JP4558414B2 - 還元酵素及びその利用 - Google Patents
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Description
本発明は、還元反応に利用可能な改変型還元酵素及びその利用に関するものである。
還元酵素は、基質を還元する触媒能を有し、近年、例えば医農薬の有効成分となる化合物やその中間体、特に光学活性である化合物やその中間体等を製造する為の有機合成反応に利用されている。
光学活性である化合物やその中間体等を製造する為に工業的に利用される還元酵素としては、還元反応における反応生成物の光学純度が高いこと又は基質の絶対立体配置に対する当該酵素の認識性が高いことや、温度・ｐＨ・溶媒・圧力等に対する安定性が高いことが望ましい。
中でも有機溶媒に対する還元酵素の安定性、即ち有機溶媒耐性が高いと、基質又は生成物からの阻害を回避するために添加される有機溶媒による当該還元酵素の失活を軽減することが可能となる。そこで、反応時間の短縮及び反応効率の向上を図るうえで有機溶媒耐性に優れた還元酵素が切望されている。
中でも有機溶媒に対する還元酵素の安定性、即ち有機溶媒耐性が高いと、基質又は生成物からの阻害を回避するために添加される有機溶媒による当該還元酵素の失活を軽減することが可能となる。そこで、反応時間の短縮及び反応効率の向上を図るうえで有機溶媒耐性に優れた還元酵素が切望されている。
このような状況下で、本発明者らは、遺伝子の部位特異的変異導入技術を用いて、鋭意検討を行った結果、野生型のアミノ酸配列においてある特定のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列を有する改変型還元酵素が優れた有機溶媒耐性を示すことを見いだし、本発明を完成した。
即ち、本発明は、
１．野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列において、（１）１２番目のアミノ酸がグリシンに、（２）２０番目のアミノ酸がアルギニンに、（３）４２番目のアミノ酸がバリンに、（４）６７番目のアミノ酸がアルギニンに、（５）１２５番目のアミノ酸がメチオニンに、（６）１６３番目のアミノ酸がアルギニンに、（７）１７３番目のアミノ酸がプロリンに、（８）２７５番目のアミノ酸がロイシンに、及び、（９）３２７番目のアミノ酸がバリンにそれぞれ置換されていること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、かつ、ｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを生産する能力を少なくとも有することを特徴とする改変型還元酵素；
２．前項１記載の改変型還元酵素における１２番目、２０番目、４２番目、６７番目、１２５番目、１６３番目、１７３番目、２７５番目及び３２７番目のアミノ酸のうち、いずれか一つ以上の改変型アミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなり、かつ、前記アミノ酸のうち、いずれか一つ以上の改変型アミノ酸を保存してなることを特徴とする改変型還元酵素；
３．２０番目及び１６３番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
４．１６３番目及び２７５番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
５．２０番目、１６３番目及び２７５番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
６．１２番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
７．２０番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
８．４２番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
９．６７番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
１０．１２５番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
１１．１６３番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
１２．１７３番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
１３．２７５番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
１４．３２７番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
１５．前項１乃至１４記載のいずれかの改変型還元酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド（以下、本発明ポリヌクレオチドと記すこともある。）；
１６．宿主細胞内において機能可能なプロモーターと前項１５記載のポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなることを特徴とするポリヌクレオチド；
１７．前項１５記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター（以下、本発明ベクターと記すこともある。）；
１８．前項１５若しくは１６記載のポリヌクレオチド又は前項１７記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）；
１９．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項１８記載の形質転換体；
２０．宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項１８記載の形質転換体；
２１．前項１５記載のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法；
２２．前項１７記載のベクターが、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とするベクター；
２３．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする前項２２記載のベクター；
２４．前項１８乃至２０記載のいずれかの形質転換体が、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドをさらに保有することを特徴とする形質転換体；
２５．前項２２又は２３記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体；
２６．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項２５記載の形質転換体；
２７．宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項２５記載の形質転換体；
２８．ケトン化合物又はアルデヒド化合物に、前項１乃至１４記載のいずれかの改変型還元酵素、それを産生する微生物、前項１８乃至２０記載のいずれかの形質転換体、前項２４乃至２７記載のいずれかの形質転換体、又は、それらの処理物を作用させることを特徴とするアルコールの製造方法（以下、本発明製造方法と記すこともある。）；
２９．ケトン化合物又はアルデヒド化合物がｍ−クロロフェナシルクロライドであり、アルコールが１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールであることを特徴とするアルコールの製造方法；
３０．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質を反応系内に共存させること特徴とする前項２８又は２９記載のアルコールの製造方法；
３１．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする前項３０記載のアルコールの製造方法；
等を提供するものである。
１．野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列において、（１）１２番目のアミノ酸がグリシンに、（２）２０番目のアミノ酸がアルギニンに、（３）４２番目のアミノ酸がバリンに、（４）６７番目のアミノ酸がアルギニンに、（５）１２５番目のアミノ酸がメチオニンに、（６）１６３番目のアミノ酸がアルギニンに、（７）１７３番目のアミノ酸がプロリンに、（８）２７５番目のアミノ酸がロイシンに、及び、（９）３２７番目のアミノ酸がバリンにそれぞれ置換されていること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列を有し、かつ、ｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを生産する能力を少なくとも有することを特徴とする改変型還元酵素；
２．前項１記載の改変型還元酵素における１２番目、２０番目、４２番目、６７番目、１２５番目、１６３番目、１７３番目、２７５番目及び３２７番目のアミノ酸のうち、いずれか一つ以上の改変型アミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなり、かつ、前記アミノ酸のうち、いずれか一つ以上の改変型アミノ酸を保存してなることを特徴とする改変型還元酵素；
３．２０番目及び１６３番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
４．１６３番目及び２７５番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
５．２０番目、１６３番目及び２７５番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
６．１２番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
７．２０番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
８．４２番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
９．６７番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
１０．１２５番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
１１．１６３番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
１２．１７３番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
１３．２７５番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
１４．３２７番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする前項２記載の改変型還元酵素；
１５．前項１乃至１４記載のいずれかの改変型還元酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド（以下、本発明ポリヌクレオチドと記すこともある。）；
１６．宿主細胞内において機能可能なプロモーターと前項１５記載のポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなることを特徴とするポリヌクレオチド；
１７．前項１５記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター（以下、本発明ベクターと記すこともある。）；
１８．前項１５若しくは１６記載のポリヌクレオチド又は前項１７記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体（以下、本発明形質転換体と記すこともある。）；
１９．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項１８記載の形質転換体；
２０．宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項１８記載の形質転換体；
２１．前項１５記載のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法；
２２．前項１７記載のベクターが、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とするベクター；
２３．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする前項２２記載のベクター；
２４．前項１８乃至２０記載のいずれかの形質転換体が、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドをさらに保有することを特徴とする形質転換体；
２５．前項２２又は２３記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体；
２６．宿主細胞が微生物であることを特徴とする前項２５記載の形質転換体；
２７．宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前項２５記載の形質転換体；
２８．ケトン化合物又はアルデヒド化合物に、前項１乃至１４記載のいずれかの改変型還元酵素、それを産生する微生物、前項１８乃至２０記載のいずれかの形質転換体、前項２４乃至２７記載のいずれかの形質転換体、又は、それらの処理物を作用させることを特徴とするアルコールの製造方法（以下、本発明製造方法と記すこともある。）；
２９．ケトン化合物又はアルデヒド化合物がｍ−クロロフェナシルクロライドであり、アルコールが１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールであることを特徴とするアルコールの製造方法；
３０．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質を反応系内に共存させること特徴とする前項２８又は２９記載のアルコールの製造方法；
３１．酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする前項３０記載のアルコールの製造方法；
等を提供するものである。
本発明によれば、ケトン化合物又はアルデヒド化合物からアルコールを製造するために優れた改変型還元酵素等が提供可能となる。
まず、本発明における改変型還元酵素について説明する。
本発明における改変型還元酵素は、（Ａ）野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列において、（１）１２番目のアミノ酸がグリシンに、（２）２０番目のアミノ酸がアルギニンに、（３）４２番目のアミノ酸がバリンに、（４）６７番目のアミノ酸がアルギニンに、（５）１２５番目のアミノ酸がメチオニンに、（６）１６３番目のアミノ酸がアルギニンに、（７）１７３番目のアミノ酸がプロリンに、（８）２７５番目のアミノ酸がロイシンに、及び、（９）３２７番目のアミノ酸がバリンにそれぞれ置換されていること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列（配列番号２３）を有し、かつ、ｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを生産する能力を少なくとも有することを特徴とする改変型還元酵素（以下、全改変型還元酵素と記すこともある。）、又は、（Ｂ）前項Ａ記載の改変型還元酵素における１２番目、２０番目、４２番目、６７番目、１２５番目、１６３番目、１７３番目、２７５番目及び３２７番目のアミノ酸のうち、いずれか一つ以上の改変型アミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなり、かつ、前記アミノ酸のうち、いずれか一つ以上の改変型アミノ酸を保存してなることを特徴とする改変型還元酵素である（以下、復帰改変型還元酵素と記すこともある。）（尚、以下、両者（Ａ）及び（Ｂ）を総じて本発明還元酵素と記すこともある。）。
本発明における改変型還元酵素は、（Ａ）野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列において、（１）１２番目のアミノ酸がグリシンに、（２）２０番目のアミノ酸がアルギニンに、（３）４２番目のアミノ酸がバリンに、（４）６７番目のアミノ酸がアルギニンに、（５）１２５番目のアミノ酸がメチオニンに、（６）１６３番目のアミノ酸がアルギニンに、（７）１７３番目のアミノ酸がプロリンに、（８）２７５番目のアミノ酸がロイシンに、及び、（９）３２７番目のアミノ酸がバリンにそれぞれ置換されていること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列と同等なアミノ酸配列（配列番号２３）を有し、かつ、ｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを生産する能力を少なくとも有することを特徴とする改変型還元酵素（以下、全改変型還元酵素と記すこともある。）、又は、（Ｂ）前項Ａ記載の改変型還元酵素における１２番目、２０番目、４２番目、６７番目、１２５番目、１６３番目、１７３番目、２７５番目及び３２７番目のアミノ酸のうち、いずれか一つ以上の改変型アミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなり、かつ、前記アミノ酸のうち、いずれか一つ以上の改変型アミノ酸を保存してなることを特徴とする改変型還元酵素である（以下、復帰改変型還元酵素と記すこともある。）（尚、以下、両者（Ａ）及び（Ｂ）を総じて本発明還元酵素と記すこともある。）。
ここで、配列番号１で示されるアミノ酸配列とは、３４８個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、当該アミノ酸配列を有するタンパク質は、ｍ−クロロフェナシルクロライドを不斉還元して（R）−１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質である。当該タンパク質は「野生型還元酵素」と記載されるものであり、ロドコッカス（Rhodococcus）属（好ましくは、ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis））に属する微生物由来の還元酵素である。当該還元酵素及び本発明還元酵素の還元酵素活性（即ち、基質を還元する能力）は、これらのタンパク質を、例えば、ｍ−クロロフェナシルクロライド、ＮＡＤＨと混合して３０℃で保温し、遊離するＮＡＤ＋量を反応液の３４０ｎｍにおける吸光度を指標に定量することにより測定することができる。本発明において「有機溶媒耐性」とは、例えば、２０％（v／v）の２−プロパノール存在下において３０℃で２２時間でのｍ−クロロフェナシルクロライドの還元反応を行った場合の還元酵素活性が、同様に還元反応を行った場合の野生型還元酵素の還元酵素活性よりも高いことを意味する。
尚、ロドコッカス（Rhodococcus）属（好ましくは、ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis））に属する微生物は、天然から分離してもよいし、菌株保存機関等から購入してもよい。
