KR100227960B1 - 글루코노박터 서브옥시단스의 솔비톨 탈수소효소 및 이의 유전자 - Google Patents

글루코노박터 서브옥시단스의 솔비톨 탈수소효소 및 이의 유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글루코노박터 서브옥시단스(KCTC 2111) 균주의 원형질막에 존재하는 솔비톨 탈수소효소(sorbitol dehydrogenase) 및 이를 코드하는 유전자에 관한 것이다. 글루코노박터 서브옥시단스로부터 분리, 정제된 솔비톨 탈수소효소는 3 개의 서브유니트로 구성되어 있으며, 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ)을 조효소로 포함하는 75 kDa 분자량의 탈수소효소 서브유니트인 제 1 서브유니트, 50 kDa 분자량의 시토크롬 c인 제 2 서브유니트, 그리고 솔비톨 탈수소효소의 안정성에 중요한 역할을 하는 29 kDa 분자량의 제 3 서브유니트로 구성되어 있는 막결합형 솔비톨 탈수소효소이다. 그리고 솔비톨 탈수소효소의 유전자는 2265 bp를 갖는 제 1 서브유니트와 1437 bp를 갖는 제 2 서브유니트를 포함하며, 이들 서브유니트는 제한효소 PstI으로 절단되는 5.7 kb 크기의 DNA 절편내에 연결되어 있다.

Description

글루코노박터 서브옥시단스의 솔비톨 탈수소효소 및 이의 유전자{SORBITOL DEHYDROGENASE OF GLUCONOBACTER SUBOXYDANS AND GENE THEREOF}
본 발명은 글루코노박터 서브옥시단스(Gluconobacter suboxydans)의 솔비톨 탈수소효소(sorbitol dehydrogenase) 및 이의 유전자에 관한 것이다.
솔비톨 탈수소효소는 솔비톨을 솔보스로 전환시키는 반응의 촉매로 작용하여, 비타민 C 및 글론산의 전구체로 활용되는 솔보스의 제조와 관련된 효소로 알려져 있다. 솔비톨로부터 솔보스를 제조하는 공정은 글루코노박터 서브옥시단스, 아세토박터 자일리늄(Acetobacter xylinum)과 같은 초산균에 의해 수행되며, 통상의 온도에서 24 시간 이내에 96 내지 99%의 전환이 이루어진다(Liebster, J. et al., Chem. List, 50, 395(1956)).
글루코노박터 속에서 발견되는 솔비톨 탈수소효소는 그 조효소의 특이성에 따라 NAD-의존성, NADP-의존성 그리고 NAD(P)-비의존성 솔비톨 탈수소효소로 분류되며, 이 가운데 직접적으로 산업적인 솔보스 전환에 관여하는 것은 NAD(P)-비의존성 효소인 것으로 알려져 있다(Cummins, J. T. et al., J. Biol. Chem., 224, 323; 226, 301(1957)).
본 발명자 등은 이와 같이 솔비톨의 솔보스로의 전환에 관여하는 대표적인 초산균인 글루코노박터 서브옥시단스(KCTC 2111)의 원형질막에 결합되어 있는 막결합형 솔비톨 탈수소효소를 정제하여 분석한 결과, 이미 정제 및 효소특성이 알려진 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 3254 균주 유래의 FAD 요구성 솔비톨 탈수소효소(Shinagawa, E. et al., Agric. Biol. Chem., 46, 135(1982))와 조효소 요구성 등이 다른 새로운 솔비톨 탈수소효소를 발견하였는데, 이 효소는 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ)을 조효소로 포함하며 3 개의 서브유니트로 구성되어 있다(Choi et al., FEMS Microbiol. Lett., 125, 45(1995)).
