CN101085987A

CN101085987A - 一种l－山梨糖脱氢酶及其编码基因与应用

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Publication number: CN101085987A
Application number: CNA2006100128053A
Authority: CN
Inventors: 贾茜; 吴洪涛; 郝爱鱼; 金奇; 修建新; 卫灿东; 刘爱兵; 耿文飞; 祝仕清; 杨丽霞; 孙君伟; 杨帆; 米造吉
Original assignee: NCPC New Drug Research and Development Co Ltd
Current assignee: Hebei Welcome Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2006-06-09
Filing date: 2006-06-09
Publication date: 2007-12-12
Anticipated expiration: 2026-06-09
Also published as: CN101085987B

Abstract

酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104(CCTCC No.M203094)经分离纯化，得到L－山梨糖脱氢酶(SDH)，其DNA序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：5，其在大肠杆菌表达系统进行了表达，重组表达产物rSDHA具有DCIP活性。可用于将L－山梨糖转化为L－山梨酮/2－KGA，或直接用该酶或各种表达系统表达的重组酶用于将L－山梨糖转化为L－山梨酮/2－KGA，最重要的是与rSNDH协同进行由L－山梨糖至2－KGA的转化，以及L－山梨酮至2－KGA的转化。

Description

一种L-山梨糖脱氢酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域中一种L-山梨糖脱氢酶(SDH)、其编码基因、表达方法与应用。

背景技术

目前已知多种微生物可以将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)，而2-KGA是维生素C生产的重要中间体，一些报道用微生物细胞裂解液将L-山梨糖转化为L-山梨酮。如美国专利3912592中报道氧化葡萄糖酸菌，假单孢菌，ACINETOBACTER杆菌，八叠球菌，链霉菌，SERRATIA，气杆菌，分支杆菌及拟青霉菌都有这样的转化特性。最早由Makover等(biotechnol bioeng17 1485-1514，1975)描述了假单孢菌PUTIDA ATCC 21812中的酶的特性，但未分离纯化。KITAMURA等(biotechnol bioeng 17 349-359，1975)报告了氧化葡萄糖酸菌(IFO3293)中SDH活性被PMS(phenazine methosulfate)、亚甲基蓝或钾铁氰化物等电子受体激活，但同样也未分离到此酶。在美国专利4916069(FUJIWARA等)从氧化葡萄糖酸菌中分离到SDH为膜结合蛋白，分子量约为58000，为单个分子，在辅酶存在下能氧化L-山梨糖至L-山梨酮，具有底物专一性。美国专利5753481(后续申请5861292，6197562)(NIWA等)由氧化葡萄糖酸菌T-100膜蛋白中分离到SDH及其基因，其分子量为58000，N端氨基酸序列为THR-SER-GLY-PHE-ASP-TYR-ILE-VAL-VAL-GLY-GLY-GLY-SER-ALA-。用E.COLI表达该基因得到的产物具有转化活性。在美国专利5437989(ASAKURA等)中称在氧化葡萄糖酸菌DSM4025 FERM BP-3812分离到与乙醇/醛脱氢酶同源的酶，在电子受体存在下，能将L-山梨糖转化为2-KGA。该酶分子量为130000/140000(凝胶过滤法测定)，由两个分子量分别为62,500-66,500daltons和60,500---64,500daltons的不同亚基组成。在文章“L-山梨糖脱氢酶的纯化及性质研究”(薛震役等)(《微生物学通报》2000年27(2))对氧化葡萄糖酸菌SCB329中的SDH进行了提纯，但即未进行蛋白组成分析，也没有进行L-山梨糖到L-山梨酮或L-KGA的转化实验。

发明创造内容

本发明的目的之一在于提供一种新的编码L-山梨糖脱氢酶的基因；

本发明的另一个目的在于提供上述基因编码的多肽；

本发明的另外一个目的在于提供上述序列的表达载体；

本发明的最后一个目的在于提供上述基因的用途。

根据本发明的一个方面，编码L-山梨糖脱氢酶的基因是从酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104(CCTCC No.M203094)中分离得到的(SEQ IDNO：1)，该基因的ORF长为1737，编码579个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：5)与所有已知基因氨基酸水平同源性最高为来源于Pseudogluconobactersaccbaroketogenes的乙醇脱氢酶，同源性为53％。SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8的同源性分别为68％，67％，67％。

具体地说，本发明提供了新的分离的多核苷酸，其含有下述序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID No：1所示的序列；

(2)编码序列表中SEQ ID No：5所示蛋白质序列的多核苷酸序列。

上述涉及的多核苷酸还包括取代、缺失、和插入变体以及等位变体、剪接变体、片段、衍生物等，其中可以通过取代、缺失、插入或衍生一个或多个核苷酸。优选的这些多核苷酸是那些编码具有生物学活性的SDH的多核苷酸。

本领域技术人员可以理解的是，上述的分离的多核苷酸也包括那些与SEQID NO.1所示序列具有较高同源性的序列，例如同源性大于90％、甚至95％、甚至98％的序列；还包括那些在严谨条件下可与SEQ ID NO.1所示序列杂交的序列；或者可与上述序列互补的序列。

根据本发明的另一方面，提供新的多肽，其含有上述核苷酸序列所编码的氨基酸序列，即含有SEQ ID NO.5所示的序列，编码蛋白为酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)的L-山梨糖脱氢酶，其具有序列表中SEQ ID No：5的氨基酸残基序列的蛋白质或将SEQ ID No：5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No：5相同活性的由SEQ IDNo：5衍生的蛋白质。

根据本发明的另一方面，本发明亦提供包括一种或多种上述多核苷酸的重组载体，以及包含上述多核苷酸的载体的基因工程宿主细胞。在优选的实施方案中，这种重组载体包括上述的多核苷酸，它编码含SEQ ID NO：5的多肽，其含SEQ ID NO：1的序列所示的多核苷酸。

本发明也涉及到包括任何一种含上述基因的重组载体的宿主细胞。在已经构建载体之后，可以插入全部或部分载体至适合的宿主细胞，以便扩增和/或多肽表达。宿主细胞可以是原核生物宿主细胞(例如E.coli)或者真核生物宿主细胞(例如丝状真菌细胞、酵母细胞，昆虫细胞，或脊椎动物细胞)。

本发明还提供了新的基因在L-山梨糖转化为L-山梨酮/2-KGA的生产中的应用，此基因可用于对2-KGA产生菌进行遗传改造，或用各种表达系统(大肠杆菌，酵母，枯草芽孢杆菌等)表达该基因，用于将L-山梨糖转化为L-山梨酮/2-KGA，或直接用该酶或各种表达系统表达的重组酶用于将L-山梨糖转化为L-山梨酮/2-KGA。

