JP3950196B2 - アルコールデヒドロゲナーゼ及びキラルヒドロキシ化合物の酵素的生産へのその使用 - Google Patents
アルコールデヒドロゲナーゼ及びキラルヒドロキシ化合物の酵素的生産へのその使用 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えばラクトバチルス属の種のような微生物、特にはラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）に由来する新規の鏡像異性選択アルコールデヒドロゲナーゼ類（ＡＤＨ）に関する。この新規酵素は、有機ケト化合物を還元して対応するヒドロキシ化合物を生成するのに特に利点があり、これらの還元は対応するＲ化合物を鏡像異性的に選択する。このプロセスにおける、ｅｅ（%）＝（Ｒ）−生成物−（Ｓ）−生成物／（Ｒ）−生成物＋（Ｓ）−生成物×100として算出される鏡像異性体過剰は通常95％を超える。本発明によるＡＤＨを用いた場合、Ｓヒドロキシ化合物は検出されなかった。その広範な基質スペクトルにより、本発明による酵素は、例えばキラルアルコール類、キラルヒドロキシエステル類（例えば、α−及びβ−ヒドロキシエステル類）及びヒドロキシ酸を生産するためにも用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】
光学的に活性なヒドロキシ化合物は、古典的な化学プロセスでは調製が困難な、価値の高いキラル構築ブロックである。このため、通常、生物工学的プロセスが微生物の全細胞を用いるか、もしくは単離酵素によるキラル化合物の生産のために考慮される。例えば、F.Aragozziniらの刊行物（Appl.Microbiol.Biotechnol.（1986）24, 175-177）に示されるように、全細胞を用いるプロセスはしばしば低収率、僅かな鏡像異性体過剰（すなわち、低ｅｅ値）及び長い反応期間という結果に終わり、そのため精製され濃縮された形態で用いることができる酵素がより有利である。アルコール類のようなキラルヒドロキシ化合物の場合、補酵素（しばしばＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ）の助けを借りてプロキラル化合物を還元するアルコールデヒドロゲナーゼ類を用いることができる。概して、これらの反応は高度に鏡像異性体選択的である。従来利用可能なアルコールデヒドロゲナーゼ類（ＡＤＨ）は全てＳ−アルコール類を導き、これらの酵素の幾つかについての基質スペクトルは比較的狭い（酵母ＡＤＨ、ウマ肝臓ＡＤＨ）。ラクトバチルス・ケフィール（Lactobacillus kefir）に由来するＮＡＤＰ依存性アルコールデヒドロゲナーゼがDE 40 14 573 C1に記述されている。これはＲ−アルコール類を導く。しかしながら、この酵素は比較的不安定であることが判明しており、それ故均質な酵素を形成させるための精製は実質的な損失を伴ってのみ可能である（＞98％）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
驚くべきことに、かなり高い安定性を有するＲ−特異的アルコールデヒドロゲナーゼが徹底的なスクリーニングにより見出された。最も類似する従来既知のＡＤＨ酵素と比較してこの酵素の熱非活性化を決定する場合、本発明の酵素が約65℃の温度で50％が不活性化するだけであるのに対して、従来既知の酵素は45℃で既に50％が不活性化することが判明する。加えて、より高い熱安定性は、より高い貯蔵安定性及び特定の反応条件下でのより高い安定性を意味する。
【０００４】
相当する安定性を有するＲ−ＡＤＨ酵素が、特に、ラクトバチルス・ブレビスのようなラクトバチルス属及びベータバクテリウム亜群（Ａ群）に見出された。従来、安定なＲ−特異的アルコールデヒドロゲナーゼを有する微生物又は生物は知られていなかった。Ｌ.ケフィールＡＤＨタンパク質に対する抗体の助けを借りて、今や、ベータバクテリウム亜群（Ａ群）の全てのラクトバチルスがこの抗体と反応する対応蛋白質を有することが示されている。対照的に、特にラクトバチルス・ブレビスでは、特に良好な酵素活性を検出することが可能である。しかしながら、この群のその他の株も、たとえそれらが与えられた培養および試験条件下において幾らか低い活性を示すとしても、そのような反応に原理的に適切な酵素を有する。これとは対照的に、他の亜群（サーモバクテリウム、ＩＡ、ストレプトバクテリウム ＩＢ、ベータバクテリウムＢ群）のラクトバチルスは、抗体試験での反応も示さず、適切な酵素活性も持たない。
【０００５】
ラクトバチルス・ブレビスから得ることができる安定な酵素を均一に精製することは可能であった。精製した酵素を用いて、タンパク質配列の対応データを決定した。そのＮ−末端アミノ酸の配列の比較は、本発明による安定な酵素と他の微生物起源のＡＤＨ類との間には多くの一致があるものの、幾つかのアミノ酸が交換されていることを示している。
【０００６】
実施された以下の生化学的な特徴付けが、対応する従来既知の酵素と比較しての本発明による酵素の相違、例えばケトン類に対する相対活性に関する相違、をさらに示す。本発明によるＡＤＨの最大安定性は、例えば、約9.0のｐＨ値にある。加えて、この酵素はおおよそｐＨ5.5で良好な安定性を有する。これは、例えば、50 mM ＭＥＳバッファ（ＭＥＳ＝２−モルホリノエタンスルホン酸）において当てはまる。同じバッファ系において、本発明による酵素は、25℃ないし60℃の温度でおおよそ30分の後でも95％を超える残留活性を有する。この酵素は約40℃に最大安定性を有する。加えて、この酵素は約50℃に活性最大を有する。
【０００７】
さらに、本発明による酵素は、アミノ酸のレベルで従来既知のＡＤＨ酵素とは異なる。例えば、そのＮ末端には全長38アミノ酸（ＡＡ）にわたって5つのアミノ酸置換があり、これは12％を上回るＡＡ相違を意味する。このように、全ての比較が、本発明のよるアルコールデヒドロゲナーゼ、特にはラクトバチルス・ブレビスに由来するもの、を対応する用途に用いることが有利であることを示す。
【０００８】
本発明のさらなる主題は、本発明による酵素の適切な微生物からの単離に関する。1972年6月6日にDSM 20054という番号で“Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen”、Braunschweigに寄託され、自由に利用することができるラクトバチルス・ブレビスの株を用いて、良好な酵素収率が達成された。
このＡＤＨの単離及び精製のためのプロセスは、本質的に、次の処理工程により進められる：培養した細胞を、例えばガラスビーズにより機械的に破壊し、疎水性クロマトグラフィーもしくは相互作用クロマトグラフィー、続いて陰イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティクロマトグラフィーを行う。特に、全ての均質化及び溶離バッファが約0.5ないし5mMのマグネシウムを含有する場合が有利であることが立証されている。これに関して、約1mMのＭｇ2+濃度が特に有利であることが立証されている。このようにして、少なくとも400U/mg、多くの場合500U/mgまでの比活性を有する酵素が得られる。
【０００９】
加えて、本発明による酵素は組換えプロセス、すなわち、適切な原核又は真核株におけるこの酵素をコードする適切なＤＮＡの発現により生産することができる。特には、大腸菌におけるラクトバチルス・ブレビスに由来するＡＤＨ構造遺伝子に基づく系が適切である。これに関しては、驚くべきことに、このアルコールデヒドロゲナーゼが可溶性かつ活性なタンパク質として排他的に発現することが特に有利であることが立証されている。
【００１０】
本発明のさらなる主題は、１，４−ブタンジオール−ジグリセリジルエーテルまたは下記の一般式（Ｉ）の有機ケト化合物の鏡像異性体選択的還元方法であって、この方法は該化合物又は適切な混合物を本発明の微生物アルコールデヒドロゲナーゼで処理することを特徴とする。１，４−ブタンジオール−ジグリセリジルエーテル、下記の一般式（Ｉ）の有機ケト化合物または前記化合物の適切な混合物は、約２０℃〜６０℃で約１５分〜３時間、本発明の微生物アルコールデヒドロゲナーゼ又は該酵素を含有する細胞の存在下においてインキュベートし、適切なＲ−ヒドロキシ化合物を単離することができる。
【００１１】
【化３】
【００１２】
（式中、Ｒ1およびＲ2は、異なっているかまたは同じであり、水素、ヒドロキシ、一緒になってあるいは個別に、直鎖もしくは分岐Ｃ1-20アルキル、直鎖もしくは分岐Ｃ1-20アルケニル、直鎖もしくは分岐Ｃ1-20アルコキシカルボニルまたは直鎖もしくは分岐Ｃ1-20アルコキシ、アリールまたはアラルキル基（これらは一つまたは数個のハロゲン原子、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシル、オキソ、Ｃ1-20アルコキシ、Ｃ1-20アルキル、Ｃ1-20アシル、Ｃ1-20アルコキシカルボニルまたはアリール−Ｃ1-20アルコキシカルボニル基で置換されてもよい）、直鎖または分岐Ｃ1-10アルキレン基（これは一つまたは数個の飽和、不飽和もしくは芳香族含窒素、含酸素もしくは含硫黄複素環、アルコキシカルボニルまたはアルキル基（これらはアルコキシカルボニル基で置換されてもよい）で置換されてもよい）、または単縮合もくしは重縮合脂環式もしくは芳香族基である。）
この場合、本発明による酵素は、そのまま、また、この酵素を産生する微生物の培養物あるいはこの酵素を含有する細胞として用いることができる。この反応は、好ましくは、水性バッファ、例えばリン酸カリウム、トリス／ＨＣｌもしくはトリエタノールアミン（ＴＥＡ）バッファ中で、マグネシウムイオンの存在下において、5ないし10、好ましくは6ないし9のｐＨ値、及び10℃ないし70℃、好ましくは30℃ないし60℃の温度で行う。加えて、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈのような適切な補酵素、及び酸化された補酵素を再生するための適切な作用物質、例えばイソプロパノール、が反応混合物中に存在する。適当な変換、例えば、好ましくは50％の変換が達成されたとき、例えばクロロホルム中で直接抽出を行うことにより反応を停止させることが好ましい。しかしながら、ｐＨ値の低下、加熱、又は適切な酵素阻害剤の添加により反応を停止させることもできる。続いて、得られた鏡像異性的に純粋なＲ−ヒドロキシ化合物を水と混和しない有機溶媒で抽出し、クロマトグラフィー又は蒸留の既知のプロセスにより未変換ケト化合物又は他の出発化合物から分離する。鏡像異性体の純度は、キラルカラム材料でのＧＣ及び／またはＨＰＬＣあるいは旋光計で決定するのが便利である。特に、本発明による方法は、ケトン類、α、βもしくはγケトンエステル類のようなケトエステル類並びに環状アリール及びアルキルエステル類、好ましくは、例えばハロゲンもしくはアルキルで置換されている残基を有するものの還元に適することが立証されている。アセトフェノン誘導体類、メチルシクロヘキサノン類、２，４−ペンタンジオンのような特定のジケトン類、様々な酢酸エステル類及びピルビン酸エチルのようなアルキルエステル類の場合に、特に良好な結果が達成された。
【００１３】
本発明のさらなる主題は、下記の一般式（ＩＩ）の有機ヒドロキシ化合物の鏡像異性体選択的製造方法であって、この方法は有機ヒドロキシ化合物のラセミ混合物または該有機ヒドロキシ化合物を本発明の微生物アルコールデヒドロゲナーゼ又は該ＡＤＨを含有する細胞で処理することを特徴とする。下記の一般式（ＩＩ）の有機ヒドロキシ化合物のラセミ混合物または該有機ヒドロキシ化合物を本発明の微生物アルコールデヒドロゲナーゼ又は該ＡＤＨを含有する細胞で、水性バッファ中で、約５〜１０のｐＨ値、好ましくは約６〜９のｐＨ値で、約１０℃〜７０℃で、好ましくは約３０℃〜６０℃、より好ましくは約２０〜６０℃の温度で約１５分〜３時間インキュベートし、次いで得られた鏡像異性体選択的に純粋なＳ−ヒドロキシ化合物を単離することができる。
【００１４】
【化４】
【００１５】
（式中、Ｒ1およびＲ2は各々前記の意味を有する。）
あるいは、上述の条件又はそのような反応について当業者に公知の条件が適用される。
本発明のよるＡＤＨは、完全にもしくは部分的に精製して、又は細胞中に存在するままで、記述される反応に用いることができる。これに関しては、細胞は未変性の形態、透過性が付与された形態、又は溶解された形態で存在することができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下の実施例において、本発明をより詳細に説明する。
【００１７】
【実施例】
実施例１
ラクトバチルス属の菌株間でのＲ−アルコールデヒドロゲナーゼのスクリーニング
ラクトバチルス属を、生理学的特徴に基づいてサーモバクテリウム(Thermobacterium) 、ストレプトバクテリウム(Streptobacterium)及びベータバクテリウム(Betabacterium) の3つの亜群に分類学的に分割し、ベータバクテリウムは2つの亜群Ａ及びＢにさらに分割する。全ての亜群の典型株を、ラクトバチルス・ケフィールに由来するアルコールデヒドロゲナーゼに対する抗体で試験し、それらがこの抗体に反応するかどうを決定した。驚くべきことに、他の全ての株が不活性であったのに対して、ベータバクテリウムの亜群Ａの試験した株の全てが反応性を示した。次に、ベータバクテリウムの亜群Ａの株の粗製抽出物を酵素試験において試験し、どの程度の酵素活性が存在するのかも決定した。それらの結果を表１にまとめる。これは、提示されている培養及び試験条件下では、この亜群の幾つかの株が、抗体試験が陽性であったにもかかわらず、酵素活性を全く示さないか、あるいは僅かしか示さないことを示している。しかしながら、ラクトバチルス・ブレビスのサンプルにおけるＡＤＨの酵素活性が特に高いことが注目された。
