JP4745762B2 - 還元酵素及びその利用 - Google Patents
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Description
1. 配列番号1で示される野生型還元酵素のアミノ酸配列において、少なくとも下記a)からf)の6箇所のアミノ酸置換を有することを特徴とする改変型還元酵素(以下、本発明還元酵素と記すこともある)。
a)12番目のアミノ酸がグリシンに置換、
b)42番目のアミノ酸がロイシンもしくはイソロイシンに置換、
c)67番目のアミノ酸がアルギニンに置換、
d)125番目のアミノ酸がメチオニンに置換、
e)173番目のアミノ酸がプロリンに置換、
f)327番目のアミノ酸がバリンに置換、
2. さらにg)3番目のアミノ酸がセリンに置換され、かつh)4番目のアミノ酸がロイシンに置換されている請求項1に記載の改変型還元酵素、
3. C末端にさらにオリゴペプチドSer−Gly−His−His−His−His−His−Hisが付加されている前記第1または2項に記載の改変型還元酵素、
4. 前記1項乃至3項のいずれかに記載の改変型還元酵素が有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド(以下、本発明ポリヌクレオチドと記すこともある)、
5. 配列番号24で示される前記第4項に記載のポリヌクレオチド、
6. 配列番号25で示される前記第4項に記載のポリヌクレオチド、
7. 宿主細胞内において機能可能なプロモーターと前記4項乃至6項のいずれかに記載のポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなることを特徴とするポリヌクレオチド、
8. 前記4項乃至6項のいずれかに記載のポリヌクレオチドを有することを特徴とするベクター、
9. 配列番号26のヌクレオチド配列を有することを特徴とするpHAR1ベクター、
10. 配列番号27のヌクレオチド配列を有することを特徴とするpHAR2ベクター、
11. 前記4項乃至7項のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は前記8項乃至10項のいずれかに記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体、
12. 宿主細胞が微生物であることを特徴とする前記11項に記載の形質転換体、
13. 宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする前記12項に記載の形質転換体、
14. 前記4項乃至7項のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は前記8項乃至10項のいずれかに記載のベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法、
15. ケトン化合物又はアルデヒド化合物に、前記1項乃至3項のいずれかに記載の改変型還元酵素もしくはそれを産生する微生物、または前記9項乃至11項のいずれかに記載の形質転換体もしくはそれらの処理物を作用させることを特徴とするアルコール化合物の製造方法、
16. ケトン化合物がm−クロロフェナシルクロライドであり、アルコール化合物が1−(3−クロロフェニル)−2−クロロエタノールであることを特徴とする前記15項に記載のアルコールの製造方法、
17. ケトン化合物が4−クロロ−3−オキソ酪酸エステルであり、アルコール化合物が4−クロロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルであることを特徴とする前記15項に記載のアルコール化合物の製造方法、
18. ケトン化合物がN−Boc−ピロリジノンであり、アルコールがN−Boc−ピロリジノールであることを特徴とする前記15項に記載のアルコール化合物の製造方法、等を提供するものである。
1.コロニー形態(30℃、48時間)
(1)細胞形態:かん菌、0.6×1.0〜2.0μm
(2)グラム染色性:陽性
(3)胞子の有無:無
(4)運動性の有無:有
2.Nutrient Agar上でのコロニー形態
コロニーの色:黄色
コロニーの形状:円形
コロニーの周縁:全縁滑らか
コロニーの隆起:低凸状
3.生理学的性質
カタラーゼ:陽性
オキシダーゼ:陰性
OFテスト:陽性/陰性
4.16SリボゾームRNAをコードするDNAの塩基配列
ロドコッカス エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)ST-10株からPCRにより16SリボゾームDNAの塩基配列約500bpを増幅し、塩基配列を解析した。得られた16SリボゾームDNAの塩基配列を使って、BLASTによる相同性検索を行った結果、相同率99.6%で、ロドコッカス エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)基準株の16SリボゾームDNAに対し、最も高い相同性を示した。
本発明ポリヌクレオチドは、天然に存在する改変型遺伝子であってもよく、又は天然の野生型遺伝子に変異を導入(部位特異的変異導入法、突然変異処理等)することにより作出された改変型遺伝子であってもよい。上記のような改変型遺伝子及び野生型遺伝子を検索する場合には、例えば、m−クロロフェナシルクロライドを還元して1−(3−クロロフェニル)−2−クロロエタノールを生産する能力を有する微生物を対象にすればよく、例えば、ロドコッカス(Rhodococcus)属(好ましくは、ロドコッカス エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis))に属する微生物をその対象として挙げることができる。