즉, SYP 배지(솔비톨 5%, 박토-펩톤 1%, 효모엑기스 0.5%)에서 배양하여 얻은 글루코노박터 서브옥시단스(KCTC 2111) 균체를 10 mM 초산완충액(pH 5.0)에 현탁, 파쇄하여 얻은 상등액을 초원심분리하여 원형질막 분획을 회수하였다. 1.5% n-옥틸글루코시드(베링거만하임사)를 첨가하여 가용화시킨 원형질막 분획을 CM-TSK 650 (S)(Merck사), DEAE-TSK 650 (S)(Merck사), Mono-S(Pharmacia사) 및 Superose 12(Pharmacia사)와 같은 일련의 컬럼을 이용하여 NAD(P)-비의존성 솔비톨 탈수소효소를 정제하였다. 이와 같이 정제된 효소는 솔비톨, 만니톨, 리비톨 등 여러 폴리올을 각각 100%, 68%, 70% 전환시키는 등 광범위한 기질에 대해 활성을 나타낸다. 특히, 본 효소는 피롤로퀴놀린 퀴논 첨가시 활성이 9배 정도 증가하는 등, 조효소로서 피롤로퀴놀린 퀴논을 요구하며 형광스펙트럼 결과 정제된 효소가 피롤로퀴놀린 퀴논을 조효소로 포함함을 알 수 있었고, 흡광 스펙트럼 결과 이 효소는 시토크롬 c를 가지는 것을 알 수 있었다. 정제된 효소는 pH 4.3의 산성조건에서 전기영동(Reisfeld, R. A., et al., Nature, 195, 281(1962))하여 활성염색하면 단일밴드를 형성하였고, 12.5% SDS-PAGE 상에서 75, 50 및 14 kDa 분자량을 가진 세 서브유니트로 구성되어 있는 것으로 나타났는데, 이를 각각 분자량이 큰 순서대로 제 1 서브유니트, 제 2 서브유니트 및 제 3 서브유니트로 명명하였다(Choi et al., FEMS Microbiol. Lett., 125, 45(1995)).
그러나 좀 더 상세한 실험 결과, 29 kDa 분자량의 또 다른 서브유니트가 솔비톨 탈수소효소의 안정성에 매우 중요한 역할을 하는 것을 알게 되었다. 즉, DEAE-TSK 컬럼을 사용한 정제시의 단백질 분리능을 향상시키기 위하여 여러 pH 조건을 조사하던 중, pH 6.0에서 솔비톨 탈수소효소 활성을 가지는 피크가 급격히 효소활성을 상실하는 피크와 효소활성을 안정적으로 유지하는 피크의 두 피크로 분리되는 것을 발견하였다. 효소활성이 안정적으로 유지되는 피크는 급격히 효소활성을 상실하는 피크와는 달리 29 kDa 분자량의 서브유니트를 추가로 가지고 있음을 알게 되었으며, 이 서브유니트를 제 3 서브유니트로 재명명하였다. 즉, 14 kDa 분자량의 제 3 서브유니트는 다른 서브유니트와의 상대적 양 등을 감안할 때 진정한 서브유니트인지가 불확실하다.
이하 29 kDa 분자량의 제 3 서브유니트를 가지는 정제효소를 사용하여 솔비톨 탈수소효소의 특성을 좀 더 자세히 조사하였다.
솔비톨 탈수소효소는 솔비톨을 기질로 사용하였을 때의 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 상수는 Km=120 mM, Vmax=3.9×10-5M/min으로 조사되었다. 또한, 솔비톨 탈수소효소의 전자수용체로 디클로로페놀 인도페놀 (dichlorophenol indophenol; DCIP)이나 페리시아나이드(ferricyanide)가 효과적으로 작용하였고, 전자매개체로서 페나진메소설페이트(phenazine methosulfate: PMS)를 첨가할 경우 그 활성의 증가를 나타내었다. 정제된 효소는 칼슘 또는 마그네슘 이온에 의해 상당한 활성의 증가를 나타내는 반면, 구리 이온은 심한 저해현상을 나타내었다.
그러나, 솔비톨 탈수소효소는 원형질막에 결합하여 존재하고 있고, 그 회수율이 0.05% 정도에 불과하므로 이와 같은 추출, 정제에 의해 얻은 효소를 산업적으로 활용하는 데는 어려움이 많다는 문제점이 있다.