【００１８】
実施例２
ラクトバチルス・ブレビスからのアルコールデヒドロゲナーゼの単離及び精製
Ａ．ラクトバチルス・ブレビスの培養
酵素を得るために、ラクトバチルス・ブレビスを次の培地において培養した（量g/L）：
グルコース（20）、酵母抽出物（5）、トリプトン（10）、肉抽出物（5）、クエン酸水素二アンモニウム（2）、酢酸ナトリウム（5）、硫酸マグネシウム（0.1）、硫酸マンガン（0.05）、リン酸水素二カリウム（2）。
【００１９】
この溶液を1Lまで満たしてｐＨ値を6.5に調整し、続いてこの培地を121℃（2バール）で10分間滅菌した。さらに酸素を供給したり、ｐＨを調節することなく、30℃で株を培養した。
滅菌及び30℃での保温の後、発酵器中で、10Lのスケールのこの培地に4％予備培養物（ＯＤ6600.35）を接種した。特定の時点でサンプルを採取し、次いでその細胞を破壊した後にＯＤ660、新鮮重量(fresh weight)及び酵素活性を試験することにより、細胞増殖の時間経過及び酵素活性をこの調製物に対する例として決定した。そのような時間経過から、Ｌ．ブレビスに由来するアルコールデヒドロゲナーゼの活性は、僅か1.5時間だけ維持される増殖の定常期に到達した後にその最大活性値を示すことがわかった。
この微生物を同じ条件下で220Lのスケールで培養し、ｐＨ値5.3及びＯＤ6602.2で13時間後に、遠心により700gの細胞塊を得た。この細胞塊は、測定し得る活性の損失もなく、-20℃で数ヶ月間にわたって保存することが可能である。
【００２０】
Ｂ．酵素の単離（粗製抽出物の生産）
ガラスビーズ（0.3mm）の助けを借りて湿式破砕により、細胞から酵素を放出させる。しかしながら、これは細菌細胞を破壊する他のいかなる方法によっても達成することができる。この細菌塊を、消泡剤（ポリプロピレングリコール）が補足されている0.1M酢酸バッファｐＨ4.0＋1mM ＭｇＣｌ2で40％懸濁液に希釈する。これを、継続的に冷却しながら、破壊装置（IMA Co.）内において、4000rpmで、ガラスビーズを1：2の比で添加して、20分間破壊した。8gの細菌が、40U/mlの容量活性及び約3mg/mlのタンパク質含量を有する10mlの粗製抽出物を産生した。酵素試験には、970 μl のトリエタノールアミンバッファ（100mM；ｐＨ7.0；11mMアセトフェノンを含有）、20μl ＮＡＤＰＨ（最終濃度0.19mM）及び酵素溶液が含まれる。
酵素単位の定義：1Uは、1分当たりに1マイクロモルの基質（アセトフェノン）を変換するのに要する酵素の量に相当する。
【００２１】
Ｃ．ラクトバチルス・ブレビスからのアルコールデヒドロゲナーゼの精製
この酵素は、疎水性相互作用クロマトグラフィー、次いで陰イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティクロマトグラフィーにより、均一に精製することができる。この場合、約1mMのＭｇ2+イオンを全てのバッファに添加するよう助言することができる。これらのイオンがないと、酵素に不可逆的な損傷を与えることがある。
【００２２】
１．疎水性相互作用クロマトグラフィー
5mlの粗製抽出物（実施例２Ｂに対応）を、小ゲル濾過カラム（PD10、Pharmacia）により1mM ＭｇＣｌ2及び0.6M （ＮＨ4）2ＳＯ4を含有する50mMトリエタノールアミンバッファｐＨ7.0中に再緩衝し、フェニル−セファロースCL-6B（Pharmacia Co.、Freiburg、Germany）にかける。このカラムを、50mMトリエタノールアミンバッファｐＨ7.0、1mM ＭｇＣｌ2及び0.6M （ＮＨ4）2ＳＯ4で平衡化する。カラムにかけてカラムを平衡化バッファですすいだ後、酵素を減少する直線塩勾配（6Mから0Mの（ＮＨ4）2ＳＯ4、流速1ml／分）を用いて0.36M （ＮＨ4）2ＳＯ4で溶離する。活性画分をプールし、1.2M （ＮＨ4）2ＳＯ4の濃度に調整する。このタンパク溶液を、50mMトリエタノールアミンバッファｐＨ7.0、1mM ＭｇＣｌ2及び1.2M （ＮＨ4）2ＳＯ4で既に平衡化されているオクチル−セファロースカラムにかける。タンパク溶液をカラムにかけ、続いてカラムをすすいだ後、酵素を減少する直線塩勾配（1.2Mから0Mの（ＮＨ4）2ＳＯ4、流速1ml／分）を用いて1.0M （ＮＨ4）2ＳＯ4で溶離する。達成された精製を表２に示す。
【００２３】
２．陰イオン交換クロマトグラフィー
上で用いた最後のカラムからの最も活性の高い画分を、ゲル濾過カラム（PD10、Pharmacia）により1mM ＭｇＣｌ2を含有する50mMトリス／ＨＣｌバッファｐＨ9.0に再緩衝し、この方法で既に平衡化されているモノＱカラム（流速1ml／分；圧力1.5MPA；ＦＰＬＣクロマトグラフィーシステム；Pharmacia Co. Freiburg、Germany）にかける。このカラムをすすいだ後、アルコールデヒドロゲナーゼを0Mから6MのＮａＣｌの直線塩勾配で溶離させる。この酵素は、0.36Ｍ ＮａＣｌで現れる。
【００２４】
３．アフィニティクロマトグラフィー
活性画分を、50mMモルホリノエタンスルホン酸バッファｐＨ5.5及び1mM ＭｇＣｌ2で既に平衡化されているゲル濾過カラム（PD10、Pharmacia Co.）により再緩衝し、この方法で既に平衡化されている２’，５’ＡＭＰ−セファロースカラム（Pharmacia Co.）にかける。続いて、同じバッファに溶解した100mM ＮａＣｌでこれをすすぐ。次に、0から10mMのＮＡＤＰの直線ＮＡＤＰ勾配でこれを溶離する。デヒドロゲナーゼは3．33mM ＮＡＤＰで溶離する。このクロマトグラフィーは0．25ml／分の流速で行った。酵素の完全な精製を表２にまとめる。
【００２５】
【００２６】
Ｄ．ラクトバチルス・ケフィールからのアルコールデヒドロゲナーゼの精製
ラクトバチルス・ケフィールは細胞内ＮＡＤＰ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（DE 40 14 573 C1）を有しており、それらの幾つかの生化学的特性（Ｒ−アルコール類の生産、補酵素特異性）はラクトバチルス・ブレビスに由来するアルコールデヒドロゲナーゼのものに類似する。両酵素の間の相違を示し、Ｌ．ブレビスに由来する酵素の利点を示すため、Ｌ．ケフィールに由来するアルコールデヒドロゲナーゼをＬ．ブレビスの酵素と同様に均一に精製し、特徴付けの過程でＬ．ブレビスの酵素を比較（例えば、温度安定性、Ｎ−末端アミノ酸配列）により試験した。ラクトバチルス・ケフィールの培養、酵素単離及び均質な酵素への精製は、Ｌ．ブレビスについて実施例２Ａ）−２Ｃ）に記述される通りに行った。表３には、Ｌ．ケフィールの酵素の精製がまとめられている。
【００２７】
Ｌ．ブレビスからＡＤＨを単離及び精製する実施例２は、この酵素がＬ．ケフィールの酵素に幾らか類似する蛋白質及び化学的特性を有することを示す。両酵素は、例えば、不可逆的な損傷を避けるためにＭｇ2+イオンを必要とする。しかしながら、特には、次の相違が存在する。
【００２８】
１．Ｌ．ブレビス及びＬ．ケフィールに由来するＡＤＨ酵素は、イオン交換体材料（この場合モノＱ）に結合した後、大きく異なる塩濃度で脱離する。結合の強さにおけるこの相違は、アミノ酸組成における荷電アミノ酸に関する相違を示す。これは、以下に記述される配列決定により確認することができた。
２．精製された酵素的に活性なタンパク質の収率は、Ｌ．ブレビスの酵素が大きく上回っている。これはより安定な酵素であることを示している。
【００２９】
実施例３
ラクトバチルス・ブレビスに由来するアルコールデヒドロゲナーゼの生化学的な特徴付け
Ａ．ｐＨ安定性
様々なｐＨ値を有するバッファ中に保存する場合の酵素の活性の依存性を、ｐＨ4ないし11の範囲で試験した。バッファの許容度(capacity)に応じて4ないし11のｐＨ範囲の様々なバッファを調製し、そこで均質な酵素を30分間インキュベートした。それらの 1μl を取り出し、トリエタノールアミンバッファ（100mM；ｐＨ7.0；11mMアセトフェノンを含有する）970 μl 及びＮＡＤＰＨ（最終濃度0.19ｍＭ）20μl の通常の試験混合物に添加した。この反応を、30℃で1分間、340nmで監視した。これによりｐＨ安定性の2つの最大が示され、低いものはｐＨ5.5及び高いものはｐＨ9.0であった。この安定性を表4に示す。
【００３０】
【００３１】
Ｂ．温度安定性
２５ないし７０℃の範囲の温度安定性を、Ａに記述されるものと類似の方法で決定した。均質な酵素溶液にそれぞれの温度を30分間施し、次いで上述の試験混合物を用いて30℃で直接測定した。このアルコールデヒドロゲナーゼは、25ないし60℃の温度範囲で提示されている期間（cf. 表５）安定であり、40℃で最大を示す。対照的に、Ｌ．ケフィールに由来するＡＤＨは37℃で最大で40℃までしか安定ではなく、その後活性は急速に減少する。この酵素の最大は37℃にある。
【００３２】
【００３３】
Ｃ．最適温度
最適試験温度を決定するため、25ないし70℃で酵素活性を測定した。試験混合物は標準濃度のアセトフェノン及びＮＡＤＰＨに相当しており、その各々を提示されている温度で5分間インキュベートした。表６に示されるように、この酵素の最適試験温度は50℃である。対照的に、Ｌ．ケフィールに由来するアルコールデヒドロゲナーゼは37℃で最適であり、45℃より高い試験温度ではその活性は急速に減少する（表５）。
【００３４】
【００３５】
Ｄ．アルコールデヒドロゲナーゼの基質スペクトル
アセトフェノンの代わりに一連の他のケトン類及びケトエステル類を用い、酵素触媒によりこれらが還元され得るかどうかを試験した。
【００３６】
以下の試験混合物をこれに用いた：
970 μl トリエタノールアミンバッファ（50mM；ｐＨ7.0；10mMケト化合物を含有）
20μl ＮＡＤＰＨ（この試験では0.19mM）
10μl 精製酵素（実施例２を参照、アフィニティクロマトグラフィーの後、1：10に希釈）
ケトン類の幾つかは、10mMで起こり得る基質阻害を確認するため、1mMの濃度でも試験した。しかしながら、10mMのケトン濃度でそのような過度の阻害は起こらないことが明らかになった。対応する基質に対して得られた活性は表７に提示されている。
【００３７】
ｐ−Ｃｌ−アセトフェノン、メチル−１−ナフチルケトン及びメチルシクロヘキサノンのような基質については、文献値に基づいてＬ．ケフィールに由来するアルコールデヒドロゲナーゼとＬ．ブレビスに由来するものとを直接比較することが可能である（Hummel, W.Appl.Microbiol.Biotechnol. (1990),34,15-19）。この比較は、本発明によるＡＤＨがこれらの化合物をより高い活性で変換することを示す。その活性は、Ｌ．ケフィールに由来するＡＤＨのものよりも約50ないし100％高い。
【００３８】
【００３９】
本発明による酵素の基質スペクトルは、その広範さに関して、Ｌ．ケフィールの酵素に類似している。両酵素は、アセトフェノン誘導体類、２−及び３−オキソエステル類、環状及び開鎖ケトン類を高い活性で変換し、ケトン類を還元することによりＲ−アルコール類を生成することが可能である。
【００４０】
Ｅ．ラクトバチルス・ブレビスに由来するアルコールデヒドロゲナーゼの分子量
ラクトバチルス・ブレビスに由来する精製したアルコールデヒドロゲナーゼを、ゲル濾過カラムSuperdex G-200（Pharmacia Co.、Freiburg）にかけた。その分子量を、既知分子量のタンパク質を用いて得た検量線により決定した。このゲル濾過におけるバッファのｐＨは、精製のための通常のｐＨ値である7.0であった（100mM ＴＥＡ、ｐＨ7.0、0.2M ＮａＣｌ、1mM ＭｇＣｌ2）。これらの条件下で、Ｌ．ブレビスのＡＤＨについて約104kDの分子量が測定され、これはＬ．ケフィールのＡＤＨのものに相当する。さらに、両酵素は4つのサブユニットから構成される。
【００４１】
Ｆ．アルコールデヒドロゲナーゼのＮ−末端配列の決定
Applied Biosystems／U.S.A.社の、オンラインＨＰＬＣモデル120Aを使用するPulsed Liquid Sequencer Model 477Aを用いてN−末端配列を決定し、Ｌ．ケフィールに由来するアルコールデヒドロゲナーゼのN−末端配列と比較した。
S-N-R-L-D-G-K-V-A-I-V-T-G-G-T-L-G-I-G-L-A-I-A-T-K-F-V-E-E-G-A-K-V-M-I-T-T-R（配列番号１）
Ｌ．ケフィールからの配列との比較において、次の５つのアミノ酸置換が最初の38アミノ酸（ＡＡ）で記録された：
1位 ThrがSerで（ＡＡの化学的挙動に相違はなし）；
2位 AspがAsnで（酸性荷電ＡＡが非荷電ＡＡで置換されている）；
5位 LysがAspで（塩基性ＡＡが酸性ＡＡで置換されている）；
24位 AspがThrで（酸性ＡＡが親水性ＡＡで置換されている）；
34位 ValがMetで（疎水性ＡＡがイオウを含有するＡＡで置換されている）。
この５つの場合の４つで、酵素のこれらの位置に反対の極性を生じるアミノ酸置換が存在する。
【００４２】
実施例４
酵素を開裂した後のアミノ酸部分配列の決定
