JP2004113040A - 新規なフラビンレダクターゼ及び該酵素をコードするdnaおよび該dnaで形質転換された形質転換細胞 - Google Patents
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Abstract
【課題】熱安定性の高い新規なフラビンレダクターゼ及びそれをコードするDNAが提供する。
【解決手段】電子供与体としてNADHおよび電子受容体としてFMNを基質とし、NAD+およびFMNH2を生成する作用を示し、その反応の至適温度が65℃から75℃の範囲にあり、pH7で70℃以下の温度においては、30分間放置してもその活性を80%以上保持しているフラビンレダクターゼ。
【選択図】 図1
【解決手段】電子供与体としてNADHおよび電子受容体としてFMNを基質とし、NAD+およびFMNH2を生成する作用を示し、その反応の至適温度が65℃から75℃の範囲にあり、pH7で70℃以下の温度においては、30分間放置してもその活性を80%以上保持しているフラビンレダクターゼ。
【選択図】 図1
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フラビンレダクターゼ依存型酵素による酸化還元反応を産業上実用的な実現するために重要な、新規フラビンレダクターゼ及び該酵素をコードするDNAおよび該DNAで形質転換された形質転換細胞に関する。
【0002】
【従来の技術】
フラビンレダクターゼの起源としては、ロドコッカス(Rhodococcus) 属(Applied and Environmental Microbiology Vol. 67, No. 3, p1179−1184, 2002 年)、パエニバチルス属(Paenibacillus)属(Journal of Bioscience andBioengineering Vol.90,No.6,p607−613,2000年)などの細菌、放線菌に属する微生物が知られている。それらに由来するフラビンレダクターゼの物理化学的特性、生化学的特性、アミノ酸配列、DNA配列などが報告されている。また、フラビンレダクターゼの工業的利用に関して、ロドコッカススピーシーズIGTS8由来のフラビンレダクターゼによるジベンゾチオフェンの酸化的脱硫などが報告されている(特許公表2002−515727)。
【0003】
しかしながら、これらのフラビンレダクターゼの熱安定性は必ずしも高くない。最も熱安定性の高いパエニバチルス属(Paenibacillus)属由来のフラビンレダクターゼでも、65℃で30分間熱処理した際の残存活性は20%と報告されている(Journal of Bioscience and Bioengineering Vol.90,No.6,p607−613,2000年)。産業上実用的にフラビンレダクターゼを利用するためには、より熱安定性の高いフラビンレダクターゼが望まれていた。
【0004】
【特許文献1】特表2002−515727公報)
【0005】
【非特許文献1】Journal of Bioscience and Bioengineering Vol.90,No.6,p607−613,2000年)
【0006】
【非特許文献2】Journal of Bioscience and Bioengineering Vol.90,No.6,p607−613,2000年)
【0007】
【非特許文献3】Journal of Bioscience and Bioengineering Vol.90,No.6,p607−613,2000年)
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、産業上実用的な熱安定性を持つ新規なフラビンレダクターゼ及び該酵素をコードするDNAおよび該DNAで形質転換された形質転換細胞及びその生産方法を提供することにある。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく、種々の微生物由来のフラビンレダクターゼについて、それらの熱安定性を評価したところ、好熱性バチルス属(Bacillus)細菌である、バチルス・エスピーDSM411(Bacillus sp.DSM411)に、熱安定性の高いフラビンレダクターゼを見出した。そして、本酵素を単離精製しその物理的・生化学的性状、アミノ酸配列およびDNA配列を明らかにし、さらにその形質転換細胞による効率的生産方法を開発することに成功し、本発明を完成するに至った。
【0010】
上記の本発明者らによる新たな知見に基づいて成された本発明は以下の各態様を含むものである。
(1) 電子供与体としてNADH、および電子受容体としてFMNを基質とし、NAD+およびFMNH2を生成する作用を示し、その反応の至適温度が65℃から75℃の範囲にあり、pH7で70℃以下の温度においては、30分間放置してもその活性を80%以上保持しているフラビンレダクターゼ。
(2) N末端から30残基目までのアミノ酸配列が配列表の配列番号:1記載の請求項1記載のフラビンレダクターゼ。
(3) アミノ酸配列が、配列表の配列番号:3記載の配列である請求項1または2記載のフラビンレダクターゼ。
(4) フラビンレダクターゼをコードする塩基配列であって、
(a)配列表の配列番号:4記載の塩基配列または、
(b)前記配列番号:4の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
(5) 請求項4記載のDNAを含むプラスミド。
(6) 請求項5に記載のプラスミドによって形質転換された形質転換細胞。
(7) 請求項6に記載の形質転換体を培養して、該形質転換体に組み込まれたプラスミドの有する塩基配列によりコードされたフラビンレダクターゼを生産させることを特徴とするフラビンレダクターゼの生産方法。
【0011】
本発明にかかるフラビンレダクターゼを用いることでフラビンレダクターゼ依存型酵素による酸化還元反応を産業上実用的に行うことができる。
【0012】
【発明の実施の形態】
本発明にかかるフラビンレダクターゼは、電子供与体としてNADH、および電子受容体としてFMNを基質とし、NAD+およびFMNH2を生成する作用を示し、その反応の至適温度が65℃から75℃の範囲にあり、pH7で70℃以下の温度においては、30分間放置してもその活性を80%以上保持しているという特性により規定することができる。
【0013】
以下に本発明を詳細に説明するが、本発明にかかるフラビンレダクターゼは上記の特性を有するものであり、上記特性を有する酵素であれば、いかなる微生物由来であっても本発明に包含されるものとする。
【0014】
(1)フラビンレダクターゼを含有する微生物及び培養法
本発明による新規なフラビンレダクターゼは、Bacillus sp.DSM411から単離・精製した。
Bacillus sp.DSM411は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen(DSM)、財団法人発酵研究所(IFO)、ATCC、JCMなどの菌株保存機関より分譲を受けることができる。
【0015】
本微生物の培養は、公知の培養方法に準じて行うことができる。使用する培地は、一般微生物の栄養源として公知のものが使用でき、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、NZアミン等の有機栄養源、グルコース、マルトース、しょ糖、デンプン、有機酸等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素、塩化アンモニウム等の窒素源、リン酸塩、マグネシウム、カリウム、鉄等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合わせて使用できる。培地のpHは、6〜9の範囲で選べばよく、培養温度は30〜80℃、好ましくは45〜55℃で好気的に培養を行う。培養期間は1〜7日間の範囲で目的のフラビンレダクターゼの含量が最大になるまで培養すればよい。