天然から分離する場合、まず、土壌を野外から採取する。採取された土壌を滅菌水で懸濁させた後、当該懸濁液を、例えば、PY培地（Bacto Peptoneを５ｇ/L、Yeast Extractを５ｇ/Lの割合で水に溶解した後、ｐHを７．０に調整）等の微生物分離用固体培地上に塗布し、これを２５℃で培養し、数日後に生えてきた菌の独立したコロニーを切り取り、新しい、例えば、PY培地等の微生物分離用固体培地に移植し、これをさらに２５℃で培養する。生育してきた菌について、SNEATH, (P.H.A.), MAIR, (N.S.) SHARPE, (M.E.) and HOLT, (J.G.):Bergey's manual of Systematic Bacteriorogy. Vol.2. 1984, Williams and Wilkins, Baltimore.等に記載される方法等に従って、ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物であるかを同定することにより、ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物を選抜すればよい。
つぎに、選抜されたロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物から、当該微生物のｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを生産する能力の有無を、例えば、後述の実施例に記載されるような方法に従って確認することにより、本発明に用いられるロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物を選抜すればよい。
天然から分離する場合、まず、土壌を野外から採取する。採取された土壌を滅菌水で懸濁させた後、当該懸濁液を、例えば、PY培地（Bacto Peptoneを５ｇ/L、Yeast Extractを５ｇ/Lの割合で水に溶解した後、ｐHを７．０に調整）等の微生物分離用固体培地上に塗布し、これを２５℃で培養し、数日後に生えてきた菌の独立したコロニーを切り取り、新しい、例えば、PY培地等の微生物分離用固体培地に移植し、これをさらに２５℃で培養する。生育してきた菌について、SNEATH, (P.H.A.), MAIR, (N.S.) SHARPE, (M.E.) and HOLT, (J.G.):Bergey's manual of Systematic Bacteriorogy. Vol.2. 1984, Williams and Wilkins, Baltimore.等に記載される方法等に従って、ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物であるかを同定することにより、ロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物を選抜すればよい。
つぎに、選抜されたロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物から、当該微生物のｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを生産する能力の有無を、例えば、後述の実施例に記載されるような方法に従って確認することにより、本発明に用いられるロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物を選抜すればよい。
このように選抜されたロドコッカス（Rhodococcus）に属する微生物のうち、ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）ST-10株は、公知の菌株であってかつ独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、微工研菌寄第１３１５０号の寄託番号が付与されている（原寄託日：平成４年９月８日）。菌学的性状は次のとおり。
１．コロニー形態（３０℃、４８時間）
（１）細胞形態：異形成かん菌、１〜１．５μｍ×５〜１５μｍ
（２）グラム染色性：陽性
（３）胞子の有無：無
（４）運動性の有無：無
２．培地における生育状態
（１）標準寒天平板培地
コロニーは点状、表面は凸円状、全縁状で象牙色。
（２）標準液体培地
粉状沈殿を有する。皮膜形成無し。
３．生理学的性質
カタラーゼ：陽性
オキシダーゼ：陽性
ＯＦテスト：利用しない。
１．コロニー形態（３０℃、４８時間）
（１）細胞形態：異形成かん菌、１〜１．５μｍ×５〜１５μｍ
（２）グラム染色性：陽性
（３）胞子の有無：無
（４）運動性の有無：無
２．培地における生育状態
（１）標準寒天平板培地
コロニーは点状、表面は凸円状、全縁状で象牙色。
（２）標準液体培地
粉状沈殿を有する。皮膜形成無し。
３．生理学的性質
カタラーゼ：陽性
オキシダーゼ：陽性
ＯＦテスト：利用しない。
本発明還元酵素としては、具体的には例えば、（i）全改変型還元酵素が有するアミノ酸配列（即ち、配列番号２３）における２０番目及び１６３番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなる本発明還元酵素、（ii）全改変型還元酵素が有するアミノ酸配列（即ち、配列番号２３）における１６３番目及び２７５番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなる本発明還元酵素、（iii）全改変型還元酵素が有するアミノ酸配列（即ち、配列番号２３）における２０番目、１６３番目及び２７５番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなる本発明還元酵素、（iv）全改変型還元酵素が有するアミノ酸配列（即ち、配列番号２３）における１２番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなる本発明還元酵素、（v）全改変型還元酵素が有するアミノ酸配列（即ち、配列番号２３）における２０番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなる本発明還元酵素、（vi）全改変型還元酵素が有するアミノ酸配列（即ち、配列番号２３）における４２番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなる本発明還元酵素、（vii）全改変型還元酵素が有するアミノ酸配列（即ち、配列番号２３）における６７番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなる本発明還元酵素、（viii）全改変型還元酵素が有するアミノ酸配列（即ち、配列番号２３）における１２５番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなる本発明還元酵素、（ix）全改変型還元酵素が有するアミノ酸配列（即ち、配列番号２３）における１６３番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなる本発明還元酵素、（x）全改変型還元酵素が有するアミノ酸配列（即ち、配列番号２３）における１７３番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなる本発明還元酵素、（xi）全改変型還元酵素が有するアミノ酸配列（即ち、配列番号２３）における２７５番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなる本発明還元酵素、（xii）全改変型還元酵素が有するアミノ酸配列（即ち、配列番号２３）における３２７番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなる本発明還元酵素等を挙げることができる。
本発明還元酵素は、例えば、後述の本発明ポリヌクレオチド又は後述の本発明ベクター等が宿主細胞に導入されてなる形質転換体（即ち、本発明形質転換体）を培養することにより製造することができる。
当該形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。
当該形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、シュークロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Corn Steep Liquor）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
尚、あらかじめ培地中に原料となる基質を少量添加しておくと、本発明に関する形質転換体の能力を高めることができる。添加する基質の量は、通常0.001％程度以上、好ましくは0.1〜1％程度がよい。
尚、あらかじめ培地中に原料となる基質を少量添加しておくと、本発明に関する形質転換体の能力を高めることができる。添加する基質の量は、通常0.001％程度以上、好ましくは0.1〜1％程度がよい。
さらに、tacプロモーター、trcプロモーター及びlacプロモーター等のアロラクトースで誘導されるタイプのプロモーターと本発明ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなる遺伝子が導入されてなる形質転換体の場合には、本発明還元酵素の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、isopropyl thio-β-D-galactoside（IPTG）を培地中に少量加えることもできる。
後述の本発明ポリヌクレオチド又は後述の本発明ベクター等が宿主細胞に導入されてなる形質転換体（即ち、本発明形質転換体）の培養は、一般微生物における通常の方法に準じて行い、固体培養、液体培養（旋回式振とう培養、往復式振とう培養、ジャーファーメンター（Jar Fermenter）培養、タンク培養等）等が可能である。特に、ジャーファーメンターを用いる場合、無菌空気を導入する必要があり、通常、培養液量の約０．１〜約２倍／分の通気条件を用いる。培養温度及び培地のｐＨは、微生物が生育する範囲から適宜選ぶことができ、例えば、約15℃〜約40℃の培養温度にて、ｐＨが約６〜約８の培地で培養することが好ましい。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約１日間〜約５日間が望ましい。温度シフト型やIPTG誘導型等の誘導型のプロモーターを有する発現ベクターを用いた場合には、誘導時間は１日間以内が好ましく、通常数時間である。
後述の本発明ポリヌクレオチド又は後述の本発明ベクター等が宿主細胞に導入されてなる形質転換体（即ち、本発明形質転換体）の培養物から本発明還元酵素を精製する方法としては、通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用することができ、例えば、次のような方法を挙げることができる。
まず、当該形質転換体の培養物から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、本発明還元酵素を精製することができる。
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名、いずれもアマシャム ファルマシア バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
尚、本発明還元酵素を含む画分を選抜するには、例えば、ｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを生産する能力を指標にして選抜すればよい。
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Q-Sepharose FF、Phenyl-Sepharose HP（商品名、いずれもアマシャム ファルマシア バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
尚、本発明還元酵素を含む画分を選抜するには、例えば、ｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを生産する能力を指標にして選抜すればよい。
次いで、本発明ポリヌクレオチドについて説明する。
本発明ポリヌクレオチドは、天然に存在する改変型遺伝子であってもよく、又は天然の野生型遺伝子に変異を導入（部位特異的変異導入法、突然変異処理等）することにより作出された改変型遺伝子であってもよい。上記のような改変型遺伝子及び野生型遺伝子を検索する場合には、ｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを生産する能力を少なくとも有する微生物を対象にすればよく、例えば、ロドコッカス（Rhodococcus）属（好ましくは、ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis））に属する微生物をその対象として挙げることができる。
本発明ポリヌクレオチドは、天然に存在する改変型遺伝子であってもよく、又は天然の野生型遺伝子に変異を導入（部位特異的変異導入法、突然変異処理等）することにより作出された改変型遺伝子であってもよい。上記のような改変型遺伝子及び野生型遺伝子を検索する場合には、ｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを生産する能力を少なくとも有する微生物を対象にすればよく、例えば、ロドコッカス（Rhodococcus）属（好ましくは、ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis））に属する微生物をその対象として挙げることができる。
本発明還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（即ち、本発明ポリヌクレオチド）を取得するには、まず、野生型還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子（即ち、野生型遺伝子）を取得するとよい。ここで、野生型遺伝子とは、配列番号２に示される塩基配列を有する遺伝子であり、例えば、J.Ｓambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis著；モレキュラー クローニング 第２版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、１９８９年、等に記載される通常の遺伝子工学的手法に準じてロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis））に属する微生物から取得することができる。即ち、ロドコッカス エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis））に属する微生物から「新 細胞工学実験プロトコール」（東京大学医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、1993年）に記載された方法に準じてＤＮＡライブラリーを調製し、調製されたＤＮＡライブラリーを鋳型として、かつ適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ又は配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ等を増幅して野生型遺伝子を調製する。
野生型遺伝子に部位特異的変異を導入することによって、本発明ポリヌクレオチドを調製することができる。部位特異的変異導入法としては、例えば、 Olfert Landt ら（Gene 96 125-128 1990）、Smithら（Genetic Engineering 3 1 Setlow,J.and Hollaender,A Plenum:New York）、Vlasukら（Experimental Manipulation of Gene Expression,Inouye,M.:Academic Press,New York）、Hos.N.Huntら（Gene 77 51 1989）の方法やMutan-Express Km（宝酒造社製）やTaKaRa La PCR in vitro Mutagenesis Kit（宝酒造社製）の市販キットの利用等があげられる。
例えば、Olfert Landtら（Gene 96 125-128 1990）の方法を用いて、配列番号２３で示されるアミノ酸配列においてその１２番目のアミノ酸がグリシンで置換されているアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる本発明ポリヌクレオチドを調製するには、まず、配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなる全改変型還元酵素の遺伝子が組み込まれたベクターＤＮＡを、例えばJ.sambrook、E.F.Fritsch、T.Maniatis著；モレキュラー クローニング 第２版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、１９８９年、等に記載される方法に準じて調製する。次いで、得られたベクターＤＮＡを鋳型にして、例えば、配列番号２３で示されるアミノ酸配列における１２番目のアミノ酸がグリシンに置換されているアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを片側のプライマーとして用い、適切な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをもう一方の側のプライマーとして用いて、ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅を行うとよい。ここで、ＰＣＲ反応の条件としては、例えば、９４℃にて５分間保温した後、９４℃にて１分間、次いで５０℃にて２分間、さらに７５℃にて３分間保温する処理を２０サイクル行い、最後に７５℃で８分間保温する。このようにして増幅されたＤＮＡ断片を、精製した後、全改変型還元酵素の遺伝子が組み込まれたベクターＤＮＡと適切な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを加え、ＰＣＲ法により、ＤＮＡ断片の増幅を行うとよい。このようにして得られたＤＮＡ断片を、例えば制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｂａＩで消化し、同様の制限酵素消化を行った全改変型還元酵素の遺伝子を含むベクターＤＮＡとライゲーション反応を行うことにより、目的とする本発明ポリヌクレオチドを得ることができる。
尚、他のポジションが他のアミノ酸で置換されている場合も上記方法に準じた方法により、目的とする本発明ポリヌクレオチドを得ることができる。
尚、他のポジションが他のアミノ酸で置換されている場合も上記方法に準じた方法により、目的とする本発明ポリヌクレオチドを得ることができる。
もちろん本発明還元酵素では．配列番号２３で示されるアミノ酸配列における２０番目のアミノ酸と１６３番目のアミノ酸との両者が、配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に置換されていてもよく、この場合にも上記方法に準じた方法を２回繰り返すことにより、目的とする本発明ポリヌクレオチドを得ることができる。尚、複数の他のポジションが他のアミノ酸で置換されている場合も当該方法により、目的とする本発明ポリヌクレオチドを得ることができる。
このようにして得られた本発明ポリヌクレオチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列において少なくとも下記の変異のいずれか一つ以上を有するアミノ酸配列であって、かつ、ｍ−クロロフェニルアシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを生産する能力を少なくとも有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを有することを特徴とする遺伝子であるとも言うことができる。
＜変異群＞