450〜900mMの塩化ナトリウム及び45〜90mMのクエン酸ナトリウムを含みドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を0.1〜1.0重量%の濃度で含み、変性した非特異的DNAを0〜200μl/mlの濃度で含み、場合によってはアルブミン、フィコール、ポリビニルピロリドン等をそれぞれ0〜0.2重量%の濃度で含んでいてもよいプレハイブリダイゼーション液(好ましくは900mMの塩化ナトリウム、90mMのクエン酸ナトリウム、1.0重量%のSDS及び100μl/mlの変性Calf-thymusDNAを含むプレハイブリダイゼーション液)を上記のようにして作製したメンブレン1cm2当たり50〜200μlの割合で準備し、当該プレハイブリダイゼーション液に前記メンブレンを浸して42〜65℃で1〜4時間保温する。
ケトン化合物又はアルデヒド化合物としては、例えば、プロピオンアルデヒド、n−ブチルアルデヒド、n−バレルアルデヒド、n−ヘキシルアルデヒド、n−ペプチルアルデヒド、n−デシルアルデヒド、2−オキソプロピオンアルデヒド、トランス−シンナムアルデヒド、4−ブロモベンズアルデヒド、2−ニトロベンズアルデヒド、3−ニトロベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、4−クロロベンズアルデヒド、2−ペンタノン、2−ヘキサノン、2−ヘプタノン、2−オクタノン、2−ノナノン、3−ペンタノン、3−クロロ−2−ブタノン、tert−ブチルアセトアセテート、4−ヒドロキシ−2−ブタノン、ヒドロキシアセトン、1,1−ジクロロアセトン、クロロアセトン、ジヒドロキシアセトン、1,1−ジクロロアセトン、メチル 3−オキソブタノエート、エチル 3−オキサブタノネート、エチル 4−クロロアセトアセテート、メチル 4−ブロモー3−オキサブタノエート、エチル 4−ブロモ−3−オキサブタノエート、N−tert−ブトキシカルボニル−3−ピロリジノン、イソプロピル 4−シアノ−3−オキソブタノエート、エチル 4−シアノ−3−オキソブタノエート、メチル 4−シアノ−3−オキソブタノエート、メチル 3−オキソペンタノエート、m−クロロフェナシルクロライド、アセトフェノン、2’−ブロモアセトフェノン、3’−ブロモアセトフェノン、4’−ブロモアセトフェノン、2−クロロアセトフェノン、3’−クロロアセトフェノン、4’−クロロアセトフェノン、ベンジルアセトン、1−フェニル−2−ブタノン、m−メトキシアセトフェノン、3,4−ジメトキシアセトフェノン、4’−メトキシアセトフェノン、2,3’−ジクロロアセトフェノン、3,4−ジメトキシフェニルアセトン、シクロペンタノン、N−ベンジルピロリジノン、N−Boc−ピロリジノン、4−アセチル安息香酸、D-(+)-グルコース等が挙げられる。
本発明の改変還元酵素は、例えば、20%(v/v)の2−プロパノールの存在下において30℃で22時間での還元反応を行った場合の還元酵素活性が、同様に還元反応を行った場合の野生型還元酵素の還元酵素活性よりも高く、有機溶媒耐性に優れる。
反応時間は適宜選択することができるが、通常、0.5時間から10日間の範囲である。
例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィー、蒸留等を組み合わせて、行うことにより精製する方法が挙げられる。
(1−1)プラスミドpEAR1の調製
配列番号3(PAR207F:(5’−AAGAATTCAAGGAGATAAGGCCATGAAGGCCATCCAGTAC −3’)で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号4(PAR207R:5’−TTTCTGCAGGCCTCACAGGCCAGGGACCACAACCGC −3’)で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、例えば、Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52:386−392等に記載される公知のプラスミドであるpUAR(野生型還元酵素の遺伝子を保有するプラスミド、受託番号FERM P−18127)を鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でPCRを行った。
pUAR:5ng
dNTP:各0.2mM-mix
プライマー:各300nM
KOD−Plus−buffer:5μl
MgSO4:1mM
KOD−Plus−DNAポリメラーゼ:1U
計50μl
上記組成の反応液が入った容器をPTC-200 Thermal Cycler (MJリサーチ)にセットし、94℃(2分間)に加熱した後、94℃(0.25分間)-55℃(0.5分間)-68℃(2分間)のサイクルを30回行なった。