ラクトバチルス・ブレビスに由来する均質なアルコールデヒドロゲナーゼを、エンドプロテイナーゼであるＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ（Boehringer Mannheim、476 986）で開裂した。このために、タンパク質は予め変性させ、カルボキシメチル化しなければならなかった。このＡＤＨサンプルを60μlのグアニジニウムバッファｐＨ8.5［2mg／ml］に直接取り、室温で30分間インキュベートした。インキュベーションが完了した後、1／10容量の111mM ＤＴＴ溶液を添加し、再度37℃で30分間インキュベートした。最後に、1／10容量の360mMヨード酢酸溶液を添加し、このサンプルを暗所において37℃で30分間インキュベートした。この反応を、β−メルカプトエタノールで停止させた。尿素（2M）を含有するバッファに再緩衝させた後、1％（最終濃度）のトリトンＸ−１００（還元）及び4.6 μg のｌｙｓ−Ｃプロテアーゼ（タンパク質量の1／25［w／w］）を添加し、これを37℃で一晩インキュベートした。時間が終了した後（少なくとも16−18時間）、1／10容量の10％ＴＦＡを添加することにより反応を停止させた。この混合物の2×150μl で3回、最後に1×100μl をＨＰＬＣに注入した。タンパク質を含むピークの各々を別々に集め、個々のランを比較した後、同じピークをプールして真空遠心で濃縮した。その後、これらのサンプル（総数18）を配列決定に直接用いた。
【００４３】
配列データ（画分の、明白で完全な配列情報を有する最も重要なデータだけを列挙する）：
ピーク画分番号３のタンパク質は、配列V-M-I-T-G-R-H-S-D-V-G-E-K（配列番号２）を有し、したがって、Ｎ−末端に直接結合する。
タンパク質画分番号５（D-Y-D-V-R-V-N-T-V-H-P-G-Y-I-K、配列番号３）及び番号６の配列も決定することができた。
後者のF-A-T-G-S-E-F-V-V-D-G-G-Y-T-A-Q（配列番号４）の場合、これはラクトバチルス・ブレビスに由来するＡＤＨのモノマーのＣ−末端に相当する。
【００４４】
残りの12の画分の配列はここには列挙しない。しかしながら、全ての部分配列を適当なクローニングで確認することが可能であった。
プロテアーゼＬｙｓＣでＬ．ケフィールに由来する精製ＡＤＨを開裂させる対応実験に成功した。ＨＰＬＣによりペプチドを分離したとき、Ｌ−ブレビスに由来する酵素の開裂において得られたものに高度に類似する開裂パターンが生じた。この開裂から、このペプチドの開裂断片の配列決定の後、Ｌ．ケフィールの酵素のほとんど完全なアミノ酸配列を得ることが可能であった。同定された配列断片をＬ．ブレビスに由来するＡＤＨの配列（図２を参照）と比較したとき、Ｌ．ケフィールの配列の部分的な断片は本質的にＬ．ブレビスの配列に対応するものの、Ｌ．ケフィールの配列には決定的な部分的断片がないことが明らかとなった。これらの部分的な断片は図２においてＸ26で示されており、すなわち、これはＬ．ブレビスの配列と一致させるために必ず26アミノ酸を含む部分的断片であり、かつ2つのアミノ酸を含む部分的断片についてはＸ2と示されている。
Ｌ．ブレビス及びＬ．ケフィールに由来するＡＤＨの配列の比較は、失われている部分的断片Ｘ26及びＸ2を別にして、18アミノ酸、すなわち約10％が置換されていることを示す。
【００４５】
実施例５
酵素のクローニング
Ａ．ラクトバチルス・ブレビスからのゲノムＤＮＡの調製
ラクトバチルス・ブレビスの細胞を50mlの高ＴＥバッファ（25mMトリス、10mMＥＤＴＡ ｐＨ8.0）で洗浄し、6000rpmで遠心した。そのペレットを10mlのＴＥ（25mMトリス、10mM ＥＤＴＡ ｐＨ8.0）に再懸濁させ、100μl のリゾチーム（100mg／ml）を添加して37℃で1.5時間インキュベートした。続いて、細胞のタンパク質を変性させ、溶解させた細胞に340μl の30％ラウリルサルコシンナトリウム、100 μl のQiagenプロテアーゼ（Qiagen、Hilden；20mg／ml）及び25μlのRNAse A（40mg／ml）を添加することにより50℃で一晩分解した。次の工程で、細胞溶解物からのＤＮＡをフェニル沈殿により他の細胞内容物から分離した。（このために、最初に純粋なフェノール（ＴＥで飽和）、次にフェノール／ＩＡＡ／ＣＨＣｌ3（25：24：1）（ＩＡＡ＝イソアミルアルコール）及び最後にＩＡＡ／ＣＨＣｌ3（24：1）を、1：1の容量比で、水相に常に添加した）。次に、合わせた水相を穏やかに攪拌することにより約5分間混合した後、20000rpmで遠心することにより分離した。最後の水性上相を0.0625容量の8M ＬｉＣｌと混合した後、2容量部の冷エタノール（100％）の層で注意深く覆った。境界層に沈殿するゲノムＤＮＡをパスツールピペットに巻き取り、冷70％エタノールで2回洗浄した。真空遠心で乾燥させた後、このＤＮＡを2mlのＴＥ（10mMトリス、1mM ＥＤＴＡ）ｐＨ8.0に取った。この単離されたＤＮＡの純度をチェックするため、この溶液を1：50に希釈し、260：280nmの商を測光法により2.0と決定した。したがってタンパク質の不純物は除外することができた。ゲルからのＤＮＡの濃度は70ng／μlであると測定され、3gの細胞から140 μg のゲノムＤＮＡが単離された。
【００４６】
Ｂ．ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のための５’及び３’プライマーとして のオリゴヌクレオチド類
Ｌ．ブレビスに由来するＡＤＨのタンパク配列のＮ−末端及びＣ−末端を、酵素によるペプチド開裂（実施例４を参照）に基づいて決定することができた。この情報を用いてＰＣＲのためのプライマーを合成した。そのように行う中で、ラクトバチルスにおいて知られている特定のコドンの公知の優位性を考慮した。コドンATG（Met）を各５’プライマーの先頭に開始コドンとして配置し（これはタンパク質配列を欠いている）、翻訳の終了を確実なものとするために２つの停止コドンを各３’プライマーの後ろに配置した。プライマー構築物を以下に列挙する（変わり得る核酸は括弧内に示す。これは、その括弧の前の核酸の代替物として組込まれ、その結果実際に用いられたプライマーは得られる組み合わせの混合である）：
５’プライマー ５’ＬＢ：
5'ATG-TCA-AAC-CGT-TTA(G)-GAT-GGT(C)-AAG-GTT(A)-GCT(A)-ATT(C)-3'（配列番号５）
３’プライマー ３’ＬＢ：
5'CTA-CTA-TTG-A(T)GC-AGT-GTA-A(G)CC-A(G)CC-ATC-A(T)AC-A(T)AC-GAA-3'（配列番号６）
これらの合成されたプライマーを冷ＮＨ3でカラムから溶離した。このＮＨ3溶液を70℃で1時間インキュベートした後、1mlのブタノールと共に振盪した。このサンプルを14000rpmで2分間遠心し、形成された上清をデカントした。このサンプルを真空遠心に5分間処して乾燥させ、そのペレットを500μl のＨ2Ｏに取った。これらのプライマーを100ピコモル／μlの濃度で用いた。
【００４７】
Ｃ．Ｌ．ブレビスに由来するゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）
以下において、テンプレート濃度（ゲノムＤＮＡ）を変化させ、他の全てのパラメータは一定に保った。アニーリング温度として52℃を選択した。
【００４８】
それぞれの混合物の容量は100 μl であり、モルのデータは最終濃度と理解されるものであり、鋳型及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）は表８に列挙される量が混合物全体に添加された。バッファ（ＰＣＲ反応バッファ；Boehringer Mannheim）は10倍の濃度で存在した。ＰＣＲを、一晩、25サイクル行った。加熱可能なカバーを備える、Perkin Elmer製のＰＣＲ装置を用いた。
【００４９】
分析作業のため、10％の混合物（容量部分）を1％アガロースゲルにのせ、100Vの定電圧で電気泳動により分離した。このＰＣＲは、約750bpのＤＮＡ断片の実質的な増幅を示した。そのシグナルは697bp及び925bpのマーカーバンドの間に存在するが、697bpにより近い。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの27kD（245ＡＡ）のADHのモノマーの分子量決定によると、この場合、ＡＤＨタンパク質のアミノ酸長及びその求められている遺伝子の塩基対長が良好に一致する。
【００５０】
Ｄ． Qiaquick ( 登録商標 ) ＰＣＲ精製キット（ Qiagen 、 Hilden ）でのＰＣＲ産生物の精製
100μl のＰＣＲ溶液に500μl のバッファＰＢをピペットにより添加し、Quiaquick (登録商標) カラム（平衡化せず）に直接かけた。遠心（1分、14000rpm）によりＤＮＡをカラムに結合させ、溶離液を廃棄した。このカラムを750μl のバッファＰＥで遠心（1分、14000rpm）により洗浄し、溶離液を廃棄した。バッファＰＥ中のエタノールの残留物を除去するため、このカラムを再度簡単に遠心した。続いて、50μlの2mMトリス／ＨＣｌ ｐＨ8.0を添加して遠心（1分、14000rpm）することにより、このカラムから溶離させた。対照のため、各々のケースにおいてこの溶出液の 1μl を分析用0.8％アガロースゲルにかけ、60Vの定電圧の下で電気泳動により分離した。濃度は、ＰＣＲ3／1については70ng／μl、ＰＣＲ3／2については90ng／μlと決定された。ＰＣＲ3／2はさらに処理し、ＰＣＲ3／1は-20℃で保存した。ＰＣＲ3／2をSpeed vacで16μlに濃縮し、Surecloneキット（16μl ＰＣＲ、 1μl クレノウ断片、2 μl 10 ×バッファ、1 μl ポリヌクレオチドキナーゼ；37℃で30分間インキュベート）の平滑化／キナーゼ反応に直接用いた。この反応混合物を分離用0.8％アガロースゲル（2時間、80V定電圧）に直接かけた。750bpでの可視バンドをゲルから切り出し、Jetsorb (登録商標) (Genomed 、Bad Oeynhausen）によりゲルから単離した。50μlの2mMトリス／ＨＣｌ ｐＨ8.0を用いて、このJetsorb材料からプラスミドＤＮＡを溶離させた。この溶液を真空遠心の助けを借りて 9μl に濃縮した。その 1μl を分析アガロースゲルに用いた。
このゲルにおけるＰＣＲ断片の濃度（150ng／μl）から、総濃度 1.2μg のＤＮＡが生じた。このサンプルを、Surecloneキットのリガーゼ混合物に用いた。
【００５１】
Ｅ．ゲルからの Jetsorb ( 登録商標 ) ＤＮＡ単離
ゲル材料100mg当たり300 μl のバッファＡ１及び10μlのJetsorb懸濁液を混合し、50℃で15分間インキュベートした。その間、Jetsorb材料への完全な結合を確実なものとするため、時々、この溶液を再度混合した。続いて、この懸濁液を11000rpmで30秒間遠心して上清を廃棄し、そのペレットを300 μl のバッファＡ２に再懸濁して11000rpmで再度遠心した。この工程を完全に繰り返した後、その上清をピペットで注意深く除去し、ペレットを50℃で5分間乾燥させた。次に、このペレットを30μlの2mMトリス／ＨＣｌ ｐＨ8.0に再懸濁させ、50℃で5分間インキュベートした。遠心（11000rpm、30秒）が完了した後、その上清を集め、ペレットを20μlの2mMトリス／ＨＣｌ ｐＨ8.0に再び再懸濁させてさらに上述の通りに処理した。得られた上清をプールし、Speed vacで18μlに濃縮した。その1 μl を分析アガロースゲルにのせた。このゲルによる濃度測定では、ＤＮＡ濃度は10ng／μl、すなわち、総濃度が160ngであった。
【００５２】
Ｆ． Sureclone キット（ Pharmacia Co. ）でのライゲーション
7 μl のＰＣＲ（1 μg ）、1 μl のpUC18ベクター（50ng）、1 μl のＤＴＴ、10μlの2倍のリガーゼバッファ及び1 μl のリガーゼを用いた。この混合物から3 μl を取り出し、ＰＣＲ断片濃度を低下させるために新しいリガーゼ混合物に用いた。この第2の混合物は、ＰＣＲ−ＤＮＡ濃度（157ng、すなわち1：3のベクター：ＰＣＲ比）を別として、第1の混合物の組成（1：20のベクター：ＰＣＲ比）に相当する。両混合物を16℃で1.5時間インキュベートした後、それらを用いて100 μl のコンピテント細胞（大腸菌XL 1 Blue）をそれぞれ形質転換した。これらのコンピテント細胞に、1 μl のリガーゼ混合物１及び4 μl のリガーゼ混合物２をピペットで添加した。それぞれの細胞懸濁液300 μl をＬＢamp−寒天プレート（ＬＢ＝カゼインペプトン／酵母抽出物；ｐＨ7.5）に塗布した。
【００５３】
増殖したコロニーを4mlの液体培地（ＬＢamp−培地）に接種し、37℃で一晩培養した。この細胞懸濁液の2mlを各々プラスミドの調製に用いた。（Qiagenミニプレッププロトコル（Qiagen、Hilden）に相当する；以下を参照）。0.7容量部のイソプロパノールを用いてこの細胞不含溶液からプラスミドＤＮＡを直接沈殿させて冷70％エタノールで洗浄し、真空遠心で乾燥させて10μlの2mMトリス／ＨＣｌバッファ（ｐＨ8.0）に取った。このプラスミド調製品からEcoRI及びHindIIIを用いて制限消化を行った（1U／μl酵素、６μlのプラスミドＤＮＡ
、37℃、1時間）。完全な消化物を0.8％アガロースゲルにのせ、80Vの定電圧で2時間電気泳動により分離した（750bpのインサートを検出）。このプラスミドを任意に後に配列決定に用いた。
【００５４】
Ｇ．プラスミドの調製（ Qiagen ミニプレップ）
4mlの液体培養物を5000rpmで5分間遠心し、そのペレットを300 μl のバッファＰ１に再懸濁した。この懸濁液に300 μl のバッファＰ２を添加し、その細胞懸濁液を室温で5分間インキュベートした。その後、この溶解細胞に300 μl の冷バッファＰ３をピペットにより添加し、核酸及びタンパク質を変性させるため、数回攪拌しながら氷上で10分間インキュベートした。変性成分を遠心（11000rmp、15分間）により除去し、その上清を1mlのＱＢＴバッファ（Qiagen、Hilden）で予め平衡化されている新しいQiagen 20チップカラム（Qiagen、Hilden）に直接かけた。このカラムを4×1mlのバッファＱＣで洗浄した後、0.8mlのバッファＱＦを用いてこのカラムからプラスミドＤＮＡを溶離した。14000rpmで30分間遠心した後、0.7容量のイソプロパノールを用いてこの溶液からＤＮＡを沈殿させた。得られたペレットを14000rpmで遠心しながら70％エタノールで2×10分間洗浄した後、真空遠心で乾燥させた。このＤＮＡを10μlの2mMトリス／ＨＣｌ pH8.0に取り、例えば、制限酵素による分析に用いた。