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列における１２番目のアミノ酸がグリシンに置換される変異、（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列における２０番目のアミノ酸がアルギニンに置換される変異、（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列における４２番目のアミノ酸がバリンに置換される変異、（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列における６７番目のアミノ酸がアルギニンに置換される変異、（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列における１２５番目のアミノ酸がメチオニンに置換される変異、（６）配列番号１で示されるアミノ酸配列における１６３番目のアミノ酸がアルギニンに置換される変異、（７）配列番号１で示されるアミノ酸配列における１７３番目のアミノ酸がプロリンに置換される変異、（８）配列番号１で示されるアミノ酸配列における２７５番目のアミノ酸がロイシンに置換される変異、（９）配列番号１で示されるアミノ酸配列における３２７番目のアミノ酸がバリンに置換される変異
＜変異群＞
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列における１２番目のアミノ酸がグリシンに置換される変異、（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列における２０番目のアミノ酸がアルギニンに置換される変異、（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列における４２番目のアミノ酸がバリンに置換される変異、（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列における６７番目のアミノ酸がアルギニンに置換される変異、（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列における１２５番目のアミノ酸がメチオニンに置換される変異、（６）配列番号１で示されるアミノ酸配列における１６３番目のアミノ酸がアルギニンに置換される変異、（７）配列番号１で示されるアミノ酸配列における１７３番目のアミノ酸がプロリンに置換される変異、（８）配列番号１で示されるアミノ酸配列における２７５番目のアミノ酸がロイシンに置換される変異、（９）配列番号１で示されるアミノ酸配列における３２７番目のアミノ酸がバリンに置換される変異
また、本発明ポリヌクレオチドは、例えば、微生物又はファージ由来のベクターに挿入されたＤＮＡライブラリーに本発明ポリヌクレオチドが有する塩基配列から選ばれる部分塩基配列を有する約１５塩基程度以上の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして後述する条件にてハイブリダイズさせ、当該プローブが特異的に結合するＤＮＡを検出することによっても取得することができる。
染色体ＤＮＡ又はＤＮＡライブラリーにプローブをハイブリダイズさせる方法としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションを挙げることができ、ライブラリーの作製に用いられたベクターの種類に応じて方法を選択することができる。
使用されるライブラリーがプラスミドベクターを用いて作製されている場合にはコロニーハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、ライブラリーのＤＮＡを宿主微生物に導入することにより形質転換体を取得し、得られた形質転換体を希釈した後、当該希釈物を寒天培地上にまき、コロニーが現われるまで培養する。
使用されるライブラリーがファージベクターを用いて作製されている場合にはプラークハイブリダイゼーションを利用するとよい。具体的には、宿主微生物とライブラリーのファージとを感染可能な条件下で混合し、さらに軟寒天培地と混合した後、当該混合物を寒天培地上にまき、プラークが現われるまで培養する。
次いで、いずれのハイブリダイゼーションの場合にも、前記の培養を行った寒天培地上にメンブレンを置き、形質転換体又はファージを当該メンブレンに吸着・転写させる。このメンブレンをアルカリ処理した後、中和処理し、次いでＤＮＡを当該メンブレンに固定する処理を行う。より具体的には、例えば、プラークハイブリダイゼーションの場合には、前記寒天培地上にニトロセルロースメンブレン又はナイロンメンブレン（例えば、Hybond-N+（アマシャム社登録商標））を置き、約１分間静置してファージ粒子をメンブレンに吸着・転写させる。次に、当該メンブレンをアルカリ溶液（例えば１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ水酸化ナトリウム）に約３分間浸してファージ粒子を溶解させることによりファージＤＮＡをメンブレン上に溶出させた後、中和溶液（例えば、１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス−塩酸緩衝溶液ｐＨ７．５）に約５分間浸す。次いで当該メンブレンを洗浄液（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸、０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．５）で約５分間洗った後、例えば、約８０℃で約９０分間加熱することによりファージＤＮＡをメンブレンに固定する。
このように調製されたメンブレンを用いて、上記ＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、J.Sambrook, E.F.Frisch, T.Maniatis著「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition（1989）」 Cold Spring Harbor Laboratory Press等の記載に準じて行うことができる。
プローブに用いられるＤＮＡは、放射性同位元素により標識されたものや、蛍光色素で標識されたものであってもよい。
プローブに用いられるＤＮＡを放射性同位元素により標識する方法としては、例えば、Random Primer Labeling Kit（宝酒造社製）等を利用することにより、ＰＣＲ反応液中のｄＣＴＰを（α−32Ｐ）ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いられるＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う方法が挙げられる。
また、プローブに用いられるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には、例えば、アマシャム製のECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System等を用いることができる。
プローブに用いられるＤＮＡを放射性同位元素により標識する方法としては、例えば、Random Primer Labeling Kit（宝酒造社製）等を利用することにより、ＰＣＲ反応液中のｄＣＴＰを（α−32Ｐ）ｄＣＴＰに替えて、プローブに用いられるＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行う方法が挙げられる。
また、プローブに用いられるＤＮＡを蛍光色素で標識する場合には、例えば、アマシャム製のECL Direct Nucleic Acid Labeling and Detection System等を用いることができる。
ハイブリダイゼーションは、例えば、以下の通りに行うことができる。
４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含みドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｌ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液（好ましくは９００ｍMの塩化ナトリウム、９０ｍMのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｌ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション液）を上記のようにして作製したメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、当該プレハイブリダイゼーション液に前記メンブレンを浸して４２〜６５℃で１〜４時間保温する。
次いで、例えば、４５０〜９００ｍMの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポロビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液（好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液）と前述の方法で調製して得られたプローブ（メンブレン１ｃｍ2当たり１．０×１０4〜２．０×１０6cpm相当量）とを混合した溶液をメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、当該ハイブリダイゼーション溶液に浸し４２〜６５℃で１２〜２０時間保温する。
４５０〜９００ｍＭの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含みドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｌ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液（好ましくは９００ｍMの塩化ナトリウム、９０ｍMのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｌ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション液）を上記のようにして作製したメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、当該プレハイブリダイゼーション液に前記メンブレンを浸して４２〜６５℃で１〜４時間保温する。
次いで、例えば、４５０〜９００ｍMの塩化ナトリウム及び４５〜９０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含み、ＳＤＳを０．１〜１．０重量％の濃度で含み、変性した非特異的ＤＮＡを０〜２００μｇ／ｍｌの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポロビニルピロリドン等をそれぞれ０〜０．２重量％の濃度で含んでいてもよいハイブリダイゼーション溶液（好ましくは、９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１．０重量％のＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性Calf-thymusＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液）と前述の方法で調製して得られたプローブ（メンブレン１ｃｍ2当たり１．０×１０4〜２．０×１０6cpm相当量）とを混合した溶液をメンブレン１ｃｍ2当たり５０〜２００μｌの割合で準備し、当該ハイブリダイゼーション溶液に浸し４２〜６５℃で１２〜２０時間保温する。
当該ハイブリダイゼーション後、メンブレンを取り出し、１５〜３００ｍＭの塩化ナトリウム１．５〜３０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．１〜１．０重量％のＳＤＳ等を含む４２〜６５℃の洗浄液（好ましくは１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム及び１．０重量％のＳＤＳを含む６５℃の洗浄液）等を用いて洗浄する。洗浄したメンブレンを２xSSC（３００ｍＭ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム）で軽くすすいだ後、乾燥する。このメンブレンを例えばオートラジオグラフィー等に供してメンブレン上のプローブの位置を検出することにより、用いたプローブとハイブリダイズするＤＮＡのメンブレン上の位置に相当するクローンを元の寒天培地上で特定し、これを釣菌することにより、当該ＤＮＡを有するクローンを単離する。
このようにして得られるクローンを培養して得られる培養菌体から本発明ポリヌクレオチドを調製することができる。
上記のようにして調製された本発明ポリヌクレオチドを「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして本発明ベクターを得ることができる。用いられるベクターとしては、具体的には、例えば、pUC119（宝酒造社製）、pTV118N（宝酒造社製）、pBluescriptII （東洋紡社製）、ｐCR2.1-TOPO（Invitrogen社製）、pTrc99A（Pharmacia社製）、ｐKK223-3（Pharmacia社製）等が挙げられる。
また、前述のＤＮＡの塩基配列は、F.Sanger, S.Nicklen, A.R.Coulson著、Proceeding of Natural Academy of Science U.S.A.(1977) 74: 5463-5467頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等の市販の試薬を用いてもよい。
上述のようにして得られるＤＮＡが、ｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを優先して生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードしていることの確認は、例えば、以下のようにして行うことができる。
まず上述のようにして得られるＤＮＡを後述のように、宿主細胞において機能可能なプロモーターの下流に接続されるようにベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を取得する。次いで当該形質転換体の培養物をｍ−クロロフェナシルクロライドに作用させる。反応生成物中の１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールの量を分析することにより、得られたＤＮＡがかかる能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードすることが確認できる。
本発明ポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させるには、例えば、宿主細胞で機能可能なプロモーターと本発明ポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する。
ここで、「機能可能な形で」とは、当該ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させた際に、本発明ポリヌクレオチドが、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、または、tacプロモーターもしくはtrcプロモーター等の大腸菌内で機能可能な合成プロモーター等をあげることができる。
一般的には、宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる遺伝子を下記のような基本ベクターに組み込んでなるベクターを宿主細胞に導入する。ここで「基本ベクター」としては、具体的には大腸菌を宿主細胞とする場合には、例えば、ベクターpUC119(宝酒造社製)やファージミドpBluescriptII(Stratagene社製)等をあげることができる。出芽酵母を宿主細胞とする場合には、ベクターpGBT9、pGAD424、pACT2(Clontech社製)等をあげることができる。また、哺乳類動物細胞を宿主細胞とする場合には、pRc/RSV、pRc/CMV(Invitrogen社製)等のベクター、ウシパピローマウイルスベクターpBPV(アマシャムファルマシアバイオテク社製)もしくはEBウイルスベクターpCEP4(Invitrogen社製)等のウイルス由来の自律複製起点を含むベクター、ワクシニアウイルス等のウイルス等をあげることができる。さらに、昆虫類動物細胞を宿主細胞とする場合には、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスをあげることができる。
自律複製起点を含むベクター、例えば、上記の酵母用ベクターpACT2や、ウシパピローマウイルスベクターpBPV、EBウイルスベクターpCEP4等を用いて本発明ベクターを構築すると、当該ベクターは宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に保持される。 尚、基本ベクターとして選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、当該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択することができる。
また本発明ベクターは、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドをさらに含有してもよい。このような本発明ベクターを用いることにより、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドをさらに保有する本発明形質転換体を作製することもできる。
自律複製起点を含むベクター、例えば、上記の酵母用ベクターpACT2や、ウシパピローマウイルスベクターpBPV、EBウイルスベクターpCEP4等を用いて本発明ベクターを構築すると、当該ベクターは宿主細胞に導入された際にエピソームとして細胞内に保持される。 尚、基本ベクターとして選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）を含むベクターを用いると、当該ベクターが導入された形質転換体を当該選択マーカー遺伝子の表現型等を指標にして選択することができる。
また本発明ベクターは、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドをさらに含有してもよい。このような本発明ベクターを用いることにより、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドをさらに保有する本発明形質転換体を作製することもできる。
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明ポリヌクレオチド又は本発明ベクター等を導入する宿主細胞としては、例えば、Escherichia属、Bacillus属、Corynebacterium属、Staphylococcus属、Streptomyces属、Saccharomyces属、Kluyveromyces属及びAspergillus属に属する微生物等があげられる。
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明ポリヌクレオチド又は本発明ベクター等を宿主細胞へ導入する方法は、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載される塩化カルシウム法や、「Methods in Electroporation:Gene Pulser /E.coli Pulser System」 Bio-Rad Laboratories, (1993)等に記載されるエレクトロポレーション法等をあげることができる。
宿主細胞において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続されてなる本発明ポリヌクレオチド又は本発明ベクター等が導入された形質転換体を選抜するには、例えば、前述のようなベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