本发明用PCR方法从华药酮古龙酸菌WB0104基因组DNA中扩增出SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4基因，在大肠杆菌表达系统中表达，所得到的表达产物均具有DCIP活性，并可以以L-山梨糖为底物在PHENAZINEMETHOSULFATE(PMS)和pyrroloquinoline quinone(PQQ)存在下，都可以将L-山梨糖转经过L-山梨酮转化为2-KGA，说明SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4基因的表达产物均为rSDH；最重要的是SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4均可以与中国发明专利申请号为CN200310116831.7中公开的重组L-山梨酮脱氢酶(rSNDH)协同进行由L-山梨糖/L-山梨酮至2-KGA的转化，即rSNDH能有效地提高rSDH将L-山梨糖/L-山梨酮转化为至2-KGA的效率。在本发明的一个实施例中，以L-山梨糖为底物，加入NAD和PQQ，在rSDH与rSNDH存在下，与rSDH单独存在相比，L-山梨糖至2-KGA的转化率显著提高。本发明的另一个实施例中，以L-山梨酮为底物，加入NAD和PQQ，在rSDH与rSNDH存在下，使rSNDH单独转化L-山梨酮为2-KGA的转化率提高了约4倍。说明rSDH与rSNDH在L-山梨糖/L-山梨酮至2-KGA的转化过程中有明显的协同作用，为有效地改造2-KGA转化菌或酶法生产2-KGA或将SDH酶用于2-KGA的生产或将SDH基因用于2-KGA生产奠定基础。

附图说明

附图1：实施例1得到的SDH的电泳图谱，两侧泳道为实施例1得到的SDH；

附图2：SDH Km值的测定结果；

附图3：L-山梨糖和2-KGA的标准品HPLC图谱(L-山梨糖：2mg/ml，2-KGA：2mg/ml)；

附图4：SDH催化L-山梨糖生成2-KGA的HPLC图谱；

附图5：用LC-MS验证标准品和SDH(4#)反应体系的2-KGA生成

谱图；(注：采集2-KGA特征离子193^-的LC-MS图谱)

附图6：纯化的rSDHA，B，C，D SDS-PAGE，从左到右：marker，rSDHB，rSDHA，rSDHD，rSDHC，rSNDH，marker.

具体实施方式

以下实施例、实验例仅对本发明进行进一步的说明，不应构成对本发明的进一步的限制。

原辅料来源：L-山梨酮为本公司合成，合成方法参见：Michael MarxJ.Org.Chem.1984，49，788-796.Reactivity-Selectivity in the Swern Oxidation ofAlcohols Using Dimethyl Sulfoxide-Oxalyl Chloride；刘希光，.Chinese Journal ofOrganic Chemistry.2001，21(8)，549-556.DMSO作为氧化剂在有机合成中的应用。

其余所用试剂及介质均为市售。

仪器设备及检测方法：

HPLC：Waters 515 Alltech 2000型ELSD；

2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)和L-山梨糖检测方法(HPLC)：乙腈(HPLC级)；三氟乙酸(分析纯)；Milli Q plus纯水；ELSD雾化气为N₂，流速2.5l/min，漂移管温度100℃；色谱柱为Thermo Quest APS2 4.6mmi.d.×25cm 5μm；流动相：乙腈-0.1％三氟乙酸水溶液(梯度)，流速1.3ml/min。进样量20ul。

LC-MS：waters公司HPLC 2690，EMD质谱检测器

色谱柱为Thermo Quest APS2 4.6mmi.d.×25cm 5μm；流动相：乙腈-0.1％三氟乙酸水溶液(梯度)，流速1.3ml/min。电喷雾电离源：ESI，电喷雾电压：3.0KV，电喷雾接口干燥气：N₂，流速：250L/hr，脱溶剂温度：190℃，碰撞诱导解离电压：30V，离子源温度：120℃。

实施例1：SDH的获得：

华北制药集团有限责任公司维生素C生产用菌株华药酮古龙酸菌WB0104(CCTCC No.M203094)，用于发酵法将L-山梨糖转化为2-酮基-L古龙酸，后者是维生素C的重要前体。挑取华药酮古龙酸菌WB0104单菌落，在种子培养基(L-山梨糖：2.0％，玉米浆：0.6％，尿素：0.1％，葡萄糖：0.2％，碳酸钙(轻质)：0.2％)中，经29℃，200rpm扩增后，转入发酵培养基(L-山梨糖：8.0％，酵母膏：0.2％，玉米浆：2.0％，尿素：1.2％，KH₂PO₄0.1％，MgSO₄.7H₂O：0.01％，轻质碳酸钙：0.5％)。经29℃，200rpm，30小时后，当2-KGA的转化率约为30％时，收集菌体，用缓冲溶液(20mM的PB，pH7.0)洗涤，超声破壁(Cole.Parmer，Ultra Homogenizer4710，20min)，以缓冲溶液(20mM的PB，pH7.0)溶解。超速离心取上清，分离的小菌的细胞质部分进行3步色谱分离，以DCIP法监测酶活性，SDS-PAGE监测分离的蛋白纯度。参阅文献(美国专利5437989及《微生物学通报》2000年27(2))更详细地三步色谱分离为：(1)SP-Sephrose Fast Flow(1.6cm×15cm)分离：超速离心的上清50ml，上样，收集不吸附组份。分离缓冲液A为50mmol/L的Tris-HCl，pH7.5，B为含1mol/L NaCl的50mmol/L Tris-HCl，pH7.5缓冲液。仪器：Waters 650 FPLC，Waters 486 UV检测器(2)DEAE-SepharoseCL-6B(1.6×10cm)分离：缓冲液A为10mmol/L的磷酸-磷酸钾缓冲液，pH7.0，B为10mmol/L的磷酸-磷酸钾，500mmol/L的氯化钠，梯度洗脱(仪器同(1))，收集活性峰。(3)Sephacryl-200分离(1.6×70cm)分离(仪器：AmershamBioscience AKTA 100 explore)：将洗脱的DEAE活性峰浓缩后进行凝胶过滤分离。分离缓冲液为50mmol/L的磷酸-磷酸钾，pH7.0。收集有DCIP(2.6-Dichlorophenolindophenol)活性的活性峰，并进行SDS-PAGE检测，收集电泳纯度和活性都高的组份，电泳图谱见附图1，中间泳道：分子量标准(97kd，67kd，43kd，30kd，2lkd)，两边泳道为纯化的天然SDH，纯度＞95％，经计算，SDH的分子量约为60.622kd。

DCIP活性检测方法：参照文献(AGRIC.BIOL.CHEM.55 363-370 1991)测定，测定酶活性的基本反应液由含0.3％Triton X-100及5mM PQQ的10mMPB(pH7.0)、0.45mL的2.5mM DCIP溶液和4.95mL H₂O组成，于测定前现配。取0.4mL基本反应液、0.1mL 1M山梨糖溶液置于1cm光程的石英比色杯中，25℃温浴5min后加入10uL酶液，测定600nm处光吸收变化率。一个酶活力单位(U)的定义为：每分钟催化还原1umol DCIP的酶量。结果见表1：

表1：SDH各步纯化的的比活性

组分	超声上清	超速上清	层析(1)	层析(2)	层析(3)
组分	超声上清	超速上清	层析(1)	层析(2)	层析(3)	比活性(U/mg)	0.0364	0.054	0.202	0.401	0.779