【００５５】
Ｈ．プラスミドのＤＮＡ配列決定
ａ．配列決定ゲルの調製
配列決定はPharmacia社製のオートリード（autoread）レーザー蛍光シーケンサー（ＡＬＦ）を用いて行った。したがって、オートリード配列決定キット（Pharmacia）を配列決定反応に用いた。このゲルの標準厚は0.5mmであった。適当なガラス板（厚さ0.35mm）をレーザー通過側に用いた。配列決定ゲル：21gの尿素（超純粋）、12gのＨ2Ｏ（Millipore）、7.5mlのアクリルアミド（Roth、ＤＮＡ配列決定用）、200 μl のＡＰＳ、45μlのＴＥＭＥＤ、6mlの10倍のＴＢＥ。0.6×ＴＢＥ（Pharmaciaの指示に相当するトリス／ホウ酸塩／ＥＤＴＡ）は移動バッファ(mobile buffer) として役立った。
ｂ．AutoReadTM配列決定キットを用いる配列決定反応
配列決定プライマー当たりそれぞれ 5μl (4μg)のプラスミドＤＮＡを用いた。
【００５６】
5 μl のプラスミドＤＮＡ、5 μl のＨ2Ｏ、2 μl のプライマー（ユニバーサル又はリバーサル）、1.5 μl の1M ＮａＯＨを一緒にピペットで計量し、ＤＮＡを変性させるために65℃で5分間インキュベートした。次に、このサンプルを直接37℃に移し、反応を1.5 μl の1M ＨＣｌで中和した。2 μl のアニーリングバッファを添加して簡単に遠心（15秒間、14000rpm）し、37℃で10分間、次いで室温でさらに10分間インキュベートした。遠心が完了した後、1 μl のエクステンションバッファ及び3.5 μl のジメチルスルホキシドをこの調製品と混合し、混合物当たり2 μl の、酵素希釈バッファで希釈したＴ７ポリメラーゼをピペットで添加した。この溶液５.２μlを、３７℃で予備インキュベートされているプレートにピペットで直接移した。このプレートには、プラスミド当たり3 μl のそれぞれのＮＴＰ混合物（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔをこの順序で）を有する4つのレーンがあった。37℃で5分間インキュベートした後、配列決定反応をSanger（Sanger, F., Nickler, S., Coulson, A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467）に従って6 μl の停止混合物を添加することにより停止させ、反応混合物を90℃で2−3分間加熱した後、鎖の復元を防ぐために氷上で直接冷却した。次に、この混合物の6 μl を配列ゲルに直接のせ、シーケンサーを作動させた。選択されたプラスミドのうちプラスミド3／1のみが正しいＤＮＡ配列を有していた。これらのデータは、次に、対応するタンパク配列（図１）に翻訳することが可能である。ユニバーサルプライマーはこの配列のＣ−末端を示し、リバーサルプライマーはＮ−末端（５’コーディング鎖）を示す。したがって、インサートは正しい方向で配置される。このＤＮＡ配列決定に基づく配列は、タンパク質の配列決定によって得られた配列データとの完全な一致を示す。
【００５７】
実施例６
Ａ． pADH 発現プラスミドの構築
アルコールデヒドロゲナーゼを発現させるため、構造遺伝子を、この構造遺伝子がＩＰＴＧで誘発され得る適切なプロモーター、好ましくはＴａｃプロモーターの制御の下で正しい方向に挿入されるような方法でpKK177発現ベクターにクローン化した。このために、ＡＤＨ遺伝子を含むpUCベクターからEcoRI及びHindIIIによりアルコールデヒドロゲナーゼの構造遺伝子を切り出し、この制限混合物をアガロースゲル電気泳動によって分離してアガロースゲルから約750bpの大断片を単離した。同時に、発現プラスミドpKK177をEcoRI及びHindIIIで切断し、この制限混合物をアガロースゲル電気泳動によって分離してアガロースゲルから約2.8kBpのベクター断片を単離した。このようにして得られた断片を記述されるように一緒にライゲートした。この新たに形成したプラスミドをpADH-1と名付けた。制限分析及び配列決定により、遺伝子の正しい挿入をチェックした。
【００５８】
Ｂ．様々な大腸菌発現株への発現プラスミド pADH-1 の形質転換
様々な大腸菌株、好ましくは大腸菌B HB101及び大腸菌K12NM522のコンピテント細胞を、Hanahanによる方法（J. Mol. Biol. 166 (1983) pp.557）に従って調製した。このように作製された細胞の200 μl を20ngの単離pADH-1プラスミドＤＮＡと混合した。氷上で30分間インキュベートした後、熱ショック（42℃で90秒間）を与えた。続いて、これらの細胞を1mlのＬＢ培地に移し、表現型発現のために37℃で1時間インキュベートした。この形質転換混合物のアリコートを、選択マーカーとしてアンピシリンを含有するＬＰプレートに塗布し、37℃で15時間インキュベートした。
【００５９】
Ｃ．大腸菌におけるラクトバチルス・ブレビスに由来するアルコールデヒドロゲナーゼの発現
発現プラスミドpADH-1を取り込んでいる形質転換体を取り出し、それぞれアンピシリンを含有するＬＢ液体培地3mlに再接種して、ローラーにおいて37℃でインキュベートした。これらの細胞を、光学濃度（測定波長550nm）0.5で、1mM ＩＰＴＧを用いて誘導した。各々の対照として、発現プラスミドは含むが誘導はしないクローン及び発現プラスミドは含まないがＩＰＴＧで誘導はするそれぞれの大腸菌WTも処理した。誘導と一晩増殖の後4時間で、光学濃度がＯＤ550＝5に相当するチューブの各々からアリコートを取り出した。これらの細胞を遠心（6000rpmで10分間、4℃）して300 μl のＴＥバッファ（50mMトリス−ＨＣｌ、50mM ＥＤＴＡ、ｐＨ8.0）に取り、超音波（Branson Sonifire 450／氷上においてレベル2で2×30秒間）により溶解した。可溶性タンパク質を、遠心（10分間、14000rpm）により不溶性蛋白質及び細胞壁成分から分離した。この時点で、活性試験を行うためにアリコートを取り出した。残りの上清を50μlの5×アプリケーションバッファ（60mMトリス−ＨＣｌ ｐＨ6.8、1.2％ＳＤＳ、10％グリセロール、0.7M２−メルカプトエタノール、0.05％ブロモフェノールブルー）と混合し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動用に調製した。タンパク質ペレット（不溶性蛋白質及び細胞壁成分）は、再度300 μl のＴＥバッファ（50mMトリス−ＨＣｌ、50mM ＥＤＴＡ、ｐＨ8.0）に取り、超音波インパルス（Branson Sonifire 450）を5回加えることにより再懸濁させた。これらのサンプルもそれぞれの容量の5×アプリケーションバッファと混合した。最後に、タンパク質を完全に変性させるため、全てのサンプルを95℃で5分間加熱した。
【００６０】
Ｄ．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、U. K. Laemmli（1970, Nature 227, pp.680-685）の方法に従って行った。可溶性及び不溶性タンパク質画分を別々に15％分離ゲルにおいて分離し、続いてタンパク質バンドをクーマシー染色溶液（0.2％クーマシー、30％エタノール、10％酢酸）で染色した。
【００６１】
用いられた大腸菌株のラクトバチルス・ブレビスに由来するアルコールデヒドロゲナーゼは、可溶性蛋白質として排他的に発現した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて〜27kDaのサイズを有することが予め決定されているさらなるタンパク質バンドに基づいて、この可溶性蛋白質画分についてこれを排他的に示すことが可能であった。このさらなるタンパク質バンドは、対照（プラスミドを含む非誘導クローン及びプラスミドを含まない誘導クローン）及び不溶性タンパク質画分を含むサンプルには見られなかった。
この粗製抽出物を用いて行われた活性試験は、アルコールデヒドロゲナーゼが可溶性の形態というだけではなく活性な形態で発現することも示した。
【００６２】
実施例７
Ｒ−フェニルエタノールの酵素触媒生産
精製酵素（実施例２Ｃ）及び必要な補酵素（ＮＡＤＰ）を、アセトフェノンからの（Ｒ）−フェニルエタノールの酵素触媒合成に用いた。酸化された補酵素はイソプロパノールにより連続的に再生した。このイソプロパノールは、この反応が触媒量の補酵素だけを必要とするように同時に存在させた。詳しく述べると、その混合物は以下のものを含有していた（この試験におけるこれらの成分の最終濃度は、括弧内に列挙する）：20μlのＮＡＤＰ（0.05mM）、7.7 μl のイソプロパノール（0.1M）、0.6 μl のアセトフェノン（5mM）、921.7 μl のトリエタノールアミンバッファ（50mM；ｐＨ7.0、1mM ＭｇＣｌ2を含有）及びラクトバチルス・ブレビスに由来する50μlのアルコールデヒドロゲナーゼ（4.5単位）。総容量1mlのこの混合物を30℃で24時間インキュベートした後、サンプルをガスクロマトグラフィーにより分析した。このために、100 μl を取り出して100 μl のクロロホルムと共に振盪し、遠心により相分離してＧＣのためにアリコートを低相（クロロホルム）から採取した。
【００６３】
ガスクロマトグラフィーでの（Ｒ）−及び（Ｓ）−フェニルエタノールの分離のための分離条件：固定相：Lipodex E、CDカラム（Macherey and Nagel, Duren）、移動相：ヘリウム、注入容量；1 μl 、検出：ＦＩＤ、温度：110℃。これらの条件下において、10.5分で基質であるアセトフェノンが、13.8分で（Ｓ）−フェニルエタノールが、及び14.2分で（Ｒ）−フェニルエタノールが溶出する。（Ｓ）−及び（Ｒ）−フェニルエタノールの保持値は、市販されているラセミ混合物（Fluka Co. Buchs, Switzerland）を用いて得ることができる。24時間後に、95％を超える基質が変換され、ＧＣクロマトグラムは次の値を示す：アセトフェノン（保持時間10.5分）：面積＝9.800；（Ｓ）−フェニルエタノール（保持時間13.8分）：面積＝<500；（Ｒ）−フェニルエタノール（保持時間14.2分）：面積＝240000。
【００６４】
実施例８
ラクトバチルス・ブレビスの全細胞を用いるケトン類の還元によるアルコール類の生産
加えて、Ｌ．ブレビスの全細胞を用いて、ケトン類をキラルアルコール類に還元することができる。この場合、細胞内に存在する補酵素が利用されるため、ＮＡＤＰを添加する必要はない。補酵素の再生は、イソプロパノールにより、又はグルコースのような代謝可能な基質により達成することができる。試験混合物：50mgのＬ．ブレビスの細胞（遠心後の湿重量）を、0．1Mグルコース及び10mMアセトフェノンを含有する860 μl のトリエタノールアミンバッファ（50mM；ｐＨ7.50；1mM ＭｇＣｌ2+を添加）に懸濁する。サンプルはガスクロマトグラフィーにより分析する。30℃で2時間インキュベートした後には、アセトフェノンはもはや検出されず、それに代わって相当する量のフェニルエタノールが生成している。キラル固定相でのＧＣ分離による定量がなされているため、同時に、生成したフェニルエタノールは光学的に高純度のものであるが、定量可能な（Ｓ）−アルコールが検出不可能であったことを示すことが可能であった。光学純度は、（Ｒ）−アルコールについて>95％という高率であった。これは、Ｌ．ブレビスの細胞が生成するアルコール類の光学純度を妨げ得るさらなるアルコールデヒドロゲナーゼを明らかに含まず、その結果、全細胞を用いるこのような方法でキラルアルコール類を生産することが可能であることを示す。
【００６５】
【配列表】
【００６６】
【化５】
【００６７】
【００６８】
【化６】
【００６９】
【００７０】
【化７】
【００７１】
【００７２】
【化８】
【００７３】
【００７４】
【化９】
【００７５】
【００７６】
【化１０】
【００７７】
【００７８】
【化１１】
【００７９】
【００８０】
【００８１】
【００８２】
【化１２】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【化１３】
【００８６】
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌におけるＬ．ブレビスに由来する組換えＡＤＨのＤＮＡ及びタンパク質配列（上列は各々の場合における核酸配列（配列番号７）、下はその三文字コードに対応するアミノ酸配列（一文字コードで、配列番号８））。この配列は、開始コドンを介して挿入されているメチオニンで始まる。このメチオニンは、純粋なタンパク質の配列決定によって得られた対応アミノ酸配列には見出されない（Ｎ−末端；実施例３Ｆ及び実施例４を参照）。
【図２】ＬｙｓＣプロテアーゼによる開裂の後にペプチドを配列決定することにより得られた、ラクトバチルス・ケフィールに由来するアルコールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号９）。