当該形質転換体が本発明ポリヌクレオチドを保有していることは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
当該形質転換体が本発明ポリヌクレオチドを保有していることは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press等に記載される通常の方法に準じて、制限酵素部位の確認、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション、ウエスタンハイブリダイゼーション等を行うことにより、確認することができる。
このようにして調製された本発明ポリヌクレオチドを用いて、前述の如く、通常の遺伝子工学的方法及び微生物培養方法等に準じ、本発明還元酵素を大量に製造し、取得することができる。
このようにして調製された本発明還元酵素を産生する本発明形質転換体又はその処理物は、基質を還元するバイオリアクターとして、例えば医農薬の有効生物となる化合物やその中間体、特に光学活性である化合物やその中間体等を製造する為の有機合成反応に利用することが可能である。
このようにして調製された本発明還元酵素を産生する本発明形質転換体又はその処理物は、基質を還元するバイオリアクターとして、例えば医農薬の有効生物となる化合物やその中間体、特に光学活性である化合物やその中間体等を製造する為の有機合成反応に利用することが可能である。
次に、本発明におけるアルコールの製造方法について説明する。
当該製造方法はケトン化合物又はアルデヒド化合物に、本発明還元酵素、それを産生する形質転換体又はその処理物を作用させることを特徴とする。
当該製造方法はケトン化合物又はアルデヒド化合物に、本発明還元酵素、それを産生する形質転換体又はその処理物を作用させることを特徴とする。
ケトン化合物又はアルデヒド化合物は、例えば、プロピオンアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−バレルアルデヒド、ｎ−ヘキシルアルデヒド、ｎ−ペプチルアルデヒド、ｎ−デシルアルデヒド、２−オキソプロピオンアルデヒド、トランス−シンナムアルデヒド、４−ブロモベンズアルデヒド、２−ニトロベンズアルデヒド、３−ニトロベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、３−フェニルプロピオンアルデヒド、４−クロロベンズアルデヒド、２−ブタノン、２−ペンタノン、２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、２−オクタノン、２−ノナノン、２−デカノン、３−ペンタノン、３−クロロ−２−ブタノン、tert−ブチルアセトアセテート、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、ヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、クロロアセトン、ジヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、メチル ３−オキソブタノエート、エチル ３−オキサブタノネート、エチル ４−クロロアセトアセテート、メチル ４−ブロモー３−オキサブタノエート、エチル ４−ブロモ−３−オキサブタノエート、Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−３−ピロリジノン、イソプロピル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、エチル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル ３−オキソペンタノエート、ｍ−クロロフェナシルクロライド、アセトフェノン、２−ブロモアセトフェノン、２’−ブロモアセトフェノン、３’−ブロモアセトフェノン、４’−ブロモアセトフェノン、２−クロロアセトフェノン、２’−クロロアセトフェノン、３’−クロロアセトフェノン、４’−クロロアセトフェノン、プロピオフェノン、ベンジルアセトン、１−フェニル−１−ブタノン、１−フェニル−２−ブタノン、１−フェニル−３−ブタノン、ｍ−メトキシアセトフェノン、３，４−ジメトキシアセトフェノン、４’−メトキシアセトフェノン、２，３’−ジクロロアセトフェノン、３，４−ジメトキシフェニルアセトン、シクロペンタノン、４−アセチル安息香酸、D-(+)-グルコース等が挙げられる。
上記方法は、通常、水及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記す。）の存在下に行うとよい。この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。当該緩衝水溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩及びこれらの混合物が挙げられる。
上記方法においては、水に加えて有機溶媒を共存させることもできる。共存させることができる有機溶媒としては、例えば、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロプルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、トルエン、ヘキサン、シクロへヘキサン、ヘプタン、イソオクタン等の炭化水素類、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド等の有機硫黄化合物、アセトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類及びこれらの混合物が挙げられる。
本発明還元酵素は、有機溶媒、特に２−プロパノール存在下（例えば、２０％(v/v)、３０℃、２２時間反応）での活性が向上した改変型還元酵素である。当該還元酵素は、基質であるケトン化合物又はアルデヒド化合物の存在下であっても活性を長く、及び／又は、活性を高く保持することができ、工業的なアルコール製造において有利である。補酵素をリサイクルするための基質となりうる２−プロパノール等の有機溶媒から、当該還元酵素の失活を軽減することが可能となるために、２−プロパノール等の有機溶媒の存在下で優れた反応性を示す。
上記方法における反応は、例えば、水、ＮＡＤＨ、及びケトン化合物又はアルデヒド化合物を、本発明還元酵素あるいはそれを産生する形質転換体又はその処理物とともに、必要によりさらに有機溶媒等を含有した状態で、攪拌、振盪等により混合することにより行われる。
上記方法における反応時のｐＨは適宜選択することができるが、通常ｐＨ３〜１０の範囲である。また反応温度は適宜選択することができるが、原料及び生成物の安定性、反応速度の点から通常０〜６０℃の範囲である。
反応の終点は、例えば、反応液中のケトン化合物又はアルデヒド化合物の量を液体クロマトグラフィー等により追跡することにより決めることができる。
反応時間は適宜選択することができるが、通常０．５時間から１０日間の範囲である。
反応時間は適宜選択することができるが、通常０．５時間から１０日間の範囲である。
反応液からのアルコールの回収は、一般に知られている任意の方法で行えばよい。
例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィー、蒸留等を組み合わせて、行うことにより精製する方法が挙げられる。
例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィー、蒸留等を組み合わせて、行うことにより精製する方法が挙げられる。
本発明還元酵素、それを産生する形質転換体又はその処理物は種々の形態で上記方法に用いることができる。
具体的な形態としては、例えば、本発明ポリヌクレオチドを保有する形質転換体の培養物、かかる形質転換体の処理物、無細胞抽出液、粗精製タンパク質、精製タンパク質等及びこれらの固定化物が挙げられる。ここで、形質転換体の処理物としては、例えば、凍結乾燥形質転換体、有機溶媒処理形質転換体、乾燥形質転換体、形質転換体摩砕物、形質転換体の自己消化物、形質転換体の超音波処理物、形質転換体抽出物、形質転換体のアルカリ処理物が挙げられる。また、固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本発明還元酵素等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本発明還元酵素等を閉じ込める方法）が挙げられる。
尚、本発明ポリヌクレオチドを保有する形質転換体を用いた工業的な生産を考慮すれば、生形質転換体を用いるよりも当該形質転換体を死滅化させた処理物を用いる方法が製造設備の制限が少ないという点では好ましい。そのための死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン及び抗生物質）が挙げられる。一般的には、これらの殺菌法のうちできるだけ本発明還元酵素の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留、汚染などの影響が少ない処理方法を選択することが望ましい。
また、本発明のアルコールの製造方法はＮＡＤＨの存在下に行われ、ケトン化合物又はアルデヒド化合物の還元反応の進行に伴い、当該ＮＡＤＨは酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ+と記す）に変換される。変換により生じたＮＡＤ+は、ＮＡＤ+を還元型（ＮＡＤＨ）に変換する能力を有するタンパク質により元のＮＡＤＨに戻すことができるので、上記方法の反応系内には、ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質を共存させることもできる。
ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質としては、例えば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等が挙げられる。
ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質としてのグルコース脱水素酵素はＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する際、基質としてグルコースを要するものであり、グルコースを酸化し、グルコノラクトンに変換する能力を有するタンパク質、もしくはそのタンパク質を発現する微生物またはその処理物であってもよい。
また、ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素である場合には、反応系内にグルコース等を共存させることにより当該タンパク質の活性が増強される場合もあり、例えば、反応液にこれらを加えてもよい。
また、当該タンパク質は、酵素そのものであってもよいし、また当該酵素をもつ微生物又は当該微生物の処理物の形態で反応系内に共存していてもよい。さらにまた、ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む形質転換体又はその処理物であってもよい。ここで処理物とは、前述にある「形質転換体の処理物」と同等なものを意味する。
ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質としては、例えば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等が挙げられる。
ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質としてのグルコース脱水素酵素はＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する際、基質としてグルコースを要するものであり、グルコースを酸化し、グルコノラクトンに変換する能力を有するタンパク質、もしくはそのタンパク質を発現する微生物またはその処理物であってもよい。
また、ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素である場合には、反応系内にグルコース等を共存させることにより当該タンパク質の活性が増強される場合もあり、例えば、反応液にこれらを加えてもよい。
また、当該タンパク質は、酵素そのものであってもよいし、また当該酵素をもつ微生物又は当該微生物の処理物の形態で反応系内に共存していてもよい。さらにまた、ＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を含む形質転換体又はその処理物であってもよい。ここで処理物とは、前述にある「形質転換体の処理物」と同等なものを意味する。
さらに、本発明のアルコールの製造方法では、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等のようなＮＡＤ+をＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を同時に保有する形質転換体を用いて行うこともできる。特にグルコース脱水素酵素はバシラス属やバークホルデリア属由来などの微生物、特にはバシラス・メガテリウム、バシラス・サチルス、バシラス・リケニホルミス、バークホルデリア・セパシア等から該酵素をコードする遺伝子を取得して、グルコース脱水素酵素をコードする塩基配列を有する遺伝子を同時に保有する形質転換体を用いて行うこともできる。
この形質転換体において、両者遺伝子を宿主細胞へ導入する方法としては、例えば、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法、複製起源の異なる複数のベクターに両者遺伝子を別々に導入した組換ベクターにより宿主細胞を形質転換する方法等があげられる。さらに、一方の遺伝子または両者遺伝子を宿主細胞の染色体中に導入してもよい。
尚、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法としては、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域をそれぞれの両者遺伝子に連結して組換ベクターを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換ベクターを構築してもよい。
この形質転換体において、両者遺伝子を宿主細胞へ導入する方法としては、例えば、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法、複製起源の異なる複数のベクターに両者遺伝子を別々に導入した組換ベクターにより宿主細胞を形質転換する方法等があげられる。さらに、一方の遺伝子または両者遺伝子を宿主細胞の染色体中に導入してもよい。
尚、単一である、両者遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入する方法としては、例えば、プロモーター、ターミネーター等の発現制御に関わる領域をそれぞれの両者遺伝子に連結して組換ベクターを構築したり、ラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させるような組換ベクターを構築してもよい。
以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１ （野生型還元酵素の遺伝子の調製）
（１−１）プラスミドｐＥＡＲ１の調製
配列番号３(PAR207F：(５’−AAGAATTCAAGGAGATAAGGCCATGAAGGCCATCCAGTAC −３’)で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４(PAR207R：５’−TTTCTGCAGGCCTCACAGGCCAGGGACCACAACCGC −３’)で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、例えば、Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 386-392等に記載される公知のプラスミドであるｐＵＡＲ（野生型還元酵素の遺伝子を保有するプラスミド、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１２７）を鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。
（１−１）プラスミドｐＥＡＲ１の調製
配列番号３(PAR207F：(５’−AAGAATTCAAGGAGATAAGGCCATGAAGGCCATCCAGTAC −３’)で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号４(PAR207R：５’−TTTCTGCAGGCCTCACAGGCCAGGGACCACAACCGC −３’)で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、例えば、Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 386-392等に記載される公知のプラスミドであるｐＵＡＲ（野生型還元酵素の遺伝子を保有するプラスミド、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８１２７）を鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐＵＡＲ：5ng
dNTP：各0.2mM-mix
プライマー：各300nM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−buffer：5μl
MgSO４：1mM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：1U
計50μl
ｐＵＡＲ：5ng
dNTP：各0.2mM-mix
プライマー：各300nM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−buffer：5μl
MgSO４：1mM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：1U
計50μl
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPTC-200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃(０．２５分間)-５５℃(０．５分間)-６８℃（２分間）のサイクルを３０回行なった。
上記組成の反応液が入った容器をPTC-200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃(０．２５分間)-５５℃(０．５分間)-６８℃（２分間）のサイクルを３０回行なった。
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片に２種類の制限酵素（ＥｃｏＲI及びＰｓｔI）を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を２重消化させた。次いで得られたＤＮＡ断片を精製した。
一方、ベクターｐＵＣ１１８（Pharmacia製）を２種類の制限酵素（ＥｃｏＲI及びＰｓｔI）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）でライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて野生型還元酵素の遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＥＡＲ１と記すこともある。）を取り出した。
