选30℃，并且在pH6.5-7.5、优选pH6.8的反应体系中进行缩合反应。优选反应体系为缓冲溶液体系。

当上述微生物共表达上述多肽(比如三分三P450酶)和一种细胞色素P450还原酶CPR1-3时，优选将多肽(比如三分三P450酶)基因和CPR1-3基因构建在不同的质粒上，转化入微生物，构建成同时表达两类酶的基因工程菌。

当用于共表达上述多肽(比如三分三P450酶)和一种CPR1-3的微生物是酿酒酵母时，可采用酵母菌By4742作为宿主菌。这种情况下，可以将上述多肽(比如三分三P450酶)基因克隆于质粒pESC-URA上，并将CPR1-3基因克隆于质粒pESC-HIS上。

当上述微生物是酿酒酵母时，优选培养基是YPD培养基、或者任何适合于酿酒酵母发酵的培养基。

本发明的双酶联合催化体系可以“一锅法”催化4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸转化为托品酮，完善了三分三莨菪生物碱的生物合成途径，具有工业化开发和应用前景。

附图说明

图1显示了AaCYP82M3和AaCPR1-3基因片段的琼脂糖凝胶电泳照片。

图2显示了的液质联用仪(LC/MS)检测两类酶AaCYP82M3和AaCPR1-3催化反应产物托品酮的质谱图。

图3显示了托品酮的离子碎片结果。其中，A是产物托品酮标品的二级碎片；B是AaCYP82M3-AaCPR1组合催化的产物离子碎片结果；C是AaCYP82M3-AaCPR2组合催化的产物离子碎片结果；D是AaCYP82M3-AaCPR3组合催化的产物离子碎片结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

本文的实施例中，如果对于操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温。

本发明通过两种酶组成的联合催化体系“一锅法”催化4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸进行反应，合成得到托品酮。其中术语“联合催化体系”是指AaCYP82M3与AaCPR1-3的组合，包括但不限于酶表达菌株的组合。

需说明的是，本文中AaCPR1-3表示三种细胞色素P450还原酶AaCPR(或称CPR)中的一种即AaCPR1或AaCPR2或AaCPR3，并不是指它们中两种或三种的混合物。

当作为生物催化剂用于生产托品酮时，本发明的酶AaCYP82M3和AaCPR1-3可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等。而且这些酶的分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体，包括冻融的菌体、固定化的菌体。

在本文中，有时为了描述简便，会将蛋白比如CYP82M3蛋白质名称与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。例如，对于CYP82M3(基因)，用于描述单氧酶功能或类别时，指的是蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该P450酶的基因，以此类推，这是本领域技术人员容易理解的。

本发明中使用的酶AaCYP82M3和AaCPR1-3序列明确，因此本领域技术人员能够容易地获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

实施例

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由上海桑尼生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，pH 7.0。

YPD培养基：10.0g/L酵母提取物，20.0g/L蛋白胨，20.0g/L葡萄糖。

YPAD培养基：10.0g/L酵母提取物、20.0g/L蛋白胨、20.0g/L D-葡萄糖、0.4g/L硫酸腺嘌呤。

LC-MS测定条件：用等体积的甲醇150μL去除蛋白，蜗旋震荡，12000rpm离心5min，上清浓缩，后用100μL 50％MeOH溶解，过0.22μm滤膜后进行质谱分析。仪器型号为液相-质谱联用仪为Agilent 1290 UHPLC-Agilent 6545 Q-TOF ESI质谱。采用色谱柱Agilent C18(4.6×150mm,3.5μm)；柱温：30℃；流动相A：0.1％甲酸，有机相B：乙腈；流速：0.25mL/min；进样量：2μL。

实施例1三分三细胞色素P450和细胞色素P450还原酶基因的克隆

1.1总RNA的提取与检测

打开超净台和紫外灯，用乙醇烧研钵、钥匙、剪刀。剪下三分三毛状根100mg，液氮中将组织研磨成粉末，分装至Ep管中，液氮挥发后加1ml Trizol-x-100，立即用力震荡或用移液器吹吸5-8次(没有块状物为止)，室温静置5min；用等体积氯仿抽提2次，7500g离心15min；上清液加入等体积提前预冷的异丙醇，混匀后室温放置30min，4℃、10000g离心10min；沉淀加入1ml 75％乙醇进行清洗，4℃、10000g离心10min；沉淀室温干燥10min后溶于25μL DEPC处理的水中，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用Eppendorf核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度。置于-80℃冰箱备用。

1.2反转录合成cDNA

采用TakaRa公司提供的PrimeScript反转录试剂盒，合成三分三mRNA第一条互补链cDNA。

1.3三分三细胞色素P450(AaCYP82M3)和细胞色素P450还原酶(AaCPR1-3)基因的克隆

从NCBI中搜索三分三基因相关的核苷酸序列和EST序列，通过比对分析，利用vector NTI软件设计4对扩增引物，如表1所示。

表1扩增所需引物

其中，F是正向引物；R是反向引物。

以三分三的cDNA为模板，按照以下体系[5×phusion buffer 4.0μL，dNTP(2.5mM)1.6μL，引物(2μM)各2μL，DMSO 0.6μL，cDNA 0.5μL，Phusion DNA聚合酶0.2μL，补加ddH₂O至终体积20.0μL]扩增AaPYKS基因，反应程序：98℃预变性30s，98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸1min 30s，30个循环，72℃终延伸5min，16℃保存。扩增的基因片段的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。利用Axygen公司的Agarose Gel Fragment Recovery KitVer.2.0纯化PCR产物，然后克隆至pMD19-T载体，筛选阳性克隆提取的质粒送桑尼公司测序，获得细胞色素P450(AaCYP82M3)及细胞色素P450还原酶(AaCPR1-3)相关基因序列(SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8)。