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えばラクトバチルス属の種のような微生物、特にはラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）に由来する新規の鏡像異性選択アルコールデヒドロゲナーゼ類（ＡＤＨ）に関する。この新規酵素は、有機ケト化合物を還元して対応するヒドロキシ化合物を生成するのに特に利点があり、これらの還元は対応するＲ化合物を鏡像異性的に選択する。このプロセスにおける、ｅｅ（%）＝（Ｒ）−生成物−（Ｓ）−生成物／（Ｒ）−生成物＋（Ｓ）−生成物×100として算出される鏡像異性体過剰は通常95％を超える。本発明によるＡＤＨを用いた場合、Ｓヒドロキシ化合物は検出されなかった。その広範な基質スペクトルにより、本発明による酵素は、例えばキラルアルコール類、キラルヒドロキシエステル類（例えば、α−及びβ−ヒドロキシエステル類）及びヒドロキシ酸を生産するためにも用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】
光学的に活性なヒドロキシ化合物は、古典的な化学プロセスでは調製が困難な、価値の高いキラル構築ブロックである。このため、通常、生物工学的プロセスが微生物の全細胞を用いるか、もしくは単離酵素によるキラル化合物の生産のために考慮される。例えば、F.Aragozziniらの刊行物（Appl.Microbiol.Biotechnol.（1986）24, 175-177）に示されるように、全細胞を用いるプロセスはしばしば低収率、僅かな鏡像異性体過剰（すなわち、低ｅｅ値）及び長い反応期間という結果に終わり、そのため精製され濃縮された形態で用いることができる酵素がより有利である。アルコール類のようなキラルヒドロキシ化合物の場合、補酵素（しばしばＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ）の助けを借りてプロキラル化合物を還元するアルコールデヒドロゲナーゼ類を用いることができる。概して、これらの反応は高度に鏡像異性体選択的である。従来利用可能なアルコールデヒドロゲナーゼ類（ＡＤＨ）は全てＳ−アルコール類を導き、これらの酵素の幾つかについての基質スペクトルは比較的狭い（酵母ＡＤＨ、ウマ肝臓ＡＤＨ）。ラクトバチルス・ケフィール（Lactobacillus kefir）に由来するＮＡＤＰ依存性アルコールデヒドロゲナーゼがDE 40 14 573 C1に記述されている。これはＲ−アルコール類を導く。しかしながら、この酵素は比較的不安定であることが判明しており、それ故均質な酵素を形成させるための精製は実質的な損失を伴ってのみ可能である（＞98％）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
驚くべきことに、かなり高い安定性を有するＲ−特異的アルコールデヒドロゲナーゼが徹底的なスクリーニングにより見出された。最も類似する従来既知のＡＤＨ酵素と比較してこの酵素の熱非活性化を決定する場合、本発明の酵素が約65℃の温度で50％が不活性化するだけであるのに対して、従来既知の酵素は45℃で既に50％が不活性化することが判明する。加えて、より高い熱安定性は、より高い貯蔵安定性及び特定の反応条件下でのより高い安定性を意味する。
【０００４】
相当する安定性を有するＲ−ＡＤＨ酵素が、特に、ラクトバチルス・ブレビスのようなラクトバチルス属及びベータバクテリウム亜群（Ａ群）に見出された。従来、安定なＲ−特異的アルコールデヒドロゲナーゼを有する微生物又は生物は知られていなかった。Ｌ.ケフィールＡＤＨタンパク質に対する抗体の助けを借りて、今や、ベータバクテリウム亜群（Ａ群）の全てのラクトバチルスがこの抗体と反応する対応蛋白質を有することが示されている。対照的に、特にラクトバチルス・ブレビスでは、特に良好な酵素活性を検出することが可能である。しかしながら、この群のその他の株も、たとえそれらが与えられた培養および試験条件下において幾らか低い活性を示すとしても、そのような反応に原理的に適切な酵素を有する。これとは対照的に、他の亜群（サーモバクテリウム、ＩＡ、ストレプトバクテリウム ＩＢ、ベータバクテリウムＢ群）のラクトバチルスは、抗体試験での反応も示さず、適切な酵素活性も持たない。
【０００５】
ラクトバチルス・ブレビスから得ることができる安定な酵素を均一に精製することは可能であった。精製した酵素を用いて、タンパク質配列の対応データを決定した。そのＮ−末端アミノ酸の配列の比較は、本発明による安定な酵素と他の微生物起源のＡＤＨ類との間には多くの一致があるものの、幾つかのアミノ酸が交換されていることを示している。
【０００６】
実施された以下の生化学的な特徴付けが、対応する従来既知の酵素と比較しての本発明による酵素の相違、例えばケトン類に対する相対活性に関する相違、をさらに示す。本発明によるＡＤＨの最大安定性は、例えば、約9.0のｐＨ値にある。加えて、この酵素はおおよそｐＨ5.5で良好な安定性を有する。これは、例えば、50 mM ＭＥＳバッファ（ＭＥＳ＝２−モルホリノエタンスルホン酸）において当てはまる。同じバッファ系において、本発明による酵素は、25℃ないし60℃の温度でおおよそ30分の後でも95％を超える残留活性を有する。この酵素は約40℃に最大安定性を有する。加えて、この酵素は約50℃に活性最大を有する。
【０００７】
さらに、本発明による酵素は、アミノ酸のレベルで従来既知のＡＤＨ酵素とは異なる。例えば、そのＮ末端には全長38アミノ酸（ＡＡ）にわたって5つのアミノ酸置換があり、これは12％を上回るＡＡ相違を意味する。このように、全ての比較が、本発明のよるアルコールデヒドロゲナーゼ、特にはラクトバチルス・ブレビスに由来するもの、を対応する用途に用いることが有利であることを示す。
【０００８】
本発明のさらなる主題は、本発明による酵素の適切な微生物からの単離に関する。1972年6月6日にDSM 20054という番号で“Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen”、Braunschweigに寄託され、自由に利用することができるラクトバチルス・ブレビスの株を用いて、良好な酵素収率が達成された。
このＡＤＨの単離及び精製のためのプロセスは、本質的に、次の処理工程により進められる：培養した細胞を、例えばガラスビーズにより機械的に破壊し、疎水性クロマトグラフィーもしくは相互作用クロマトグラフィー、続いて陰イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティクロマトグラフィーを行う。特に、全ての均質化及び溶離バッファが約0.5ないし5mMのマグネシウムを含有する場合が有利であることが立証されている。これに関して、約1mMのＭｇ2+濃度が特に有利であることが立証されている。このようにして、少なくとも400U/mg、多くの場合500U/mgまでの比活性を有する酵素が得られる。
【０００９】
加えて、本発明による酵素は組換えプロセス、すなわち、適切な原核又は真核株におけるこの酵素をコードする適切なＤＮＡの発現により生産することができる。特には、大腸菌におけるラクトバチルス・ブレビスに由来するＡＤＨ構造遺伝子に基づく系が適切である。これに関しては、驚くべきことに、このアルコールデヒドロゲナーゼが可溶性かつ活性なタンパク質として排他的に発現することが特に有利であることが立証されている。
【００１０】
本発明のさらなる主題は、１，４−ブタンジオール−ジグリセリジルエーテルまたは下記の一般式（Ｉ）の有機ケト化合物の鏡像異性体選択的還元方法であって、この方法は該化合物又は適切な混合物を本発明の微生物アルコールデヒドロゲナーゼで処理することを特徴とする。１，４−ブタンジオール−ジグリセリジルエーテル、下記の一般式（Ｉ）の有機ケト化合物または前記化合物の適切な混合物は、約２０℃〜６０℃で約１５分〜３時間、本発明の微生物アルコールデヒドロゲナーゼ又は該酵素を含有する細胞の存在下においてインキュベートし、適切なＲ−ヒドロキシ化合物を単離することができる。
【００１１】
【化３】
（式中、Ｒ1およびＲ2は、異なっているかまたは同じであり、水素、ヒドロキシ、一緒になってあるいは個別に、直鎖もしくは分岐Ｃ1-20アルキル、直鎖もしくは分岐Ｃ1-20アルケニル、直鎖もしくは分岐Ｃ1-20アルコキシカルボニルまたは直鎖もしくは分岐Ｃ1-20アルコキシ、アリールまたはアラルキル基（これらは一つまたは数個のハロゲン原子、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシル、オキソ、Ｃ1-20アルコキシ、Ｃ1-20アルキル、Ｃ1-20アシル、Ｃ1-20アルコキシカルボニルまたはアリール−Ｃ1-20アルコキシカルボニル基で置換されてもよい）、直鎖または分岐Ｃ1-10アルキレン基（これは一つまたは数個の飽和、不飽和もしくは芳香族含窒素、含酸素もしくは含硫黄複素環、アルコキシカルボニルまたはアルキル基（これらはアルコキシカルボニル基で置換されてもよい）で置換されてもよい）、または単縮合もくしは重縮合脂環式もしくは芳香族基である。）
この場合、本発明による酵素は、そのまま、また、この酵素を産生する微生物の培養物あるいはこの酵素を含有する細胞として用いることができる。この反応は、好ましくは、水性バッファ、例えばリン酸カリウム、トリス／ＨＣｌもしくはトリエタノールアミン（ＴＥＡ）バッファ中で、マグネシウムイオンの存在下において、5ないし10、好ましくは6ないし9のｐＨ値、及び10℃ないし70℃、好ましくは30℃ないし60℃の温度で行う。加えて、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈのような適切な補酵素、及び酸化された補酵素を再生するための適切な作用物質、例えばイソプロパノール、が反応混合物中に存在する。適当な変換、例えば、好ましくは50％の変換が達成されたとき、例えばクロロホルム中で直接抽出を行うことにより反応を停止させることが好ましい。しかしながら、ｐＨ値の低下、加熱、又は適切な酵素阻害剤の添加により反応を停止させることもできる。続いて、得られた鏡像異性的に純粋なＲ−ヒドロキシ化合物を水と混和しない有機溶媒で抽出し、クロマトグラフィー又は蒸留の既知のプロセスにより未変換ケト化合物又は他の出発化合物から分離する。鏡像異性体の純度は、キラルカラム材料でのＧＣ及び／またはＨＰＬＣあるいは旋光計で決定するのが便利である。特に、本発明による方法は、ケトン類、α、βもしくはγケトンエステル類のようなケトエステル類並びに環状アリール及びアルキルエステル類、好ましくは、例えばハロゲンもしくはアルキルで置換されている残基を有するものの還元に適することが立証されている。アセトフェノン誘導体類、メチルシクロヘキサノン類、２，４−ペンタンジオンのような特定のジケトン類、様々な酢酸エステル類及びピルビン酸エチルのようなアルキルエステル類の場合に、特に良好な結果が達成された。
【００１３】
本発明のさらなる主題は、下記の一般式（ＩＩ）の有機ヒドロキシ化合物の鏡像異性体選択的製造方法であって、この方法は有機ヒドロキシ化合物のラセミ混合物または該有機ヒドロキシ化合物を本発明の微生物アルコールデヒドロゲナーゼ又は該ＡＤＨを含有する細胞で処理することを特徴とする。下記の一般式（ＩＩ）の有機ヒドロキシ化合物のラセミ混合物または該有機ヒドロキシ化合物を本発明の微生物アルコールデヒドロゲナーゼ又は該ＡＤＨを含有する細胞で、水性バッファ中で、約５〜１０のｐＨ値、好ましくは約６〜９のｐＨ値で、約１０℃〜７０℃で、好ましくは約３０℃〜６０℃、より好ましくは約２０〜６０℃の温度で約１５分〜３時間インキュベートし、次いで得られた鏡像異性体選択的に純粋なＳ−ヒドロキシ化合物を単離することができる。
【００１４】
【化４】
（式中、Ｒ1およびＲ2は各々前記の意味を有する。）
あるいは、上述の条件又はそのような反応について当業者に公知の条件が適用される。
本発明のよるＡＤＨは、完全にもしくは部分的に精製して、又は細胞中に存在するままで、記述される反応に用いることができる。これに関しては、細胞は未変性の形態、透過性が付与された形態、又は溶解された形態で存在することができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下の実施例において、本発明をより詳細に説明する。
【００１７】
【実施例】
実施例１
ラクトバチルス属の菌株間でのＲ−アルコールデヒドロゲナーゼのスクリーニング
ラクトバチルス属を、生理学的特徴に基づいてサーモバクテリウム(Thermobacterium) 、ストレプトバクテリウム(Streptobacterium)及びベータバクテリウム(Betabacterium) の3つの亜群に分類学的に分割し、ベータバクテリウムは2つの亜群Ａ及びＢにさらに分割する。全ての亜群の典型株を、ラクトバチルス・ケフィールに由来するアルコールデヒドロゲナーゼに対する抗体で試験し、それらがこの抗体に反応するかどうを決定した。驚くべきことに、他の全ての株が不活性であったのに対して、ベータバクテリウムの亜群Ａの試験した株の全てが反応性を示した。次に、ベータバクテリウムの亜群Ａの株の粗製抽出物を酵素試験において試験し、どの程度の酵素活性が存在するのかも決定した。それらの結果を表１にまとめる。これは、提示されている培養及び試験条件下では、この亜群の幾つかの株が、抗体試験が陽性であったにもかかわらず、酵素活性を全く示さないか、あるいは僅かしか示さないことを示している。しかしながら、ラクトバチルス・ブレビスのサンプルにおけるＡＤＨの酵素活性が特に高いことが注目された。
【００１８】
ラクトバチルス・ブレビスからのアルコールデヒドロゲナーゼの単離及び精製
Ａ．ラクトバチルス・ブレビスの培養
酵素を得るために、ラクトバチルス・ブレビスを次の培地において培養した（量g/L）：