따라서, 본 발명자들은 비타민 C 및 글론산의 필수적인 전구체로 활용되는 솔보스의 생산에 필요한 효소인 솔비톨 탈수소효소를 대량생산할 수 있는 방법을 연구하던 중, 특히 산업적으로 중요한 원형질막에 존재하는 솔비톨 탈수소효소를 글루코노박터 서브옥시단스 균주로부터 분리, 정제하여 그 특성을 규명하여 정제된 효소는 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ)을 조효소로 포함하는 75 kDa 분자량의 탈수소효소 서브유니트인 제 1 서브유니트와 시토크롬 c인 50 kDa 분자량의 제 2 서브유니트, 그리고 솔비톨 탈수소효소의 안정성에 중요한 역할을 하는 29 kDa 분자량의 제 3 서브유니트를 가지는 막결합형 솔비톨 탈수소효소임을 알았으며 각 서브유니트의 아미노말단 아미노산 서열을 결정하였다. 그리고 솔비톨 탈수소효소의 유전자를 클로닝하여 그 DNA 염기서열을 해독함으로써 제 1 서브유니트와 제 2 서브유니트에 대한 DNA 염기서열을 결정할 수 있게 되었다.
본 발명의 목적은 글루코노박터 서브옥시단스(Gluconobacter suboxydans)의 원형질막에 존재하는 솔비톨 탈수소효소 및 이의 유전자를 제공하는 것이다.
도 1은 pH 5 및 pH 6의 초산완충액을 이용한 DEAE-TSK 컬럼 크로마토 그래피를 나타낸 것이다.
도 2는 DEAE-TSK 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리된 피크 I과 피크 II의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 글루코노박터 서브옥시단스의 솔비톨 탈수소효소 제 1 서브유니트의 아미노 말단을 포함하는 1.53 kb DNA 절편(#SDH 2-1)이 포함된 람다 GEM 5-1의 제한효소 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 람다 GEM 5-1을 제한효소 PstI으로 절단한 5.7 kb DNA 절편에 있어서, 여러 종류의 제한효소로 절단하여 제조한 S1, S2 및 S3 DNA 단편의 위치를 나타낸 것이다.
도 5는 제한효소 PstI으로 절단한 5.7 kb DNA 절편내의 염기서열을 나타낸 그림이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 75 kDa의 제 1 서브유니트(subunit), 50 kDa의 제 2 서브유니트 및 29 kDa의 제 3 서브유니트를 포함하는, 글루코노박터 서브옥시단스(Gluconobacter suboxydans)의 막결합형 솔비톨 탈수소효소 및 글루코노박터 서브옥시단스(KCTC 2111)의 제한효소 PstI에 의해 절단되는 5.7 kb 크기의 DNA 절편에 포함되는 솔비톨 탈수소효소 유전자를 제공한다.
글루코노박터 서브옥시단스(KCTC 2111)의 원형질막으로부터 일련의 컬럼을 이용하여 솔비톨 탈수소효소를 분리 정제한다. 정제된 효소의 여러 생화학적 특성을 규명하고, 각 서브유니트를 순수분리한 후 아미노산 서열 분석기(Applied Biosystems사, 477A)를 이용하여 각 서브유니트의 아미노말단 서열을 결정한다.
결정된 제 1 서브유니트의 아미노말단 아미노산 서열을 토대로 이에 대한 코돈을 활용하여 프라이머 1과 프라이머 2를 합성한다. 글루코노박터 서브옥시단스로부터 추출한 게놈 DNA를 플라스미드 pBluescript SK(Staratagene사)에 연결하고 프라이머 1과 2를 이용하여 SSP-PCR 방법에 따라 30 사이클을 실시하여 1.53kb 크기의 #SDH2-1 조각을 분리한다. 이 조각은 제 1 서브유니트의 아미노말단 일부를 포함한다. 이 #SDH2-1 조각을 플라스미드 pBluescript SK에 연결하고, 이를 이용하여 대장균을 형질전환시킨 후, 형질전환체를 배양하고 알칼리법으로 플라스미드를 추출한다.
솔비톨 탈수소효소의 유전자 라이브러리를 제조하기 위하여, 우선 글루코노박터 서브옥시단스로부터 추출한 게놈 DNA에 제한효소를 처리하여 람다 GEM-11(Promega사)에 클로닝한 다음, 라벨링된 #SDH2-1을 이용하여 상기 라이브러리로부터 람다 GEM 5-1을 분리한다. 이어서, 람다 GEM 5-1을 제한효소로 절단하여 약 5.7 kb 크기의 DNA 절편을 얻어서 DNA 서열을 분석한다. 이 절편을 제한효소 KpnI과 PstI, 제한효소 NotI과 SacII 및 제한효소 PstI과 SacI으로 절단하여 각각 S1 DNA 단편, S2 DNA 단편 및 S3 DNA 단편을 제조한다. 수득된 S1, S2 및 S3의 각 DNA 단편들을 ExoIII-멍빈(Mungbean)(Stratagene사)을 이용하여 DNA 염기서열을 해독할 수 있다.