实施例2真核表达载体的构建

2.1克隆AaCYP82M3以及AaCPR1-3基因：使用Axygen的质粒抽提试剂盒抽提测序正确的T载体，以T载体中的AaCYP82M3以及AaCPR1-3基因为模板，利用表1引物，进行PCR扩增，按照以下体系〔5×phusion缓冲液4.0μL，dNTP(2.5mM)1.6μL，引物(2μM)各2μL，DMSO 0.6μL，cDNA 0.5μL，Phusion DNA聚合酶0.2μL，补加ddH₂O至终体积20.0μL〕扩增基因，反应程序：98℃预变性30s，98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，72℃终延伸5min，使用Axygen的胶回收试剂进行回收，得到相应的片段。

2.2基因双酶切：将AaCYP82M3的PCR产物，经限制性内切酶BamHI和KpnI于37℃酶切2h；将AaCPR1的PCR产物，经限制性内切酶BamHI和XhoI于37℃酶切2h；将AaCPR2的PCR产物，经限制性内切酶BamHI和XhoI于37℃酶切2h；将AaCPR3的PCR产物，经限制性内切酶BamHI和XhoI于37℃酶切2h。分别将上述酶切产物进行胶回收。

2.3表达质粒双酶切：pESC-URA经限制性内切酶BamHI和KpnI于37℃酶切2h；pESC-HIS经限制性内切酶BamHI和XhoI于37℃酶切2h。

2.4连接：利用T4DNA连接酶，将酶切后的质粒及基因于20℃连接2h，转化DH5α感受态细胞(购买自南京诺唯赞生物科技有限公司的商品化感受态细胞)，涂布氨苄霉素LB平板，过夜培养。

2.5菌落PCR验证：利用表1引物进行PCR验证转化子，PCR体系如下([5×phusionbuffer 4.0μL，dNTP(2.5mM)1.6μL，引物(2μM)各2μL，DMSO 0.6μL，cDNA 0.5μL，PhusionDNA聚合酶0.2μL，补加ddH₂O至终体积20.0μL]扩增基因，反应程序：98℃预变性30s，98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸1min 30s，30个循环，72℃终延伸5min，)。阳性菌接入LB液体试管，使用Axygen的质粒抽提试剂盒抽提质粒进行测序，从而得到正确的表达质粒。

实施例3 AaCYP82M3和AaCPR1-3表达菌株的构建

酿酒酵母菌By4742在YPD板上划线，30℃培养2天；挑酵母菌单菌落接至5mL YPAD液体培养基中，30℃，200rpm培养过夜；将酵母菌液稀释10倍，测OD₆₀₀，此时OD₆₀₀应为0.4-0.5(表示生长良好)。按比例1:20到1:25转接到2*YPAD(生长速度快)，50mL培养，使起始OD₆₀₀小于等于0.2；在30℃，200rpm培养至OD₆₀₀为0.5，约4-5个小时；-20℃冻存的载体DNA(鱼精DNA)100℃变性5分钟后，立刻插入冰里(保持单链)。室温下1,000g离心5分钟收集菌体，用1/2体积无菌水重悬(如50mL菌液用25mL无菌水重悬)离心；1/2体积无菌水再洗一次，1,000g离心5分钟离心收集菌体。用2mL TE/LiAc重悬后，10*200μL每管分装备用；在1.5mLEP管中加入1-5μg实施例2中构建得到的质粒DNA，200μg鲑鱼精DNA(变性的，2mg/ml)加入200μL感受态细胞，轻弹混匀，加入600μL PEG/LiAC，轻弹混匀；30℃，200rpm，30min复苏，加入70μL DMSO温和混匀。42℃热激15min，每5-10min，间歇轻弹混匀，冰上2min，1000g离心3min。弃上清，用液体200μL H₂O培养基重悬，涂板在相应的缺陷性培养基(即，不含组氨酸和尿嘧啶的SD培养基)中进行筛选，筛选出阳性克隆株。

实施例4酿酒酵母的微粒体的提取

从缺陷性培养基上挑取单菌落，接种到2mL SD液体培养基(6.7g/L无氨基的酵母氮源，20g/L葡萄糖，1.3g氨基酸粉末，缺陷性培养基中不含组氨酸和尿嘧啶)中培养过夜，按比例1：50稀释转接到200mLSD培养基中，30℃，200rpm培养至OD₆₀₀约为0.6。离心后收集细胞，转接到200mL SG液体培养基(6.7g/L无氨基的酵母氮源，20g/L半乳糖，1.3g氨基酸粉末，缺陷性培养基中不含组氨酸和尿嘧啶)中培养过夜，继续培养36小时，收集细胞。细胞用1/10体积的磷酸溶液进行重悬，压榨破碎，于4℃，15000g离心20min，取上清后利用超速离心机4℃，100,000g离心60min，取沉淀，利用磷酸溶液进行重悬，得到包含AaCYP82M3和AaCPR1-3蛋白质的微粒体，分装后放置-80℃，待检测活性。

实施例5酿酒酵母微粒体的活性检测

在磷酸缓冲液(10mM，pH 7.0)中配制酶反应体系，取500μg粗酶液(即包含AaCYP82M3和AaCPR1-3的酿酒酵母微粒体)，加入1mM DTT、1mM NADPH，0.2mM 4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸，至体积150μL。于30℃反应过夜后，用等体积的甲醇沉淀蛋白，12000g离心5min，上清过0.22μm滤膜后利用高分辨质谱进行检测。

检测结果参见图2和图3，图2显示了AaCYP82M3和AaCPR1-3催化4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸反应生成目标产物托品酮。图3的离子碎片验证了产物是目标化合物托品酮。