グルコース（20）、酵母抽出物（5）、トリプトン（10）、肉抽出物（5）、クエン酸水素二アンモニウム（2）、酢酸ナトリウム（5）、硫酸マグネシウム（0.1）、硫酸マンガン（0.05）、リン酸水素二カリウム（2）。
【００１９】
この溶液を1Lまで満たしてｐＨ値を6.5に調整し、続いてこの培地を121℃（2バール）で10分間滅菌した。さらに酸素を供給したり、ｐＨを調節することなく、30℃で株を培養した。
滅菌及び30℃での保温の後、発酵器中で、10Lのスケールのこの培地に4％予備培養物（ＯＤ6600.35）を接種した。特定の時点でサンプルを採取し、次いでその細胞を破壊した後にＯＤ660、新鮮重量(fresh weight)及び酵素活性を試験することにより、細胞増殖の時間経過及び酵素活性をこの調製物に対する例として決定した。そのような時間経過から、Ｌ．ブレビスに由来するアルコールデヒドロゲナーゼの活性は、僅か1.5時間だけ維持される増殖の定常期に到達した後にその最大活性値を示すことがわかった。
この微生物を同じ条件下で220Lのスケールで培養し、ｐＨ値5.3及びＯＤ6602.2で13時間後に、遠心により700gの細胞塊を得た。この細胞塊は、測定し得る活性の損失もなく、-20℃で数ヶ月間にわたって保存することが可能である。
【００２０】
Ｂ．酵素の単離（粗製抽出物の生産）
ガラスビーズ（0.3mm）の助けを借りて湿式破砕により、細胞から酵素を放出させる。しかしながら、これは細菌細胞を破壊する他のいかなる方法によっても達成することができる。この細菌塊を、消泡剤（ポリプロピレングリコール）が補足されている0.1M酢酸バッファｐＨ4.0＋1mM ＭｇＣｌ2で40％懸濁液に希釈する。これを、継続的に冷却しながら、破壊装置（IMA Co.）内において、4000rpmで、ガラスビーズを1：2の比で添加して、20分間破壊した。8gの細菌が、40U/mlの容量活性及び約3mg/mlのタンパク質含量を有する10mlの粗製抽出物を産生した。酵素試験には、970 μl のトリエタノールアミンバッファ（100mM；ｐＨ7.0；11mMアセトフェノンを含有）、20μl ＮＡＤＰＨ（最終濃度0.19mM）及び酵素溶液が含まれる。
酵素単位の定義：1Uは、1分当たりに1マイクロモルの基質（アセトフェノン）を変換するのに要する酵素の量に相当する。
【００２１】
Ｃ．ラクトバチルス・ブレビスからのアルコールデヒドロゲナーゼの精製
この酵素は、疎水性相互作用クロマトグラフィー、次いで陰イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティクロマトグラフィーにより、均一に精製することができる。この場合、約1mMのＭｇ2+イオンを全てのバッファに添加するよう助言することができる。これらのイオンがないと、酵素に不可逆的な損傷を与えることがある。
【００２２】
１．疎水性相互作用クロマトグラフィー
5mlの粗製抽出物（実施例２Ｂに対応）を、小ゲル濾過カラム（PD10、Pharmacia）により1mM ＭｇＣｌ2及び0.6M （ＮＨ4）2ＳＯ4を含有する50mMトリエタノールアミンバッファｐＨ7.0中に再緩衝し、フェニル−セファロースCL-6B（Pharmacia Co.、Freiburg、Germany）にかける。このカラムを、50mMトリエタノールアミンバッファｐＨ7.0、1mM ＭｇＣｌ2及び0.6M （ＮＨ4）2ＳＯ4で平衡化する。カラムにかけてカラムを平衡化バッファですすいだ後、酵素を減少する直線塩勾配（6Mから0Mの（ＮＨ4）2ＳＯ4、流速1ml／分）を用いて0.36M （ＮＨ4）2ＳＯ4で溶離する。活性画分をプールし、1.2M （ＮＨ4）2ＳＯ4の濃度に調整する。このタンパク溶液を、50mMトリエタノールアミンバッファｐＨ7.0、1mM ＭｇＣｌ2及び1.2M （ＮＨ4）2ＳＯ4で既に平衡化されているオクチル−セファロースカラムにかける。タンパク溶液をカラムにかけ、続いてカラムをすすいだ後、酵素を減少する直線塩勾配（1.2Mから0Mの（ＮＨ4）2ＳＯ4、流速1ml／分）を用いて1.0M （ＮＨ4）2ＳＯ4で溶離する。達成された精製を表２に示す。
【００２３】
２．陰イオン交換クロマトグラフィー
上で用いた最後のカラムからの最も活性の高い画分を、ゲル濾過カラム（PD10、Pharmacia）により1mM ＭｇＣｌ2を含有する50mMトリス／ＨＣｌバッファｐＨ9.0に再緩衝し、この方法で既に平衡化されているモノＱカラム（流速1ml／分；圧力1.5MPA；ＦＰＬＣクロマトグラフィーシステム；Pharmacia Co. Freiburg、Germany）にかける。このカラムをすすいだ後、アルコールデヒドロゲナーゼを0Mから6MのＮａＣｌの直線塩勾配で溶離させる。この酵素は、0.36Ｍ ＮａＣｌで現れる。
【００２４】
３．アフィニティクロマトグラフィー
活性画分を、50mMモルホリノエタンスルホン酸バッファｐＨ5.5及び1mM ＭｇＣｌ2で既に平衡化されているゲル濾過カラム（PD10、Pharmacia Co.）により再緩衝し、この方法で既に平衡化されている２’，５’ＡＭＰ−セファロースカラム（Pharmacia Co.）にかける。続いて、同じバッファに溶解した100mM ＮａＣｌでこれをすすぐ。次に、0から10mMのＮＡＤＰの直線ＮＡＤＰ勾配でこれを溶離する。デヒドロゲナーゼは3．33mM ＮＡＤＰで溶離する。このクロマトグラフィーは0．25ml／分の流速で行った。酵素の完全な精製を表２にまとめる。
【００２５】
Ｄ．ラクトバチルス・ケフィールからのアルコールデヒドロゲナーゼの精製
ラクトバチルス・ケフィールは細胞内ＮＡＤＰ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（DE 40 14 573 C1）を有しており、それらの幾つかの生化学的特性（Ｒ−アルコール類の生産、補酵素特異性）はラクトバチルス・ブレビスに由来するアルコールデヒドロゲナーゼのものに類似する。両酵素の間の相違を示し、Ｌ．ブレビスに由来する酵素の利点を示すため、Ｌ．ケフィールに由来するアルコールデヒドロゲナーゼをＬ．ブレビスの酵素と同様に均一に精製し、特徴付けの過程でＬ．ブレビスの酵素を比較（例えば、温度安定性、Ｎ−末端アミノ酸配列）により試験した。ラクトバチルス・ケフィールの培養、酵素単離及び均質な酵素への精製は、Ｌ．ブレビスについて実施例２Ａ）−２Ｃ）に記述される通りに行った。表３には、Ｌ．ケフィールの酵素の精製がまとめられている。
【００２７】
【００２８】
１．Ｌ．ブレビス及びＬ．ケフィールに由来するＡＤＨ酵素は、イオン交換体材料（この場合モノＱ）に結合した後、大きく異なる塩濃度で脱離する。結合の強さにおけるこの相違は、アミノ酸組成における荷電アミノ酸に関する相違を示す。これは、以下に記述される配列決定により確認することができた。
２．精製された酵素的に活性なタンパク質の収率は、Ｌ．ブレビスの酵素が大きく上回っている。これはより安定な酵素であることを示している。
【００２９】
実施例３
ラクトバチルス・ブレビスに由来するアルコールデヒドロゲナーゼの生化学的な特徴付け
Ａ．ｐＨ安定性
様々なｐＨ値を有するバッファ中に保存する場合の酵素の活性の依存性を、ｐＨ4ないし11の範囲で試験した。バッファの許容度(capacity)に応じて4ないし11のｐＨ範囲の様々なバッファを調製し、そこで均質な酵素を30分間インキュベートした。それらの 1μl を取り出し、トリエタノールアミンバッファ（100mM；ｐＨ7.0；11mMアセトフェノンを含有する）970 μl 及びＮＡＤＰＨ（最終濃度0.19ｍＭ）20μl の通常の試験混合物に添加した。この反応を、30℃で1分間、340nmで監視した。これによりｐＨ安定性の2つの最大が示され、低いものはｐＨ5.5及び高いものはｐＨ9.0であった。この安定性を表4に示す。
【００３０】
Ｂ．温度安定性
２５ないし７０℃の範囲の温度安定性を、Ａに記述されるものと類似の方法で決定した。均質な酵素溶液にそれぞれの温度を30分間施し、次いで上述の試験混合物を用いて30℃で直接測定した。このアルコールデヒドロゲナーゼは、25ないし60℃の温度範囲で提示されている期間（cf. 表５）安定であり、40℃で最大を示す。対照的に、Ｌ．ケフィールに由来するＡＤＨは37℃で最大で40℃までしか安定ではなく、その後活性は急速に減少する。この酵素の最大は37℃にある。
【００３２】
Ｃ．最適温度
最適試験温度を決定するため、25ないし70℃で酵素活性を測定した。試験混合物は標準濃度のアセトフェノン及びＮＡＤＰＨに相当しており、その各々を提示されている温度で5分間インキュベートした。表６に示されるように、この酵素の最適試験温度は50℃である。対照的に、Ｌ．ケフィールに由来するアルコールデヒドロゲナーゼは37℃で最適であり、45℃より高い試験温度ではその活性は急速に減少する（表５）。
【００３４】
Ｄ．アルコールデヒドロゲナーゼの基質スペクトル
アセトフェノンの代わりに一連の他のケトン類及びケトエステル類を用い、酵素触媒によりこれらが還元され得るかどうかを試験した。
【００３６】
以下の試験混合物をこれに用いた：
970 μl トリエタノールアミンバッファ（50mM；ｐＨ7.0；10mMケト化合物を含有）
20μl ＮＡＤＰＨ（この試験では0.19mM）
10μl 精製酵素（実施例２を参照、アフィニティクロマトグラフィーの後、1：10に希釈）
ケトン類の幾つかは、10mMで起こり得る基質阻害を確認するため、1mMの濃度でも試験した。しかしながら、10mMのケトン濃度でそのような過度の阻害は起こらないことが明らかになった。対応する基質に対して得られた活性は表７に提示されている。
【００３７】
ｐ−Ｃｌ−アセトフェノン、メチル−１−ナフチルケトン及びメチルシクロヘキサノンのような基質については、文献値に基づいてＬ．ケフィールに由来するアルコールデヒドロゲナーゼとＬ．ブレビスに由来するものとを直接比較することが可能である（Hummel, W.Appl.Microbiol.Biotechnol. (1990),34,15-19）。この比較は、本発明によるＡＤＨがこれらの化合物をより高い活性で変換することを示す。その活性は、Ｌ．ケフィールに由来するＡＤＨのものよりも約50ないし100％高い。
【００３８】
本発明による酵素の基質スペクトルは、その広範さに関して、Ｌ．ケフィールの酵素に類似している。両酵素は、アセトフェノン誘導体類、２−及び３−オキソエステル類、環状及び開鎖ケトン類を高い活性で変換し、ケトン類を還元することによりＲ−アルコール類を生成することが可能である。
【００４０】
Ｅ．ラクトバチルス・ブレビスに由来するアルコールデヒドロゲナーゼの分子量
ラクトバチルス・ブレビスに由来する精製したアルコールデヒドロゲナーゼを、ゲル濾過カラムSuperdex G-200（Pharmacia Co.、Freiburg）にかけた。その分子量を、既知分子量のタンパク質を用いて得た検量線により決定した。このゲル濾過におけるバッファのｐＨは、精製のための通常のｐＨ値である7.0であった（100mM ＴＥＡ、ｐＨ7.0、0.2M ＮａＣｌ、1mM ＭｇＣｌ2）。これらの条件下で、Ｌ．ブレビスのＡＤＨについて約104kDの分子量が測定され、これはＬ．ケフィールのＡＤＨのものに相当する。さらに、両酵素は4つのサブユニットから構成される。
【００４１】
Ｆ．アルコールデヒドロゲナーゼのＮ−末端配列の決定
Applied Biosystems／U.S.A.社の、オンラインＨＰＬＣモデル120Aを使用するPulsed Liquid Sequencer Model 477Aを用いてN−末端配列を決定し、Ｌ．ケフィールに由来するアルコールデヒドロゲナーゼのN−末端配列と比較した。
S-N-R-L-D-G-K-V-A-I-V-T-G-G-T-L-G-I-G-L-A-I-A-T-K-F-V-E-E-G-A-K-V-M-I-T-T-R（配列番号１）
Ｌ．ケフィールからの配列との比較において、次の５つのアミノ酸置換が最初の38アミノ酸（ＡＡ）で記録された：
1位 ThrがSerで（ＡＡの化学的挙動に相違はなし）；
2位 AspがAsnで（酸性荷電ＡＡが非荷電ＡＡで置換されている）；
5位 LysがAspで（塩基性ＡＡが酸性ＡＡで置換されている）；
24位 AspがThrで（酸性ＡＡが親水性ＡＡで置換されている）；
34位 ValがMetで（疎水性ＡＡがイオウを含有するＡＡで置換されている）。
この５つの場合の４つで、酵素のこれらの位置に反対の極性を生じるアミノ酸置換が存在する。
【００４２】
実施例４
酵素を開裂した後のアミノ酸部分配列の決定
ラクトバチルス・ブレビスに由来する均質なアルコールデヒドロゲナーゼを、エンドプロテイナーゼであるＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ（Boehringer Mannheim、476 986）で開裂した。このために、タンパク質は予め変性させ、カルボキシメチル化しなければならなかった。このＡＤＨサンプルを60μlのグアニジニウムバッファｐＨ8.5［2mg／ml］に直接取り、室温で30分間インキュベートした。インキュベーションが完了した後、1／10容量の111mM ＤＴＴ溶液を添加し、再度37℃で30分間インキュベートした。最後に、1／10容量の360mMヨード酢酸溶液を添加し、このサンプルを暗所において37℃で30分間インキュベートした。この反応を、β−メルカプトエタノールで停止させた。尿素（2M）を含有するバッファに再緩衝させた後、1％（最終濃度）のトリトンＸ−１００（還元）及び4.6 μg のｌｙｓ−Ｃプロテアーゼ（タンパク質量の1／25［w／w］）を添加し、これを37℃で一晩インキュベートした。時間が終了した後（少なくとも16−18時間）、1／10容量の10％ＴＦＡを添加することにより反応を停止させた。この混合物の2×150μl で3回、最後に1×100μl をＨＰＬＣに注入した。タンパク質を含むピークの各々を別々に集め、個々のランを比較した後、同じピークをプールして真空遠心で濃縮した。その後、これらのサンプル（総数18）を配列決定に直接用いた。