이와 같이 해독된 염기서열을 분석하면, 글루코노박터 서브옥시단스의 솔비톨 탈수소효소에는 2265 bp로 구성되어 있고 79,139 Da의 분자량을 갖는 제 1 서브유니트 및 1437 bp로 구성되어 있고 51,368 Da의 분자량을 갖는 제 2 서브유니트가 제한효소 PstI으로 절단되는 5.7 kb 크기의 DNA 절편내에 연결되어 존재한다는 것을 알 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
실 시 예
(단계 1) 제 3 서브유니트의 분리 및 기능
글루코노박터 서브옥시단스(KCTC 2111) 균주로부터 솔비톨 탈수소효소의 정제과정 중 음이온 교환컬럼인 DEAE-TSK의 pH 변화에 따른 단백질 분리능 및 효소활성도의 안정성에 관하여 조사하였다.
CM-TSK 컬럼을 통해 부분정제된 시료를 pH 5 또는 pH 6의 10 mM 초산완충액을 이용하여 DEAE-TSK 컬럼 크로마토그래피를 수행한 뒤 활성을 나타내는 각 분획의 효소활성을 측정하였다.
도 1에서 보는 바와 같이, pH 6으로 용출한 경우(b)가 pH 5를 사용한 경우(a) 보다 그 분해능이 훨씬 더 높았으며, 효소 활성을 보이는 피크 I과 피크 II가 순수하게 분리되었다.
두 피크가 완전히 분리된 pH 6으로 용출한 DEAE-TSK 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리된 분획들의 SDS-PAGE 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2a는 첫 번째 활성 피크인 피크 I에서 용출된 분획들로서, 제 M 열은 표준분자량 단백질을 나타낸 것이고, 제 1 내지 4 열에서 보듯이, 제 1 서브유니트와 제 2 서브유니트인 75 kDa과 50 kDa 밴드는 관찰되지만 제 3 서브유니트인 29 kDa의 밴드가 나타나지 않았으며, 이 경우에는 용출 후 1 시간 후에는 약 10 배 이상의 효소활성이 감소되는 것을 알 수 있었다. 도 2b는 두 번째 활성 피크인 피크 II에서 용출된 분획들로서, 제 M 열은 표준분자량 단백질을 나타낸 것이고, 제 5 내지 8 열에서 보듯이, 두 서브유니트 외에도 제 3 서브유니트인 29 kDa 밴드가 존재하는 피크 II의 경우에는 효소활성이 그대로 유지되는 것을 확인하였다. 결국, 제 3 서브유니트인 29 kDa 분자량의 단백질은 솔비톨 탈수소효소의 작용기작과 밀접한 연관이 있는 전자전달계에 관여할 가능성이 있으며, 솔비톨 탈수소효소의 활성도를 안정화시키는 데에 기여하는 것으로 사료된다.
(단계 2) 제 1 서브유니트 및 제 3 서브유니트의 아미노말단 아미노산 서열 결정
글루코노박터 서브옥시단스(KCTC 2111)의 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ)을 조효소로 갖는 솔비톨 탈수소효소를 분리 정제하고(Choi, et al., FEMS Microbiol. Lett., 125, 45(1995)), 정제된 효소의 각 서브유니트를 순수분리한 뒤 아미노산 서열 분석기(Applied Biosystems사, 477A)를 이용하여 하기 서열 1의 제 1 서브유니트 및 하기 서열 2의 제 3 서브유니트의 아미노말단 서열을 결정하였다.
[서열 1]
Glu-Asp-Thr-Gly-Thr-Ala-Ile-Thr-Asn-Ala-Asp-Gln-His-Pro-Gly
[서열 2]
Ala-Gly-Thr-Pro-Leu-Lys-Ile-Gly-Val-Thr-Phe-Gln
(단계 3) 프라이머 제작 및 1.53 kb DNA 절편의 분리
결정된 제 1 서브유니트의 아미노말단 아미노산 서열을 토대로 이에 대한 코돈을 활용하여 프라이머 1(5'-CCGGAATTC GAA(G) GAT(C) ACI GGI ACI GC-3') 및 프라이머 2(5'-ATT(C,A) ACI AAT(C) GCI GAT(C) CAA(G) CAT(C) CC-3')를 합성하였다.