上述结果标明：提纯后的酶活力比粗品提高了约21倍。

实施例2：SDH的性质研究：

1.分子量：

①以凝胶过滤法(参见《生物化学》沈同王镜岩主编第二版)测定分子量：选取Sigma的MW-GF-200 Moleculer Weight Mark Kit为分子量标准，以superdex 200层析柱测定分子量为139.053+-4.96kd。

洗脱体积(Ve)，外水体积(Vo)及分子量(MW)的测定结果见表2：

表2：Ve和MW的测定结果

Ve(ml)	分子量(MW)Kd	Lg MW	Ve/Vo(Vo＝46ml)
Ve(ml)	分子量(MW)Kd	Lg MW	Ve/Vo(Vo＝46ml)	67	200K	5.3010	1.46
72	150K	5.1761	1.56	67	200K	5.3010	1.46
72	150K	5.1761	1.56	78	66K	4.8195	1.70
88	29K	4.4624	1.91	78	66K	4.8195	1.70
88	29K	4.4624	1.91	95	12.4K	4.0934	2.06
72	X1			95	12.4K	4.0934	2.06
72	X1			71	X2
71	X3			71	X2
71	X3			71	X4
71	X5			71	X4

注：测定SDH的分子量为139.053±4.96kd。

2.Km的测定：

参照文献《生物化学》(沈同王镜岩主编第二版)方法测定不同L-山梨糖底物浓度下的DCIP活性，对L-山梨糖作用的Km值为23.94mM。测定结果见附图2。

3.催化活性：

1.催化2-KGA和L-山梨酮的生成：

以L-山梨糖为底物，测定了SDH的催化活性，HPLC检测，体系中有2-KGA生成，并通过LC-MS验证。同时通过LC-MS，可检测到反应体系中有L-山梨酮生成。

反应体系：20mM PB(pH7.0)，100mM L-山梨糖，200ug/ml的SDH，10mMPMS。

反应结果：HPLC定量2-KGA的生成浓度为：4.56mg/ml

HPLC谱图见附图3(L-山梨糖，2-KGA标准)及附图4(SDH催化L-山梨糖生成2-KGA结果)

附图5为标准品和SDH(4#)反应体系的LC-MS验证2-KGA生成谱图：

2.底物为L-山梨糖时，r SNDH和SDH有协同转酸作用，在反应体系：20mM PB(pH7.0)，100mM L-山梨糖，200ug/ml的SDH，10mM PMS中加入200ug/ml r SNDH，能大幅度提高2-KGA的转化率，结果见表3：

表3：r SNDH和SDH的协同作用

底物/酶	2-KGA
	2-KGA		峰面积	相对含量
	L-山梨糖+SDH	229.48×5	峰面积	相对含量	100％
L-山梨糖+SDH+rSNDH	L-山梨糖+SDH	229.48×5	1270.1×5	453％	100％

实施例3：L-山梨糖脱氢酶基因的获得

将实施例1中高度纯化的SDH进行常规SDS-PAGE电泳，将SDH条带切下，乙腈/碳酸氢铵(1∶1)混合溶液脱色后真空抽干，分别加入10mM DTT和55mM iodoacetamide进行还原和烷基化反应并真空抽干；加入测序级trypsin(w/w 1∶10)37℃酶切过夜；乙腈/碳酸氢铵(1∶1)混合溶液抽提胶内肽段并真空抽干，用1％甲酸重悬样品进行质谱测定(离子阱质谱仪：LCQDECA XP^plus ProteomeX Workstation，Thermo Finnigan，PaloAlto，CA)：阳离子柱(BioBasic SCX，Thermo Hypersil-Keystone)洗脱缓冲液(1M NH4Cl/5％乙腈/0.1％甲酸)；反相柱(BioBasic-18，100×0.18mm，ThermoHypersil-Keystone)洗脱梯度：缓冲液(乙腈/0.1％甲酸)0～100％100min；流速：2uL/min；电喷雾电压：3.0KV；电喷雾接口干燥气：高纯N₂；离子源温度：180℃。以数据依赖方式(Data-dependent scan)进行质谱数据采集。多肽离子检测范围为400～1850m/z，正离子扫描，随后进行3个二级质谱(MS/MS)鉴定(35％标准碰撞能量，动态排除时间为3min)；收集得到的质谱数据用BioWorks v3.1软件进行检索分析(参考文献：MacCoss，M.J.；Wu，C.C.；Yates，J.R.，3rd，Probability-based validation of protein identifications using a modifiedSEQUEST algorithm.Anal Chem 2002，74，5593-5599.)；所得结果与该菌种全基因组序列库氨基酸水平比对，得到一系列蛋白质序列，经同源性分析，结合蛋白质结构域预测，确定SEQ5、SEQ6、SEQ7、SEQ8为L-山梨糖脱氢酶的备选氨基酸序列(其中，涂黑部分为经质谱方法对该酶进行多肽氨基酸序列测定时多次测到的片断)(见下述氨基酸序列)，其理论分子量分别为62651，62917，62885，62638道尔顿；相对应地，在酮古龙酸菌WB0104全基因组中发现了SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8的基因序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4，经实验验证为L-山梨糖脱氢酶基因。

实施例4：重组L-山梨糖脱氢酶的特性研究

1.重组L-山梨糖脱氢酶的获得：

L-山梨糖脱氢酶基因(A，B，C，D)在大肠杆菌中的表达

用Novagen PET-39B(含HIS-TAG)表达以上四种蛋白，所用引物、退火温度见下表4：

表4：L-山梨糖脱氢酶基因(A，B，C，D)引物、退火温度

基因名称	正向引物	反向引物	退火温度
基因名称	正向引物	反向引物	退火温度	A	GCATATGCGACGCGGATTGATGATCAG	GCTCGAGACCTTCGGGAAGGGCAAAG	60℃
B	GCATATGAAACCGACTTCGCTGCTTTGGGC	GCTCGAGTTGCGGCAGGGCGAAGACG	62℃	A	GCATATGCGACGCGGATTGATGATCAG	GCTCGAGACCTTCGGGAAGGGCAAAG	60℃
B	GCATATGAAACCGACTTCGCTGCTTTGGGC	GCTCGAGTTGCGGCAGGGCGAAGACG	62℃	C	GCATATGAAGACGTCGTCTTTGCTGGTTGCG	GCTCGAGTTGCTGGGGCAGCGCGAAG	60℃
D	GCATATGCGTATCTTCTCGGAGGAGAGGGATG	GCTCGAGCTGCTGCGGCAGAGCAAAGAC	60℃	C	GCATATGAAGACGTCGTCTTTGCTGGTTGCG	GCTCGAGTTGCTGGGGCAGCGCGAAG	60℃

以酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104(CCTCC No.M203094)基因组DNA为模板进行PCR反应，50μl体系中含有终浓度为1.5mmol/LMgCl₂，0.2mmol/LdNTPs，各0.2μmol/L的正向引物和反向引物，10mmol/LTris-HCl，2ul TaqDNA聚合酶；PCR反应条件为：94℃ 5分钟；然后在如下条件下进行30个循环：94℃ 1分钟，退火(温度见上表)1分钟，72℃ 2分钟；72℃ 10分钟。PCR产物经电泳回收纯化与pGEM-T-VECTOR用T4 DNA连接酶连接，然后转化DH5α，挑取白斑，用QIAGEN的MINI质粒提取柱提取质粒并用酶切验证，找出正确插入的pGEM-T-VECTOR-rSDH质粒后，基因测序验证为目标序列；经NdeI/XhoI酶切并琼脂糖电泳回收1.7kb后，与表达载体PET39B(含HIS-TAG，同样经NdeI/XhoI处理)连接，转化DH5α，铺平板(含Kana 50μg/ml)，挑取克隆并用酶切鉴定，得到分别含rSDHA，B，C，D基因的阳性克隆质粒。

分别提取阳性克隆质粒，转化表达用宿主大肠杆菌BL21(DE3)。挑单菌落接种到5mlLB培养基中(含Kana 50μg/ml)37℃培养过夜，按1％接种量接种到50mlLB培养基中(含Kana 50μg/ml)培养至OD＝0.6-1.0，加IPTG诱导(终浓度0.3mmol/L)，继续培养4个小时，离心收集菌体，进行SDS-PAGE检测。

rSDH的纯化：按1/100的接种量将保存菌种接种于50ml含Kana的LB培养基中，37℃摇床中培养过夜，在10个各分装有300ml的LB培养基(含Kana50ug/L)的1000ml培养瓶中，按1/100接种量接种，37℃摇床中培养至OD600值为0.6～0.8，加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG进行诱导，30℃，摇床中以200rpm的转速继续培养4hr。以下操作均在4℃操作：10g菌体1∶5的比例悬浮于10mmol/L的磷酸/磷酸钾，pH7.0缓冲液中，超声破碎(Cole.Parmer，UltraHomogenizer 4710，20min)，15000g离心15分钟去除菌体碎片，收集上清液。上清液进行Chelating-SFF(Ni)亲和层析，(平衡液：50mmol/L的磷酸/磷酸钾，150mmol/L的NaCl，pH7.0，洗脱液：50mmol/L的磷酸/磷酸钾，150mmol/L的NaCl，500mmol/L咪唑，pH7.0，梯度洗脱，分步收集)，以DCIP活性检测收集的各个组份，将活性最高的部分测定蛋白质含量，作为纯化的rSDH进行功能测定。附图六为纯化的rSDHA，B，C，D SDS-PAGE，rSDH的分子量均约为62kd.marker(分子量标准)为Pharmacia公司产品，依次为94，67，43，30，22，14.4kd.

以凝胶过滤法测定rSDHA及rSDHB的分子量均约为139.05Kd，因而推测其稳定状态为双亚基结构。

对所得到的rSDH进行DCIP活性测定，结果见表5

表5：rSDH的DCIP活性

2.rSDH的L-山梨糖脱氢酶活性

在20mmol/L磷酸-磷酸钾，pH7.0的缓冲体系中，加入底物L-山梨糖100mmol/L，5mmol/L的PMS，2mmol/L PQQ，400ug/ml rSDH或SDH，30℃恒温4小时，HPLC分析生成的产物。结果见下表：所有rSDH均能以L-山梨糖为底物，在PMS和PQQ存在下将L-山梨糖转化为2-KGA，结果见表6：

表6：L-山梨糖脱氢酶以L-山梨糖为底物生成2-KGA

L-山梨糖脱氢酶	2-KGA生成浓度(mg/ml)
L-山梨糖脱氢酶	2-KGA生成浓度(mg/ml)	天然SDH	6.076
rSDHA	6.560	天然SDH	6.076
rSDHA	6.560	rSDHB	7.825
rSDHC	10.241	rSDHB	7.825
rSDHC	10.241	rSDHD	8.520

3.rSDH间、rSDH与rSNDH间的协同作用：将上述反应体系中的400ug/mlrSDH以不同的rSDH 1∶1等量混合或与rSNDH 1∶1等量混合，使酶的总量仍为200ug/ml，测定反应体系的产物仍为2-KGA，rSDH之间或rSDH与rSNDH之间有明显的协同作用。结果见表7：

表7：rSDH间的协同作用

酶	酶浓度(ug/ml)	2-KGA相对转化率(以rSDHB为100％)(％)
酶	酶浓度(ug/ml)	2-KGA相对转化率(以rSDHB为100％)(％)	rSDHB	400	100
rSDHA+rSDHB	200+200	121	rSDHB	400	100
rSDHA+rSDHB	200+200	121	rSDHA+rSDHC	200+200	124
rSDHA+rSDHD	200+200	198	rSDHA+rSDHC	200+200	124
rSDHA+rSDHD	200+200	198	rSDHB+rSDHC	200+200	152
rSDHA+rSNDH	200+200	329	rSDHB+rSDHC	200+200	152
rSDHA+rSNDH	200+200	329	rSDHB+rSNDH	200+200	408

实施例5：SDH/rSDH与rSNDH以L-山梨酮为底物的协同作用

反应体系：

20mmol/L磷酸-磷酸钾，pH8.2的缓冲体系，底物L-山梨酮(本公司合成)10mg/mL，NAD 0.5mg/mL，SDH或rSDH(A)400ug/ml，rSNDH 200ug/ml，PQQ5mM，30℃恒温5小时，HPLC分析生成的产物，反应结果见表8。r SNDH能催化L-山梨酮为古龙酸，SDH能显著增加古龙酸的生成量。

表8：

样品	2-KGA峰面积(起始)	2-KGA峰面积(5小时后)	2-KGA浓度(mg/ml)
样品	2-KGA峰面积(起始)	2-KGA峰面积(5小时后)	2-KGA浓度(mg/ml)	L-山梨酮+空白反应液	0	0	0
L-山梨酮+r SNDH	1331.678	2118.312	0.2811	L-山梨酮+空白反应液	0	0	0
L-山梨酮+r SNDH	1331.678	2118.312	0.2811	L-山梨酮+SDH+r SNDH	3950.346	1.3036e4	1.7299
L-山梨酮+rSDH(A)+r SNDH	3260.256	8204.628	1.0888	L-山梨酮+SDH+r SNDH	3950.346	1.3036e4	1.7299

以上结果表明：天然的以及重组的SDH均对所述rSNDH以L-山梨酮为底物的转化率有4-6倍的提高。

实施例6：rSDH用于2-KGA的生产

所发现的rSDH可以各种众所周知的方法用于2-KGA的生产，如固定化酶(细胞)法，将该基因导入原产生菌中增加该酶基因的拷贝数等。本试验例还提供了一种最简便的方法---将该基因导入2-KGA产生菌如酮古龙酸菌WB0104的辅助菌中用于提高2-KGA的产量。