实施例5的结果表明，本发明的三分三细胞色素P450(AaCYP82M3)和细胞色素P450还原酶(AaCPR1-3)能够有效地催化4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸反应并转化成托品酮。本领域技术人员显然容易理解，与化学合成法相比，本发明的生物合成法具有绿色环保的天然优势，因而具有工业化开发和应用前景。

还需说明的是，本说明书中对先前公开的文献的列举和论述不应视为承认该文献是现有技术或者是公知常识。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 三分三P450酶及其在制备托品酮中的应用

<130> SHPI1910089

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 519

<212> PRT

<213> Anisodus acutangulus

<400> 1

Met Tyr Asp Asn Phe Pro Phe Tyr Asp Leu Gln Ile Ile Leu Gly Val

1 5 10 15

Leu Leu Thr Phe Val Val Ser Ile Ile Leu Trp Thr Arg Asn Trp Lys

20 25 30

Ser Pro Lys Leu Pro Pro Lys Ile Pro Gly Ser Trp Pro Ile Ile Gly

35 40 45

His Leu Arg Gly Phe Gly Asp Gly Glu Asn Val Pro Leu Ala Arg Thr

50 55 60

Phe Gly Lys Leu Ser Asp Gln Tyr Gly Pro Ile Phe Thr Ile Lys Leu

65 70 75 80

Gly Met Phe Arg Tyr Cys Val Ile Asn Asn Trp Glu Ala Ala Lys Asp

85 90 95

Cys Phe Thr Ile His Asp Lys Glu Leu Ala Ala Arg Pro Ile Ser Leu

100 105 110

Ala Ala Glu His Tyr Gly Tyr Asn Tyr Ala Arg Phe Ser Phe Ala Asn

115 120 125

Tyr Gly Pro Tyr Tyr Cys Gln Val Arg Lys Leu Val Leu Gln Asn Val

130 135 140

Leu Ser Ser Thr Arg Leu Glu Lys Val Lys His Val Arg Ile Ser Glu

145 150 155 160

Val Glu Ile Ser Ile Lys Glu Leu Tyr Ser Glu Ser Ser Lys Val Ile

165 170 175

Asn Ile Ser Gln Trp Phe Glu Lys Leu Thr Leu Asn Ile Ile Val Lys

180 185 190

Met Ile Ala Gly Lys Arg Tyr Gly Ser Leu Glu Lys Asp Glu Glu Ala

195 200 205

Gln Cys Phe Arg Arg Ala Phe Ala Lys Ile Met Tyr Leu Ala Gly Gln

210 215 220

Phe Ile Leu Tyr Asp Ser Ile Pro Phe Gln Ile Phe Lys Tyr Leu Asp

225 230 235 240

Phe Gln Gly His Ile Lys Thr Met Lys Gln Ile Tyr Lys Asp Leu Asp

245 250 255

Asp Ile Leu Gln Ser Trp Val Asn Glu His Met Glu Lys Asn Lys Lys

260 265 270

Val Ala Asp Asp Asp Glu Glu Gln Asp Cys Ile Asp Ala Met Leu Ser

275 280 285

Val Thr Lys Pro Asp Asp Phe Lys Ala Tyr Gly Tyr Thr Arg Asp Thr

290 295 300

Val Ile Lys Ala Thr Val Leu Ser Met Ile Leu Asp Gly Ser Asp Thr

305 310 315 320

Thr Ala Val His Leu Thr Trp Val Met Ser Leu Leu Leu Asn Asn Pro

325 330 335

His Val Met Lys His Ala Gln Glu Glu Ile Asp Asn Lys Val Gly Thr

340 345 350

Glu Lys Trp Val Glu Glu Ser Asp Ile Lys Asp Leu Val Tyr Leu Gln

355 360 365

Ala Ile Val Lys Glu Ala Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Ala Pro Leu Leu