配列番号3(PAR207F:5’−AAGAATTCAAGGAGATAAGGCCATGAAGGCCATCCAGTAC −3’)で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号5(PAR207RH:3’−TTTCTGCAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCGGACAGGCCAGGGACCACAACCGC−5’)で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、pUAR(受託番号FERM P−18127)を鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でPCRを行った。
pEAR1:1ng
dNTP:各0.2mM−mix
プライマー:各500nM
ExTaq−buffer:5μl
ExTaq−DNAポリメラーゼ(宝酒造社製):5U
計100μl
上記組成の反応液が入った容器をPTC-200 Thermal Cycler (MJリサーチ)にセットし、94℃(5分間)に加熱した後、94℃(0.5分間)−55℃(0.5分間)−72℃(1分間)のサイクルを30回行った。
プラスミドpEAR2に制限酵素(EcoT14I)を加えることにより、当該DNA断片を消化させた。次いで得られたDNA断片を精製した。
配列番号6(RV-M:5’−GAGCGGATAACAATTTCACACAGG −3’)(宝酒造社製)で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号7(M13-47:5’−CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC −3’)(宝酒造社製)で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、pEAR2を鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でPCRを行った。
pEAR1:1ng
dATP:0.2mM
dTTP:1mM
dGTP:0.2mM
dCTP:1mM
プライマー:各30pmol
MgCl2:7mM
MnCl2 :0.5mM
KCl:50mM
Tris−HCl buffer (pH8.3):10mM
Gelatin:0.01%(w/v)
Taq−DNAポリメラーゼ(ロシュ・ダイアグノスティックス):5U
計100μl
上記組成の反応液が入った容器をPTC-200 Thermal Cycler (MJリサーチ)にセットし、94℃(1分間)-45℃(1分間)-72℃(1分間)のサイクルを30回行なった。
(3−1) 有機溶媒耐性(20%イソプロパノール中で活性を示す)を有する形質転換大腸菌の一次選抜
実施例2で得られた形質転換体を0.4mMのisopropyl−β−D−thiogalactopyranoside(IPTG)、100μg/mlのアンピシリン、0.01%(w/v)のZnCl2、10g/LのBacto-tryptone(Difco)、5g/LのBacto−yeast extract(Difco)、10g/LのNaCl及び15g/Lのアガロースを含有する滅菌寒天培地に接種し、これを30℃で24時間培養した。培養後、得られたコロニーをナイロン膜(BiodyneA, 日本ポール社製)に転写した後、そのナイロン膜を1mMのNAD+、200μMのnitroblue tetrazolium、10μMの1−methoxy−5−methylphenazinium methylsulfate(同仁化学研究所社製)及び20%(v/v)の2-プロパノールを含む50mMの3−(N−morpholino)propanesulfonic acid(MOPS)バッファー中に室温で30分間浸した。その後、ナイロン膜を蒸留水で洗浄し、染色されたコロニー320種を選抜した。選抜された320のコロニー、プラスミドpEAR2にて形質転換されたJM109形質転換大腸菌(JM109(pEAR2))、そして、プラスミドpEAR2sにて形質転換されたJM109形質転換大腸菌(JM109(pEAR2s))を、100μg/mlのアンピシリンを含有する滅菌LB培地(1%トリプトン、0.5%酵母エキス、1%塩化ナトリウム)(100μl)に接種し、これを37℃で18時間振盪培養した。
(3−1)で一次選抜された320種の選抜コロニーのうち、40コロニーを0.4mMのIPTG)、100μg/mlのアンピシリン、0.01%(w/v)のZnCl2、10g/LのBacto‐tryptone(Difco)、5g/LのBacto−yeast extract(Difco)、10g/LのNaClを含有する滅菌培地(1ml)に接種し、これを37℃で22時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離(20000×g、5分、4℃)することにより、沈殿として湿菌体を回収した。回収された湿菌体に、最終濃度1mMとなるNAD+を含む最終濃度50mMとなるMOPSバッファー0.4mlを加えた。次に、5%(w/v)のm−クロロフェナシルクロライドを含む2−プロパノール0.1mlを加えた。これを30℃で22時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを1ml添加し、有機層を分取した。有機層はNa2SO4にて脱水処理を行った。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析に供試した。このような分析を160種の一次選抜された全てのコロニーについて行った結果、クローンC38、C12、H23、E9を見出した。
カラム:Chiralcel OB−H(ダイセル化学工業社製)