将培养好的酮古龙酸菌WB0104(简称WB0104)种液及含有或无PET39B-rSDH质粒的E.coli BL21(DE3)(简称E)混合(10∶1)共3ml((L-山梨糖：2.0％，玉米浆：0.6％，尿素：0.1％，葡萄糖：0.2％，碳酸钙(轻质)：0.2％)接种到20ml发酵培养基中(L-山梨糖：8.0％，酵母膏：0.2％，玉米浆：2.0％，尿素：1.2％，KH₂PO₄：0.1％，MgSO4.7H₂O：0.01％，轻质碳酸钙：0.5％)。在29℃，200rpm条件下培养，在24h，32h取样测定古龙酸含量、40h左右取样测发酵液体积、测定L-山梨糖和2-酮基-L-古龙酸含量，根据L-山梨糖含量确定发酵终点取样时间，并计算最终转化率。结果如表9所示，表明rSDH的表达显著提高2-KGA的转化率。

表9酮古龙酸菌WB0104和PET39b-rSDH/E.coliBL21(DE3)对L-山梨糖的转化

	24h产酸(mg/ml)	32h产酸(mg/ml)	终点酸(mg/ml)	残糖(mg/ml)	体积(ml)	转化率(％)	周期(h)
	24h产酸(mg/ml)	32h产酸(mg/ml)	终点酸(mg/ml)	残糖(mg/ml)	体积(ml)	转化率(％)	周期(h)	WB0104+PET39b-rSDHA/E	35.76	56.68	76.92	0.98	20.80	84.36	40
WB0104+PET39b-rSDHA/E(在5h加入IPTG诱导)	35.07	58.73	79.80	0.82	20.80	87.52	40	WB0104+PET39b-rSDHA/E	35.76	56.68	76.92	0.98	20.80	84.36	40
WB0104+PET39b-rSDHA/E(在5h加入IPTG诱导)	35.07	58.73	79.80	0.82	20.80	87.52	40	WB0104+PET39b/E	25.61	52.36	74.89	1.04	20.80	82.13	44

序列表：SEQUENCE LISTING

<110>华北制药集团有限责任公司

<120>一种L-山梨糖脱氢酶及其编码基因与应用

<130>美国专利3912592

<160>8

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1737

<212>DNA

<213>Keteleeria davidiana

<400>1

atgcgacgcg gattgatgat cagtgccgct gcctgtgtga tgggagcaca ggcagccttg 60

gcacaaatga cgccgattac cgacgaattg ctgcaaaacc cacctgaaag cgactggctg 120

tcctatggcc acggccctga aaactaccgc cactcacccc tgacccagat cacgcccgag 180

aatgtcggat cgctgcaact ggtctgggcg cgcgggatgg agccgcaggg catggtgcaa 240

agcgccccgc tggtcgcgga tggcgtgctg tatctgccca accccggcga tgtgatccag 300

gcgatcgacg ccgccaccgg cgatctgatc tgggaacacc gccgccaact gcccgatacc 360

actgttctga acacgattgg cgagcgtaag cgcggtgtcg cgctctatgg cgacaacctg 420

ctgttcatgt cctgggacaa tcatctggtc gcgctgaacc gcgaaagcgg acaggtggtc 480

tatgatatcg accgtggtca gggggatgag cggatctcga attcgaccgg accgttcatc 540

gcgaacggcg tcgtcgtggc gggatcgacttgccaatatt ccgcctttgg ctgttatgtg 600

accggccatg acgccaatac cggcgaagag ctgtggcgca attatttcat cccccgtccc 660

ggcgaggaag gcgacgagac ctggggcaat gattatgaat cgcgctggat gaccggcgca 720

tgggggcagg tctcgtatga tcccgtgacc aatctggtct attacggctc cagcgcagtc 780

ggccccgcgt ccgaggcaca gcgcggcacg cccggcggca cgttgcacgg caccaacacc 840

cgctttgccg tgcgccccga taccggcgag atcgtctggc agcaccagac cctgccacgc 900

gacaactggg atcaggaatg cacgttcgag atgctgccgg tatcgaccaa tgtgaacccg 960

gcggccgata tggacggcgt tctggccatc aaccccaatg ccgcaaccgg cgagcggcgc 1020

gtgctgaccg gggtgccctg caaaaccggc acattgtggc aattcgatgc cgagacgggc 1080

gaattcctgt gggcccgcga caccaatctg caaaatctga ttgaatccgt tgatcctgaa 1140

acgggcatcg tcaccgtgaa cgaagatgtc gtgcaccatg acgccaccag cactgtcgcc 1200

atgtgcccga cctatctggg tggtcgcgac tggccgacca cagcctttaa ccccagcacc 1260

ggcgtcatct ttgtgccgct gaacaatatg tgcgcggatt cgacccctgt ggacgacgat 1320

ttctcggcgc ttgatgtcta taacaccgac ctcgtctacc accttgcccc cggatttgaa 1380

aatatcggcc gcatcgacgc gattgatgtc tcaaccggga acacgctctg gagctatgaa 1440

caacccgagg gactttatgc gcccgtcacc tcgaccgcag gcgggctgtt gttcaccggc 1500

ggctcggatc ggcggttcaa ggcgatcagc caggacaccg gtgaagtgct gtggagcgcg 1560

cgcctctcga ccggcatttc gggtcacccg atttcattcg cggtggatgg tcgccaatat 1620

gtcgccgtgg cgggcggcgg ctcgcattac ggcacgcggt tcaacacgcc tgtcggcctg 1680

aacatcgacg cgacgatggt cggatcggcg ctatgggtct ttgcccttcc cgaaggt 1737

<210>2

<211>1737

<212>DNA

<213>Ketogulonigenium sp.