370 375 380

Val Pro His Glu Ala Val Glu Asp Cys Thr Val Ala Gly Tyr Asn Ile

385 390 395 400

Pro Lys Gly Thr Arg Leu Phe Pro Asn Ala Trp Lys Ile Gln Arg Asp

405 410 415

Pro Arg Val Tyr Ser Glu Pro Asp Lys Phe Met Pro Glu Arg Phe Leu

420 425 430

Asp Lys His Ser Asn Val Asp Ala Arg Gly Gln His Phe Glu Phe Ile

435 440 445

Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Ile Asn Phe Ala Thr

450 455 460

Gln Val Ala His Leu Thr Ile Ser Arg Leu Ile Gln Gly Phe Thr Tyr

465 470 475 480

Gly Thr Pro Ser Asn Leu Pro Val Asp Met Thr Glu Gly Gln Gly Ile

485 490 495

Thr Met Pro Lys Ala Asn Pro Val Glu Val Val Ile Thr Pro Arg Leu

500 505 510

Asn Ser Val Leu Tyr Glu Leu

515

<210> 2

<211> 1560

<212> DNA

<213> Anisodus acutangulus

<400> 2

atgtatgata attttccctt ctatgatctg caaattatac ttggagtcct tctaactttt 60

gttgtatcaa tcattctatg gacaagaaat tggaaaagtc caaaactacc ccccaaaatc 120

cctggatcat ggccaattat aggccatctc cgtggttttg gcgatggcga aaacgtccct 180

ctagcacgaa cattcggaaa attatccgat caatatggtc caattttcac tattaagctt 240

ggcatgtttc gttattgtgt gattaataat tgggaagcag ctaaagattg cttcacaatt 300

catgataaag aactcgctgc tagaccaatt agtctagcag ctgaacatta tggctataat 360

tacgcaagat tttcttttgc taattatggt ccatattatt gccaagtacg aaaactcgtg 420

ttacaaaatg ttctttctag tactagactt gaaaaagtca aacatgtccg aatttccgag 480

gtggaaatta gcatcaaaga attatatagt gaaagttcca aagtgattaa tattagtcaa 540

tggttcgaaa aattgacttt gaatataatt gtgaagatga ttgctgggaa aagatatgga 600

tctttggaga aagatgaaga ggcacaatgt tttagaaggg cttttgctaa gataatgtat 660

cttgctgggc aattcatttt atatgactct attccgttcc aaattttcaa atatttggat 720

tttcaagggc atattaagac catgaagcaa atttacaagg acttggatga tattcttcaa 780

agttgggtta atgaacatat ggagaaaaat aagaaggttg cagatgatga tgaagaacaa 840

gattgtatag atgcaatgct ttcagtgaca aagcctgatg atttcaaagc ctatggttat 900

acacgagata cagttatcaa ggcaactgta ttgagcatga tattggatgg ttcagataca 960

actgcagttc acctaacatg ggtcatgtcc ctattattga acaatcctca cgtcatgaaa 1020

catgcccaag aagaaataga caacaaagtt ggtacagaaa aatgggttga agaatccgat 1080

atcaaagatc ttgtctatct ccaagctatt gttaaagaag cgttgcgctt atatccacca 1140

gcacctttgt tagtcccaca cgaagctgtg gaagattgta ccgtggcagg gtacaacatc 1200

ccaaagggta ctcgtttgtt cccgaacgca tggaagatac aacgagaccc tcgggtttat 1260

tcagagcccg ataagttcat gccagagaga ttcttagaca aacattcgaa tgtggatgct 1320

cgtggtcagc attttgagtt catcccgttt ggttctggaa gacggtcttg tcctggaatt 1380

aattttgcaa cgcaagtggc gcatctcaca attagtcgat taattcaagg atttacctat 1440

ggtacaccat caaatttgcc agttgatatg actgaaggtc aaggtattac tatgcctaaa 1500

gcaaatcctg tggaagttgt aatcaccccg cgtttgaatt ctgtgcttta tgaactttga 1560

<210> 3

<211> 711

<212> PRT

<213> Anisodus acutangulus

<400> 3

Met Glu Ser Thr Ser Glu Lys Leu Ser Ala Phe Asp Phe Met Ala Ala

1 5 10 15

Ile Val Lys Gly Gly Asn Ile Phe Asp Arg Leu Asn Ser Ser Leu Asp

20 25 30

Ser Gly Asp Ser Ser Ser Thr Ala Leu Leu Met Glu Asn Lys Asp Leu

35 40 45

Met Met Ile Leu Thr Thr Ser Val Ala Val Leu Ile Gly Cys Ala Val

50 55 60

Val Leu Met Trp Arg Arg Ser Ser Thr Ser Ala Lys Lys Val Val Glu

65 70 75 80

Pro Pro Lys Leu Val Val Pro Lys Ser Val Ile Glu Pro Glu Glu Ile

85 90 95

Asp Asp Gly Lys Lys Lys Ile Thr Ile Phe Phe Gly Thr Gln Thr Gly

100 105 110

Thr Ala Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Ala Glu Glu Ala Lys Ala Arg

115 120 125

Tyr Asp Lys Ala Thr Phe Lys Val Ile Asp Met Asp Asp Tyr Ala Ala

130 135 140

Asp Asp Glu Glu Tyr Glu Glu Lys Leu Lys Lys Glu Thr Phe Ala Phe

145 150 155 160

Phe Phe Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr Asp Asn Ala Ala

165 170 175

Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Val Glu Gly Lys Glu Arg Gly Asp Tyr Phe

180 185 190

Lys Asn Leu Gln Tyr Gly Val Phe Gly Leu Gly Asn Arg Gln Tyr Glu

195 200 205

His Phe Asn Lys Ile Ala Lys Val Val Asp Glu Leu Leu Val Glu Gln

210 215 220

Gly Gly Gln Arg Leu Val Pro Val Gly Leu Gly Asp Asp Asp Gln Cys

225 230 235 240

Ile Glu Asp Asp Ile Thr Ala Trp Arg Glu Leu Leu Trp Pro Glu Leu

245 250 255

Asp Lys Val Leu Leu Asp Gly Asp Asp Ala Thr Ala Ala Thr Pro Tyr

260 265 270

Thr Ala Ala Val Leu Glu Tyr Arg Val Val Ile His Glu Lys Ser Ser

275 280 285

Phe Asp Asn Asp Leu Thr Thr Ala Asn Gly His Ala Asn Gly His Val

290 295 300

Ile Val Asp Ala Gln His Pro Cys Arg Ala Asn Val Ala Val Arg Lys

305 310 315 320

Glu Leu His Thr Pro Ala Ser Asp Arg Ser Cys Thr His Leu Glu Phe

325 330 335

Asp Ile Pro Gly Thr Gly Leu Ala Tyr Glu Thr Gly Asp His Val Gly

340 345 350

Val Tyr Cys Glu Asn Phe Ile Glu Thr Val Glu Glu Ala Glu Arg Leu

355 360 365

Leu Asn Ile Ser Pro Asp Thr Phe Phe Ser Ile His Thr Asp Lys Glu

370 375 380

Asp Gly Thr Pro Leu Gly Gly Ser Ser Leu Pro Ser Pro Phe Pro Pro

385 390 395 400

Cys Thr Leu Arg Thr Ala Leu Thr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ser Ser