一方、ベクターｐＵＣ１１８（Pharmacia製）を２種類の制限酵素（ＥｃｏＲI及びＰｓｔI）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）でライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて野生型還元酵素の遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＥＡＲ１と記すこともある。）を取り出した。
（１−２）プラスミドｐＥＡＲ２の調製
配列番号３(PAR207F：５’−AAGAATTCAAGGAGATAAGGCCATGAAGGCCATCCAGTAC −３’)で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５(PAR207RH：３’−TTTCTGCAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCGGACAGGCCAGGGACCACAACCGC−５’)で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、プラスミドｐＥＡＲ１を鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。
配列番号３(PAR207F：５’−AAGAATTCAAGGAGATAAGGCCATGAAGGCCATCCAGTAC −３’)で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号５(PAR207RH：３’−TTTCTGCAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCGGACAGGCCAGGGACCACAACCGC−５’)で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、プラスミドｐＥＡＲ１を鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐEAR1：１ng
dNTP：各0.2mM−mix
プライマー：各500nM
ＥｘＴａｑ−buffer：5μl
ＥｘＴａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）：5U
計100μl
ｐEAR1：１ng
dNTP：各0.2mM−mix
プライマー：各500nM
ＥｘＴａｑ−buffer：5μl
ＥｘＴａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）：5U
計100μl
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPTC-200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃（５分間）に加熱した後、９４℃(０．５分間)−５５℃(０．５分間)−７２℃（１分間）のサイクルを３０回行なった。
上記組成の反応液が入った容器をPTC-200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃（５分間）に加熱した後、９４℃(０．５分間)−５５℃(０．５分間)−７２℃（１分間）のサイクルを３０回行なった。
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片に２種類の制限酵素（ＫｐｎI及びＰｓｔI）を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を２重消化させた。次いで得られたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐＥＡＲ１を２種類の制限酵素（ＫｐｎI及びＰｓｔI）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて野生型還元酵素の遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＥＡＲ２と記すこともある。）を取り出した。
一方、プラスミドｐＥＡＲ１を２種類の制限酵素（ＫｐｎI及びＰｓｔI）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて野生型還元酵素の遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＥＡＲ２と記すこともある。）を取り出した。
（１−３）プラスミドｐＥＡＲ２ｓの調製
プラスミドｐＥＡＲ２に制限酵素（SfiI, EcoT14I）を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を消化させた。次いで得られたＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られたＤＮＡ断片を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs社製）で平滑化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでセルフライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用い、野生型還元酵素の遺伝子の一部欠如した遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＥＡＲ２ｓと記すこともある。）を取り出した。
プラスミドｐＥＡＲ２に制限酵素（SfiI, EcoT14I）を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を消化させた。次いで得られたＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られたＤＮＡ断片を、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs社製）で平滑化した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでセルフライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用い、野生型還元酵素の遺伝子の一部欠如した遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＥＡＲ２ｓと記すこともある。）を取り出した。
実施例２ （プラスミドｐＥＡＲ２のランダム変異導入ライブラリーの調製）
配列番号６（RV-M：５’−GAGCGGATAACAATTTCACACAGG −３’）（宝酒造社製）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号７（M13-47：５’−CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC −３’）（宝酒造社製）で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、ｐＥＡＲ２を鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。
配列番号６（RV-M：５’−GAGCGGATAACAATTTCACACAGG −３’）（宝酒造社製）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号７（M13-47：５’−CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC −３’）（宝酒造社製）で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、ｐＥＡＲ２を鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐEAR2：１ng
dATP：0.2mM
dTTP：１mM
dGTP：0.2mM
dCTP：１mM
プライマー：各30pmol
MgCl２：7mM
KCｌ：50mM
Tris−HCl buffer (pH8.3)：10mM
Gelatin：0.01%(w／v)
Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス）：5U
計100μl
ｐEAR2：１ng
dATP：0.2mM
dTTP：１mM
dGTP：0.2mM
dCTP：１mM
プライマー：各30pmol
MgCl２：7mM
KCｌ：50mM
Tris−HCl buffer (pH8.3)：10mM
Gelatin：0.01%(w／v)
Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュ・ダイアグノスティックス）：5U
計100μl
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPTC-200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃(１分間)-４５℃(１分間)-７２℃（１分間）のサイクルを３０回行なった。
上記組成の反応液が入った容器をPTC-200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃(１分間)-４５℃(１分間)-７２℃（１分間）のサイクルを３０回行なった。
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片に制限酵素（SfiI）を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を消化させた。次いで得られたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐＥＡＲ２sを制限酵素（SfiI）を加えることにより、当該ベクターを消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてランダム変異の導入された野生型還元酵素の遺伝子を含有するランダム変異導入ライブラリーを取り出した。
一方、プラスミドｐＥＡＲ２sを制限酵素（SfiI）を加えることにより、当該ベクターを消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてランダム変異の導入された野生型還元酵素の遺伝子を含有するランダム変異導入ライブラリーを取り出した。
実施例３ （本発明形質転換体である形質転換大腸菌の選抜）
（３−１） 有機溶媒耐性（２０％イソプロパノール中で活性を示す）を有する形質転換大腸菌の一次選抜
実施例２で得られた形質転換体を０．４ｍＭのisopropyl−β−D−thiogalactopyranoside(ＩＰＴＧ)、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、1％(w／v)のZnCl２、10g／LのBacto-tryptone(Difco)、5g／LのBacto−yeast extract(Difco)、10g／LのNaCl及び15g／Lのアガロースを含有する滅菌寒天培地に接種し、これを３０℃で２４時間培養した。培養後、得られたコロニーをナイロン膜（BiodyneA, 日本ポール社製）に転写した後、そのナイロン膜を1mMのNAD＋、200μMのnitroblue tetrazolium、10μMの1−methoxy−5−methylphenazinium methylsulfate(同仁化学研究所社製)及び20％(v／v)の2-プロパノールを含む50mMの3−(N−morpholino)propanesulfonic acid(MOPS)バッファー中に室温で30分間浸した。その後、ナイロン膜を蒸留水で洗浄し、染色されたコロニー１６０種を選抜した。選抜された１６０のコロニー、プラスミドpEAR2にて形質転換されたJM109形質転換大腸菌（JM109(pEAR2)）、そして、pEAR2ｓにて形質転換されたJM109形質転換大腸菌（JM109(pEAR2s)）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム）（１００μｌ）に接種し、これを３７℃で１８時間振盪培養した。
（３−１） 有機溶媒耐性（２０％イソプロパノール中で活性を示す）を有する形質転換大腸菌の一次選抜
実施例２で得られた形質転換体を０．４ｍＭのisopropyl−β−D−thiogalactopyranoside(ＩＰＴＧ)、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、1％(w／v)のZnCl２、10g／LのBacto-tryptone(Difco)、5g／LのBacto−yeast extract(Difco)、10g／LのNaCl及び15g／Lのアガロースを含有する滅菌寒天培地に接種し、これを３０℃で２４時間培養した。培養後、得られたコロニーをナイロン膜（BiodyneA, 日本ポール社製）に転写した後、そのナイロン膜を1mMのNAD＋、200μMのnitroblue tetrazolium、10μMの1−methoxy−5−methylphenazinium methylsulfate(同仁化学研究所社製)及び20％(v／v)の2-プロパノールを含む50mMの3−(N−morpholino)propanesulfonic acid(MOPS)バッファー中に室温で30分間浸した。その後、ナイロン膜を蒸留水で洗浄し、染色されたコロニー１６０種を選抜した。選抜された１６０のコロニー、プラスミドpEAR2にて形質転換されたJM109形質転換大腸菌（JM109(pEAR2)）、そして、pEAR2ｓにて形質転換されたJM109形質転換大腸菌（JM109(pEAR2s)）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム）（１００μｌ）に接種し、これを３７℃で１８時間振盪培養した。
（３−２） 有機溶媒耐性（２０％イソプロパノール中で活性を示す）を有する形質転換大腸菌の二次選抜
（３−１）で一次選抜された１６０種の選抜コロニーのうち、40コロニーを０．４ｍＭのIPTG)、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、1％(w／v)のZnCl２、10g／LのBacto‐tryptone(Difco)、5g／LのBacto−yeast extract(Difco)、10g／LのNaClを含有する滅菌培地（１ml）に接種し、これを３７℃で２２時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（２００００×ｇ、５分、4℃）することにより、沈殿として湿菌体を回収した。回収された湿菌体に、最終濃度1mMとなるNAD＋を含む最終濃度50mMとなるMOPSバッファー０．４mlを加えた。次に、５％(w／v)のｍ−クロロフェナシルクロライドを含む２−プロパノール０.１ｍｌを加えた。これを３０℃で２２時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを１ｍｌ添加し、有機層を分取した。有機層はNa２CO３にて脱水処理を行った。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析に供試した。このような分析を１６０種の一次選抜された全てのコロニーについて行った結果、クローンC38、C12、H23、E9を見出した。
（３−１）で一次選抜された１６０種の選抜コロニーのうち、40コロニーを０．４ｍＭのIPTG)、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、1％(w／v)のZnCl２、10g／LのBacto‐tryptone(Difco)、5g／LのBacto−yeast extract(Difco)、10g／LのNaClを含有する滅菌培地（１ml）に接種し、これを３７℃で２２時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（２００００×ｇ、５分、4℃）することにより、沈殿として湿菌体を回収した。回収された湿菌体に、最終濃度1mMとなるNAD＋を含む最終濃度50mMとなるMOPSバッファー０．４mlを加えた。次に、５％(w／v)のｍ−クロロフェナシルクロライドを含む２−プロパノール０.１ｍｌを加えた。これを３０℃で２２時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを１ｍｌ添加し、有機層を分取した。有機層はNa２CO３にて脱水処理を行った。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析に供試した。このような分析を１６０種の一次選抜された全てのコロニーについて行った結果、クローンC38、C12、H23、E9を見出した。
（含量分析条件）
カラム：Chiralcel ＯＢ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
キャリアー溶媒：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９：１（ｖ／ｖ）
流速：０.８ml／分
検出器：UV２６８nm
カラム：Chiralcel ＯＢ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
キャリアー溶媒：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９：１（ｖ／ｖ）
流速：０.８ml／分
検出器：UV２６８nm
実施例４ （多重改変型本発明ポリヌクレオチドの作製）
（４−１） ライゲーションによる改変型遺伝子の作製
実施例３（３−２）で二次選抜されたクローンC38、C12、H23、E9をそれぞれ１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（４ｍｌ）に接種し、これを３７℃で２２時間振盪培養した。培養後、得られたクローンC38、C12、H23、E9からそれぞれQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。クローンH23のプラスミドを精製した後、２種類の制限酵素（AccIとHindIII）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製し3384bpのＤＮＡ断片を得た。クローンC38のプラスミドを精製した後、２種類の制限酵素（AccIとKpnI）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製し280bpのＤＮＡ断片を得た。クローンE9のプラスミドを精製した後、２種類の制限酵素（KpnIとHindIII）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製し550bpのＤＮＡ断片を得た。このようにして精製して得られた３種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE．coliＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用い、野生型還元酵素の遺伝子に変異が導入されたプラスミド（以下、プラスミドｐSarPと記すこともある。）を取り出した。
（４−１） ライゲーションによる改変型遺伝子の作製
実施例３（３−２）で二次選抜されたクローンC38、C12、H23、E9をそれぞれ１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する滅菌ＬＢ培地（４ｍｌ）に接種し、これを３７℃で２２時間振盪培養した。培養後、得られたクローンC38、C12、H23、E9からそれぞれQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。クローンH23のプラスミドを精製した後、２種類の制限酵素（AccIとHindIII）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製し3384bpのＤＮＡ断片を得た。クローンC38のプラスミドを精製した後、２種類の制限酵素（AccIとKpnI）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製し280bpのＤＮＡ断片を得た。クローンE9のプラスミドを精製した後、２種類の制限酵素（KpnIとHindIII）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製し550bpのＤＮＡ断片を得た。このようにして精製して得られた３種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE．coliＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用い、野生型還元酵素の遺伝子に変異が導入されたプラスミド（以下、プラスミドｐSarPと記すこともある。）を取り出した。