<400>2

atgaaaccga cttcgctgct ttgggccagt gctggcgcac ttgcattgct tgccgcaccc 60

gcctttgctc aagtgacccc cgtcaccgat gaattgctgg cgaacccgcc cgctggtgaa 120

tggatcagct acggtcagaa ccaagaaaac taccgtcact cgcccctgac gcagatcacg 180

actgagaacg tcggccaact gcaactggtc tgggcgcgcg gcatgcagcc gggcaaagtc 240

caagtcacgc ccctgatcca tgacggcgtc atgtatctgg caaacccggg cgacgtgatc 300

caggccatcg acgccaaaac tggcgatctg atctgggaac accgccgcca actgccgaac 360

atcgccacgc tgaacagctt tggcgagccg acccgcggca tggcgctgta cggcaccaac 420

gtttactttg tttcgtggga caaccacctg gtcgccctcg acaccgcaac tggccaagtg 480

acgttcgacg tcgaccgcgg ccaaggcgaa gacatggttt cgaactcgtc gggcccgatc 540

gtggcaaacg gcgtgatcgt tgccggttcg acctgccaat actcgccgtt cggctgcttt 600

gtctcgggcc acgactcggc caccggtgaa gagctgtggc gcaactactt catcccgcgc 660

gctggcgaag agggtgatga gacttggggc aacgattacg aagcccgttg gatgaccggt 720

gcctggggcc agatcaccta tgaccccgtc accaaccttg tccactacgg ctcgaccgct 780

gtgggtccgg cgtcggaaac ccaacgcggc accccgggcg gcacgctgta cggcacgaac 840

acccgtttcg ccgtgcgtcc tgacacgggc gagattgtct ggcgtcacca gaccctgccc 900

cgcgacaact gggaccagga atgcacgttc gagatgatgg tcaccaatgt ggatgtccaa 960

ccctcgaccg agatggaagg tctgcagtcg atcaacccga acgccgcaac tggcgagcgt 1020

cgcgtgctga ccggcgttcc gtgcaaaacc ggcaccatgt ggcagttcga cgccgaaacc 1080

ggcgaattcc tgtgggcccg tgataccaac taccagaaca tgatcgaatc catcgacgaa 1140

aacggcatcg tgaccgtgaa cgaagatgcg atcctgaagg aactggatgt tgaatatgac 1200

gtctgcccga ccttcttggg cggccgcgac tggccgtcgg ccgcactgaa ccccgacagc 1260

ggcatctact tcatcccgct gaacaacgtc tgctatgaca tgatggccgt cgatcaggaa 1320

ttcacctcga tggacgtcta taacaccagc aacgtgacca agctgccgcc cggcaaggat 1380

atgatcggtc gtattgacgc gatcgacatc agcacgggtc gtacgctgtg gtcggtcgaa 1440

cgtgctgcgg cgaactattc gcccgtcttg tcgaccggcg gcggcgttct gttcaacggt 1500

ggtacggatc gttacttccg cgccctcagc caagaaaccg gcgagaccct gtggcagacc 1560

cgccttgcaa ccgtcgcgtc gggccaggcc atctcttacg aggttgacgg catgcaatat 1620

gtcgccatcg caggtggtgg tgtcagctat ggctcgggcc tgaactcggc actggctggc 1680

gagcgagtcg actcgaccgc catcggtaac gccgtctacg tcttcgccct gccgcaa 1737

<210>3

<211>1737

<212>DNA

<213>Ketogulonigenium sp.

<400>3

atgaagacgt cgtctttgct ggttgcgagc gttgccgcgc ttgcaagcta tagctccttt 60

gcgcttgctc aagtgacccc cgtcaccgat gaattgctgg cgaacccgcc cgctggtgaa 120

tggatcagct acggtcagaa ccaagaaaac taccgtcact cgcccctgac gcagatcacg 180

actgagaacg tcggccaact gcaactggtc tgggcgcgcg gcatgcagcc gggcaaagtc 240

caagtcacgc ccctgatcca tgacggcgtc atgtatctgg caaacccggg cgacgtgatc 300

caggccatcg acgccaaaac tggcgatctg atctgggaac accgccgcca actgccgaac 360

atcgccacgc tgaacagctt tggcgagccg acccgcggca tggcgctgta cggcaccaac 420

gtttactttg tttcgtggga caaccacctg gtcgccctcg acaccgcaac tggccaagtg 480

acgttcgacg tcgaccgcgg ccaaggcgaa gacatggttt cgaactcgtc gggcccgatc 540

gtggcaaacg gcgtgatcgt tgccggttcg acctgccaat actcgccgtt cggctgcttt 600

gtctcgggcc acgactcggc caccggtgaa gagctgtggc gcaactactt catcccgcgc 660

gctggcgaag agggtgatga gacttggggc aacgattacg aagcccgttg gatgaccggc 720

gtctggggtc agatcaccta tgaccccgtt ggcggccttg tccactacgg ctcgtcggct 780

gttggcccgg cttcggaaac ccagcgcggc accaccggcg gcaccatgta cggcaccaac 840

acccgtttcg ctgtccgtcc cgagactggc gagatcgtct ggcgtcacca aactctgccc 900

cgcgacaact gggaccaaga gtgcaccttc gagatgatgg ttgccaacgt tgacgtgcag 960

cccgcagctg acatggacgg cgtccgctcg atcaacccga acgccgccac cggcgagcgt 1020

cgcgttctga ccggcgttcc gtgcaaaacc ggcaccatgt ggcagttcga cgccgaaacc 1080

ggcgaattcc tgtgggcccg tgacaccagc tacgagaaca tcatcgaatc gatcgacgaa 1140

aacggcatcg tgaccgtcga cgagtcgaaa gttctgaccg agctggacac cccctatgac 1200

gtctgcccgc tgctgctggg tggccgtgac tggccgtcgg ctgcgctgaa ccccgatacc 1260

ggcatctact ttatcccgct gaacaacacc tgcatggata tcgaagctgt cgaccaggaa 1320

ttcagctcgc tggacgtgta caaccaaagc ctgaccgcca aaatggcacc gggtaaagag 1380

ctggttggcc gtatcgacgc catcgacatc agcacaggcc gcaccctgtg gaccgctgag 1440

cgcgaagcct cgaactacgc gcctgtcctg tcgaccgctg gcggcgttct gttcaacggc 1500

ggcaccgacc gttacttccg cgctctcagc caagagaccg gcgagaccct gtggcagacc 1560

cgtctggcga ctgtcgcttc gggccaagct gtctcgtacg agatcgacgg cgtccaatac 1620

atcgccatcg gcggcggcgg cacgacctat ggttcgttcc acaaccgtcc cctggccgag 1680

ccggtcgact cgaccgcgat cggtaatgcg atgtacgtct tcgcgctgcc ccagcaa 1737

<210>4

<211>1734

<212>DNA

<213>Ketogulonigenium sp.