405 410 415

Pro Lys Lys Ser Ala Leu Leu Thr Leu Ala Ala Phe Ala Ser Asp Pro

420 425 430

Asn Glu Ala Asp Arg Leu Arg Tyr Leu Ala Ser Pro Ala Gly Lys Glu

435 440 445

Glu Tyr Ala Gln Trp Ile Ile Ala Ser Gln Arg Ser Leu Leu Glu Val

450 455 460

Met Ala Glu Phe Pro Ser Ala Lys Pro Ser Val Gly Val Phe Phe Ala

465 470 475 480

Ser Val Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg Phe Tyr Ser Ile Ser Ser Ser

485 490 495

Pro Arg Met Ala Pro Ser Arg Ile His Val Thr Cys Ala Leu Val Tyr

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Met Lys Asn Ala Ile Pro Leu Glu Glu Ser Leu Ser Cys Ser Thr Ala

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Pro Ile Phe Val Arg Gln Ser Asn Phe Lys Leu Pro Ala Asp Asn Lys

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Gly Pro Ala Val Leu Phe Phe Gly Cys Arg Asn Arg Gln Met Asp Tyr

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Glu Leu Val Val Ala Phe Ser Arg Glu Gly Pro Asn Lys Glu Tyr Val

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Gln His Lys Met Ser Glu Lys Ala Ala Asp Ile Trp Asn Met Ile Ser

645 650 655

Gln Gly Gly Tyr Val Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys Gly Met Ala Arg

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Asp Val His Arg Thr Leu Asn Thr Ile Ala Gln Asn Gln Gly Ser Leu

675 680 685

Asp Ser Ser Lys Ala Glu Ser Leu Val Lys Asn Leu Gln Thr Thr Gly

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Arg Tyr Leu Arg Asp Val Trp

705 710

<210> 4

<211> 2136

<212> DNA

<213> Anisodus acutangulus

<400> 4

atggagtcga catcagaaaa actttctgct tttgatttta tggcagcgat cgttaaggga 60

ggaaatatat ttgatagact gaactcgtca ttagattctg gtgactcaag ttcgacagct 120

ttgttgatgg agaacaaaga tttgatgatg atattgacaa cctcggttgc tgttttaatt 180

ggatgtgcag ttgtcttgat gtggcggcgc tcctcgacat ctgctaagaa ggttgttgaa 240

ccaccgaaat tggtggttcc taagtcggtt atagaacctg aagagattga tgatggcaag 300

aagaaaatta ccatcttttt tggaacccag actggtacag cagaaggctt cgcaaaggca 360

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gattatgcgg ctgatgatga agagtatgaa gagaaattga agaaagaaac attcgcattc 480

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tggtttgtag agggaaaaga gaggggtgac tacttcaaga atcttcagta tggagtattt 600

gggcttggta acagacaata cgagcatttc aacaagattg ctaaagttgt ggatgaactt 660

ctggttgagc aaggtggaca gaggcttgtt ccagtgggtc ttggagatga tgaccaatgc 720

attgaagatg atattactgc atggcgtgaa ttactgtggc ctgaattgga taaggtgctt 780

cttgatgggg atgatgcaac tgctgcaact ccatatactg ctgcagtttt ggaatatagg 840

gttgttatcc atgaaaagtc cagctttgat aatgacttga ctaccgcaaa tggtcatgca 900

aatggacatg tcattgttga tgctcaacat ccttgcagag ctaatgttgc tgttaggaag 960

gaacttcaca ctcctgcttc tgatcgttct tgcactcatc tggagtttga cattcctggc 1020

actggacttg cgtatgaaac tggtgatcat gttggtgtgt actgtgaaaa ttttattgaa 1080

accgtggagg aagctgaaag gttacttaac atatcgccag acactttctt ttccattcac 1140

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tgcactttga gaacggcatt gactcggtat gctgatcttt tgagttctcc taaaaagtct 1260

gctttactta ctttagcggc atttgcttct gatccaaatg aagctgatcg attacgatat 1320

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cttcttgaag tcatggctga atttccttca gccaagcctt cagtcggtgt tttctttgct 1440

tctgttgctc ctcgcctaca accgagattc tactctatct catcatctcc taggatggcg 1500

ccatctagga ttcatgtcac ttgtgcactg gtttacgaca aaatgccaac tggacgagtt 1560

cacaagggtg tctgctcaac atggatgaag aacgctattc ctctagaaga aagcctttcc 1620

tgcagtacgg cacctatttt tgttcggcaa tcaaacttta aacttccagc tgataacaag 1680

attccaatca taatgattgg ccctggtact gggttggcac cattcagggg tttcctccag 1740

gaaagattag cttcgaagaa ggaaggagcc gagcttggtc ctgcagtgtt attttttgga 1800

tgcaggaacc gccaaatgga ctacatctat caagatgagt tagacaattt cctcgaggct 1860

ggtgcacttt ctgagctagt tgttgctttc tcacgtgaag gacctaacaa agaatacgtg 1920

caacataaaa tgtcagagaa ggctgcggac atctggaaca tgatttctca gggaggatat 1980

gtatatgtat gcggtgatgc taaaggcatg gctagggatg tccatcggac tcttaacact 2040

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<210> 5

<211> 715

<212> PRT

<213> Anisodus acutangulus

<400> 5

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Ile Phe Lys Gly Gly Lys Ile Phe Asp Lys Leu Asn Ser Ser Leu Asp

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Ser Gly Asp Ser Ser Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ala Leu Leu Met Glu

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Asn Lys Asp Leu Met Met Ile Leu Thr Thr Ser Val Ala Val Leu Ile

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Pro Glu Asp Ile Asn Asp Gly Lys Lys Lys Ile Thr Ile Phe Phe Gly