【００４３】
配列データ（画分の、明白で完全な配列情報を有する最も重要なデータだけを列挙する）：
ピーク画分番号３のタンパク質は、配列V-M-I-T-G-R-H-S-D-V-G-E-K（配列番号２）を有し、したがって、Ｎ−末端に直接結合する。
タンパク質画分番号５（D-Y-D-V-R-V-N-T-V-H-P-G-Y-I-K、配列番号３）及び番号６の配列も決定することができた。
後者のF-A-T-G-S-E-F-V-V-D-G-G-Y-T-A-Q（配列番号４）の場合、これはラクトバチルス・ブレビスに由来するＡＤＨのモノマーのＣ−末端に相当する。
【００４４】
残りの12の画分の配列はここには列挙しない。しかしながら、全ての部分配列を適当なクローニングで確認することが可能であった。
プロテアーゼＬｙｓＣでＬ．ケフィールに由来する精製ＡＤＨを開裂させる対応実験に成功した。ＨＰＬＣによりペプチドを分離したとき、Ｌ−ブレビスに由来する酵素の開裂において得られたものに高度に類似する開裂パターンが生じた。この開裂から、このペプチドの開裂断片の配列決定の後、Ｌ．ケフィールの酵素のほとんど完全なアミノ酸配列を得ることが可能であった。同定された配列断片をＬ．ブレビスに由来するＡＤＨの配列（図２を参照）と比較したとき、Ｌ．ケフィールの配列の部分的な断片は本質的にＬ．ブレビスの配列に対応するものの、Ｌ．ケフィールの配列には決定的な部分的断片がないことが明らかとなった。これらの部分的な断片は図２においてＸ26で示されており、すなわち、これはＬ．ブレビスの配列と一致させるために必ず26アミノ酸を含む部分的断片であり、かつ2つのアミノ酸を含む部分的断片についてはＸ2と示されている。
Ｌ．ブレビス及びＬ．ケフィールに由来するＡＤＨの配列の比較は、失われている部分的断片Ｘ26及びＸ2を別にして、18アミノ酸、すなわち約10％が置換されていることを示す。
【００４５】
実施例５
酵素のクローニング
Ａ．ラクトバチルス・ブレビスからのゲノムＤＮＡの調製
ラクトバチルス・ブレビスの細胞を50mlの高ＴＥバッファ（25mMトリス、10mMＥＤＴＡ ｐＨ8.0）で洗浄し、6000rpmで遠心した。そのペレットを10mlのＴＥ（25mMトリス、10mM ＥＤＴＡ ｐＨ8.0）に再懸濁させ、100μl のリゾチーム（100mg／ml）を添加して37℃で1.5時間インキュベートした。続いて、細胞のタンパク質を変性させ、溶解させた細胞に340μl の30％ラウリルサルコシンナトリウム、100 μl のQiagenプロテアーゼ（Qiagen、Hilden；20mg／ml）及び25μlのRNAse A（40mg／ml）を添加することにより50℃で一晩分解した。次の工程で、細胞溶解物からのＤＮＡをフェニル沈殿により他の細胞内容物から分離した。（このために、最初に純粋なフェノール（ＴＥで飽和）、次にフェノール／ＩＡＡ／ＣＨＣｌ3（25：24：1）（ＩＡＡ＝イソアミルアルコール）及び最後にＩＡＡ／ＣＨＣｌ3（24：1）を、1：1の容量比で、水相に常に添加した）。次に、合わせた水相を穏やかに攪拌することにより約5分間混合した後、20000rpmで遠心することにより分離した。最後の水性上相を0.0625容量の8M ＬｉＣｌと混合した後、2容量部の冷エタノール（100％）の層で注意深く覆った。境界層に沈殿するゲノムＤＮＡをパスツールピペットに巻き取り、冷70％エタノールで2回洗浄した。真空遠心で乾燥させた後、このＤＮＡを2mlのＴＥ（10mMトリス、1mM ＥＤＴＡ）ｐＨ8.0に取った。この単離されたＤＮＡの純度をチェックするため、この溶液を1：50に希釈し、260：280nmの商を測光法により2.0と決定した。したがってタンパク質の不純物は除外することができた。ゲルからのＤＮＡの濃度は70ng／μlであると測定され、3gの細胞から140 μg のゲノムＤＮＡが単離された。
【００４６】
Ｂ．ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のための５’及び３’プライマーとして のオリゴヌクレオチド類
Ｌ．ブレビスに由来するＡＤＨのタンパク配列のＮ−末端及びＣ−末端を、酵素によるペプチド開裂（実施例４を参照）に基づいて決定することができた。この情報を用いてＰＣＲのためのプライマーを合成した。そのように行う中で、ラクトバチルスにおいて知られている特定のコドンの公知の優位性を考慮した。コドンATG（Met）を各５’プライマーの先頭に開始コドンとして配置し（これはタンパク質配列を欠いている）、翻訳の終了を確実なものとするために２つの停止コドンを各３’プライマーの後ろに配置した。プライマー構築物を以下に列挙する（変わり得る核酸は括弧内に示す。これは、その括弧の前の核酸の代替物として組込まれ、その結果実際に用いられたプライマーは得られる組み合わせの混合である）：
５’プライマー ５’ＬＢ：
5'ATG-TCA-AAC-CGT-TTA(G)-GAT-GGT(C)-AAG-GTT(A)-GCT(A)-ATT(C)-3'（配列番号５）
３’プライマー ３’ＬＢ：
5'CTA-CTA-TTG-A(T)GC-AGT-GTA-A(G)CC-A(G)CC-ATC-A(T)AC-A(T)AC-GAA-3'（配列番号６）
これらの合成されたプライマーを冷ＮＨ3でカラムから溶離した。このＮＨ3溶液を70℃で1時間インキュベートした後、1mlのブタノールと共に振盪した。このサンプルを14000rpmで2分間遠心し、形成された上清をデカントした。このサンプルを真空遠心に5分間処して乾燥させ、そのペレットを500μl のＨ2Ｏに取った。これらのプライマーを100ピコモル／μlの濃度で用いた。
【００４７】
Ｃ．Ｌ．ブレビスに由来するゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）
以下において、テンプレート濃度（ゲノムＤＮＡ）を変化させ、他の全てのパラメータは一定に保った。アニーリング温度として52℃を選択した。
【００４８】
【００４９】
分析作業のため、10％の混合物（容量部分）を1％アガロースゲルにのせ、100Vの定電圧で電気泳動により分離した。このＰＣＲは、約750bpのＤＮＡ断片の実質的な増幅を示した。そのシグナルは697bp及び925bpのマーカーバンドの間に存在するが、697bpにより近い。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの27kD（245ＡＡ）のADHのモノマーの分子量決定によると、この場合、ＡＤＨタンパク質のアミノ酸長及びその求められている遺伝子の塩基対長が良好に一致する。
【００５０】
Ｄ． Qiaquick ( 登録商標 ) ＰＣＲ精製キット（ Qiagen 、 Hilden ）でのＰＣＲ産生物の精製
100μl のＰＣＲ溶液に500μl のバッファＰＢをピペットにより添加し、Quiaquick (登録商標) カラム（平衡化せず）に直接かけた。遠心（1分、14000rpm）によりＤＮＡをカラムに結合させ、溶離液を廃棄した。このカラムを750μl のバッファＰＥで遠心（1分、14000rpm）により洗浄し、溶離液を廃棄した。バッファＰＥ中のエタノールの残留物を除去するため、このカラムを再度簡単に遠心した。続いて、50μlの2mMトリス／ＨＣｌ ｐＨ8.0を添加して遠心（1分、14000rpm）することにより、このカラムから溶離させた。対照のため、各々のケースにおいてこの溶出液の 1μl を分析用0.8％アガロースゲルにかけ、60Vの定電圧の下で電気泳動により分離した。濃度は、ＰＣＲ3／1については70ng／μl、ＰＣＲ3／2については90ng／μlと決定された。ＰＣＲ3／2はさらに処理し、ＰＣＲ3／1は-20℃で保存した。ＰＣＲ3／2をSpeed vacで16μlに濃縮し、Surecloneキット（16μl ＰＣＲ、 1μl クレノウ断片、2 μl 10 ×バッファ、1 μl ポリヌクレオチドキナーゼ；37℃で30分間インキュベート）の平滑化／キナーゼ反応に直接用いた。この反応混合物を分離用0.8％アガロースゲル（2時間、80V定電圧）に直接かけた。750bpでの可視バンドをゲルから切り出し、Jetsorb (登録商標) (Genomed 、Bad Oeynhausen）によりゲルから単離した。50μlの2mMトリス／ＨＣｌ ｐＨ8.0を用いて、このJetsorb材料からプラスミドＤＮＡを溶離させた。この溶液を真空遠心の助けを借りて 9μl に濃縮した。その 1μl を分析アガロースゲルに用いた。
このゲルにおけるＰＣＲ断片の濃度（150ng／μl）から、総濃度 1.2μg のＤＮＡが生じた。このサンプルを、Surecloneキットのリガーゼ混合物に用いた。
【００５１】
Ｅ．ゲルからの Jetsorb ( 登録商標 ) ＤＮＡ単離
ゲル材料100mg当たり300 μl のバッファＡ１及び10μlのJetsorb懸濁液を混合し、50℃で15分間インキュベートした。その間、Jetsorb材料への完全な結合を確実なものとするため、時々、この溶液を再度混合した。続いて、この懸濁液を11000rpmで30秒間遠心して上清を廃棄し、そのペレットを300 μl のバッファＡ２に再懸濁して11000rpmで再度遠心した。この工程を完全に繰り返した後、その上清をピペットで注意深く除去し、ペレットを50℃で5分間乾燥させた。次に、このペレットを30μlの2mMトリス／ＨＣｌ ｐＨ8.0に再懸濁させ、50℃で5分間インキュベートした。遠心（11000rpm、30秒）が完了した後、その上清を集め、ペレットを20μlの2mMトリス／ＨＣｌ ｐＨ8.0に再び再懸濁させてさらに上述の通りに処理した。得られた上清をプールし、Speed vacで18μlに濃縮した。その1 μl を分析アガロースゲルにのせた。このゲルによる濃度測定では、ＤＮＡ濃度は10ng／μl、すなわち、総濃度が160ngであった。
【００５２】
Ｆ． Sureclone キット（ Pharmacia Co. ）でのライゲーション
7 μl のＰＣＲ（1 μg ）、1 μl のpUC18ベクター（50ng）、1 μl のＤＴＴ、10μlの2倍のリガーゼバッファ及び1 μl のリガーゼを用いた。この混合物から3 μl を取り出し、ＰＣＲ断片濃度を低下させるために新しいリガーゼ混合物に用いた。この第2の混合物は、ＰＣＲ−ＤＮＡ濃度（157ng、すなわち1：3のベクター：ＰＣＲ比）を別として、第1の混合物の組成（1：20のベクター：ＰＣＲ比）に相当する。両混合物を16℃で1.5時間インキュベートした後、それらを用いて100 μl のコンピテント細胞（大腸菌XL 1 Blue）をそれぞれ形質転換した。これらのコンピテント細胞に、1 μl のリガーゼ混合物１及び4 μl のリガーゼ混合物２をピペットで添加した。それぞれの細胞懸濁液300 μl をＬＢamp−寒天プレート（ＬＢ＝カゼインペプトン／酵母抽出物；ｐＨ7.5）に塗布した。
【００５３】
増殖したコロニーを4mlの液体培地（ＬＢamp−培地）に接種し、37℃で一晩培養した。この細胞懸濁液の2mlを各々プラスミドの調製に用いた。（Qiagenミニプレッププロトコル（Qiagen、Hilden）に相当する；以下を参照）。0.7容量部のイソプロパノールを用いてこの細胞不含溶液からプラスミドＤＮＡを直接沈殿させて冷70％エタノールで洗浄し、真空遠心で乾燥させて10μlの2mMトリス／ＨＣｌバッファ（ｐＨ8.0）に取った。このプラスミド調製品からEcoRI及びHindIIIを用いて制限消化を行った（1U／μl酵素、６μlのプラスミドＤＮＡ
、37℃、1時間）。完全な消化物を0.8％アガロースゲルにのせ、80Vの定電圧で2時間電気泳動により分離した（750bpのインサートを検出）。このプラスミドを任意に後に配列決定に用いた。
【００５４】
Ｇ．プラスミドの調製（ Qiagen ミニプレップ）
4mlの液体培養物を5000rpmで5分間遠心し、そのペレットを300 μl のバッファＰ１に再懸濁した。この懸濁液に300 μl のバッファＰ２を添加し、その細胞懸濁液を室温で5分間インキュベートした。その後、この溶解細胞に300 μl の冷バッファＰ３をピペットにより添加し、核酸及びタンパク質を変性させるため、数回攪拌しながら氷上で10分間インキュベートした。変性成分を遠心（11000rmp、15分間）により除去し、その上清を1mlのＱＢＴバッファ（Qiagen、Hilden）で予め平衡化されている新しいQiagen 20チップカラム（Qiagen、Hilden）に直接かけた。このカラムを4×1mlのバッファＱＣで洗浄した後、0.8mlのバッファＱＦを用いてこのカラムからプラスミドＤＮＡを溶離した。14000rpmで30分間遠心した後、0.7容量のイソプロパノールを用いてこの溶液からＤＮＡを沈殿させた。得られたペレットを14000rpmで遠心しながら70％エタノールで2×10分間洗浄した後、真空遠心で乾燥させた。このＤＮＡを10μlの2mMトリス／ＨＣｌ pH8.0に取り、例えば、制限酵素による分析に用いた。
【００５５】
Ｈ．プラスミドのＤＮＡ配列決定
ａ．配列決定ゲルの調製
配列決定はPharmacia社製のオートリード（autoread）レーザー蛍光シーケンサー（ＡＬＦ）を用いて行った。したがって、オートリード配列決定キット（Pharmacia）を配列決定反応に用いた。このゲルの標準厚は0.5mmであった。適当なガラス板（厚さ0.35mm）をレーザー通過側に用いた。配列決定ゲル：21gの尿素（超純粋）、12gのＨ2Ｏ（Millipore）、7.5mlのアクリルアミド（Roth、ＤＮＡ配列決定用）、200 μl のＡＰＳ、45μlのＴＥＭＥＤ、6mlの10倍のＴＢＥ。0.6×ＴＢＥ（Pharmaciaの指示に相当するトリス／ホウ酸塩／ＥＤＴＡ）は移動バッファ(mobile buffer) として役立った。