<400>4

atgaaactga cgaccctgct gcaaagcagc gccgccctgc ttgtgcttgg caccattccc 60

gcccttgccc aaaccgccat caccgatgaa atgctggcga acccgcccgc tggtgaatgg 120

atcaactacg gtcagaacca agagaactac cgccactcgc ccctgacgca gattaccgca 180

gacaacgtcg gccaactgca actggtctgg gcgcgcggta tggaagcggg caagatccaa 240

gtgaccccgc ttgtccatga cggcgtcatg tatctggcaa accccggtga cgtgatccag 300

gccatcgacg ccgcgaccgg cgatctgatc tgggaacacc gccgccaact gccgaacatc 360

gccacgctga acagctttgg tgagccgacc cgcggcatgg ccctctatgg caccaacgtc 420

tatttcgtct cgtgggacaa ccacttggtc gcgctggaca cctcgaccgg ccaagtcgta 480

ttcgacgtcg atcgcggtca aggcacggat atggtctcga actcgtccgg cccgattgtc 540

gccaatggcg tcatcgttgc gggctcgacc tgtcagtatt cgccgttcgg ctgtttcgtt 600

tcgggccacg actcggccac cggtgaagag ctgtggcgca acacctttat cccgcgcgcc 660

ggcgaagagg gtgatgagac ctggggcaat gattacgagg cccgctggat gaccggcgtt 720

tggggccaga tcacctatga ccccgttggc ggccttgtcc actacggcac ctcagcagtt 780

ggccctgcgg ccgagattca gcgcggcacc gttggcggct cgatgtatgg caccaacacc 840

cgctttgctg tccgccccga gaccggcgag atcgtctggc gtcaccaaac tctgccccgc 900

gacaactggg accaagagtg tacgttcgag atgatggtcg tcaacgtcga cgtccagccc 960

tcggctgaga tggaaggcct gcacgccatc aaccccgatg ccgccacggg cgagcgtcgc 1020

gttgtgaccg gcgttccgtg caagaacggc accatgtggc agttcgacgc cgaaaccggc 1080

gaattcctgt gggcgcgcga caccagctat cagaacctga tcgaaagcgt cgatcccgat 1140

ggtctggtgc atgtgaacga agatctggtc gtgaccgagc tggaagtggc ctatgaaatc 1200

tgcccgacct tcctgggtgg ccgcgactgg ccgtcggctg cgctgaaccc cgatactggc 1260

atctatttca tcccgctgaa caacgcctgt agcggtatga cggctgtcga ccaagagttc 1320

agctcgctcg atgtgtataa cgtcagcctc gactataaac tgtcgcccgg ttcggaaaac 1380

atgggccgta tcgacgccat cgacatcagc accggccgca cgctgtggtc ggctgaacgc 1440

tacgcctcga actacgcgcc tgtcctgtcc accggcggcg gcgtgctgtt caacggcggc 1500

accgaccgtt acttccgcgc cctcagccaa gagaccggcg agacgctgtg gcagacccgt 1560

ctggcgactg tcgcctcggg tcaagcgatt tcctatgaga tcgacggcgt gcaatatgtc 1620

gccatcggcg gcggcggcac cagctatggc agcaaccaca accgcgccct gaccgagcgg 1680

atcgactcga ccgccatcgg cagcgcgatc tatgtctttg ctctgccgca gcag l734

<210>5

<211>579

<212>PRT

<213>Ketogulonigenium sp.

<400>5

Met Arg Arg Gly Leu Met Ile Ser Ala Ala Ala Cys Val Met Gly Ala

1 5 10 15

Gln Ala Ala Leu Ala Gln Met Thr Pro Ile Thr Asp Glu Leu Leu Gln

20 25 30

Asn Pro Pro Glu Ser Asp Trp Leu Ser Tyr Gly His Gly Pro Glu Asn

35 40 45

Tyr Arg His Ser Pro Leu Thr Gln Ile Thr Pro Glu Asn Val Gly Ser

50 55 60

Leu Gln Leu Val Trp Ala Arg Gly Met Glu Pro Gln Gly Met Val Gln

65 70 75 80

Ser Ala Pro Leu Val Ala Asp Gly Val Leu Tyr Leu Pro Asn Pro Gly

85 90 95

Asp Val Ile Gln Ala Ile Asp Ala Ala Thr Gly Asp Leu Ile Trp Glu

100 105 110

His Arg Arg Gln Leu Pro Asp Thr Thr Val Leu Asn Thr Ile Gly Glu

115 120 125

Arg Lys Arg Gly Val Ala Leu Tyr Gly Asp Asn Leu Leu Phe Met Ser

130 135 140

Trp Asp Asn His Leu Val Ala Leu Asn Arg Glu Ser Gly Gln Val Val

145 150 155 160

Tyr Asp Ile Asp Arg Gly Gln Gly Asp Glu Arg Ile Ser Asn Ser Thr

165 170 175

Gly Pro Phe Ile Ala Asn Gly Val Val Val Ala Gly Ser Thr Cys Gln

180 185 190

Tyr Ser Ala Phe Gly Cys Tyr Val Thr Gly His Asp Ala Asn Thr Gly

195 200 205

Glu Glu Leu Trp Arg Asn Tyr Phe Ile Pro Arg Pro Gly Glu Glu Gly

210 215 220

Asp Glu Thr Trp Gly Asn Asp Tyr Glu Ser Arg Trp Met Thr Gly Ala

225 230 235 240

Trp Gly Gln Val Ser Tyr Asp Pro Val Thr Asn Leu Val Tyr Tyr Gly

245 250 255

Ser Ser Ala Val Gly Pro Ala Ser Glu Ala Gln Arg Gly Thr Pro Gly

260 265 270

Gly Thr Leu His Gly Thr Asn Thr Arg Phe Ala Val Arg Pro Asp Thr

275 280 285

Gly Glu Ile Val Trp Gln His Gln Thr Leu Pro Arg Asp Asn Trp Asp

290 295 300

Gln Glu Cys Thr Phe Glu Met Leu Pro Val Ser Thr Asn Val Asn Pro

305 310 315 320

Ala Ala Asp Met Asp Gly Val Leu Ala Ile Asn Pro Asn Ala Ala Thr

325 330 335

Gly Glu Arg Arg Val Leu Thr Gly Val Pro Cys Lys Thr Gly Thr Leu

340 345 350

Trp Gln Phe Asp Ala Glu Thr Gly Glu Phe Leu Trp Ala Arg Asp Thr

355 360 365

Asn Leu Gln Asn Leu Ile Glu Ser Val Asp Pro Glu Thr Gly Ile Val

370 375 380

Thr Val Asn Glu Asp Val Val His His Asp Ala Thr Ser Thr Val Ala

385 390 395 400

Met Cys Pro Thr Tyr Leu Gly Gly Arg Asp Trp Pro Thr Thr Ala Phe

405 410 415

Asn Pro Ser Thr Gly Val Ile Phe Val Pro Leu Asn Asn Met Cys Ala

420 425 430

Asp Ser Thr Pro Val Asp Asp Asp Phe Ser Ala Leu Asp Val Tyr Asn

435 440 445

Thr Asp Leu Val Tyr His Leu Ala Pro Gly Phe Glu Asn Ile Gly Arg

450 455 460

Ile Asp Ala Ile Asp Val Ser Thr Gly Asn Thr Leu Trp Ser Tyr Glu

465 470 475 480

Gln Pro Glu Gly Leu Tyr Ala Pro Val Thr Ser Thr Ala Gly Gly Leu

485 490 495

Leu Phe Thr Gly Gly Ser Asp Arg Arg Phe Lys Ala Ile Ser Gln Asp

500 505 510

Thr Gly Glu Val Leu Trp Ser Ala Arg Leu Ser Thr Gly Ile Ser Gly

515 520 525

His Pro Ile Ser Phe Ala Val Asp Gly Arg Gln Tyr Val Ala Val Ala

530 535 540

Gly Gly Gly Ser His Tyr Gly Thr Arg Phe Asn Thr Pro Val Gly Leu

545 550 555 560

Asn Ile Asp Ala Thr Met Val Gly Ser Ala Leu Trp Val Phe Ala Leu

565 570 575

Pro Glu Gly

<210>6

<211>579

<212>PRT

<213>Ketogulonigenium sp.