【0016】
(2)フラビンレダクターゼの精製
フラビンレダクターゼの精製は、通常の酵素精製法を用いることができる。培養収量液より遠心分離等により菌体を集め、超音波処理、フレンチプレス、ダイノミル等の機械的方法によって菌体を破砕する。細胞片等の固形物を遠心により除き、粗酵素液を得る。次に硫酸アンモニウム等による塩析、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、結晶化等を行うことにより精製される。これについては実施例にて1例を記載する。
【0017】
(3)フラビンレダクターゼの活性測定法
20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)、0.5mMNADH、0.02mMFMN、および適当量のフラビンレダクターゼからなる0.5mlの反応液中で酵素反応を行う。反応は65℃で行い、この際分光光度計を用いて340nmの吸光度をモニターする。NADHの340nmにおける吸光係数をε=6220M−1cm−1とし、340nmの吸光度の減少速度からNADHの減少速度を算出することにより酵素活性を算出した。酵素活性をあらわす単位Uは、μmol/mg・minとする。酵素の添加量は、340nmの吸光度減少速度から適切な添加量を設定すればよい。
【0018】
(4)酵素の均一性
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動をトリス−グリシン緩衝液を用い4−20%ゲルにて、Laemmliの方法(Nature.227.680.1970年)で行った。クマシーブルーで染色後、均一な1本のタンパク質バンドが見られ、公知の標準タンパク質との比較から、このタンパク質の分子量は、16000±2000となった。
【0019】
(5)N末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列の決定法
精製されたフラビンレダクターゼのN末端及び内部アミノ酸配列は、各種アミノ酸シーケンサーで決定するすることができる。内部アミノ酸配列については、精製されたフラビンレダクターゼをCNBr等で処理し部分分解したのち、高速液体クロマトグラフィーで断片を取得することで解析することができる。
この結果、配列表1に示したN末端アミノ酸配列の30残基及び配列表1に示した内部アミノ酸配列の19残基を決定した。
また本発明におけるフラビンレダクターゼの熱安定性は、20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)に溶解した酵素溶液を、10、20、30、40、50、60、70、75、80、90、100℃の各温度にて30分間熱処理を行った後、上記の活性測定法と同様の方法で酵素反応を行い、熱処理を施さない酵素の活性を100%として活性の残存残存率を算出することにより規定することができる。
さらに本発明におけるフラビンレダクターゼの至適反応温度は、20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)に溶解した酵素溶液を、30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100℃の各温度で、上記の活性測定法に準じてと酵素反応を行うことで規定することができる。
【0020】
本発明にかかるフラビンレダクターゼの物性は以下のとおりである。
分子量 :16000±2000(SDS−PAGE)
至適pH:pH5〜7
至適温度:65℃〜75℃
熱安定性:70℃/30分の熱処理で80%の残存活性を示す。
基質特異性:電子受容体 FMN、FAD及びリボフラビン、ルミフラビン等のフラビン化合物、4−ニトロアセトフェノン、4−ニトロ安息香酸等の芳香族ニトロ化合物、メチレンブルー等を電子受容体とする。なかでも、FMNが最も好適な電子受容体である。
電子供与体 NADH、NADPHを電子供与体とするが、NADPHを電子供与体とするときの活性は、NADHを電子供与体とするときの10%以下である。
【0021】
本発明におけるフラビンレダクターゼの一態様は、配列表の配列番号:3に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号:3に記載のアミノ酸配列に1もしくは2以上、好ましくは数個のアミノ酸がフラビンレダクターゼ活性を保持する範囲内で置換、欠失、修飾または挿入または付加されたアミノ酸配列を有する。
【0022】
本発明におけるフラビンレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは配列表の配列番号:4に記載の塩基配列を含む。配列番号:4に示す塩基配列は、配列番号:2に示すタンパク質をコードする。ただし、配列番号:4に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列には、配列番号:3に示す塩基配列のみならず、異なるコドンに基づくあらゆる塩基配列が含まれる。更に適宜置換、欠失、修飾または挿入または付加を導入する事によりポリヌクレオチドのホモログを得る事も可能である。本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは配列番号:4に示す塩基配列に対して、これによりコードされるD−アシルアミラーゼが所定の酵素活性を維持し得る範囲内で塩基の置換、欠失または付加を行って得られるものである。このホモログには、例えば、配列番号:4の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできる塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【0023】
このストリンジェントな条件でのハイブリダイゼ−ションは、例えばMolecular Cloning:Cold Spring Harbor Laboratory Press,Current Protocols in Molecular Biology;Wiley Interscienceに記載の方法によって行なう事ができ、市販のシステムとしては、GeneImageシステム(アマシャム)を挙げる事ができる。具体的には以下の操作によってハイブリダイゼ−ションを行なう事ができる。試験すべきDNAまたはRNA分子を転写した膜を製品プロトコールに従って、標識したプローブとプロトコール指定のハイブリダイゼ−ションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼ−ションバッファーの組成は、0.1重量%SDS、5重量%デキストラン硫酸、1/20溶のキット添付のブロッキング試薬及び2〜7×SSCからなる。ブロッキング試薬としては例えば、100×Denhardt‘s solution、2%(重量/容量)Bovine serum albumin、2%(重量/容量)FicllTM400、2%(重量/容量)ポリビニルピロリドンを5倍濃度で調製したものを1/20に希釈して使用する事ができる。20×SSCは、3M塩化ナトリウム、0.3Mクエン酸溶液であり、SSCは、より好ましくは3〜6×SSC、更に好ましくは4〜5×SSCの濃度で使用する。ハイブリダイゼ−ションの温度は40〜80℃、より好ましくは50〜70℃、更に好ましくは55〜65℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行なった後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は6×SSC+0.1重量%SDS溶液、より好ましくは4×SSC+0.1重量%SDS溶液、更に好ましくは1×SSC+0.1重量%SDS溶液、最も好ましくは0.1×SSC+0.1重量%SDS溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたDNA分子またはRNA分子をプローブに用いた標識を利用して識別する事ができる。