타케다와 시미즈의 방법(Takeda & Shimizu, J. Ferm. Bioeng., 72, 1(1991))에 따라 글루코노박터 서브옥시단스로부터 추출한 게놈 DNA를 제한효소 BamHI으로 부분절단하였다. 이어서 플라스미드 pBluescript SK(Stratagene사)를 NaeI과 BamHI으로 절단한 후, BamHI 위치에 부분절단된 게놈 DNA를 연결하였다.
상기 프라이머 1과 프라이머 2, 및 T7 프라이머를 이용하여 SSP-PCR 방법(White, B., SSP-PCR and genome walking, in Method in Mol. Biol. PCR protocols, Humana Press, 15, 339(1993))에 따라 30 회 실시한 후, 1.53 kb 크기의 절편 #SDH2-1을 분리하였다.
분리된 #SDH2-1 절편을 플라스미드 pBluescript SK에 연결하고 이를 이용하여 대장균 DH5α을 형질전환시킨 후, 앰피실린 100 ㎍/mL이 첨가된 LB 배지에서 배양하였다. 이어서 알칼리법(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, CSH Press, p.1.25 (1989))으로 플라스미드를 추출하여 이를 프라이머 1 및 프라이머 2와 반응시켰을 때 양성으로 반응하였으며, 이 #SDH2-1 절편은 제 1 서브유니트의 아미노말단 일부를 포함하지만 카르복시말단 부분을 갖고 있지 않았다.
(단계 4) 1.53 kb DNA 절편을 이용한 15 kb DNA 절편의 분리
#SDH2-1을 DIG(베링거만하임사)으로 라벨화하였다(Ausubel, F. et al., Current Protocols in Mol. Biol., Wiley & Sons Inc., p.2.4.1 (1987)).
솔비톨 탈수소효소의 유전자 라이브러리를 제조하기 위하여, 상기 (단계 3)과 같은 방법으로 글루코노박터 서브옥시단스(KCTC 2111)로부터 게놈 DNA를 추출하고 이를 제한효소 Sau3A로 부분절단한 15 내지 23 kb 크기의 DNA를 람다 GEM-11(Promega사)의 BamHI 위치에 클로닝하였다.
상기 라벨링된 #SDH2-1을 이용하여 상기 라이브러리로부터 15 kb 크기의 람다 GEM 5-1을 분리하였다.
도 3은 람다 GEM 5-1의 제한효소 지도를 나타낸 것이다.
(단계 5) 15 kb DNA 절편 중 PstI 절단부위의 염기서열 해독
람다 GEM 5-1을 제한효소 PstI으로 절단하여 #SDH2-1을 포함하는 약 5.7 kb 크기의 DNA 절편을 얻었다.
염기서열 해독을 용이하게 하기 위하여, 5.7 kb DNA 절편을 각각 제한효소 KpnI과 PstI으로 절단한 S1 DNA 단편, 제한효소 NotI과 SacII로 절단한 S2 DNA 단편 그리고 제한효소 PstI과 SacI으로 절단한 S3 DNA 단편을 제조하였다.
도 4는 람다 GEM 5-1을 제한효소 PstI으로 절단하여 얻은 #SDH2-1을 포함하는 약 5.7 kb 크기의 DNA 절편에 있어서, 여러 종류의 제한효소로 절단하여 제조한 S1, S2 및 S3 DNA 단편의 위치를 나타낸 것이다.
각 S1, S2 및 S3 DNA의 염기서열을 ExoIII-멍빈(Mungbean)(Stratagene사)을 이용하여 해독하였다.
도 5는 제한효소 PstI으로 절단한 5.7 kb DNA 절편내의 염기서열을 나타낸 것이다.