<400>6

Met Lys Pro Thr Ser Leu Leu Trp Ala Ser Ala Gly Ala Leu Ala Leu

1 5 10 15

Leu Ala Ala Pro Ala Phe Ala Gln Val Thr Pro Val Thr Asp Glu Leu

20 25 30

Leu Ala Asn Pro Pro Ala Gly Glu Trp Ile Ser Tyr Gly Gln Asn Gln

35 40 45

Glu Asn Tyr Arg His Ser Pro Leu Thr Gln Ile Thr Thr Glu Asn Val

50 55 60

Gly Gln Leu Gln Leu Val Trp Ala Arg Gly Met Gln Pro Gly Lys Val

65 70 75 80

Gln Val Thr Pro Leu Ile His Asp Gly Val Met Tyr Leu Ala Asn Pro

85 90 95

Gly Asp Val Ile Gln Ala Ile Asp Ala Lys Thr Gly Asp Leu Ile Trp

100 105 110

Glu His Arg Arg Gln Leu Pro Asn Ile Ala Thr Leu Asn Ser Phe Gly

115 120 125

Glu Pro Thr Arg Gly Met Ala Leu Tyr Gly Thr Asn Val Tyr Phe Val

130 135 140

Ser Trp Asp Asn His Leu Val Ala Leu Asp Thr Ala Thr Gly Gln Val

145 150 155 160

Thr Phe Asp Val Asp Arg Gly Gln Gly Glu Asp Met Val Ser Asn Ser

165 170 175

Ser Gly Pro Ile Val Ala Asn Gly Val Ile Val Ala Gly Ser Thr Cys

180 185 190

Gln Tyr Ser Pro Phe Gly Cys Phe Val Ser Gly His Asp Ser Ala Thr

195 200 205

Gly Glu Glu Leu Trp Arg Asn Tyr Phe Ile Pro Arg Ala Gly Glu Glu

210 215 220

Gly Asp Glu Thr Trp Gly Asn Asp Tyr Glu Ala Arg Trp Met Thr Gly

225 230 235 240

Ala Trp Gly Gln Ile Thr Tyr Asp Pro Val Thr Asn Leu Val His Tyr

245 250 255

Gly Ser Thr Ala Val Gly Pro Ala Ser Glu Thr Gln Arg Gly Thr Pro

260 265 270

Gly Gly Thr Leu Tyr Gly Thr Asn Thr Arg Phe Ala Val Arg Pro Asp

275 280 285

Thr Gly Glu Ile Val Trp Arg His Gln Thr Leu Pro Arg Asp Asn Trp

290 295 300

Asp Gln Glu Cys Thr Phe Glu Met Met Val Thr Asn Val Asp Val Gln

305 310 315 320

Pro Ser Thr Glu Met Glu Gly Leu Gln Ser Ile Asn Pro Asn Ala Ala

325 330 335

Thr Gly Glu Arg Arg Val Leu Thr Gly Val Pro Cys Lys Thr Gly Thr

340 345 350

Met Trp Gln Phe Asp Ala Glu Thr Gly Glu Phe Leu Trp Ala Arg Asp

355 360 365

Thr Asn Tyr Gln Asn Met Ile Glu Ser Ile Asp Glu Asn Gly Ile Val

370 375 380

Thr Val Asn Glu Asp Ala Ile Leu Lys Glu Leu Asp Val Glu Tyr Asp

385 390 395 400

Val Cys Pro Thr Phe Leu Gly Gly Arg Asp Trp Pro Ser Ala Ala Leu

405 410 415

Asn Pro Asp Ser Gly Ile Tyr Phe Ile Pro Leu Asn Asn Val Cys Tyr

420 425 430

Asp Met Met Ala Val Asp Gln Glu Phe Thr Ser Met Asp Val Tyr Asn

435 440 445

Thr Ser Asn Val Thr Lys Leu Pro Pro Gly Lys Asp Met Ile Gly Arg

450 455 460

Ile Asp Ala Ile Asp Ile Ser Thr Gly Arg Thr Leu Trp Ser Val Glu

465 470 475 480

Arg Ala Ala Ala Asn Tyr Ser Pro Val Leu Ser Thr Gly Gly Gly Val

485 490 495

Leu Phe Asn Gly Gly Thr Asp Arg Tyr Phe Arg Ala Leu Ser Gln Glu

500 505 510

Thr Gly Glu Thr Leu Trp Gln Thr Arg Leu Ala Thr Val Ala Ser Gly

515 520 525

Gln Ala Ile Ser Tyr Glu Val Asp Gly Met Gln Tyr Val Ala Ile Ala

530 535 540

Gly Gly Gly Val Ser Tyr Gly Ser Gly Leu Asn Ser Ala Leu Ala Gly

545 550 555 560

Glu Arg Val Asp Ser Thr Ala Ile Gly Asn Ala Val Tyr Val Phe Ala

565 570 575

Leu Pro Gln

<210>7

<211>579

<212>PRT

<213>Ketogulonigenium sp.

<400>7

Met Lys Thr Ser Ser Leu Leu Val Ala Ser Val Ala Ala Leu Ala Ser

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Tyr Ser Ser Phe Ala Leu Ala Gln Val Thr Pro Val Thr Asp Glu Leu

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Leu Ala Asn Pro Pro Ala Gly Glu Trp Ile Ser Tyr Gly Gln Asn Gln

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Glu Asn Tyr Arg His Ser Pro Leu Thr Gln Ile Thr Thr Glu Asn Val

50 55 60

Gly Gln Leu Gln Leu Val Trp Ala Arg Gly Met Gln Pro Gly Lys Val

65 70 75 80

Gln Val Thr Pro Leu Ile His Asp Gly Val Met Tyr Leu Ala Asn Pro

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<212>PRT

<213>Ketogulonigenium sp.

<400>8

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1 5 10 15

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545 550 555 560

Ile Asp Ser Thr Ala Ile Gly Ser Ala Ile Tyr Val Phe Ala Leu Pro

565 570 575

Gln Gln

Claims

1.一种分离的多核苷酸，含有下述核苷酸序列之一：

(1)SEQ ID No：1所示的序列；

(2)编码SEQ ID No：5所示的蛋白质序列的多核苷酸序列。

2.一种分离的多核苷酸，含有与权利要求1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

3.由权利要求1所述的核苷酸序列编码的多肽。

4.权利要求3所述的多肽，其具有SEQ ID NO.1所示的序列，具有L-山梨糖脱氢酶活性。

5.含有权利要求1所述的多核苷酸的表达载体。

6.含有权利要求5所述的表达载体的宿主细胞。

7.权利要求1所述的分离的多核苷酸在L-山梨糖转化为L-山梨酮/2-KGA中的应用。

8.权利要求1所述的分离的多核苷酸和/或含有SEQ ID NO：2的多核苷酸和/或含有SEQ ID NO：3的多核苷酸和/或含有SEQ ID NO：4的多核苷酸在L-山梨糖转化为L-山梨酮/2-KGA中的应用。

9.权利要求1所述的分离的多核苷酸和/或含有SEQ ID NO：2的多核苷酸和/或含有SEQ ID NO：3的多核苷酸和/或含有SEQ ID NO：4的多核苷酸与重组山梨酮脱氢酶rSNDH一起在L-山梨糖/L-山梨酮转化为2-KGA中的应用。