（４−２） 部位特異的変異導入操作
配列番号８（PARSQ-R1：５’−CATTAGGCACCCCAGGCTTTACAC−３’）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１４（PAR-A125T-comp：５’−CTCATGATGAAGACGTCCGAGTGGC −３’）で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、ｐSarPを鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。また、配列番号１５（PAR-T373A-sens：５’−GCACCCGGCGCGATGGCCGAGTTCA−３’）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１６（PAR-T517C-comp：５’−CAACCGCGTACGGGCCTCCGCGAAG−３’）で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、ｐSarPを鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。
配列番号８（PARSQ-R1：５’−CATTAGGCACCCCAGGCTTTACAC−３’）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１４（PAR-A125T-comp：５’−CTCATGATGAAGACGTCCGAGTGGC −３’）で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、ｐSarPを鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。また、配列番号１５（PAR-T373A-sens：５’−GCACCCGGCGCGATGGCCGAGTTCA−３’）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１６（PAR-T517C-comp：５’−CAACCGCGTACGGGCCTCCGCGAAG−３’）で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、ｐSarPを鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐSarP：5ng
dNTP：各0.2mM−mix
プライマー：各300nM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−buffer：5μl
MgSO４：1mM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：1U
計50μl
ｐSarP：5ng
dNTP：各0.2mM−mix
プライマー：各300nM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−buffer：5μl
MgSO４：1mM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：1U
計50μl
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPTC−200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃(０．２５分間)−５５℃(０．５分間)−６８℃（２分間）のサイクルを３０回行なった。
上記組成の反応液が入った容器をPTC−200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃(０．２５分間)−５５℃(０．５分間)−６８℃（２分間）のサイクルを３０回行なった。
配列番号８（PARSQ-R1：５’−CATTAGGCACCCCAGGCTTTACAC−３’）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１４（PAR−A125T−comp：５’−CTCATGATGAAGACGTCCGAGTGGC−３’）で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、ｐSarPを鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った結果、262bpのDNA断片が得られた。また、配列番号１５（PAR−T373A−sens：５’−GCACCCGGCGCGATGGCCGAGTTCA−３’）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号１６（PAR−T517C−comp：５’−CAACCGCGTACGGGCCTCCGCGAAG−３’）で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、ｐSarPを鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った結果、169bpのDNA断片が得られた。このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片をプライマーに用いて、ｐSarPを鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐSarP：5ng
dNTP：各0.2mM−mix
プライマー：各300nM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−buffer：5μl
MgSO４：1mM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：1U
計50μl
ｐSarP：5ng
dNTP：各0.2mM−mix
プライマー：各300nM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−buffer：5μl
MgSO４：1mM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：1U
計50μl
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPTC−200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃(０．２５分間)−５５℃(０．５分間)−６８℃（２分間）のサイクルを３０回行なった。
上記組成の反応液が入った容器をPTC−200 Thermal Cycler (ＭＪリサーチ)にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃(０．２５分間)−５５℃(０．５分間)−６８℃（２分間）のサイクルを３０回行なった。
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片に２種類の制限酵素（ＥｃｏＲI及びBsiWI）を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を２重消化させた。次いで得られた５３７ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐSarPを２種類の制限酵素（ＥｃｏＲI及びBsiWI）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）でライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて改変型還元酵素の遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐSarAと記すこともある。）を取り出した。
一方、プラスミドｐSarPを２種類の制限酵素（ＥｃｏＲI及びBsiWI）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）でライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて改変型還元酵素の遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐSarAと記すこともある。）を取り出した。
（４−２）で得られたプラスミドｐSarAをダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、９つのアミノ酸変異（12 Gly,20 Arg,42 Val,67 Arg,125 Met,163 Arg,173 Pro,275 Leu,327 Val）が導入されていることを確認した。
実施例５ （本発明ポリヌクレオチド及び補酵素再生酵素の遺伝子を保有する形質転換体の調製：プラスミドｐSar１、ｐSar２、ｐSar４、ｐSar６、ｐSar８、ｐSar９の構築）
表１で示される塩基配列を有する組合わせのオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、プラスミドｐSarAを鋳型にして以下の反応液組成及び反応条件で第１ＰＣＲを行った。
表１で示される塩基配列を有する組合わせのオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、プラスミドｐSarAを鋳型にして以下の反応液組成及び反応条件で第１ＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐSarA：5ng
dNTP：各0.2mM−mix
プライマー：各300nM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−buffer：5μl
MgSO４：1mM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：1U
計50μl
ｐSarA：5ng
dNTP：各0.2mM−mix
プライマー：各300nM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−buffer：5μl
MgSO４：1mM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：1U
計50μl
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃(０．２５分間)−５５℃(０．５分間)−６８℃（２分間）のサイクルを３０回行なった。
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃(０．２５分間)−５５℃(０．５分間)−６８℃（２分間）のサイクルを３０回行なった。
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片と表２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、プラスミドｐSarAを鋳型にして以下の反応液組成及び反応条件で第２ＰＣＲを行った。
［反応液組成］
ｐSarA：5ng
dNTP：各0.2mM−mix
プライマー：各300nM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−buffer：5μl
MgSO４：1mM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：1U
計50μl
ｐSarA：5ng
dNTP：各0.2mM−mix
プライマー：各300nM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−buffer：5μl
MgSO４：1mM
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ：1U
計50μl
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃(０．２５分間)−５５℃(０．５分間)−６８℃（２分間）のサイクルを３０回行なった。
上記組成の反応液が入った容器をPERKIN ELMER−GeneAmp PCR System2400にセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃(０．２５分間)−５５℃(０．５分間)−６８℃（２分間）のサイクルを３０回行なった。
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片に表３に示す２種類の制限酵素を加えることにより、当該ＤＮＡ断片を２重消化させた。次いで得られたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐSarAを表３に示す２種類の制限酵素を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐSarAを表３に示す２種類の制限酵素を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られたそれぞれのプラスミドに対応する２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて改変型還元酵素の遺伝子を含有するそれぞれのプラスミドを取り出した。
実施例６ （本発明ポリヌクレオチド及び補酵素再生酵素の遺伝子を保有する形質転換体の調製：プラスミドｐSar３、ｐSar５、ｐSar７の構築）
プラスミドｐSarAを表３に示す２種類の制限酵素を加えることにより、プラスミドｐSarAを２重消化させた。次いで得られたインサート部分のＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐSarPを表４に示す２種類の制限酵素を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたベクター部分のＤＮＡ断片を精製した。
プラスミドｐSarAを表３に示す２種類の制限酵素を加えることにより、プラスミドｐSarAを２重消化させた。次いで得られたインサート部分のＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐSarPを表４に示す２種類の制限酵素を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたベクター部分のＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られたそれぞれのプラスミドに対応する２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて改変型還元酵素の遺伝子を含有するそれぞれのプラスミドを取り出した。
実施例７ （本発明ポリヌクレオチド及び補酵素再生酵素の遺伝子を保有する形質転換体の調製：プラスミドｐSar２６、ｐSar６８、ｐSar２６８の構築）
（７−１）ｐSar２６の構築
プラスミドｐSar２を２種類の制限酵素（XhoＩ及びKpnＩ）を加えることにより、プラスミドｐSarAを２重消化させた。次いで得られたベクター部分のＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐSar６を２種類の制限酵素（XhoＩ及びKpnＩ）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたインサート部分のＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて改変型還元酵素の遺伝子を含有するプラスミドを取り出した（以下、プラスミドｐSar２６と記すこともある。）。
（７−１）ｐSar２６の構築
プラスミドｐSar２を２種類の制限酵素（XhoＩ及びKpnＩ）を加えることにより、プラスミドｐSarAを２重消化させた。次いで得られたベクター部分のＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐSar６を２種類の制限酵素（XhoＩ及びKpnＩ）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたインサート部分のＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて改変型還元酵素の遺伝子を含有するプラスミドを取り出した（以下、プラスミドｐSar２６と記すこともある。）。
（７−２）ｐSar６８の構築
プラスミドｐSar８を２種類の制限酵素（XhoＩ及びKpnＩ）を加えることにより、プラスミドｐSarAを２重消化させた。次いで得られたベクター部分のＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐSar６を２種類の制限酵素（XhoＩ及びKpnＩ）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたインサート部分のＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて改変型還元酵素の遺伝子を含有するプラスミドを取り出した（以下、プラスミドｐSar６８と記すこともある。）。
プラスミドｐSar８を２種類の制限酵素（XhoＩ及びKpnＩ）を加えることにより、プラスミドｐSarAを２重消化させた。次いで得られたベクター部分のＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐSar６を２種類の制限酵素（XhoＩ及びKpnＩ）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたインサート部分のＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られた２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて改変型還元酵素の遺伝子を含有するプラスミドを取り出した（以下、プラスミドｐSar６８と記すこともある。）。
（７−３）ｐSar２６８の構築
プラスミドｐSar２を２種類の制限酵素（XhoＩ及びHindIIＩ）を加えることにより、プラスミドｐSarAを２重消化させた。次いで得られたベクター部分のＤＮＡ断片を精製した。
また、プラスミドｐSar６を２種類の制限酵素（XhoＩ及びKpnＩ）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたインサート部分のＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐSar８を２種類の制限酵素（KpnＩ及びHindIIＩ）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたインサート部分のＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られた３種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて改変型還元酵素の遺伝子を含有するプラスミドを取り出した（以下、プラスミドｐSar２６８と記すこともある。）。