여기에서 보듯이, 샤인-달가노 서열인 'AGGA'는 651∼654 bp에 위치하고, 제 1 서브유니트의 시그날 서열은 665∼766 bp에 위치하며, 이 시그날 펩티드가 잘려진 제 1 서브유니트를 코드하는 서열은 767∼2926 bp에 존재하였다. 이것은 754 개의 아미노산을 코딩하며, 그 아미노말단 서열이 제 1 서브유니트의 아미노말단 서열분석 결과 밝혀진 15 개의 아미노산 서열과 일치하는 것을 알 수 있었다. 이어서 2950∼2953 bp에 샤인-달가노 서열(AGGA)이 존재하고, 제 2 서브유니트는 2964∼4400 bp에 위치하였으며, 이것은 478 개의 아미노산을 코딩하며, 정지코돈에 이어서 역위 반복서열이 여러개 존재하였다. 또한, 이상의 염기서열로부터 유추된 활성형 단백질의 분자량은 제 1 서브유니트는 79 kDa, 제 2 서브유니트는 51 kDa으로써, 동효소의 전기영동상 결과인 75 kDa 및 50 kDa 분자량과 유사함을 알 수 있었다.
그리고 세균내에서 발견되는 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ)을 조효소로 포함하는 탈수소효소들의 아미노말단과 카르복시말단 부위에서 특징적으로 일치하여 나타나는 서열들이 제 1 서브유니트 내에 존재함을 알 수 있었고, 아미노말단 부위에 존재하는 특정적인 일치서열은 하기 서열 3에 나타내었고, 카브록시말단 부위에 존재하는 특정적인 일치서열은 하기 서열 4에 나타내었다. 이는 제 1 서브유니트가 조효소로 피롤로퀴놀린 퀴논을 포함하고 있음을 증명하는 또 다른 증거라 할 수 있다(여기에서 Xaa는 임의의 아미노산이다).
[서열 3]
〔Asp/Glu/Asn〕-Trp-Xaa-Xaa-Xaa-Gly-〔Arg/Lys〕-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-〔Phe/Tyr/Trp〕-Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-〔Leu/Ile/Val/Met〕-Xaa-Xaa-Xaa-Asn-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-〔Arg/Lys〕
[서열 4]
Trp-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Tyr-Asp-Xaa-Xaa-Xaa-〔Asp/Asn〕-〔Leu/Ile/Val/Met/ Phe/Tyr〕-〔Leu/Ile/Val/Met/Phe/Tyr〕-〔Leu/Ile/Val/Met/Phe/Tyr〕-〔Leu/Ile/ Val/Met/Phe/Tyr〕-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-〔Ser/Thr/Ala〕-Pro
이 외에도 하기 서열 5의 헴(heme) 결합서열이 제 1 서브유니트와 제 2 서브유니트 내에 하나 또는 세 개가 존재함을 확인하였다(여기에서 Xaa는 임의의 아미노산이고, Yaa는 Xaa와는 다른 임의의 아미노산이다).
[서열 5]
Cys-Xaa-Yaa-Cys-His
DNA 염기서열의 동일성을 분석한 결과, 제 1 서브유니트의 DNA 염기서열은 피롤로퀴놀린 퀴논을 조효소로 포함하는 여러 탈수소효소와 높은 유사성을 보였는데, 특히 아세토박터 폴리옥소제네스(Acetobacter polyoxogenes)와 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti)의 알코올 탈수소효소와 각각 77%(Tamaki, T. et al., BBA., 1088, 292(1991))와 70%(Inoue, T. et al., J. Bacteriol., 171, 3115(1989))의 동일성을 보였다. 제 2 서브유니트의 DNA 염기서열은 글루코노박터 서브옥시단스 IFO 12528의 시토크롬 c-553(Takeda and Shimizu, J. Ferm. Bioeng., 72, 1(1991))의 서열과 가장 높은 동일성을 나타냈는데, DNA 염기상 동일성은 83%, 아미노산 서열상 동일성은 88%로 나타났다.
이와 같이 제 1 서브유니트와 제 2 서브유니트는 하나의 오페론에 위치함을 확인하였다. 한편 29 kDa을 코드하는 제 3 서브유니트는 아직 발견하지 못하였다.
이상에서 글루코노박터 서브옥시단스(KCTC 2111)의 솔비톨 탈수소효소의 유전자는 2265 bp에 의해 코드되는 제 1 서브유니트, 1437 bp에 의해 코드되는 제 2 서브유니트를 포함하며, 이들 서브유니트는 제한효소 PstI으로 절단되는 5.7 kb 크기의 DNA 절편내에 연결되어 있음을 알 수 있다. 이들 염기서열은 GenBank에 제 U26263 호로서 1995 년 5 월 4 일에 등록되어 있다.