ｂ．AutoReadTM配列決定キットを用いる配列決定反応
配列決定プライマー当たりそれぞれ 5μl (4μg)のプラスミドＤＮＡを用いた。
【００５６】
5 μl のプラスミドＤＮＡ、5 μl のＨ2Ｏ、2 μl のプライマー（ユニバーサル又はリバーサル）、1.5 μl の1M ＮａＯＨを一緒にピペットで計量し、ＤＮＡを変性させるために65℃で5分間インキュベートした。次に、このサンプルを直接37℃に移し、反応を1.5 μl の1M ＨＣｌで中和した。2 μl のアニーリングバッファを添加して簡単に遠心（15秒間、14000rpm）し、37℃で10分間、次いで室温でさらに10分間インキュベートした。遠心が完了した後、1 μl のエクステンションバッファ及び3.5 μl のジメチルスルホキシドをこの調製品と混合し、混合物当たり2 μl の、酵素希釈バッファで希釈したＴ７ポリメラーゼをピペットで添加した。この溶液５.２μlを、３７℃で予備インキュベートされているプレートにピペットで直接移した。このプレートには、プラスミド当たり3 μl のそれぞれのＮＴＰ混合物（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔをこの順序で）を有する4つのレーンがあった。37℃で5分間インキュベートした後、配列決定反応をSanger（Sanger, F., Nickler, S., Coulson, A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467）に従って6 μl の停止混合物を添加することにより停止させ、反応混合物を90℃で2−3分間加熱した後、鎖の復元を防ぐために氷上で直接冷却した。次に、この混合物の6 μl を配列ゲルに直接のせ、シーケンサーを作動させた。選択されたプラスミドのうちプラスミド3／1のみが正しいＤＮＡ配列を有していた。これらのデータは、次に、対応するタンパク配列（図１）に翻訳することが可能である。ユニバーサルプライマーはこの配列のＣ−末端を示し、リバーサルプライマーはＮ−末端（５’コーディング鎖）を示す。したがって、インサートは正しい方向で配置される。このＤＮＡ配列決定に基づく配列は、タンパク質の配列決定によって得られた配列データとの完全な一致を示す。
【００５７】
実施例６
Ａ． pADH 発現プラスミドの構築
アルコールデヒドロゲナーゼを発現させるため、構造遺伝子を、この構造遺伝子がＩＰＴＧで誘発され得る適切なプロモーター、好ましくはＴａｃプロモーターの制御の下で正しい方向に挿入されるような方法でpKK177発現ベクターにクローン化した。このために、ＡＤＨ遺伝子を含むpUCベクターからEcoRI及びHindIIIによりアルコールデヒドロゲナーゼの構造遺伝子を切り出し、この制限混合物をアガロースゲル電気泳動によって分離してアガロースゲルから約750bpの大断片を単離した。同時に、発現プラスミドpKK177をEcoRI及びHindIIIで切断し、この制限混合物をアガロースゲル電気泳動によって分離してアガロースゲルから約2.8kBpのベクター断片を単離した。このようにして得られた断片を記述されるように一緒にライゲートした。この新たに形成したプラスミドをpADH-1と名付けた。制限分析及び配列決定により、遺伝子の正しい挿入をチェックした。
【００５８】
Ｂ．様々な大腸菌発現株への発現プラスミド pADH-1 の形質転換
様々な大腸菌株、好ましくは大腸菌B HB101及び大腸菌K12NM522のコンピテント細胞を、Hanahanによる方法（J. Mol. Biol. 166 (1983) pp.557）に従って調製した。このように作製された細胞の200 μl を20ngの単離pADH-1プラスミドＤＮＡと混合した。氷上で30分間インキュベートした後、熱ショック（42℃で90秒間）を与えた。続いて、これらの細胞を1mlのＬＢ培地に移し、表現型発現のために37℃で1時間インキュベートした。この形質転換混合物のアリコートを、選択マーカーとしてアンピシリンを含有するＬＰプレートに塗布し、37℃で15時間インキュベートした。
【００５９】
Ｃ．大腸菌におけるラクトバチルス・ブレビスに由来するアルコールデヒドロゲナーゼの発現
発現プラスミドpADH-1を取り込んでいる形質転換体を取り出し、それぞれアンピシリンを含有するＬＢ液体培地3mlに再接種して、ローラーにおいて37℃でインキュベートした。これらの細胞を、光学濃度（測定波長550nm）0.5で、1mM ＩＰＴＧを用いて誘導した。各々の対照として、発現プラスミドは含むが誘導はしないクローン及び発現プラスミドは含まないがＩＰＴＧで誘導はするそれぞれの大腸菌WTも処理した。誘導と一晩増殖の後4時間で、光学濃度がＯＤ550＝5に相当するチューブの各々からアリコートを取り出した。これらの細胞を遠心（6000rpmで10分間、4℃）して300 μl のＴＥバッファ（50mMトリス−ＨＣｌ、50mM ＥＤＴＡ、ｐＨ8.0）に取り、超音波（Branson Sonifire 450／氷上においてレベル2で2×30秒間）により溶解した。可溶性タンパク質を、遠心（10分間、14000rpm）により不溶性蛋白質及び細胞壁成分から分離した。この時点で、活性試験を行うためにアリコートを取り出した。残りの上清を50μlの5×アプリケーションバッファ（60mMトリス−ＨＣｌ ｐＨ6.8、1.2％ＳＤＳ、10％グリセロール、0.7M２−メルカプトエタノール、0.05％ブロモフェノールブルー）と混合し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動用に調製した。タンパク質ペレット（不溶性蛋白質及び細胞壁成分）は、再度300 μl のＴＥバッファ（50mMトリス−ＨＣｌ、50mM ＥＤＴＡ、ｐＨ8.0）に取り、超音波インパルス（Branson Sonifire 450）を5回加えることにより再懸濁させた。これらのサンプルもそれぞれの容量の5×アプリケーションバッファと混合した。最後に、タンパク質を完全に変性させるため、全てのサンプルを95℃で5分間加熱した。
【００６０】
Ｄ．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、U. K. Laemmli（1970, Nature 227, pp.680-685）の方法に従って行った。可溶性及び不溶性タンパク質画分を別々に15％分離ゲルにおいて分離し、続いてタンパク質バンドをクーマシー染色溶液（0.2％クーマシー、30％エタノール、10％酢酸）で染色した。
【００６１】
用いられた大腸菌株のラクトバチルス・ブレビスに由来するアルコールデヒドロゲナーゼは、可溶性蛋白質として排他的に発現した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて〜27kDaのサイズを有することが予め決定されているさらなるタンパク質バンドに基づいて、この可溶性蛋白質画分についてこれを排他的に示すことが可能であった。このさらなるタンパク質バンドは、対照（プラスミドを含む非誘導クローン及びプラスミドを含まない誘導クローン）及び不溶性タンパク質画分を含むサンプルには見られなかった。
この粗製抽出物を用いて行われた活性試験は、アルコールデヒドロゲナーゼが可溶性の形態というだけではなく活性な形態で発現することも示した。
【００６２】
実施例７
Ｒ−フェニルエタノールの酵素触媒生産
精製酵素（実施例２Ｃ）及び必要な補酵素（ＮＡＤＰ）を、アセトフェノンからの（Ｒ）−フェニルエタノールの酵素触媒合成に用いた。酸化された補酵素はイソプロパノールにより連続的に再生した。このイソプロパノールは、この反応が触媒量の補酵素だけを必要とするように同時に存在させた。詳しく述べると、その混合物は以下のものを含有していた（この試験におけるこれらの成分の最終濃度は、括弧内に列挙する）：20μlのＮＡＤＰ（0.05mM）、7.7 μl のイソプロパノール（0.1M）、0.6 μl のアセトフェノン（5mM）、921.7 μl のトリエタノールアミンバッファ（50mM；ｐＨ7.0、1mM ＭｇＣｌ2を含有）及びラクトバチルス・ブレビスに由来する50μlのアルコールデヒドロゲナーゼ（4.5単位）。総容量1mlのこの混合物を30℃で24時間インキュベートした後、サンプルをガスクロマトグラフィーにより分析した。このために、100 μl を取り出して100 μl のクロロホルムと共に振盪し、遠心により相分離してＧＣのためにアリコートを低相（クロロホルム）から採取した。
【００６３】
ガスクロマトグラフィーでの（Ｒ）−及び（Ｓ）−フェニルエタノールの分離のための分離条件：固定相：Lipodex E、CDカラム（Macherey and Nagel, Duren）、移動相：ヘリウム、注入容量；1 μl 、検出：ＦＩＤ、温度：110℃。これらの条件下において、10.5分で基質であるアセトフェノンが、13.8分で（Ｓ）−フェニルエタノールが、及び14.2分で（Ｒ）−フェニルエタノールが溶出する。（Ｓ）−及び（Ｒ）−フェニルエタノールの保持値は、市販されているラセミ混合物（Fluka Co. Buchs, Switzerland）を用いて得ることができる。24時間後に、95％を超える基質が変換され、ＧＣクロマトグラムは次の値を示す：アセトフェノン（保持時間10.5分）：面積＝9.800；（Ｓ）−フェニルエタノール（保持時間13.8分）：面積＝<500；（Ｒ）−フェニルエタノール（保持時間14.2分）：面積＝240000。
【００６４】
実施例８
ラクトバチルス・ブレビスの全細胞を用いるケトン類の還元によるアルコール類の生産
加えて、Ｌ．ブレビスの全細胞を用いて、ケトン類をキラルアルコール類に還元することができる。この場合、細胞内に存在する補酵素が利用されるため、ＮＡＤＰを添加する必要はない。補酵素の再生は、イソプロパノールにより、又はグルコースのような代謝可能な基質により達成することができる。試験混合物：50mgのＬ．ブレビスの細胞（遠心後の湿重量）を、0．1Mグルコース及び10mMアセトフェノンを含有する860 μl のトリエタノールアミンバッファ（50mM；ｐＨ7.50；1mM ＭｇＣｌ2+を添加）に懸濁する。サンプルはガスクロマトグラフィーにより分析する。30℃で2時間インキュベートした後には、アセトフェノンはもはや検出されず、それに代わって相当する量のフェニルエタノールが生成している。キラル固定相でのＧＣ分離による定量がなされているため、同時に、生成したフェニルエタノールは光学的に高純度のものであるが、定量可能な（Ｓ）−アルコールが検出不可能であったことを示すことが可能であった。光学純度は、（Ｒ）−アルコールについて>95％という高率であった。これは、Ｌ．ブレビスの細胞が生成するアルコール類の光学純度を妨げ得るさらなるアルコールデヒドロゲナーゼを明らかに含まず、その結果、全細胞を用いるこのような方法でキラルアルコール類を生産することが可能であることを示す。
【００６５】
【配列表】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌におけるＬ．ブレビスに由来する組換えＡＤＨのＤＮＡ及びタンパク質配列（上列は各々の場合における核酸配列（配列番号７）、下はその三文字コードに対応するアミノ酸配列（一文字コードで、配列番号８））。この配列は、開始コドンを介して挿入されているメチオニンで始まる。このメチオニンは、純粋なタンパク質の配列決定によって得られた対応アミノ酸配列には見出されない（Ｎ−末端；実施例３Ｆ及び実施例４を参照）。
【図２】ＬｙｓＣプロテアーゼによる開裂の後にペプチドを配列決定することにより得られた、ラクトバチルス・ケフィールに由来するアルコールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号９）。
Claims (9)
- 配列番号８で表されるアミノ酸配列を有する安定なアルコールデヒドロゲナーゼ。
- 配列番号７で表されるＤＮＡ配列によってコードされる安定なアルコールデヒドロゲナーゼ。
- 請求項１又は２に記載の酵素の単離方法であって、ＡＤＨをコードする遺伝子で任意に形質転換されている微生物サンプルを溶解し、続いて、マグネシウムイオンを含有する適切なバッファ系において疎水性相互作用クロマトグラフィー、陰イオン交換及びアフィニティクロマトグラフィーに処する方法。
- 前記微生物がラクトバチルス・ブレビス(DSM 20054) である、請求項３に記載の方法。
- １，４−ブタンジオール−ジグリセリジルエーテルまたは下記の一般式（Ｉ）の有機ケト化合物の鏡像異性体選択的還元方法であって、該化合物又は適切な混合物を約２０℃〜６０℃で約１５分〜３時間、請求項１又は２に記載のアルコールデヒドロゲナーゼ又は該酵素を含有する細胞の存在下においてインキュベートし、適切なＲ−ヒドロキシ化合物を単離する方法。
- 下記の一般式（ＩＩ）の有機ヒドロキシ化合物の鏡像異性体選択的合成方法であって、ラセミ混合物または該有機ヒドロキシ化合物を請求項１又は２に記載のアルコールデヒドロゲナーゼ又は該酵素を含有する細胞とともに約２０℃〜６０℃で約１５分〜３時間インキュベートし、適切なＳ−ヒドロキシ化合物を単離する方法。
- マグネシウムイオンが存在し、かつｐＨ値が6ないし9である請求項３又は４に記載の方法。
- 安定なアルコールデヒドロゲナーゼの組換え生産方法であって、配列番号７で表されるヌクレオチド配列を原核又は真核細胞において発現させる方法。
- 安定なアルコールデヒドロゲナーゼをコードする単離ＤＮＡであって、配列番号７で表される核酸配列又はそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む単離ＤＮＡ。
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