100 105 110

Thr Gln Thr Gly Thr Ala Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Ala Glu Glu

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Ala Lys Ala Arg Tyr Asp Lys Ala Thr Phe Lys Val Ile Asp Met Asp

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Asp Tyr Ala Ala Asp Asp Glu Glu Tyr Glu Glu Lys Leu Lys Lys Glu

145 150 155 160

Thr Phe Ala Phe Phe Phe Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu Pro Thr

165 170 175

Asp Asn Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Val Glu Gly Lys Glu Arg

180 185 190

Gly Asp Tyr Phe Lys Asn Leu Gln Tyr Gly Val Phe Gly Leu Gly Asn

195 200 205

Arg Gln Tyr Glu His Phe Asn Lys Ile Ala Lys Val Val Asp Glu Leu

210 215 220

Leu Val Glu Gln Gly Gly Gln Arg Leu Val Pro Val Gly Leu Gly Asp

225 230 235 240

Asp Asp Gln Cys Ile Glu Asp Asp Ile Thr Ala Trp Arg Glu Leu Leu

245 250 255

Trp Pro Glu Leu Asp Lys Val Leu Leu Asp Gly Asp Asp Ala Thr Ala

260 265 270

Ala Thr Pro Tyr Thr Ala Ala Val Leu Glu Tyr Arg Val Val Ile His

275 280 285

Glu Lys Ser Ser Phe Asp Asn Asp Leu Thr Thr Ala Asn Gly His Ala

290 295 300

Asn Gly His Val Ile Val Asp Ala Gln His Pro Cys Arg Ala Asn Val

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Ala Val Arg Lys Glu Leu His Thr Pro Ala Ser Asp Arg Ser Cys Thr

325 330 335

His Leu Glu Phe Asp Ile Pro Gly Thr Gly Leu Ala Tyr Glu Thr Gly

340 345 350

Asp His Val Gly Val Tyr Cys Glu Asn Phe Ile Glu Thr Val Glu Glu

355 360 365

Ala Glu Arg Leu Leu Asn Ile Ser Pro Asp Thr Phe Phe Ser Ile His

370 375 380

Thr Asp Lys Glu Asp Gly Thr Pro Leu Gly Gly Ser Ser Leu Pro Ser

385 390 395 400

Pro Phe Pro Pro Cys Thr Leu Arg Thr Ala Leu Thr Arg Tyr Ala Asp

405 410 415

Leu Leu Ser Ser Pro Lys Lys Ser Ala Leu Leu Thr Leu Ala Ala Phe

420 425 430

Ala Ser Asp Pro Asn Glu Ala Asp Arg Leu Arg Tyr Leu Ala Ser Pro

435 440 445

Ala Gly Lys Glu Glu Tyr Ala Gln Trp Ile Ile Ala Ser Gln Arg Ser

450 455 460

Leu Leu Glu Val Met Ala Glu Phe Pro Ser Ala Lys Pro Ser Val Gly

465 470 475 480

Val Phe Phe Ala Ser Val Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg Phe Tyr Ser

485 490 495

Ile Ser Ser Ser Pro Arg Met Ala Pro Ser Arg Ile His Val Thr Cys

500 505 510

Ala Leu Val Tyr Asp Lys Met Pro Thr Gly Arg Val His Lys Gly Val

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Cys Ser Thr Trp Met Lys Asn Ala Ile Pro Leu Glu Glu Ser Leu Ser

530 535 540

Cys Ser Thr Ala Pro Ile Phe Val Arg Gln Ser Asn Phe Lys Leu Pro

545 550 555 560

Ala Asp Asn Lys Ile Pro Ile Ile Met Ile Gly Pro Gly Thr Gly Leu

565 570 575

Ala Pro Phe Arg Gly Phe Leu Gln Glu Arg Leu Ala Ser Lys Lys Glu

580 585 590

Gly Ala Glu Leu Gly Pro Ala Val Leu Phe Phe Gly Cys Arg Asn Arg

595 600 605

Gln Met Asp Tyr Ile Tyr Gln Asp Glu Leu Asp Asn Phe Leu Glu Ala

610 615 620

Gly Ala Leu Ser Glu Leu Val Val Ala Phe Ser Arg Glu Gly Pro Asn

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Lys Glu Tyr Val Gln His Lys Met Ser Glu Lys Ala Ala Asp Ile Trp

645 650 655

Asn Met Ile Ser Gln Gly Gly Tyr Val Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys

660 665 670

Gly Met Ala Arg Asp Val His Arg Thr Leu His Ile Ile Ala His Asp

675 680 685

Gln Gly Ser Leu Asp Asn Ser Lys Ala Glu Ser Leu Val Lys Asn Leu

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Gln Thr Thr Gly Arg Tyr Leu Arg Asp Val Trp

705 710 715

<210> 6

<211> 2148

<212> DNA

<213> Anisodus acutangulus

<400> 6

atggagtcga catcagaaaa gctttctcct tttgatttta tggcagcaat ctttaaggga 60

ggaaagatat ttgataaact gaactcgtca ttagattctg gtgactcaag ttcatcagct 120

tcattggcag ctttgttgat ggagaacaaa gatttgatga tgatattgac aacctcggtt 180

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gataaggtgc ttcttgatgg ggatgatgca actgctgcaa ctccatatac tgctgcagtt 840

ttggaatata gggttgttat ccatgaaaag tccagctttg ataatgactt gactaccgca 900

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aattttattg aaaccgtgga ggaagctgaa aggttactta acatatcgcc agacactttc 1140