キャリアー溶媒:n−ヘキサン/2−プロパノール=9:1(v/v)
流速:0.8ml/分
検出器:UV268nm
(4−1) ライゲーションによる改変型遺伝子の作製
実施例3(3−2)で二次選抜されたクローンC38、C12、H23、E9をそれぞれ100μg/mlのアンピシリンを含有する滅菌LB培地(4ml)に接種し、これを37℃で22時間振盪培養した。培養後、得られたクローンC38、C12、H23、E9からそれぞれQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いてプラスミドを取り出した。クローンH23のプラスミドを精製した後、2種類の制限酵素(AccIとHindIII)を加えることにより、当該プラスミドを2重消化させた。次いで消化されたDNA断片を精製し3384bpのDNA断片を得た。クローンC38のプラスミドを精製した後、2種類の制限酵素(AccIとKpnI)を加えることにより、当該プラスミドを2重消化させた。次いで消化されたDNA断片を精製し280bpのDNA断片を得た。クローンE9のプラスミドを精製した後、2種類の制限酵素(KpnIとHindIII)を加えることにより、当該プラスミドを2重消化させた。次いで消化されたDNA断片を精製し550bpのDNA断片を得た。このようにして精製して得られた3種類のDNA断片を混合し、T4 DNAリガーゼでライゲーションした。得られたライゲーション液でE.coliJM109株を形質転換した。得られた形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用い、野生型還元酵素の遺伝子に変異が導入されたプラスミド(以下、プラスミドpSarPと記すこともある。)を取り出した。
配列番号8(PARSQ-R1:5’−CATTAGGCACCCCAGGCTTTACAC−3’)で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号13(PAR-A125T-comp:5’−CTCATGATGAAGACGTCCGAGTGGC −3’)で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、pSarPを鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でPCRを行った。また、配列番号14(PAR-T373A-sens:5’−GCACCCGGCGCGATGGCCGAGTTCA−3’)で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号15(PAR-T517C-comp:5’−CAACCGCGTACGGGCCTCCGCGAAG−3’)で示されるオリゴヌクレオチドとをプライマーに用いて、pSarPを鋳型にして下記の反応液組成及び反応条件でPCRを行った。
pSarP:5ng
dNTP:各0.2mM−mix
プライマー:各300nM
KOD−Plus−buffer:5μl
MgSO4:1mM
KOD−Plus−DNAポリメラーゼ:1U
計50μl
上記組成の反応液が入った容器をPTC−200 Thermal Cycler (MJリサーチ)にセットし、94℃(2分間)に加熱した後、94℃(0.25分間)−55℃(0.5分間)−68℃(2分間)のサイクルを30回行なった。
pSarP:5ng
dNTP:各0.2mM−mix
プライマー:各300nM
KOD−Plus−buffer:5μl
MgSO4:1mM
KOD−Plus−DNAポリメラーゼ:1U
計50μl
上記組成の反応液が入った容器をPTC−200 Thermal Cycler (MJリサーチ)にセットし、94℃(2分間)に加熱した後、94℃(0.25分間)−55℃(0.5分間)−68℃(2分間)のサイクルを30回行なった。
pSarA:5ng
dNTP:各0.2mM−mix
プライマー:各300nM
KOD−Plus−buffer:5μl
MgSO4:1mM
KOD−Plus−DNAポリメラーゼ:1U
計50μl
上記組成の反応液が入った容器をPTC−200 Thermal Cycler (MJリサーチ)にセットし、94℃(2分間)に加熱した後、94℃(0.25分間)−55℃(0.5分間)−68℃(2分間)のサイクルを30回行った。
pSarA:5ng
dNTP:各0.2mM−mix
プライマー:各300nM
KOD−Plus−buffer:5μl
MgSO4:1mM
KOD−Plus−DNAポリメラーゼ:1U
計50μl
上記組成の反応液が入った容器をPTC−200 Thermal Cycler (MJリサーチ)にセットし、94℃(2分間)に加熱した後、94℃(0.25分間)−55℃(0.5分間)−68℃(2分間)のサイクルを30回行なった。
プラスミドpSar2を2種類の制限酵素(XhoI及びHindIII)を加えることにより、プラスミドpSarAを2重消化させた。次いで得られたベクター部分のDNA断片を精製した。
配列番号19(SatSar3: 5'-CTGCCACTCGGACNNKTTCATCATGAGC-3')もしくは配列番号20(SatSar3-2: 5'-CTGCCACTCGGACMHYTTCATCATGAGC-3')で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号12(PARSQ-F3: 5'-GCACCGAGACCGGGAGGATTG-3')で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、プラスミドpSar268を鋳型にして以下の反応液組成及び反応条件で第1PCRを行った。
