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Die
Nutzung von biokatalytischen Prozessen für die enantioselektive
Herstellung von chiralen Alkoholen ist seit dem Einsatz leicht verfügbarer
Biokatalysatoren wie der Bäckerhefe und Enzymen wie Lipasen
bekannt. In den letzen 20 Jahren wurden eine Vielzahl von Enzymen
und Mikroorganismen auf Ihre Möglichkeit zur Reduktion
von prochiralen Verbindungen getestet. Trotz erfolgreicher Verfahrensentwicklungen
bestehen meist zwei entscheidende Probleme, die stabile Enantioselektivität
mit einem Enantiomerenüberschuss (ee.) von > 99% und die hohen
Kosten durch geringe Ausbeute, hohe Nebenkosten (z. B. Cofaktoren)
und hohe Aufarbeitungskosten.
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Die
Reduktion von prochiralen Verbindungen zu chiralen Alkoholen ist
biokatalytisch sowohl als enzymatische als auch als Ganzzellkatalyse
möglich. Während bei der enzymatischen Reduktion
hohe Kosten durch Enzyme, Cofaktoren und Cofaktorregenerierung auftreten,
ist bei der Ganzzellkatalyse die Enantioselektivität und
die Toleranz gegenüber höheren Edukt-Konzentrationen
problematisch. Bei schwer wasserlöslichen hydrophoben Substanzen
ist es deshalb technisch schwer möglich Biotransformationen
in wirtschaftlich sinnvollen Konzentrationen durchzuführen.
Deshalb wurden Biotransformationen für diese Substanzen
in 2-Phasensystemen und Membransystemen durchgeführt. Beim
Einsatz dieser Systeme in Ganzzellkatalysen ist jedoch die Inaktivierung
von Mikroorganismen an der Phasengrenze und die Stabilität
der Membran ein Problem.
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In
den letzten Jahren gab es ebenfalls verschiedene Arbeiten zur Nutzung
von Adsorbermaterialien als Speicher für Edukte und zur
Verringerung der Edukt- und Produktkonzentration im Ansatz. Diese
Adsorbermaterialien binden mit unterschiedlicher Selektivität
die organischen Edukte und Produkte wodurch in der wässrigen
Phase mit dem Biokatalysator nur geringe Konzentrationen vorliegen.
So wurde von Fantoni, Servi u. a. das Adsorbermaterial Amberlite
XAD 1180 für die Biotransformation verschiedener Substanzen
mit Bäckerhefe genutzt (Tetrahedron 54 (1998) 15017–15026).
Von Rodrigues et al. wurde Amberlite XAD 7 als Eduktspeicher für
die asymmetrische Reduktion mit Pichia stipitis verwendet (Tetrahedron
Asymmetry 14 (2003) 43–45). Ebenso wurden Untersuchungen
zum Einsatz von Adsorbermaterialien in biokatalytischen Ganzzell-Umsetzungen
zur Edukt und Produktspeicherung gemacht wobei der Adsorber direkt
im Reaktionsansatz eingesetzt wurde (Vicenzi et al., Enz.
Microbial. Technol. 20, 494 (1997); Vicenzi, J.
T., Zmijewski, M. J., Reinhard, M. R., Landen, B. E., Muth, W. L.,
Marler, P. G. (1997) Enzyme Microb. Technol. 20, 494–499).
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Der
Einsatz von Lactobacillen zur Reduktion von prochiralen Ketonen
ist bereits seit den Arbeiten von Aragozzini zu Biotransformationen
und Hummel zur Enzymisolierung einer Dehydrogenase bekannt. Problematisch
ist jedoch die ungenügende Stabilität und der
abnehmende Umsatz und Enantioselektivität der Zellen gegenüber
höheren Edukt- und Produktkonzentrationen. Deshalb werden
bisher auch hauptsächlich die isolierten Enzyme zur Biotransformation
genutzt. (
Hummel, W. und Riebel, B. (2000): „Alcohol
dehydrogenase and its use for the enzymatic production of chiral
hydroxy compounds", United States Patent
US6037158 ). Es wurden auch
Arbeiten mit Lactobacillen als Ganzzellbiokatalysator zur Reduktion
von Diketonen zu Diolen durchgeführt (
EP 1067195 A2 ). Dabei wurden
jedoch keine Adsorbermaterialien als Eduktspeicher eingesetzt.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur technischen
Nutzung von Mikroorganismen als Ganzzellbiokatalysatoren mit einem
Anlagenkonzept zur technischen Umsetzung zu entwickeln.