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cctaaaaagt ctgctttact tactttagcg gcatttgctt ctgatccaaa tgaagctgat 1320

cgattacgat atcttgcatc acccgctgga aaggaagaat atgctcagtg gataattgca 1380

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gttttctttg cttctgttgc tcctcgccta caaccgagat tctactctat ctcatcatct 1500

cctaggatgg cgccatctag gattcatgtc acttgtgcac tggtttacga caaaatgcca 1560

actggacgag ttcacaaggg tgtctgctca acatggatga agaacgctat tcctctagaa 1620

gaaagccttt cctgcagtac ggcacctatt tttgttcggc aatcaaactt taaacttcca 1680

gctgataaca agattccaat cataatgatt ggccctggta ctgggttggc accattcagg 1740

ggtttcctcc aggaaagatt agcttcgaag aaggaaggag ccgagcttgg tcctgcagtg 1800

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ttcctcgagg ctggtgcact ttctgagcta gttgttgctt tctcacgtga aggacctaac 1920

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cagggaggat atgtatatgt atgcggtgat gctaaaggca tggctaggga tgtccatcgg 2040

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<210> 7

<211> 686

<212> PRT

<213> Anisodus acutangulus

<400> 7

Met Glu Ser Ser Ser Glu Leu Val Arg Ser Val Glu Ser Ala Ile Gly

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Val Ser Leu Gly Ser Asp Thr Val Leu Val Leu Leu Thr Thr Ser Phe

20 25 30

Ala Val Ile Val Gly Leu Ile Val Leu Phe Phe Lys Arg Ser Ser Asp

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Glu Pro Glu Glu Glu Thr Glu Pro Glu Pro Gly Lys Val Lys Val Thr

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85 90 95

Leu Ser Glu Glu Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Lys Ala Val Val Lys Val

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Val Asp Met Asp Asp Tyr Ala Ala Asp Asp Glu Leu Tyr Glu Glu Lys

115 120 125

Leu Lys Lys Glu Thr Val Ala Phe Phe Met Val Ala Thr Tyr Gly Asp

130 135 140

Gly Glu Pro Thr Asp Asn Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Thr Glu

145 150 155 160

Gly Gln Glu Arg Gly Ala Trp Leu Gln His Leu Thr Tyr Gly Val Phe

165 170 175

Gly Leu Gly Asn Arg Gln Tyr Glu His Phe Asn Lys Ile Gly Lys Val

180 185 190

Ile Asp Glu Gln Leu Ser Glu Gln Gly Ala Lys Arg Leu Val Pro Val

195 200 205

Gly Leu Gly Asp Asp Asp Gln Cys Ile Glu Asp Asp Phe Ala Ala Trp

210 215 220

Arg Glu Gln Leu Trp Pro Glu Leu Asp Gln Ile Leu Lys Asp Glu Asp

225 230 235 240

Asp Ala Asn Ser Ala Ala Thr Pro Tyr Thr Ala Ala Ile Pro Glu Tyr

245 250 255

Arg Leu Val Ile His Asp Thr Thr Met Ser Leu Glu Asp Lys His Ala

260 265 270

Asn Met Ala Asn Gly Asn Thr Thr Tyr Asp Ile His His Pro Cys Lys

275 280 285

Val Asn Val Ala Ile Gln Arg Glu Leu His Thr Pro Glu Ser Asp Arg

290 295 300

Ser Cys Leu His Leu Glu Phe Asp Ile Ser Gly Thr Gly Ile Ser Tyr

305 310 315 320

Glu Thr Gly Asp His Val Gly Val Tyr Ala Glu Asn Ser Glu Glu Thr

325 330 335

Val Glu Glu Ala Ala Arg Leu Leu Gly Gln Ser Leu Asp Leu Val Phe

340 345 350

Ser Ile His Thr Asp Lys Glu Asp Gly Thr Ser Val Gly Gly Ser Leu

355 360 365

Pro Pro Pro Phe Pro Gly Pro Cys Thr Leu Arg Ala Ala Leu Ala Arg

370 375 380

Tyr Thr Asp Leu Leu Asn Pro Pro Arg Lys Ala Thr Leu Val Ala Leu

385 390 395 400

Ala Ala His Ala Ala Glu Pro Ser Glu Ala Glu Lys Leu Lys Phe Leu

405 410 415

Ala Ser Pro Gln Gly Lys Asp Glu Tyr Ser Gln Trp Ile Val Ala Ser

420 425 430

Gln Arg Ser Leu Val Glu Val Met Ala Glu Phe Pro Ser Ala Lys Pro

435 440 445

Pro Leu Gly Val Phe Phe Ala Ala Val Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg

450 455 460

Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro Arg Phe Ala Pro Ala Arg Val His