pSar268:5ng
dNTP:各0.2mM−mix
プライマー:各300nM
KOD−Plus−buffer:5μl
MgSO4:1mM
KOD−Plus−DNAポリメラーゼ:1U
計50μl
上記組成の反応液が入った容器をPTC−200 Thermal Cycler (MJリサーチ)にセットし、94℃(2分間)に加熱した後、94℃(0.25分間)−58℃(0.5分間)−68℃(0.5分間)のサイクルを30回繰り返し、65℃(5分間)ののち、4℃で保温した。
pSar268:5ng
dNTP:各0.2mM−mix
プライマー:各300nM
KOD−Plus−buffer:5μl
MgSO4:1mM
KOD−Plus−DNAポリメラーゼ:1U
計50μl
上記組成の反応液が入った容器をPTC−200 Thermal Cycler (MJリサーチ)にセットし、94℃(2分間)に加熱した後、94℃(0.25分間)−58℃(0.5分間)−68℃(0.5分間)のサイクルを30回繰り返し、65℃(5分間)ののち、4℃で保温した。
なお、プラスミドに挿入されたDNA断片の塩基配列の解析は、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)を用いて各プラスミドを鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたDNAの塩基配列をABI PRISM 310 Genetic Analyserで解析することにより行った。
実施例8で得られた形質転換体の中から50クローンを選抜し、さらに、プラスミドpSar268またはpRAE2sでE.coli JM109株を形質転換したおのおの8クローンずつの形質転換体、合計66クローンを0.4mMのIPTG、100μg/mlのアンピシリン、0.01%(w/v)のZnCl2、10g/LのBacto-tryptone(Difco)、5g/LのBacto−yeast extract(Difco)、10g/LのNaClを含有する滅菌培地(1ml)に接種し、これを37℃で22時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離(20000×g、5分、4℃)することにより、沈澱として湿菌体を回収した。回収された湿菌体約10mgに、17.4%(v/v)の2−プロパノール、4%(w/v)のm−クロロフェナシルクロライド、1mMのNAD+含む50mM MOPS緩衝液(pH7.0)0.5mlを添加した。これを30℃で22時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを1ml添加し、有機層を分取した。有機層はNa2SO4にて脱水処理を行なった。当該有機層を下記条件でガスクロマトグラフィーによる含量分析に供試した。(R)- 1−(3−クロロフェニル)−2−クロロエタノールとm−クロロフェナシルクロライドの合計ピーク面積に対する(R)- 1−(3−クロロフェニル)−2−クロロエタノールのピーク面積の割合を変換率として算出した。結果を表4に示す。このような分析を66種のクローンについて行った結果、42番目のアミノ酸がロイシンまたはイソロイシンに置換された変異体が有意に高い変換能を持つことを見出した。得られた42番目のアミノ酸がロイシンまたはイソロイシンに置換された変異型Sar268を有する形質転換体からQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen社製)を用いて改変型還元酵素の遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれ取り出した(以下、プラスミドpSar268V42L、またはプラスミドpSar268V42Iと記すこともある。)。
カラム:CP-cyclodextrine-β-236 M-19, 0.25mm by 25m
カラム温度:160℃
インジェクション温度:240℃
ディテクション温度:250℃
キャリアーガス:ヘリウム(流量:0.4ml/min)
検出器:FID
改変型還元酵素をコードする遺伝子の5’末端配列と開始コドン前の16残基を特定の遺伝子配列に置換したベクターを構築するため、配列番号21(PARHE-S:5'-ATGAAATCATTACAATATACGAGAATCGGCGCG-3')で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号22(PARHE-A:5'-ATGAGACTCTCCAGTCAAATTGTTATCCGCTCAC-3')で示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをT4 polynucleotide kinase(New England Biolabs)にてリン酸化した後、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、プラスミドpSar268、pSar268V42L、またはpSar268V42Iを鋳型にして以下の反応液組成及び反応条件でPCRを行った。
テンプレートDNA:5ng
dNTP:各0.2mM−mix
プライマー:各300nM
KOD−Plus−buffer:5μl
MgSO4:1mM