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Die
Lösung der Aufgabe erfolgt mit einem Verfahren zur biokatalytischen
Reduktion von schwer wasserlöslichen hydrophoben prochiralen
Ketonen der allgemeinen Formel
wobei die Substituenten R1
und R2 ausgewählt sind aus der Gruppe der Alkyl-, Alkenyl-,
Cycloalkyl-, Cycloalkenyl-, Aryl-, Aralkyl- und Cycloalkylalkyl-Reste,
die Reste R1 und R2 gleich- oder verschiedenartig sind und durch
Halogenierungen Nitro- und Aminogruppen substituiert sind, mittels
Mikroorganismen zu chiralen Alkoholen, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass die prochiralen Ketone an Adsorbermaterialien fixiert,
von dort mittels eines wässrigen Mediums gelöst,
in einen Reaktionsraum transportiert und in Gegenwart von zur Reduktion
befähigten Mikroorganismen zu chiralen Alkoholen umgesetzt
werden.
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Die
erfindungsgemäße Anordnung zur biokatalytischen
Reduktion von schwer wasserlöslichen hydrophoben prochiralen
Ketonen mittels Mikroorganismen ist gekennzeichnet durch einen Bioreaktor,
eine separat angeordnete Adsorbersäule sowie einen Zellrückhaltefilter,
wobei der Bioreaktor, die Adsorbersäule und der Zellrückhaltefilter
mittels Rohrleitungen so miteinander verbunden sind, dass ein wässriges
Reaktionsmedium im Kreislauf führbar ist.
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Eine
Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist dadurch gekennzeichnet, dass nach der Umsetzung das wässrige
Medium von den Mikroorganismen abgetrennt, zur Adsorption der Produkte
erneut am Adsorbermaterial vorbeigeführt und wieder dem
Reaktionsraum zugeführt wird.
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In
einer Weiterbildung wird das wässrige Medium im Kreislauf
geführt.
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Eine
Ausgestaltung des Verfahrens sieht vor, dass nach Ende der Reduktion
des prochiralen Ketons der chirale Alkohol mit Lösungsmitteln
aus dem Adsorbermaterial extrahiert wird.
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In
einer vorteilhaften Weiterbildung des Verfahrens werden zur Reduktion
befähigte Mikroorganismen ausgewählt aus Hefen
und Bakterien oder Lactobacillus-Kulturen eingesetzt.
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Eine
Ausgestaltung des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die
Konzentration der prochiralen Ketone zwischen 1 und 200 g/l eingestellt
wird.
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In
einer vorteilhaften Weiterbildung wird die Konzentration der prochiralen
Ketone zwischen 5 und 50 g/l, insbesondere zwischen 10 und 30 g/l
eingestellt.
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In
einer Weiterbildung wird durch Veränderung der Durchflussgeschwindigkeit
im Kreislauf die Ketonmenge im Reaktionsraum variiert.
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Die
Weiterbildung der erfindungsgemäßen Anordnung
ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Lösungsmittelspeicher
mit der Adsorbersäule verbunden ist.
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In
einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung ist ein
Produktablauf mit der Adsorbersäule verbunden.
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Dazu
wurde ein Bioreaktor mit einem externen Umlaufsystem und einem durchspülbaren
Adsorberspeicher gekoppelt. Die Mikroorganismen werden durch eine
Cross-Flow-Filtration nach dem Reaktor zurückgehalten.
Adsorbermaterialien werden als Speicher für hydrophobe
Substanzen bei der extraktiven Ganzzellbiokatalyse in Wasser im
Adsorberspeicher eingesetzt. Über den Umlauf wird abgestimmt
auf die Umsetzungskinetik kontinuierlich Edukt dem Reaktor zugeführt
und Produkt zum Adsorbermaterialspeicher zurückgeführt. Durch
die spezifische Einstellung der Substanz-Adsorberverhältnisse
auf die optimalen Biokatalysebedingungen konnte ein präparatives
Verfahren zur Herstellung von chiralen Alkoholen durch Lactobazillen
entwickelt werden, mit denen Substanzen wie (R)-1-Phenylethanol
und (R)-2-Octanol mit Umsätzen > 99% und Enantiomerenüberschüssen
von > 99% hergestellt
werden. Das Anlagenkonzept ist dabei auf andere Ganzzellbiotransformationen übertragbar.
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Dabei
werden aromatische und aliphatische organische Verbindungen der
allgemeinen Formel (I) als einzusetzende Substanzen verwendet,
wobei die Substituenten R1,
R2 ausgewählt sind aus der Gruppe der Alkyl-, Alkenyl-,
Cycloalkyl-, Cycloalkenyl-, Aryl-, Aralkyl- und Cycloalkylalkyl-Reste.
Die Reste R1 und R2 können dabei gleich- oder verschiedenartig sein.
Diese Substanzen können durch Halogenierungen, Nitro- und
Aminogruppen an den Resten R1 und R2 substituiert sein.