【0024】
本発明の新規なフラビンレダクターゼをコードするDNAは、例えば、以下の様な方法によって単離することができる。微生物からゲノムDNAを精製し、制限酵素によって消化した後に得られたDNAを超遠心分離もしくは電気泳動等によって、その長さによって分画する。その分画試料のDNAを回収してプラスミドに組み込むことによってプラスミドライブラリーを作成する。その中からフラビンレダクターゼ遺伝子を持つクローンを選抜してフラビンレダクターゼ遺伝子をコードするDNAを含むプラスミドを取得する。
【0025】
フラビンレダクターゼ遺伝子の選抜は、N末端アミノ酸及び内部アミノ酸配列からプローブとなるオリゴヌクレオチドを合成し、ハイブリダイゼーション等の方法で行うことができる。
そのプラスミドの塩基配列を解析することによって、目的のフラビンレダクターゼ遺伝子をコードするDNAの塩基配列が判明し、DNAの塩基配列からコードされているフラビンレダクターゼのアミノ酸配列を推定することが出来る。
【0026】
上記のようにして単離された本発明のフラビンレダクターゼをコードするDNAを、例えば宿主が大腸菌の場合、pUC18、pBR322、BluescriptII SK(−)、pSC101などに代表される発現用のプラスミドに組み込むことにより、フラビンレダクターゼ発現プラスミドが提供される。尚、形質転換に使用する宿主生物としては、組換えベクターが安定、かつ自律的に増殖可能で、さらに外来性DNAの形質が発現できるものであればよく、例として大腸菌が挙げられるが、特に大腸菌に限定されるものではない。
【0027】
そして、本発明においては該プラスミドで形質転換して得られた形質転換体を公知の情報に基づいて、培養することができ、本発明のフラビンレダクターゼを産生させることができる。培地としては炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば合成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行なう事が出来る。培養条件は、培養の種類、培養方法により適宜選択すればよく、菌株が生育しフラビンレダクターゼを産生できる条件であれば特に制限はない。
【0028】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【0029】
実施例1:バチルス エスピー(Bacillus sp.)DSM411の培養
蒸留水1リットル中に、ポリペプトン5g、グリセロール2g、酵母エキス2g、エーリッヒ肉エキス2g、リン酸水素2カリウム2g、リン酸水素1カリウム1g、硫酸マグネシウム7水和物0.1g、塩化カルシウム0.05gを含み、pH7.2に調整した液体培地にあらかじめブイヨン寒天プレートに生育させた菌体を接種し55℃、18時間振とう培養してフラビンレダクターゼの活性を有する菌体を得た。
【0030】
実施例2:フラビンレダクターゼの精製
実施例1に示される方法でバチルス エスピー(Bacillus sp.)DSM411を培養して菌体を回収し、0.05Mトリス塩酸バッファー(pH8.0)に懸濁した。懸濁液の状態で超音波破砕機によって菌体を破砕し、冷却遠心分離にて菌体破砕物を除去し、Cell−free extractを得た。
このCell−free extractを上記バッファーで平衡化したQ−セファロースカラムに供し、同バッファーで洗浄後、0.1M塩化カリウムを含むバッファーで溶出し、フラビンレダクターゼ活性を持つ画分を得た。
次にこの画分を2.0M硫酸アンモニウムを含む上記バッファーで平衡化したフェニルトヨパールカラムに供し、同バッファーで洗浄後、1.4M硫酸アンモニウムを含むバッファーで溶出し、フラビンレダクターゼ活性を持つ画分を得た。
さらに、得られた画分を1.5Mリン酸カリウムバッファー(pH8.0)で平衡化したFMN−アガロースカラムに供し、同バッファーおよび0.9Mリン酸カリウムバッファー(pH8.0)で洗浄後、蒸留水で溶出し、フラビンレダクターゼ活性を持つ画分を得た。
最後に0.05Mトリス塩酸バッファー(pH8.0)で平衡化したスーパーデックスによるゲルクロマトグラフィーを行い、フラビンレダクターゼの精製酵素液を得た。精製過程の総括した結果を、表1に示した。
【0031】
【表1】
【0032】
この精製酵素液の一部を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、分子量約16000Daの位置にバンドを確認した。
この56kDaタンパク質についてN末端アミノ酸配列の分析をアミノ酸シークエンサーを用い行ったところ、配列番号:1に示す様に部分断片のアミノ酸配列であると決定された。
さらに、精製酵素液の一部をエバポレーターにより乾固させた後、70%ギ酸に溶解させ、CNBrを添加し、窒素を充填した容器中で一晩放置した。得られた標品をエバポレーターにより乾固し、0.1%トリフルオロ酢酸に溶解し、HPLCに供した。Wakosil−II 5C18ARカラムを用い、20分まで0.1%トリフルオロ酢酸で洗浄後、20分から120分にかけてアセトニトリル濃度を0から100%まで上昇させて溶出し、ペプチド断片を分離した。
分取した断片のアミノ酸配列の分析をアミノ酸シークエンサーを用い行ったところ、配列番号:2に示す様に決定された。
【0033】
実施例3:フラビンレダクターゼの熱安定性及び至適反応温度の測定
実施例2で得られたフラビンレダクターゼを、20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)に溶解し、10、20、30、40、50、60、70、75、80、90、100℃の各温度にて30分間熱処理を行った。その後、20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)、0.5mMNADH、0.02mMFMN、および適当量の熱処理酵素液からなる0.5mlの反応液中で酵素反応を行った。反応は65℃で行い、この際分光光度計を用いて340nmの吸光度をモニターした。NADHの340nmにおける吸光係数をε=6220M−1cm−1とし、340nmでの吸光度の減少速度からNADHの減少速度を算出することにより酵素活性を算出した。熱処理を施さない際の酵素活性を100%として、各熱処理後の活性残存残存率を算出した結果を図1に示した。
【0034】
フラビンレダクターゼの至適反応温度は、20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)に溶解した酵素溶液を、反応温度のみを30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100℃の各温度に設定し、上記の活性測定法に準じてと酵素反応を行った。70℃での酵素活性を100%として、各反応温度の相対活性値を図2に示した。