KOD−Plus−DNAポリメラーゼ:1U
計50μl
上記組成の反応液が入った容器をPTC−200 Thermal Cycler (MJリサーチ)にセットし、94℃(2分間)に加熱した後、94℃(0.25分間)−58℃(0.5分間)−68℃(4分間)のサイクルを30回繰り返し、65℃(5分間)ののち、4℃で保温した。
なお、プラスミドに挿入されたDNA断片の塩基配列の解析は、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)を用いて各プラスミドを鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたDNAの塩基配列をABI PRISM 310 Genetic Analyserで解析することにより行った。
実施例7、10で得られた4種類の形質転換体を0.4mMのIPTG、100μg/mlのアンピシリン、0.01%(w/v)のZnCl2、10g/LのBacto-tryptone(Difco)、5g/LのBacto−yeast extract(Difco)、10g/LのNaClを含有する滅菌培地(1ml)に接種し、これを37℃で22時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離(20000×g、5分、4℃)することにより、沈澱として湿菌体を回収した。回収された湿菌体約10mgに、21.8%(v/v)の2−プロパノール、5%(w/v)のm−クロロフェナシルクロライド、1mMのNAD+含む50mM MOPS緩衝液(pH7.0)0.5mlを添加した。これを30℃で22時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを1ml添加し、有機層を分取した。有機層はNa2SO4にて脱水処理を行なった。当該有機層を下記条件でガスクロマトグラフィーによる含量分析に供試した。(R)- 1−(3−クロロフェニル)−2−クロロエタノールとm−クロロフェナシルクロライドの合計ピーク面積に対する(R)- 1−(3−クロロフェニル)−2−クロロエタノールのピーク面積の割合を変換率として算出した。結果を表5に示す。
カラム:CP-cyclodextrine-β-236 M-19, 0.25mm by 25m
カラム温度:160℃
インジェクション温度:240℃
ディテクション温度:250℃
キャリアーガス:ヘリウム(流量:0.4ml/min)
検出器:FID
2種類の形質転換体(JM109(pHAR1) 、JM109(pSar268))を0.4mMのIPTG、100μg/mlのアンピシリン、0.01%(w/v)のZnCl2、10g/LのBacto−tryptone(Difco)、5g/LのBacto−yeast extract(Difco)、10g/LのNaClを含有する滅菌培地(100ml)に接種し、これを37℃で22時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離(5000×g、15分、4℃)することにより、沈澱として湿菌体を回収した。回収された湿菌体30mgに、20%(v/v)の2−プロパノール、1mMのNAD+を含む50mM MOPS緩衝液(pH7.0)0.5mlを添加したものに、m−クロロフェナシルクロライドを100、125、150、175、または、200mg添加した。これを30℃で22時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを1ml添加し、有機層を分取した。有機層はNa2SO4にて脱水処理を行なった。当該有機層を下記条件でガスクロマトグラフィーによる含量分析に供試した。(R)- 1−(3−クロロフェニル)−2−クロロエタノールとm−クロロフェナシルクロライドの合計ピーク面積に対する(R)- 1−(3−クロロフェニル)−2−クロロエタノールのピーク面積の割合を変換率として算出した。結果を表6に示す。また、いずれの反応条件でも1−(3−クロロフェニル)−2−クロロエタノールの光学純度は99%e.e.(R)以上であった。
カラム:CP-cyclodextrine-β-236 M-19, 0.25mm by 25m
カラム温度:160℃
インジェクション温度:240℃
ディテクション温度:250℃
キャリアーガス:ヘリウム(流量:0.4ml/min)
検出器:FID
保持時間:m−クロロフェナシルクロライド; 8.5分
(S)- 1−(3−クロロフェニル)−2−クロロエタノール;12.7分
(R)- 1−(3−クロロフェニル)−2−クロロエタノール;13.1分
2種類の形質転換体(JM109(pHAR1) 、JM109(pSar268))を0.4mMのIPTG、100μg/mlのアンピシリン、1%(w/v)のZnCl2、10g/LのBacto−tryptone(Difco)、5g/LのBacto−yeast extract(Difco)、10g/LのNaClを含有する滅菌培地(100ml)に接種し、これを37℃で22時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離(5000×g、15分、4℃)することにより、沈澱として湿菌体を回収した。回収された湿菌体30mgに、20%(v/v)の2−プロパノール、1mMのNAD+を含む50mM MOPS緩衝液(pH7.0)0.25mlを添加したものに、さらに50、75、87.5、または、100μlの4−クロロ−3−オキソ酪酸エチルとn−オクタンを合計0.25mlとなるよう添加した。これを30℃で22時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを1ml添加し、有機層を分取した。有機層はNa2SO4にて脱水処理を行なった。当該有機層を下記条件でガスクロマトグラフィーによる含量分析に、液体クロマトグラフィーによる光学異性体分析に供試した。各形質転換体を用いて反応を行なった時のガスクロマトグラフィーによる結果から4−クロロ−3−オキソ酪酸エチルのモル変換率を算出した。結果を表7に示す。また、いずれの反応条件でも4−クロロ−3−ヒドロキシ酪酸エチルの光学純度は99%e.e.(R)以上であった。