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Die
Erfindung wird anhand der Beispiele und Figuren näher erläutert.
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Es
zeigen
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1 Adsorption
von Acetophenon mit XAD-2, 4, 7, 16 und 1180 nach 1 h,
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2 Vergleich
verschiedener Adsorbermaterialien bei der Adsorption von Acetophenon,
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3 Endumsetzung
zu (R)-1-Phenylethanol vs. Start-Acetophenon-Konzentration,
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4 Umsatz-
und ee-Abhängigkeit von der Adsorbermenge [20 g/l Acetophenon],
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5 Reaktorkonzept
für die Umsetzung mit Mikroorganismen und Adsorbermaterialien
mit integrierter Produktgewinnung,
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6 Umsetzung
im Reaktor mit 25g/l Acetophenon und L. kefiri,
und
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7 Reduktion
von 2-Oktanon zu (R)-2-Oktanol mit Lactobacillus kefiri.
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Beispiele
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Beispiel 1: Einsatz verschiedener Adsorbermaterialien
zur Adsorption von hydrophoben organischen Substanzen am Beispiel
von Acetophenon
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Für
eine optimale Auswahl von Adsorbermaterialien für die Speicherung
des Edukts müssen verschiedene Materialien in ihrem Adsorptionsvermögen
gestestet werden. Dazu müssen die Adsorptionskinetik, die Adsorptionskapazität
und die optimalen Edukt/Adsorberverhältnisse bestimmt werden.
Zur Bestimmung dieser Kenngrößen für
Acetophenon mit verschiedenen Adsorbern wurden folgende Ansätze
gemacht:
| Acetophenon | 5
g/l in Wasser |
| Adsorbermaterial | 0
bis 100 g/l |
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Es
wurden als Adsorber polymere Adsorber-Harze mit unterschiedlichen
Porositäten, Partikelgrößen und Porenweiten
getestet. Dabei wurden Materialien der Firma „Rohm und
Haas”, Philadelphia, USA (Amberlite, XAD), der Firma Purolite, Philadelphia,
USA (Macronet, MN) und der Firma DOW Chemical, Midland, Michigan
(DOWEX).
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Die
Ansätze wurden zur Bestimmung der Adsorptionskinetik nach
5, 10, 15, 30, 45 und 60 Minuten bemessen. Es zeigte sich bereits
nach 15 Minuten eine Gleichgewichtseinstellung und keine weitere Änderung bis
zu 60 Minuten. Für die weiteren Untersuchungen wurde mit
einer 60 Minuten Bestimmung gearbeitet.
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Der
nächste Schritt war die Ermittlung optimaler Edukt/Adsorberverhältnisse.
Bei einer festen Acetophenon-Konzentration von 5 g/l wurde die Adsorberkonzentration
von 0 bis 100 g/l variiert. In 1 ist die
Ermittlung optimaler Edukt-Adsorberverhältnisse für
5 Adsorbermaterialien graphisch aufgetragen.
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Es
zeigt sich deutlich die unterschiedlich starke Adsorption von Acetophenon
aus dem Wasser und die damit verbundene Adsorberkapazität
und Gleichgewichtseinstellung.
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In 2 ist
ein Vergleich verschiedener Adsorbermaterialien bei der Adsorption
von Acetophenon bei einer Adsorberkonzentration von 20 g/l dargestellt.
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Man
kann die starken Unterschiede in der Adsorption von Acetophenon
bei einheitlichen Bedingungen erkennen. Der Rest-Acetophenon-Anteil
reicht von 60% für XAD 2 bis zu nur 11% für XAD
4. Diese Auswahl des Adsorbermaterials ist für jede Substanz
spezifisch und muss vor der Nutzung in Biotransformationsansätzen
ermittelt werden.
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Beispiel 2: Kultivierung von Lactobacillus-Kulturen
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Für
die Kultivierung der Lactobacillen wird das Medium 11: MRS MEDIUM
(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen,
www.dsmz.de)
eingesetzt. Die Zusammensetzung ist wie folgt:
| Casein
peptone, tryptic digest | 10.00
g |
| Meat
extract | 10.00
g |
| Yeast
extract | 5.00
g |
| Glucose | 20.00
g |
| Tween
80 | 1.00
g |
| K2HPO4 | 2.00
g |
| Na-acetate | 5.00
g |
| (NH4)2 citrate | 2.00
g |
| MgSO4 × 7 H2O | 0.20
g |
| MnSO4 × H2O | 0.05
g |
| Distilled
water | 1000.00
ml |
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Das
Medium wird nach Lösung der Bestandteile auf einen pH von
6,2–6,5 eingestellt.