【0035】
実施例4:フラビンレダクターゼプローブの作製
実施例1に示した培養方法でバチルス エスピー(Bacillus sp.)DSM411を2日間培養し、遠心分離で菌体を回収し、0.05Mトリス塩酸バッファー(pH8.0)で洗浄した。この菌体より「基礎生化学実験法2 抽出・分離・精製 阿南功一他著 丸善株式会社出版」記載によるバクテリアゲノムDNAの分離方法に従い、ゲノムDNAを調製した。
【0036】
実施例2で決定したフラビンレダクターゼのN末端アミノ酸配列と内部アミノ酸配列をもとに、配列番号5及び配列番号6に示したフラビンレダクターゼ遺伝子増幅用プライマーを設計し、DNA合成装置で合成した。
調製したゲノムDNAとフラビンレダクターゼ遺伝子増幅用プライマーを用い以下の条件で、PCRを行いフラビンレダクターゼ遺伝子断片を増幅した。その結果、約450bpの増幅断片を得た。
この増幅断片を、ロシュ・ダイアグノスティックス社製ジギキシゲニンラベルかキットを用い蛍光ラベルし、フラビンレダクターゼプローブとした。
【0037】
【0038】
実施例5:フラビンレダクターゼプローブによるサザンハイブリダイゼーション
実施例4で調製したゲノムDNAを各種制限酵素で完全消化し、アガロースゲル電気泳動を行った後、DNAをメンブレンにブロッティングし、実施例4で調製したフラビンレダクターゼプローブを用い、以下の条件でサザンハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼ−ションバッファーの組成は、0.1重量%SDS、5重量%デキストラン硫酸、1/20溶のキット添付のブロッキング試薬及び2〜7×SSCからなる。ブロッキング試薬としては例えば、100×Denhardt‘s solution、2%(重量/容量)Bovine serum albumin、2%(重量/容量)FicollTM400、2%(重量/容量)ポリビニルピロリドンを5倍濃度で調製したものを1/20に希釈して使用する事ができる。20×SSCは、3M塩化ナトリウム、0.3Mクエン酸溶液であり、SSCは、より好ましくは3〜6×SSC、更に好ましくは4〜5×SSCの濃度で使用する。ハイブリダイゼ−ションの温度は40〜80℃、より好ましくは50〜70℃、更に好ましくは55〜65℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行なった後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は6×SSC+0.1重量%SDS溶液、より好ましくは4×SSC+0.1重量%SDS溶液、更に好ましくは1×SSC+0.1重量%SDS溶液、最も好ましくは0.1×SSC+0.1重量%SDS溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、蛍光フラビンレダクターゼプローブがハイブリダイズしたDNA分子を検出した。
その結果、制限酵素Eco RI及びHindIIIで完全消化した約5.5kbの位置にバンドが検出された。
【0039】
実施例6: バチルス エスピー(Bacillus sp.)DSM411のゲノミックDNAライブラリー作成
実施例4調製したゲノムDNAを制限酵素Eco RI及びHindIIIで完全消化してアガロースゲル電気泳動にてDNAの長さによって分画し、約5.5kbのDNAを回収した。そのDNAを、制限酵素Eco RI及びHindIIIで消化して5’末端を脱リン酸化したベクターpBluescript IISK(−)に連結し、プラスミドライブラリーを作成した。このプラスミドライブラリーによって大腸菌DH5αを形質転換したものを50μg/mlのアンピシリンを添加したLB(Luria−Bertani)アガロース培地に塗布して静置培養し、コロニーを出現させた。
【0040】
実施例7:プラスミドライブラリーからのフラビンレダクターゼ遺伝子のクローニング
実施例6で出現した個々のコロニーをメンブレンにトランスファーし、フラビンレダクターゼプローブを用いコロニーハイブリダイゼーションを行い、ポジティブクローンを選抜した。
このクローンからプラスミドDNAを抽出し、制限酵素SalIで消化し2.2kbのDNA断片を回収した。このDNA断片をベクターpBluescript IISK(−)に連結し、プラスミドpBFR411を得た。さらに、2.2kbの挿入DNA断片の塩基配列をDNAシークエンサーで決定した。塩基配列の決定はPE Applied Biosystems社、BigDye Teminator Cycle Sequencing kitを用い、同社製Genetic Analyzer 310にて行った。その結果配列番号4に示すフラビンレダクターゼ遺伝子をコードするDNAの塩基配列が得られた。該フラビンレダクターゼ遺伝子の塩基配列をアミノ酸翻訳したものを配列番号3に示す。そのアミノ酸配列中には、実施例2で決定した配列番号1に示すフラビンレダクターゼN−末端アミノ酸配列及び配列番号2に示す内部アミノ酸配列が含まれた。また、該アミノ酸配列からフラビンレダクターゼの分子量は約17kDaと推定された。
【0041】
実施例8:フラビンレダクターゼ遺伝子を含むDNAによって形質転換した大腸菌によるフラビンレダクターゼの生産
(菌体懸濁液の調製)
実施例7で作製したプラスミドpBFR411で形質転換した大腸菌をアンピシリン(50μg/ml)及び1mMのイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を含むLB培地で16時間37℃で振とう培養を行なった。培養後、遠心分離により集菌、0.05Mトリス塩酸バッファー(pH7.0)で洗浄後に菌体を0.05Mトリス塩酸バッファー(pH7.0)に懸濁した。
(フラビンレダクターゼ発現確認)
菌体懸濁を超音波葉再処理にかけ、無細胞抽出液を調製した。この無細胞抽出液をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した結果、16KDaの位置にタンパク質のバンドが確認できた。
(フラビンレダクターゼ活性測定)
20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)、0.5mMNADH、0.02mMFMN、および適当量の無細胞抽出液からなる0.5mlの反応液中で酵素反応を行った。反応は65℃で行い、この際分光光度計を用いて340nmの吸光度をモニターした。NADHの340nmにおける吸光係数をε=6220M−1cm−1とし、340nmでの吸光度の減少速度からNADHの減少速度を算出することにより酵素活性を算出した。
その結果、プラスミドpBFR411で形質転換しない宿主大腸菌に対し約7倍のフラビンレダクターゼ活性が検出された。
【0042】
【発明の効果】
本発明により、熱安定性の高い新規なフラビンレダクターゼ及びそれをコードするDNAが提供される。本発明のフラビンレダクターゼは産業上の有用性に優れた酵素であり、フラビンレダクターゼ依存型酵素による酸化還元反応を産業上実用的に実現することができる。
【0043】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】フラビンレダクターゼの熱安定性を示す図である。