カラム:CP-cyclodextrine-β-236 M-19, 0.25mm by 25m
カラム温度:120℃
インジェクション温度:240℃
ディテクション温度:250℃
キャリアーガス:ヘリウム(流量:0.4ml/min)
検出器:FID
保持時間:4−クロロ−3−オキソ酪酸エチル; 6.0分
4−クロロ−3−ヒドロキシ酪酸エチル;8.4分
カラム:Chiralcel OB−H(ダイセル化学工業社製)
キャリアー溶媒:n−ヘキサン/2−プロパノール=9:1(v/v)
流速:1.0ml/分
カラム温度:30℃
検出器:UV220nm
保持時間:4−クロロ−3−オキソ酪酸エチル;11.6分
(R)- 4−クロロ−3−ヒドロキシ酪酸エチル;7.7分
(S)- 4−クロロ−3−ヒドロキシ酪酸エチル;8.3分
2種類の形質転換体(JM109(pHAR1) 、JM109(pSar268))を0.4mMのIPTG、100μg/mlのアンピシリン、1%(w/v)のZnCl2、10g/LのBacto−tryptone(Difco)、5g/LのBacto−yeast extract(Difco)、10g/LのNaClを含有する滅菌培地(100ml)に接種し、これを37℃で22時間培養した。培養後、得られた培養液を遠心分離(5000×g、15分、4℃)することにより、沈澱として湿菌体を回収した。回収された湿菌体30mgに、20%(v/v)の2−プロパノール、1mMのNAD+を含む50mM MOPS緩衝液(pH7.0)0.5mlを添加したものに、さらに50、75、100、または125mgのN-Boc-ピロリジノンを添加した。これを30℃で22時間反応させた。反応終了後、酢酸エチルを1ml添加し、有機層を分取した。有機層はNa2SO4にて脱水処理を行なった。当該有機層を下記条件で、液体クロマトグラフィーによる含量分析に供試した。各形質転換体を用いて反応を行なった時の液体クロマトグラフィーによる結果からN-Boc-ピロリジノンのモル変換率を算出した。結果を表8に示す。また、いずれの反応条件でもN-Boc-ピロリジノールの光学純度は99%e.e.(S)以上であった。
カラム:Chiralcel OB−H(ダイセル化学工業社製)
キャリアー溶媒:n−ヘキサン/2−プロパノール=4:1(v/v)
流速:0.5ml/分
カラム温度:40℃
検出器:UV220nm
保持時間:N-Boc-ピロリジノン;20.1分
(R)- N-Boc-ピロリジノール;13.4分
(S)- N-Boc-ピロリジノール;11.9分
実施例8、10に記載された方法で培養を行った形質転換体5種類を各々超音波破砕(20KHz、15分、4℃)した後、遠心分離(100000xg、60分、4℃)を行い、その上清を得る。得られた超遠心上清をイオン交換クロマトグラフィーカラム[DEAE-Sepharose CL-6B(アマシャムファルマシアバイオテク社製)][カリウム−リン酸バッファー(20mM、pH7.5)で平衡化したもの]に展着し、NaClを溶解したカリウム−リン酸バッファー(NaCl濃度0M→0.8Mの濃度勾配)を移動層として目的酵素を溶出する。溶出画分の酵素活性の測定はアセトフェノンを用いて行う。
配列番号1
野生型還元酵素のアミノ酸配列
配列番号2
野生型還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNA
配列番号3
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号4
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号5
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号6
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号7
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号8
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号9
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号10
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号11
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号12
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号13
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号14