プラスミドｐSar２を２種類の制限酵素（XhoＩ及びHindIIＩ）を加えることにより、プラスミドｐSarAを２重消化させた。次いで得られたベクター部分のＤＮＡ断片を精製した。
また、プラスミドｐSar６を２種類の制限酵素（XhoＩ及びKpnＩ）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたインサート部分のＤＮＡ断片を精製した。
一方、プラスミドｐSar８を２種類の制限酵素（KpnＩ及びHindIIＩ）を加えることにより、当該ベクターを２重消化させた。次いで消化されたインサート部分のＤＮＡ断片を精製した。
このようにして精製して得られた３種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coli ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて改変型還元酵素の遺伝子を含有するプラスミドを取り出した（以下、プラスミドｐSar２６８と記すこともある。）。
実施例８ （本発明還元酵素を用いた反応（その１））
実施例１及び実施例３から６で得られた１６種類の形質転換体を０．４ｍＭのIPTG、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、1％(w／v)のZnCl２、10g／LのBacto-tryptone(Difco)、5g／LのBacto−yeast extract(Difco)、10g／LのNaClを含有する滅菌培地（１ml）に接種し、これを３７℃で２２時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（２００００×ｇ、５分、4℃）することにより、沈澱として湿菌体を回収した。回収された湿菌体約10mｇに、ｍ−クロロフェナシルクロライド５ｍｇ、ＮＡＤ＋０．３３２ｍｇ及び５００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．０５ｍｌと、２−プロパノール０.０９７５ｍｌ及び水を含む反応液の０．５ｍｌとを混合した。これを３０℃で２２時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを１ｍｌ添加し、有機層を分取した。有機層はNa２CO３にて脱水処理を行なった。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析に供試した。プラスミドpEAR2(野生型)にて形質転換した形質転換大腸菌（JM109(pEAR2)）を用いて反応を行なった時のｍ−クロロフェナシルクロライド転化率を1として、各形質転換体の比活性を算出した。結果を表５に示す。
実施例１及び実施例３から６で得られた１６種類の形質転換体を０．４ｍＭのIPTG、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、1％(w／v)のZnCl２、10g／LのBacto-tryptone(Difco)、5g／LのBacto−yeast extract(Difco)、10g／LのNaClを含有する滅菌培地（１ml）に接種し、これを３７℃で２２時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（２００００×ｇ、５分、4℃）することにより、沈澱として湿菌体を回収した。回収された湿菌体約10mｇに、ｍ−クロロフェナシルクロライド５ｍｇ、ＮＡＤ＋０．３３２ｍｇ及び５００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．０５ｍｌと、２−プロパノール０.０９７５ｍｌ及び水を含む反応液の０．５ｍｌとを混合した。これを３０℃で２２時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを１ｍｌ添加し、有機層を分取した。有機層はNa２CO３にて脱水処理を行なった。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析に供試した。プラスミドpEAR2(野生型)にて形質転換した形質転換大腸菌（JM109(pEAR2)）を用いて反応を行なった時のｍ−クロロフェナシルクロライド転化率を1として、各形質転換体の比活性を算出した。結果を表５に示す。
（含量分析条件）
カラム：Chiralcel ＯＢ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
キャリアー溶媒：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９：１（ｖ／ｖ）
流速：０.８ml／分
検出器：UV２６８nm
カラム：Chiralcel ＯＢ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
キャリアー溶媒：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９：１（ｖ／ｖ）
流速：０.８ml／分
検出器：UV２６８nm
実施例９ （本発明還元酵素を用いた反応（その２））
実施例１及び実施例４から７で得られた９種類の形質転換体を０．４ｍＭのIPTG、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、1％(w／v)のZnCl２、10g／LのBacto-tryptone(Difco)、5g／LのBacto−yeast extract(Difco)、10g／LのNaClを含有する滅菌培地（１ml）に接種し、これを３７℃で２２時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（２００００×ｇ、５分、4℃）することにより、沈澱として湿菌体を回収した。回収された湿菌体約10mｇに、ｍ−クロロフェナシルクロライド５ｍｇ、ＮＡＤ＋０．３３２ｍｇ及び５００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．０５ｍｌと、２−プロパノール０．０９７５ｍｌ及び水を含む反応液の０．５ｍｌとを混合した。これを３０℃で２２時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを１ml添加し、有機層を分取した。有機層はNa２CO３にて脱水処理を行なった。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析に供試した。プラスミドpEAR2(野生型)にて形質転換した形質転換大腸菌（JM109(pEAR2)）を用いて反応を行なった時のｍ−クロロフェナシルクロライド転化率を1として、各形質転換体の比活性を算出した。結果を表６に示す。
実施例１及び実施例４から７で得られた９種類の形質転換体を０．４ｍＭのIPTG、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、1％(w／v)のZnCl２、10g／LのBacto-tryptone(Difco)、5g／LのBacto−yeast extract(Difco)、10g／LのNaClを含有する滅菌培地（１ml）に接種し、これを３７℃で２２時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（２００００×ｇ、５分、4℃）することにより、沈澱として湿菌体を回収した。回収された湿菌体約10mｇに、ｍ−クロロフェナシルクロライド５ｍｇ、ＮＡＤ＋０．３３２ｍｇ及び５００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．０５ｍｌと、２−プロパノール０．０９７５ｍｌ及び水を含む反応液の０．５ｍｌとを混合した。これを３０℃で２２時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを１ml添加し、有機層を分取した。有機層はNa２CO３にて脱水処理を行なった。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析に供試した。プラスミドpEAR2(野生型)にて形質転換した形質転換大腸菌（JM109(pEAR2)）を用いて反応を行なった時のｍ−クロロフェナシルクロライド転化率を1として、各形質転換体の比活性を算出した。結果を表６に示す。
（含量分析条件）
カラム：Chiralcel ＯＢ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
キャリアー溶媒：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９：１（ｖ/ｖ）
流速：０.８ml／分
検出器：UV２６８nm
カラム：Chiralcel ＯＢ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
キャリアー溶媒：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９：１（ｖ/ｖ）
流速：０.８ml／分
検出器：UV２６８nm
実施例１０ （本発明還元酵素を用いた反応（その３））
６種類の形質転換体（JM109(pUAR) 、JM109(pEAR1)、JM109(pEAR2)、JM109(pEAR2s)、JM109(pSarA)、JM109(pSar268)）を０．４ｍＭのIPTG)、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、1％(w／v)のZnCl２、10g／LのBacto−tryptone(Difco)、5g／LのBacto−yeast extract(Difco)、10g／LのNaClを含有する滅菌培地（１００ml）に接種し、これを３７℃で２２時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５分、4℃）することにより、沈澱として湿菌体を回収した。回収された湿菌体６０ｍｇに、ｍ−クロロフェナシルクロライド１００ｍｇ、ＮＡＤ＋０．６６４ｍｇ及び５００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．１ｍｌと、０．２ｍｌの２−プロパノール及び水を混合した溶液の０．９ｍｌとを混合した。これを３０℃で２２時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを一回につき０．５ml添加し、３回に分けて有機層を分取した。集めた有機層はNa２CO３にて脱水処理を行なった。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析に供試した。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析に供試した。各形質転換体を用いて反応を行なった時の液体クロマトグラフィーによる結果から１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールのエリア値／（ｍ−クロロフェナシルクロライドのエリア値＋１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールのエリア値）を算出した。結果を表７に示す。
６種類の形質転換体（JM109(pUAR) 、JM109(pEAR1)、JM109(pEAR2)、JM109(pEAR2s)、JM109(pSarA)、JM109(pSar268)）を０．４ｍＭのIPTG)、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、1％(w／v)のZnCl２、10g／LのBacto−tryptone(Difco)、5g／LのBacto−yeast extract(Difco)、10g／LのNaClを含有する滅菌培地（１００ml）に接種し、これを３７℃で２２時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５分、4℃）することにより、沈澱として湿菌体を回収した。回収された湿菌体６０ｍｇに、ｍ−クロロフェナシルクロライド１００ｍｇ、ＮＡＤ＋０．６６４ｍｇ及び５００ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）０．１ｍｌと、０．２ｍｌの２−プロパノール及び水を混合した溶液の０．９ｍｌとを混合した。これを３０℃で２２時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを一回につき０．５ml添加し、３回に分けて有機層を分取した。集めた有機層はNa２CO３にて脱水処理を行なった。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析に供試した。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析に供試した。各形質転換体を用いて反応を行なった時の液体クロマトグラフィーによる結果から１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールのエリア値／（ｍ−クロロフェナシルクロライドのエリア値＋１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールのエリア値）を算出した。結果を表７に示す。
（含量分析条件）
カラム：Chiralcel OB−H（ダイセル化学工業社製）
キャリアー溶媒：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９：１（ｖ/ｖ）
流速：０.８ml/分
検出器：UV２６８nm
カラム：Chiralcel OB−H（ダイセル化学工業社製）
キャリアー溶媒：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９：１（ｖ/ｖ）
流速：０.８ml/分
検出器：UV２６８nm
実施例１１ （本発明還元酵素の精製）
実施例８〜１０に記載された方法で培養を行った形質転換体１９種類を各々超音波破砕（２０ＫＨｚ、１５分、４℃）した後、遠心分離（１０００００xｇ、６０分、４℃）を行い、その上清を得る。得られた超遠心上清をイオン交換クロマトグラフィーカラム［DEAE-Sepharose CL-6B（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［カリウム−リン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）で平衡化したもの］に展着し、NaClを溶解したカリウム−リン酸バッファー（NaCｌ濃度０Ｍ→０．８Ｍの濃度勾配）を移動層として目的酵素を溶出する。溶出画分の酵素活性の測定はアセトフェノンを用いて行う。
具体的には、溶出画分を含む０．０１ｍｌの溶出液に、アセトフェノン（０．３６５ｍｇ／ｍｌ）及びＮＡＤH（０．５４３ｍｇ／ｍｌ）を溶解したリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．０）０．９９ｍｌを加え、２５℃で保温し、３４０ｎｍの吸光度の減少を測定する。還元酵素活性のある画分を集め、当該画分に硫酸アンモニウムをその濃度が１．８Ｍになるまで徐々に加える。これを疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム［Butyl-Toyopearl 650（東ソー社製）］［１．８Ｍ硫酸アンモニウムを含むカリウム−リン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、硫酸アンモニウムを溶解したカリウム−リン酸バッファー（硫酸アンモニウム濃度１．８Ｍ→０Ｍの濃度勾配）を移動層として目的酵素を溶出する。還元酵素活性のある画分を集め、当該画分に硫酸アンモニウムをその濃度が１．８Ｍになるまで徐々に加える。これを疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム［Phenyl-Toyopearl 650（東ソー社製）］［１．８Ｍ硫酸アンモニウムを含むカリウム−リン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、硫酸アンモニウムを溶解したカリウム−リン酸バッファー（硫酸アンモニウム濃度１．８Ｍ→０Ｍの濃度勾配）を移動層として目的酵素を溶出する。還元酵素活性のある画分を集め、当該画分をCellulofine GC-700mカラム（生化学工業社製）［０．１ＭNaClを含むカリウム−リン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、０．１ＭNaClを含むカリウム−リン酸バッファーを移動層として目的酵素を溶出する。還元酵素活性のある画分を集め、当該画分をCellulofine GC-2000sfカラム（生化学工業社製）［０．１ＭNaClを含むカリウム−リン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、０．１ＭNaClを含むカリウム−リン酸バッファーを移動層として目的酵素を溶出させる。還元酵素活性のある画分を集め、精製還元酵素を得る。
実施例８〜１０に記載された方法で培養を行った形質転換体１９種類を各々超音波破砕（２０ＫＨｚ、１５分、４℃）した後、遠心分離（１０００００xｇ、６０分、４℃）を行い、その上清を得る。得られた超遠心上清をイオン交換クロマトグラフィーカラム［DEAE-Sepharose CL-6B（アマシャムファルマシアバイオテク社製）］［カリウム−リン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）で平衡化したもの］に展着し、NaClを溶解したカリウム−リン酸バッファー（NaCｌ濃度０Ｍ→０．８Ｍの濃度勾配）を移動層として目的酵素を溶出する。溶出画分の酵素活性の測定はアセトフェノンを用いて行う。
具体的には、溶出画分を含む０．０１ｍｌの溶出液に、アセトフェノン（０．３６５ｍｇ／ｍｌ）及びＮＡＤH（０．５４３ｍｇ／ｍｌ）を溶解したリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．０）０．９９ｍｌを加え、２５℃で保温し、３４０ｎｍの吸光度の減少を測定する。還元酵素活性のある画分を集め、当該画分に硫酸アンモニウムをその濃度が１．８Ｍになるまで徐々に加える。これを疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム［Butyl-Toyopearl 650（東ソー社製）］［１．８Ｍ硫酸アンモニウムを含むカリウム−リン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、硫酸アンモニウムを溶解したカリウム−リン酸バッファー（硫酸アンモニウム濃度１．８Ｍ→０Ｍの濃度勾配）を移動層として目的酵素を溶出する。還元酵素活性のある画分を集め、当該画分に硫酸アンモニウムをその濃度が１．８Ｍになるまで徐々に加える。これを疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム［Phenyl-Toyopearl 650（東ソー社製）］［１．８Ｍ硫酸アンモニウムを含むカリウム−リン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、硫酸アンモニウムを溶解したカリウム−リン酸バッファー（硫酸アンモニウム濃度１．８Ｍ→０Ｍの濃度勾配）を移動層として目的酵素を溶出する。還元酵素活性のある画分を集め、当該画分をCellulofine GC-700mカラム（生化学工業社製）［０．１ＭNaClを含むカリウム−リン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、０．１ＭNaClを含むカリウム−リン酸バッファーを移動層として目的酵素を溶出する。還元酵素活性のある画分を集め、当該画分をCellulofine GC-2000sfカラム（生化学工業社製）［０．１ＭNaClを含むカリウム−リン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したもの］に展着し、０．１ＭNaClを含むカリウム−リン酸バッファーを移動層として目的酵素を溶出させる。還元酵素活性のある画分を集め、精製還元酵素を得る。