【図2】フラビンレダクターゼの至適反応温度を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、フラビンレダクターゼ依存型酵素による酸化還元反応を産業上実用的な実現するために重要な、新規フラビンレダクターゼ及び該酵素をコードするDNAおよび該DNAで形質転換された形質転換細胞に関する。
【0002】
【従来の技術】
フラビンレダクターゼの起源としては、ロドコッカス(Rhodococcus) 属(Applied and Environmental Microbiology Vol. 67, No. 3, p1179−1184, 2002 年)、パエニバチルス属(Paenibacillus)属(Journal of Bioscience andBioengineering Vol.90,No.6,p607−613,2000年)などの細菌、放線菌に属する微生物が知られている。それらに由来するフラビンレダクターゼの物理化学的特性、生化学的特性、アミノ酸配列、DNA配列などが報告されている。また、フラビンレダクターゼの工業的利用に関して、ロドコッカススピーシーズIGTS8由来のフラビンレダクターゼによるジベンゾチオフェンの酸化的脱硫などが報告されている(特許公表2002−515727)。
【0003】
しかしながら、これらのフラビンレダクターゼの熱安定性は必ずしも高くない。最も熱安定性の高いパエニバチルス属(Paenibacillus)属由来のフラビンレダクターゼでも、65℃で30分間熱処理した際の残存活性は20%と報告されている(Journal of Bioscience and Bioengineering Vol.90,No.6,p607−613,2000年)。産業上実用的にフラビンレダクターゼを利用するためには、より熱安定性の高いフラビンレダクターゼが望まれていた。
【0004】
【特許文献1】特表2002−515727公報)
【0005】
【非特許文献1】Journal of Bioscience and Bioengineering Vol.90,No.6,p607−613,2000年)
【0006】
【非特許文献2】Journal of Bioscience and Bioengineering Vol.90,No.6,p607−613,2000年)
【0007】
【非特許文献3】Journal of Bioscience and Bioengineering Vol.90,No.6,p607−613,2000年)
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、産業上実用的な熱安定性を持つ新規なフラビンレダクターゼ及び該酵素をコードするDNAおよび該DNAで形質転換された形質転換細胞及びその生産方法を提供することにある。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく、種々の微生物由来のフラビンレダクターゼについて、それらの熱安定性を評価したところ、好熱性バチルス属(Bacillus)細菌である、バチルス・エスピーDSM411(Bacillus sp.DSM411)に、熱安定性の高いフラビンレダクターゼを見出した。そして、本酵素を単離精製しその物理的・生化学的性状、アミノ酸配列およびDNA配列を明らかにし、さらにその形質転換細胞による効率的生産方法を開発することに成功し、本発明を完成するに至った。
【0010】
上記の本発明者らによる新たな知見に基づいて成された本発明は以下の各態様を含むものである。
(1) 電子供与体としてNADH、および電子受容体としてFMNを基質とし、NAD+およびFMNH2を生成する作用を示し、その反応の至適温度が65℃から75℃の範囲にあり、pH7で70℃以下の温度においては、30分間放置してもその活性を80%以上保持しているフラビンレダクターゼ。
(2) N末端から30残基目までのアミノ酸配列が配列表の配列番号:1記載の請求項1記載のフラビンレダクターゼ。
(3) アミノ酸配列が、配列表の配列番号:3記載の配列である請求項1または2記載のフラビンレダクターゼ。
(4) フラビンレダクターゼをコードする塩基配列であって、
(a)配列表の配列番号:4記載の塩基配列または、
(b)前記配列番号:4の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
(5) 請求項4記載のDNAを含むプラスミド。
(6) 請求項5に記載のプラスミドによって形質転換された形質転換細胞。
(7) 請求項6に記載の形質転換体を培養して、該形質転換体に組み込まれたプラスミドの有する塩基配列によりコードされたフラビンレダクターゼを生産させることを特徴とするフラビンレダクターゼの生産方法。
【0011】
本発明にかかるフラビンレダクターゼを用いることでフラビンレダクターゼ依存型酵素による酸化還元反応を産業上実用的に行うことができる。
【0012】
【発明の実施の形態】
本発明にかかるフラビンレダクターゼは、電子供与体としてNADH、および電子受容体としてFMNを基質とし、NAD+およびFMNH2を生成する作用を示し、その反応の至適温度が65℃から75℃の範囲にあり、pH7で70℃以下の温度においては、30分間放置してもその活性を80%以上保持しているという特性により規定することができる。
【0013】
以下に本発明を詳細に説明するが、本発明にかかるフラビンレダクターゼは上記の特性を有するものであり、上記特性を有する酵素であれば、いかなる微生物由来であっても本発明に包含されるものとする。
【0014】
(1)フラビンレダクターゼを含有する微生物及び培養法
本発明による新規なフラビンレダクターゼは、Bacillus sp.DSM411から単離・精製した。
Bacillus sp.DSM411は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen(DSM)、財団法人発酵研究所(IFO)、ATCC、JCMなどの菌株保存機関より分譲を受けることができる。
【0015】
本微生物の培養は、公知の培養方法に準じて行うことができる。使用する培地は、一般微生物の栄養源として公知のものが使用でき、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、NZアミン等の有機栄養源、グルコース、マルトース、しょ糖、デンプン、有機酸等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素、塩化アンモニウム等の窒素源、リン酸塩、マグネシウム、カリウム、鉄等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合わせて使用できる。培地のpHは、6〜9の範囲で選べばよく、培養温度は30〜80℃、好ましくは45〜55℃で好気的に培養を行う。培養期間は1〜7日間の範囲で目的のフラビンレダクターゼの含量が最大になるまで培養すればよい。
【0016】
(2)フラビンレダクターゼの精製
フラビンレダクターゼの精製は、通常の酵素精製法を用いることができる。培養収量液より遠心分離等により菌体を集め、超音波処理、フレンチプレス、ダイノミル等の機械的方法によって菌体を破砕する。細胞片等の固形物を遠心により除き、粗酵素液を得る。次に硫酸アンモニウム等による塩析、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、結晶化等を行うことにより精製される。これについては実施例にて1例を記載する。
【0017】
(3)フラビンレダクターゼの活性測定法