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号15
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号16
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号17
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号18
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号19
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号20
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号21
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号22
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号23
変異型還元酵素のアミノ酸配列
配列番号24
変異型還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNA
配列番号25
変異型還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNA
配列番号26
変異型還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNA
配列番号27
変異型還元酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNA
Claims (17)
- 配列番号1で示される野生型還元酵素のアミノ酸配列において、少なくとも下記a)からf)の6箇所のアミノ酸置換を有することを特徴とする改変型還元酵素。
a)12番目のアミノ酸がグリシンに置換、
b)42番目のアミノ酸がロイシンもしくはイソロイシンに置換、
c)67番目のアミノ酸がアルギニンに置換、
d)125番目のアミノ酸がメチオニンに置換、
e)173番目のアミノ酸がプロリンに置換、
f)327番目のアミノ酸がバリンに置換。 - さらにg)3番目のアミノ酸がセリンに置換され、かつh)4番目のアミノ酸がロイシンに置換されている請求項1に記載の改変型還元酵素。
- C末端にさらにオリゴペプチドSer−Gly−His−His−His−His−His−Hisが付加されている請求項1または2に記載の改変型還元酵素。
- 請求項1乃至3のいずれかに記載の改変型還元酵素が有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号24のポリヌクレオチドを有する請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号25のポリヌクレオチドを有する請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- 宿主細胞内において機能可能なプロモーターと請求項4乃至6のいずれかに記載のポリヌクレオチドとが機能可能な形で接続されてなることを特徴とするポリヌクレオチド。
- 請求項4乃至6のいずれかに記載のポリヌクレオチドを有することを特徴とするベクター。
- 配列番号26のヌクレオチド配列を有することを特徴とするpHAR1ベクター。
- 配列番号27のヌクレオチド配列を有することを特徴とするpHAR2ベクター。
- 請求項4乃至7のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は請求項8乃至10のいずれかに記載のベクターが宿主細胞に導入されてなることを特徴とする形質転換体。
- 宿主細胞が微生物であることを特徴とする請求項11に記載の形質転換体。
- 宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項12に記載の形質転換体。
- 請求項4乃至7のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は請求項8乃至10のいずれかに記載のベクターを宿主細胞に導入する工程を含むことを特徴とする形質転換体の製造方法。
- m−クロロフェナシルクロライドに、請求項1乃至3のいずれかに記載の改変型還元酵素もしくはそれを産生する微生物、または請求項11乃至13のいずれかに記載の形質転換体もしくはそれらの処理物を作用させることを特徴とする1−(3−クロロフェニル)−2−クロロエタノールの製造方法。
- 4−クロロ−3−オキソ酪酸エステルに、請求項1乃至3のいずれかに記載の改変型還元酵素もしくはそれを産生する微生物、または請求項11乃至13のいずれかに記載の形質転換体もしくはそれらの処理物を作用させることを特徴とする4−クロロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルの製造方法。
- N−Boc−ピロリジノンに、請求項1乃至3のいずれかに記載の改変型還元酵素もしくはそれを産生する微生物、または請求項11乃至13のいずれかに記載の形質転換体もしくはそれらの処理物を作用させることを特徴とするN−Boc−ピロリジノールの製造方法。
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