Claims (8)

  1. 다음의 물리화학적 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 글루코노박터 서브옥시단스(Gluconobacter suboxydans)의 막결합형 솔비톨 탈수소효소:
    1) 구성 : 75 kDa의 제 1 서브유니트(subunit), 50 kDa의 제 2 서브유니트 및 29 kDa의 제 3 서브유니트를 포함함;
    2) 기질 특이성 : 솔비톨, 만니톨, 리비톨에 대해 특이성이 있음;
    3) 전자수용체 : 디클로로페놀 인도페놀(dichlorophenol indophenol)이나 페리시아나이드(ferricyanide)가 효과적으로 작용하고 전자매개체로서 페나진메토설페이트(phenazinemethosulfate)를 첨가할 경우 활성의 증가를 나타냄;
    4) 활성 : 구리이온에 의해 심한 활성저해를 받고; 칼슘 또는 마그네슘에 의하여 활성이 증가됨;
    5) 조효소 : 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ)을 조효소로 요구함.
  2. 제 1 항에 있어서,
    제 1 서브유니트 내에 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ)을 조효소로 포함하는 솔비톨 탈수소효소.
  3. 제 1 항에 있어서,
    제 1 서브유니트가 하기 서열 1의 아미노말단 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 솔비톨 탈수소효소.
    서열 1
    Glu-Asp-Thr-Gly-Thr-Ala-Ile-Thr-Asn-Ala-Asp-Gln-His-Pro-Gly
  4. 제 1 항에 있어서,
    제 3 서브유니트가 하기 서열 2의 아미노말단 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 솔비톨 탈수소효소.
    서열 2
    Ala-Gly-Thr-Pro-Leu-Lys-Ile-Gly-Val-Thr-Phe-Gln
  5. 제 2 항에 있어서,
    피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ)을 조효소로 포함하는 효소의 아미노말단 부위에 특징적으로 나타나는 하기 서열 3의 아미노산 서열을 제 1 서브유니트 내에 포함하는 것을 특징으로 하는 솔비톨 탈수소효소(여기에서 Xaa는 임의의 아미노산이다):
    서열 3
    〔Asp/Glu/Asn〕-Trp-Xaa-Xaa-Xaa-Gly-〔Arg/Lys〕-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-〔Phe/Tyr/Trp〕-Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-〔Leu/Ile/Val/Met〕-Xaa-Xaa-Xaa-Asn-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-〔Arg/Lys〕
  6. 제 2 항에 있어서,
    피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ)을 조효소로 포함하는 효소의 카르복시말단 부위에 특징적으로 나타나는 하기 서열 4의 아미노산 서열을 제 1 서브유니트 내에 포함하는 것을 특징으로 하는 솔비톨 탈수소효소(여기에서 Xaa는 임의의 아미노산이다):
    서열 4
    Trp-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Tyr-Asp-Xaa-Xaa-Xaa-〔Asp/Asn〕-〔Leu/Ile/Val/Met/Phe/Tyr〕-〔Leu/Ile/Val/Met/Phe/Tyr〕-〔Leu/Ile/Val/Met/Phe/Tyr〕-〔Leu/Ile/Val/Met/Phe/Tyr〕-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-〔Ser/Thr/Ala〕-Pro
  7. 제 1 항에 있어서,
    제 1 서브유니트 및 제 2 서브유니트가 하기 서열 5의 헴(heme) 결합서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 솔비톨 탈수소효소(여기에서 Xaa는 임의의 아미노산이고, Yaa는 Xaa와는 다른 임의의 아미노산이다).
    서열 5
    Cys-Xaa-Yaa-Cys-His
  8. 글루코노박터 서브옥시단스(KCTC 2111)의 제한효소 PstI에 의해 절단하는 5.7 kb 크기의 DNA 절편에 포함되는, 2265 bp의 제 1 서브유니트가 하기 서열 6의 염기서열을 포함하고 1437 bp의 제 2 서브유니트가 하기 서열 7의 염기서열을 포함하는 솔비톨 탈수소효소 유전자:
    [서열 6]
    Figure pat00001
    Figure pat00002
    [서열 7]
    Figure pat00003
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