20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)、0.5mMNADH、0.02mMFMN、および適当量のフラビンレダクターゼからなる0.5mlの反応液中で酵素反応を行う。反応は65℃で行い、この際分光光度計を用いて340nmの吸光度をモニターする。NADHの340nmにおける吸光係数をε=6220M−1cm−1とし、340nmの吸光度の減少速度からNADHの減少速度を算出することにより酵素活性を算出した。酵素活性をあらわす単位Uは、μmol/mg・minとする。酵素の添加量は、340nmの吸光度減少速度から適切な添加量を設定すればよい。
【0018】
(4)酵素の均一性
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動をトリス−グリシン緩衝液を用い4−20%ゲルにて、Laemmliの方法(Nature.227.680.1970年)で行った。クマシーブルーで染色後、均一な1本のタンパク質バンドが見られ、公知の標準タンパク質との比較から、このタンパク質の分子量は、16000±2000となった。
【0019】
(5)N末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列の決定法
精製されたフラビンレダクターゼのN末端及び内部アミノ酸配列は、各種アミノ酸シーケンサーで決定するすることができる。内部アミノ酸配列については、精製されたフラビンレダクターゼをCNBr等で処理し部分分解したのち、高速液体クロマトグラフィーで断片を取得することで解析することができる。
この結果、配列表1に示したN末端アミノ酸配列の30残基及び配列表1に示した内部アミノ酸配列の19残基を決定した。
また本発明におけるフラビンレダクターゼの熱安定性は、20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)に溶解した酵素溶液を、10、20、30、40、50、60、70、75、80、90、100℃の各温度にて30分間熱処理を行った後、上記の活性測定法と同様の方法で酵素反応を行い、熱処理を施さない酵素の活性を100%として活性の残存残存率を算出することにより規定することができる。
さらに本発明におけるフラビンレダクターゼの至適反応温度は、20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)に溶解した酵素溶液を、30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100℃の各温度で、上記の活性測定法に準じてと酵素反応を行うことで規定することができる。
【0020】
本発明にかかるフラビンレダクターゼの物性は以下のとおりである。
分子量 :16000±2000(SDS−PAGE)
至適pH:pH5〜7
至適温度:65℃〜75℃
熱安定性:70℃/30分の熱処理で80%の残存活性を示す。
基質特異性:電子受容体 FMN、FAD及びリボフラビン、ルミフラビン等のフラビン化合物、4−ニトロアセトフェノン、4−ニトロ安息香酸等の芳香族ニトロ化合物、メチレンブルー等を電子受容体とする。なかでも、FMNが最も好適な電子受容体である。
電子供与体 NADH、NADPHを電子供与体とするが、NADPHを電子供与体とするときの活性は、NADHを電子供与体とするときの10%以下である。
【0021】
本発明におけるフラビンレダクターゼの一態様は、配列表の配列番号:3に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号:3に記載のアミノ酸配列に1もしくは2以上、好ましくは数個のアミノ酸がフラビンレダクターゼ活性を保持する範囲内で置換、欠失、修飾または挿入または付加されたアミノ酸配列を有する。
【0022】
本発明におけるフラビンレダクターゼをコードするポリヌクレオチドは配列表の配列番号:4に記載の塩基配列を含む。配列番号:4に示す塩基配列は、配列番号:2に示すタンパク質をコードする。ただし、配列番号:4に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列には、配列番号:3に示す塩基配列のみならず、異なるコドンに基づくあらゆる塩基配列が含まれる。更に適宜置換、欠失、修飾または挿入または付加を導入する事によりポリヌクレオチドのホモログを得る事も可能である。本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは配列番号:4に示す塩基配列に対して、これによりコードされるD−アシルアミラーゼが所定の酵素活性を維持し得る範囲内で塩基の置換、欠失または付加を行って得られるものである。このホモログには、例えば、配列番号:4の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできる塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【0023】
このストリンジェントな条件でのハイブリダイゼ−ションは、例えばMolecular Cloning:Cold Spring Harbor Laboratory Press,Current Protocols in Molecular Biology;Wiley Interscienceに記載の方法によって行なう事ができ、市販のシステムとしては、GeneImageシステム(アマシャム)を挙げる事ができる。具体的には以下の操作によってハイブリダイゼ−ションを行なう事ができる。試験すべきDNAまたはRNA分子を転写した膜を製品プロトコールに従って、標識したプローブとプロトコール指定のハイブリダイゼ−ションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼ−ションバッファーの組成は、0.1重量%SDS、5重量%デキストラン硫酸、1/20溶のキット添付のブロッキング試薬及び2〜7×SSCからなる。ブロッキング試薬としては例えば、100×Denhardt‘s solution、2%(重量/容量)Bovine serum albumin、2%(重量/容量)FicllTM400、2%(重量/容量)ポリビニルピロリドンを5倍濃度で調製したものを1/20に希釈して使用する事ができる。20×SSCは、3M塩化ナトリウム、0.3Mクエン酸溶液であり、SSCは、より好ましくは3〜6×SSC、更に好ましくは4〜5×SSCの濃度で使用する。ハイブリダイゼ−ションの温度は40〜80℃、より好ましくは50〜70℃、更に好ましくは55〜65℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行なった後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は6×SSC+0.1重量%SDS溶液、より好ましくは4×SSC+0.1重量%SDS溶液、更に好ましくは1×SSC+0.1重量%SDS溶液、最も好ましくは0.1×SSC+0.1重量%SDS溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたDNA分子またはRNA分子をプローブに用いた標識を利用して識別する事ができる。
【0024】
本発明の新規なフラビンレダクターゼをコードするDNAは、例えば、以下の様な方法によって単離することができる。微生物からゲノムDNAを精製し、制限酵素によって消化した後に得られたDNAを超遠心分離もしくは電気泳動等によって、その長さによって分画する。その分画試料のDNAを回収してプラスミドに組み込むことによってプラスミドライブラリーを作成する。その中からフラビンレダクターゼ遺伝子を持つクローンを選抜してフラビンレダクターゼ遺伝子をコードするDNAを含むプラスミドを取得する。