465 470 475 480

Val Thr Cys Ala Leu Val Tyr Gly Pro Thr Pro Thr Gly Arg Ile His

485 490 495

Lys Gly Val Cys Ser Thr Trp Met Lys Asn Ala Val Pro Leu Lys Lys

500 505 510

Ser His Asn Cys Ser Ser Ala Pro Ile Phe Ile Arg Pro Ser Asn Phe

515 520 525

Lys Leu Pro Ala Asp Pro Ser Ile Pro Ile Val Met Val Gly Pro Gly

530 535 540

Thr Gly Leu Ala Pro Phe Arg Gly Phe Leu Gln Glu Arg Ala Ala Leu

545 550 555 560

Lys Glu Asp Gly Ala Gln Leu Gly Pro Ala Leu Leu Phe Phe Gly Cys

565 570 575

Arg Asn Arg Arg Thr Asp Phe Ile Tyr Glu Glu Glu Leu Gln Ser Phe

580 585 590

Val Asp Gln Gly Val Ile Ser Glu Leu Ile Ile Ala Phe Ser Arg Glu

595 600 605

Gly Pro Gln Lys Glu Tyr Val Gln His Lys Met Met Glu Lys Ala Ser

610 615 620

Gln Val Trp Ser Ser Ile Ser Gln Glu Gly Tyr Leu Tyr Val Cys Gly

625 630 635 640

Asp Ala Lys Gly Met Ala Arg Asp Val His Arg Thr Leu His Thr Ile

645 650 655

Val Gln Glu Gln Glu Lys Ala Asp Ser Thr Lys Ala Glu Ala Ile Val

660 665 670

Lys Lys Leu Gln Met Asp Gly Arg Tyr Leu Arg Asp Val Trp

675 680 685

<210> 8

<211> 2061

<212> DNA

<213> Anisodus acutangulus

<400> 8

atggagtcga gttcggagtt ggtgagatcg gttgaatcgg caatcggggt atcattaggg 60

agcgatacgg tgttagtgct acttacgacg tcgtttgcgg tcatcgtagg gttaattgtg 120

ttgtttttta agagatcaag tgatcggagt aaagaagtga agcctgttgt gttcccgaag 180

tcgttacaag tggagccgga ggaggaaact gagccagaac ctggaaaagt taaggtcaca 240

gtgtttttcg gtactcaaac tggtactgct gagggttttg ccaaggcttt atcagaggag 300

ataaaagcaa gatatgagaa ggcagttgtg aaagttgtgg acatggatga ttatgctgcc 360

gatgatgagc tttacgagga gaagctgaag aaagaaacag ttgcattttt catggtggca 420

acctacgggg atggcgagcc aactgataat gctgcaaggt tttacaagtg gttcactgag 480

ggacaagaac ggggtgcgtg gctgcagcac cttacctatg gcgtttttgg cctgggtaat 540

cgccaatatg aacacttcaa caagattggg aaggtgatag atgaacaatt gagtgaacaa 600

ggtgcaaaac gtcttgtgcc tgttggcctt ggtgatgatg atcagtgcat tgaagatgat 660

tttgctgcct ggcgagaaca attatggcca gaattggatc aaatacttaa agacgaggat 720

gatgcaaatt ctgcagccac tccatataca gctgcaattc ctgaatatcg tttggttatc 780

catgatacca ctatgagtct tgaggataag catgcaaaca tggctaatgg aaataccaca 840

tatgacatcc accatccatg caaagtaaat gttgctattc aaagagagct tcacacacct 900

gagtctgatc gctcatgttt acatttggag tttgatatat ctggcactgg gatttcctat 960

gaaacaggag atcatgtggg tgtttatgct gaaaattctg aagaaactgt tgaagaagct 1020

gcgagattgc tggggcagtc attagattta gtattctcta ttcataccga caaggaggat 1080

ggtacatctg ttggaggctc gttaccccca ccttttcctg gtccttgcac tctgcgtgcg 1140

gcacttgctc gttacacaga tcttctgaat cctccacgga aggctacttt ggttgcattg 1200

gctgcccatg cagctgaacc tagtgaagca gaaaagctca agttcttggc atctccacag 1260

ggcaaggacg agtattctca atggattgtt gcaagtcaaa gaagtcttgt tgaagtaatg 1320

gctgagttcc cttcggcgaa gcctcccctt ggtgtatttt ttgcagcagt tgctcctcgt 1380

ttacagcctc gttattattc aatctcgtca tctcctcgat ttgcacctgc tagagtccat 1440

gtgacctgtg cactagtcta tggtccaaca cctactggcc gaattcataa aggagtgtgt 1500

tcgacttgga tgaagaatgc agttcctttg aagaaaagtc acaattgcag ctctgctccc 1560

attttcatta ggccatctaa tttcaaacta ccggctgacc cttcaattcc aattgtcatg 1620

gtggggcctg gtactggctt ggcaccattt aggggattcc tacaggaaag agcagctttg 1680

aaggaagatg gggctcaact cggtcctgct ttgttgtttt tcggttgtag gaatcgtaga 1740

acggatttta tttatgagga ggagcttcag agttttgtgg atcaaggtgt aatatcagag 1800

ctgattattg ccttttcaag ggaagggccg cagaaagagt atgtacaaca taaaatgatg 1860

gaaaaggctt cccaggtttg gagttcaatc tcccaggagg gatatctata tgtatgtggg 1920

gatgcaaaag ggatggccag agacgttcat cgtacactcc ataccatagt ccaggagcag 1980

gagaaggccg actcaaccaa agcagaggct attgtgaaga aactccaaat ggatggaaga 2040

tatctcaggg atgtgtggtg a 2061

Claims

1.一种分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO:1。

2.分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的多肽。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.包含如权利要求2所述多核苷酸的载体。

5.一种用于表达如权利要求1所述多肽的微生物，其特征在于，所述微生物转化了如权利要求4所述载体。

6.如权利要求5所述的微生物，其特征在于，所述微生物选自大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、枯草杆菌。

7.如权利要求1所述多肽、或者如权利要求5所述微生物在制备托品酮中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，以4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸为底物原料，在如权利要求1所述多肽和细胞色素P450还原酶的联合催化下进行反应来制备托品酮。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细胞色素P450还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或者SEQ ID NO:7。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，编码细胞色素P450还原酶SEQ ID NO:3的基因是SEQ ID NO:4；编码细胞色素P450还原酶SEQ ID NO:5的基因是SEQ ID NO:6；编码细胞色素P450还原酶SEQ ID NO:7的基因是SEQ ID NO:8。

11.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述权利要求1的多肽和细胞色素P450还原酶在同一个微生物中共表达；或者在不同的微生物中分别表达。

12.如权利要求8所述的应用，其特征在于，反应体系中还添加有二硫苏糖醇和NADPH。