実施例１２ 本還元酵素遺伝子及び補酵素再生酵素遺伝子を含有するプラスミドの調製
（１２−１）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等を還元型に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を調製するための準備
フラスコにＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム）１００ｍｌを入れ、滅菌した。このようにして調製された培地に、Bacillus megaterium IFO12108株が前記組成の液体培地で予め培養された培養液０．３ｍｌを接種し、これを３０℃で１０時間振盪培養した。
培養後、得られた培養液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、菌体を回収した。回収された菌体を、５０ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３０ｍｌに懸濁し、この懸濁液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、洗浄菌体を得た。
このようにして得られた洗浄菌体からQiagen Genomic Tip (Qiagen社製)を用い、それに付属するマニュアルに記載される方法に従って染色体ＤＮＡを精製した。
（１２−１）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等を還元型に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を調製するための準備
フラスコにＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム）１００ｍｌを入れ、滅菌した。このようにして調製された培地に、Bacillus megaterium IFO12108株が前記組成の液体培地で予め培養された培養液０．３ｍｌを接種し、これを３０℃で１０時間振盪培養した。
培養後、得られた培養液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、菌体を回収した。回収された菌体を、５０ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３０ｍｌに懸濁し、この懸濁液を遠心分離（１５０００×ｇ、１５分、４℃）することにより、洗浄菌体を得た。
このようにして得られた洗浄菌体からQiagen Genomic Tip (Qiagen社製)を用い、それに付属するマニュアルに記載される方法に従って染色体ＤＮＡを精製した。
（１２−２）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド等を還元型に変換する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子の調製（プラスミドｐＳＤＧＤＨ１２の構築）
The Journal of Biological Chemistry Vol.264, No.11, 6381-6385(1989)に記載された公知のBacillus megaterium IWG3由来のグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列に基づいて、配列番号２４（５’−gatcatcata gcaggagtca t−３’）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２５（５’−gaattcaaca ccagtcagct c−３’）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを合成する。
配列番号２４（５’−gatcatcata gcaggagtca t−３’）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２５（５’−gaattcaaca ccagtcagct c−３’）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、前記（１２−１）で精製された染色体ＤＮＡを鋳型にして実施例１（１−２）に記載される反応液組成、反応条件でＰＣＲを行う。
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を、Invitrogen社製TOPOTMTA cloningキットを用いてｐCR2.1−TOPOベクターの既存「PCR Product挿入サイト」にライゲーションする。得られるライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換する。
得られる形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてグルコース脱水素酵素を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＳＤＧＤＨ１２と記すこともある。）を取り出す。
次に、取り出されるプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２を鋳型として、Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit（パーキンエルマー製）を用いたシークエンス反応を行った後、得られるＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー製）で解析することにより、所望の補酵素再生酵素遺伝子であることを確認する。
The Journal of Biological Chemistry Vol.264, No.11, 6381-6385(1989)に記載された公知のBacillus megaterium IWG3由来のグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列に基づいて、配列番号２４（５’−gatcatcata gcaggagtca t−３’）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２５（５’−gaattcaaca ccagtcagct c−３’）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを合成する。
配列番号２４（５’−gatcatcata gcaggagtca t−３’）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号２５（５’−gaattcaaca ccagtcagct c−３’）で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、前記（１２−１）で精製された染色体ＤＮＡを鋳型にして実施例１（１−２）に記載される反応液組成、反応条件でＰＣＲを行う。
ＰＣＲ反応液を精製して得られたＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を、Invitrogen社製TOPOTMTA cloningキットを用いてｐCR2.1−TOPOベクターの既存「PCR Product挿入サイト」にライゲーションする。得られるライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換する。
得られる形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてグルコース脱水素酵素を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐＳＤＧＤＨ１２と記すこともある。）を取り出す。
次に、取り出されるプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２を鋳型として、Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit（パーキンエルマー製）を用いたシークエンス反応を行った後、得られるＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー373A（パーキンエルマー製）で解析することにより、所望の補酵素再生酵素遺伝子であることを確認する。
（１２−３）本還元酵素遺伝子及び補酵素再生酵素遺伝子を含有するプラスミドの調製（プラスミドｐSarＳｂＧの構築）
（１２-２）で調製されたプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２に２種類の制限酵素（BamHIとXbaI）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させる。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製する。
一方、例えば実施例４で調製されるプラスミドｐSarAに２種類の制限酵素（BamHIとXbaI）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させる。次いで得られるＤＮＡ断片を精製する。
このようにして精製して得られる２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションする。得られるライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換する。
得られる形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて本還元酵素遺伝子及び補酵素再生遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐSarＳｂＧと記すこともある。）を取り出す。
（１２-２）で調製されたプラスミドｐＳＤＧＤＨ１２に２種類の制限酵素（BamHIとXbaI）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させる。次いで消化されたＤＮＡ断片を精製する。
一方、例えば実施例４で調製されるプラスミドｐSarAに２種類の制限酵素（BamHIとXbaI）を加えることにより、当該プラスミドを２重消化させる。次いで得られるＤＮＡ断片を精製する。
このようにして精製して得られる２種類のＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼでライゲーションする。得られるライゲーション液でE．coli DH5αを形質転換する。
得られる形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて本還元酵素遺伝子及び補酵素再生遺伝子を含有するプラスミド（以下、プラスミドｐSarＳｂＧと記すこともある。）を取り出す。
本発明によれば、ケトン化合物又はアルデヒド化合物からアルコールを製造するために優れた改変型還元酵素等が提供可能となる。
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配列番号３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
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配列番号５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
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配列番号８
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配列番号１４
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配列番号１５
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配列番号１６
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配列番号１７
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配列番号１８
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配列番号１９
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配列番号２０
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配列番号２１
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配列番号２２
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配列番号２４
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配列番号２５
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配列番号３
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Claims (30)
- 野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列において、（１）１２番目のアミノ酸がグリシンに、（２）２０番目のアミノ酸がアルギニンに、（３）４２番目のアミノ酸がバリンに、（４）６７番目のアミノ酸がアルギニンに、（５）１２５番目のアミノ酸がメチオニンに、（６）１６３番目のアミノ酸がアルギニンに、（７）１７３番目のアミノ酸がプロリンに、（８）２７５番目のアミノ酸がロイシンに、及び、（９）３２７番目のアミノ酸がバリンにそれぞれ置換されていること以外には配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、かつ、ｍ−クロロフェナシルクロライドを還元して１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールを生産する能力を少なくとも有することを特徴とする改変型還元酵素。
- ２０番目及び１６３番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする請求項１記載の改変型還元酵素。
- １６３番目及び２７５番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする請求項１記載の改変型還元酵素。
- ２０番目、１６３番目及び２７５番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする請求項１記載の改変型還元酵素。
- １２番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする請求項１記載の改変型還元酵素。
- ２０番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする請求項１記載の改変型還元酵素。
- ４２番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする請求項１記載の改変型還元酵素。
- ６７番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする請求項１記載の改変型還元酵素。
- １２５番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする請求項１記載の改変型還元酵素。
- １６３番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする請求項１記載の改変型還元酵素。
- １７３番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする請求項１記載の改変型還元酵素。
- ２７５番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする請求項１記載の改変型還元酵素。
- ３２７番目のアミノ酸が、野生型還元酵素が有する配列番号１で示されるアミノ酸配列における野生型アミノ酸に復帰してなることを特徴とする請求項１記載の改変型還元酵素。
- 請求項１乃至１３記載のいずれかの改変型還元酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
- 宿主細胞内において機能可能なプロモーターと請求項１４記載のポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなることを特徴とするポリヌクレオチド。
- 請求項１４記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
- 請求項１４若しくは１５記載のポリヌクレオチド又は請求項１６記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
- 宿主細胞が微生物であることを特徴とする請求項１７記載の形質転換体。
- 宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項１７記載の形質転換体。
- 請求項１４記載のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法。
- 請求項１６記載のベクターが、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とするベクター。
- 酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする請求項２１記載のベクター。
- 請求項１８乃至２０記載のいずれかの形質転換体が、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドをさらに保有することを特徴とする形質転換体。
- 請求項２１又は２２記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
- 宿主細胞が微生物であることを特徴とする請求項２４記載の形質転換体。
- 宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項２５記載の形質転換体。
- ケトン化合物又はアルデヒド化合物に、請求項１乃至１３記載のいずれかの改変型還元酵素、それを産生する微生物、請求項１７乃至１９記載のいずれかの形質転換体、請求項２３乃至２６記載のいずれかの形質転換体、又は、それらの処理物を作用させることを特徴とするアルコールの製造方法。
- ケトン化合物又はアルデヒド化合物がｍ−クロロフェナシルクロライドであり、アルコールが１−（３−クロロフェニル）−２−クロロエタノールであることを特徴とする請求項２７記載のアルコールの製造方法。
- 酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質を反応系内に共存させること特徴とする請求項２７又は２８記載のアルコールの製造方法。
- 酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを還元型に変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素であることを特徴とする請求項２９記載のアルコールの製造方法。
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