【0025】
フラビンレダクターゼ遺伝子の選抜は、N末端アミノ酸及び内部アミノ酸配列からプローブとなるオリゴヌクレオチドを合成し、ハイブリダイゼーション等の方法で行うことができる。
そのプラスミドの塩基配列を解析することによって、目的のフラビンレダクターゼ遺伝子をコードするDNAの塩基配列が判明し、DNAの塩基配列からコードされているフラビンレダクターゼのアミノ酸配列を推定することが出来る。
【0026】
上記のようにして単離された本発明のフラビンレダクターゼをコードするDNAを、例えば宿主が大腸菌の場合、pUC18、pBR322、BluescriptII SK(−)、pSC101などに代表される発現用のプラスミドに組み込むことにより、フラビンレダクターゼ発現プラスミドが提供される。尚、形質転換に使用する宿主生物としては、組換えベクターが安定、かつ自律的に増殖可能で、さらに外来性DNAの形質が発現できるものであればよく、例として大腸菌が挙げられるが、特に大腸菌に限定されるものではない。
【0027】
そして、本発明においては該プラスミドで形質転換して得られた形質転換体を公知の情報に基づいて、培養することができ、本発明のフラビンレダクターゼを産生させることができる。培地としては炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば合成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行なう事が出来る。培養条件は、培養の種類、培養方法により適宜選択すればよく、菌株が生育しフラビンレダクターゼを産生できる条件であれば特に制限はない。
【0028】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【0029】
実施例1:バチルス エスピー(Bacillus sp.)DSM411の培養
蒸留水1リットル中に、ポリペプトン5g、グリセロール2g、酵母エキス2g、エーリッヒ肉エキス2g、リン酸水素2カリウム2g、リン酸水素1カリウム1g、硫酸マグネシウム7水和物0.1g、塩化カルシウム0.05gを含み、pH7.2に調整した液体培地にあらかじめブイヨン寒天プレートに生育させた菌体を接種し55℃、18時間振とう培養してフラビンレダクターゼの活性を有する菌体を得た。
【0030】
実施例2:フラビンレダクターゼの精製
実施例1に示される方法でバチルス エスピー(Bacillus sp.)DSM411を培養して菌体を回収し、0.05Mトリス塩酸バッファー(pH8.0)に懸濁した。懸濁液の状態で超音波破砕機によって菌体を破砕し、冷却遠心分離にて菌体破砕物を除去し、Cell−free extractを得た。
このCell−free extractを上記バッファーで平衡化したQ−セファロースカラムに供し、同バッファーで洗浄後、0.1M塩化カリウムを含むバッファーで溶出し、フラビンレダクターゼ活性を持つ画分を得た。
次にこの画分を2.0M硫酸アンモニウムを含む上記バッファーで平衡化したフェニルトヨパールカラムに供し、同バッファーで洗浄後、1.4M硫酸アンモニウムを含むバッファーで溶出し、フラビンレダクターゼ活性を持つ画分を得た。
さらに、得られた画分を1.5Mリン酸カリウムバッファー(pH8.0)で平衡化したFMN−アガロースカラムに供し、同バッファーおよび0.9Mリン酸カリウムバッファー(pH8.0)で洗浄後、蒸留水で溶出し、フラビンレダクターゼ活性を持つ画分を得た。
最後に0.05Mトリス塩酸バッファー(pH8.0)で平衡化したスーパーデックスによるゲルクロマトグラフィーを行い、フラビンレダクターゼの精製酵素液を得た。精製過程の総括した結果を、表1に示した。
【0031】
【表1】
【0032】
この精製酵素液の一部を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、分子量約16000Daの位置にバンドを確認した。
この56kDaタンパク質についてN末端アミノ酸配列の分析をアミノ酸シークエンサーを用い行ったところ、配列番号:1に示す様に部分断片のアミノ酸配列であると決定された。
さらに、精製酵素液の一部をエバポレーターにより乾固させた後、70%ギ酸に溶解させ、CNBrを添加し、窒素を充填した容器中で一晩放置した。得られた標品をエバポレーターにより乾固し、0.1%トリフルオロ酢酸に溶解し、HPLCに供した。Wakosil−II 5C18ARカラムを用い、20分まで0.1%トリフルオロ酢酸で洗浄後、20分から120分にかけてアセトニトリル濃度を0から100%まで上昇させて溶出し、ペプチド断片を分離した。
分取した断片のアミノ酸配列の分析をアミノ酸シークエンサーを用い行ったところ、配列番号:2に示す様に決定された。
【0033】
実施例3:フラビンレダクターゼの熱安定性及び至適反応温度の測定
実施例2で得られたフラビンレダクターゼを、20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)に溶解し、10、20、30、40、50、60、70、75、80、90、100℃の各温度にて30分間熱処理を行った。その後、20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)、0.5mMNADH、0.02mMFMN、および適当量の熱処理酵素液からなる0.5mlの反応液中で酵素反応を行った。反応は65℃で行い、この際分光光度計を用いて340nmの吸光度をモニターした。NADHの340nmにおける吸光係数をε=6220M−1cm−1とし、340nmでの吸光度の減少速度からNADHの減少速度を算出することにより酵素活性を算出した。熱処理を施さない際の酵素活性を100%として、各熱処理後の活性残存残存率を算出した結果を図1に示した。
【0034】
フラビンレダクターゼの至適反応温度は、20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)に溶解した酵素溶液を、反応温度のみを30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100℃の各温度に設定し、上記の活性測定法に準じてと酵素反応を行った。70℃での酵素活性を100%として、各反応温度の相対活性値を図2に示した。
【0035】
実施例4:フラビンレダクターゼプローブの作製
実施例1に示した培養方法でバチルス エスピー(Bacillus sp.)DSM411を2日間培養し、遠心分離で菌体を回収し、0.05Mトリス塩酸バッファー(pH8.0)で洗浄した。この菌体より「基礎生化学実験法2 抽出・分離・精製 阿南功一他著 丸善株式会社出版」記載によるバクテリアゲノムDNAの分離方法に従い、ゲノムDNAを調製した。
【0036】
実施例2で決定したフラビンレダクターゼのN末端アミノ酸配列と内部アミノ酸配列をもとに、配列番号5及び配列番号6に示したフラビンレダクターゼ遺伝子増幅用プライマーを設計し、DNA合成装置で合成した。
調製したゲノムDNAとフラビンレダクターゼ遺伝子増幅用プライマーを用い以下の条件で、PCRを行いフラビンレダクターゼ遺伝子断片を増幅した。その結果、約450bpの増幅断片を得た。
この増幅断片を、ロシュ・ダイアグノスティックス社製ジギキシゲニンラベルかキットを用い蛍光ラベルし、フラビンレダクターゼプローブとした。
【0037】
【0038】
実施例5:フラビンレダクターゼプローブによるサザンハイブリダイゼーション
実施例4で調製したゲノムDNAを各種制限酵素で完全消化し、アガロースゲル電気泳動を行った後、DNAをメンブレンにブロッティングし、実施例4で調製したフラビンレダクターゼプローブを用い、以下の条件でサザンハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼ−ションバッファーの組成は、0.1重量%SDS、5重量%デキストラン硫酸、1/20溶のキット添付のブロッキング試薬及び2〜7×SSCからなる。ブロッキング試薬としては例えば、100×Denhardt‘s solution、2%(重量/容量)Bovine serum albumin、2%(重量/容量)FicollTM400、2%(重量/容量)ポリビニルピロリドンを5倍濃度で調製したものを1/20に希釈して使用する事ができる。20×SSCは、3M塩化ナトリウム、0.3Mクエン酸溶液であり、SSCは、より好ましくは3〜6×SSC、更に好ましくは4〜5×SSCの濃度で使用する。ハイブリダイゼ−ションの温度は40〜80℃、より好ましくは50〜70℃、更に好ましくは55〜65℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行なった後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は6×SSC+0.1重量%SDS溶液、より好ましくは4×SSC+0.1重量%SDS溶液、更に好ましくは1×SSC+0.1重量%SDS溶液、最も好ましくは0.1×SSC+0.1重量%SDS溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、蛍光フラビンレダクターゼプローブがハイブリダイズしたDNA分子を検出した。
その結果、制限酵素Eco RI及びHindIIIで完全消化した約5.5kbの位置にバンドが検出された。
【0039】
実施例6: バチルス エスピー(Bacillus sp.)DSM411のゲノミックDNAライブラリー作成
実施例4調製したゲノムDNAを制限酵素Eco RI及びHindIIIで完全消化してアガロースゲル電気泳動にてDNAの長さによって分画し、約5.5kbのDNAを回収した。そのDNAを、制限酵素Eco RI及びHindIIIで消化して5’末端を脱リン酸化したベクターpBluescript IISK(−)に連結し、プラスミドライブラリーを作成した。このプラスミドライブラリーによって大腸菌DH5αを形質転換したものを50μg/mlのアンピシリンを添加したLB(Luria−Bertani)アガロース培地に塗布して静置培養し、コロニーを出現させた。
【0040】
実施例7:プラスミドライブラリーからのフラビンレダクターゼ遺伝子のクローニング
実施例6で出現した個々のコロニーをメンブレンにトランスファーし、フラビンレダクターゼプローブを用いコロニーハイブリダイゼーションを行い、ポジティブクローンを選抜した。
このクローンからプラスミドDNAを抽出し、制限酵素SalIで消化し2.2kbのDNA断片を回収した。このDNA断片をベクターpBluescript IISK(−)に連結し、プラスミドpBFR411を得た。さらに、2.2kbの挿入DNA断片の塩基配列をDNAシークエンサーで決定した。塩基配列の決定はPE Applied Biosystems社、BigDye Teminator Cycle Sequencing kitを用い、同社製Genetic Analyzer 310にて行った。その結果配列番号4に示すフラビンレダクターゼ遺伝子をコードするDNAの塩基配列が得られた。該フラビンレダクターゼ遺伝子の塩基配列をアミノ酸翻訳したものを配列番号3に示す。そのアミノ酸配列中には、実施例2で決定した配列番号1に示すフラビンレダクターゼN−末端アミノ酸配列及び配列番号2に示す内部アミノ酸配列が含まれた。また、該アミノ酸配列からフラビンレダクターゼの分子量は約17kDaと推定された。
【0041】
実施例8:フラビンレダクターゼ遺伝子を含むDNAによって形質転換した大腸菌によるフラビンレダクターゼの生産
(菌体懸濁液の調製)
実施例7で作製したプラスミドpBFR411で形質転換した大腸菌をアンピシリン(50μg/ml)及び1mMのイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を含むLB培地で16時間37℃で振とう培養を行なった。培養後、遠心分離により集菌、0.05Mトリス塩酸バッファー(pH7.0)で洗浄後に菌体を0.05Mトリス塩酸バッファー(pH7.0)に懸濁した。
(フラビンレダクターゼ発現確認)
菌体懸濁を超音波葉再処理にかけ、無細胞抽出液を調製した。この無細胞抽出液をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した結果、16KDaの位置にタンパク質のバンドが確認できた。
(フラビンレダクターゼ活性測定)
20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.0)、0.5mMNADH、0.02mMFMN、および適当量の無細胞抽出液からなる0.5mlの反応液中で酵素反応を行った。反応は65℃で行い、この際分光光度計を用いて340nmの吸光度をモニターした。NADHの340nmにおける吸光係数をε=6220M−1cm−1とし、340nmでの吸光度の減少速度からNADHの減少速度を算出することにより酵素活性を算出した。
その結果、プラスミドpBFR411で形質転換しない宿主大腸菌に対し約7倍のフラビンレダクターゼ活性が検出された。
【0042】
【発明の効果】
本発明により、熱安定性の高い新規なフラビンレダクターゼ及びそれをコードするDNAが提供される。本発明のフラビンレダクターゼは産業上の有用性に優れた酵素であり、フラビンレダクターゼ依存型酵素による酸化還元反応を産業上実用的に実現することができる。
【0043】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】フラビンレダクターゼの熱安定性を示す図である。
【図2】フラビンレダクターゼの至適反応温度を示す図である。
Claims (7)
- 電子供与体としてNADH、および電子受容体としてFMNを基質とし、NAD+およびFMNH2を生成する作用を示し、その反応の至適温度が65℃から75℃の範囲にあり、pH7で70℃以下の温度においては、30分間放置してもその活性を80%以上保持しているフラビンレダクターゼ。
- N末端から30残基目までのアミノ酸配列が配列表の配列番号:1記載の請求項1記載のフラビンレダクターゼ。
- アミノ酸配列が、配列表の配列番号:3記載の配列である請求項1または2記載のフラビンレダクターゼ。
- フラビンレダクターゼをコードする塩基配列であって、
(a)配列表の配列番号:4記載の塩基配列または、
(b)前記配列番号:4の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。 - 請求項4記載のDNAを含むプラスミド。
- 請求項5に記載のプラスミドによって形質転換された形質転換細胞。
- 請求項6に記載の形質転換体を培養して、該形質転換体に組み込まれたプラスミドの有する塩基配列によりコードされたフラビンレダクターゼを生産させることを特徴とするフラビンレダクターゼの生産方法。
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