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Die
Vorkultur wird bei 30°C nach dem sterilen Animpfen mit
einer Impföse von der Platte für 48 h bis zu einer
Optischen Dichte bei 600 nm von 2–4 kultiviert. Danach
können die Hauptkulturen mit 10% (v/v) mit der Vorkultur
beimpft werden und für 24 h bei 30°C anaerob wachsen.
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Beispiel 3: Umsetzung von Acetophenon
zu (R)-1-Phenylethanol ohne Adsorbermaterialien
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Bei
der biokatalytischen Reduktion von hydrophoben prochiralen Ketonen
treten bei steigenden Eduktkonzentrationen oft sinkende Enantioselektivitäten
und Gesamtumsätze auf. Dabei liegt die Ursache nicht bei der
unzureichenden katalytischen Aktivität der Mikroorganismen,
sondern oft bei der zellschädigenden Wirkung der hydrophoben
prochiralen Ketone. Im Folgenden ist die Reduktion von Acetophenon
zu (R)-1-Phenylethanol mit Lactobacillus kefiri mit verschiedenen
Acetophenon-Startkonzentrationen dargestellt. Ansatz:
| | |
| Lactobacillus
kefiri Kultur | 48
h, 10 ml |
| Acetophenon | 0,25,
0,5; 0,75; 1,0% (v/v) |
| Glucose | 20
g/l |
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Die
Probenahme erfolgte nach 24 und 48 h Versuchslaufzeit. Die Analytik
erfolgte nach Extraktion mit Essigsäureethylester mittels
Gaschromatographie. Es wurde eine Säule vom Typ β-DEX
225 mit 30 m Länge und 0,25 mm Innendurchmesser (Fa. Supelco)
eingesetzt. Als Trägergas wurde Helium verwendet. Die Einstellungen
an der GC waren: Injektortemperatur: 230°C; FID: 230°C;
Injektionsvolumen 1 μl; Säulentemperatur 120°C.
In 3 ist die Endumsetzung zu (R)-1-Phenylethanol
nach 48 h gegen die Start-Acetophenon-Konzentration aufgetragen.
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Es
zeigte sich eine starke Abnahme der Produktumsetzung mit steigenden
Eduktkonzentrationen. Obwohl eine Reduktion von Acetophenon zu (R)-1-Phenylethanol
mit Lactobacillus kefiri in niedrigen Konzentrationen gut funktioniert,
nimmt sowohl Umsatz als auch die Enantioselektivität mit
steigender Acetophenonkonzentration stark ab. Somit ist eine Nutzung
für eine Produktion mit Mengen von > 5 g/l nicht wirtschaftlich möglich.
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Beispiel 4: Umsetzung von Acetophenon
zu (R)-1-Phenylethanol mit Adsorbermaterialien
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Die
Verwendung der Lactobacillenkultur für die präparative
Reduktion hydrophober Substanzen ist wie in Beispiel 3 dargestellt
wenig erfolgreich. Deshalb wurden erfindungsgemäß Adsorbermaterialien
in verschiedenen Konzentrationen eingesetzt um die Umsetzung und
den Enantiomerenüberschuss des Produkts zu verbessern.
Die Adsorbermaterialien können im Biotransformationsmedium
suspendiert oder in einem externen Austauscher, der mit Biotransformationsmedium
durchströmt wird, befindlich sein. Getestet wurden verschiedene
Hefen und Bakterien in diesem System. So wurden Mikroorganismen
der Gattungen Lactobacillus, Pichia, Candida, Saccharomyces, Kluyveromyces
und Yarrowia. In 4 ist ein Beispiel für
die Abhängigkeit von Umsatz und ee. von der XAD-Konzentration
mit Acetophenon als Edukt und Lactobacillus kefiri als Ganzzellbiokatalysator
dargestellt.
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Die
Versuche mit einer Eduktkonzentration von 20 g/l Acetophenon und
Adsorberkonzentrationen von 40 bis 200 g/l zeigen eine deutliche
Steigerung bei Umsatz und Enantiomerenüberschuss (ee) durch
den Einsatz von Adsorbern. Bei einem Einsatz von 200 g Adsorber
in der Adsorbersäule mit 20 g Acetophenon und einem Liter
Reaktorvolumen mit Mikroorganismen wurde eine Umsetzung von > 90% und eine Enantioselektivität > 99% erreicht.
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Beispiel 5: Umsetzung von Acetophenon
zu (R)-1-Phenyethanol im Reaktor
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Der
Ansatz zur Ganzzell-Biotransfomation von Acetophenon zu (R)-1-Phenyethanol
mit Lactobacillus kefiri im Reaktorsystem mit Adsorbermaterialien
wurde wie folgt zusammengestellt:
| Lactobacillus
kefiri Kultur | 24
h, 2 Liter in gerührtem anaeroben Bioreaktor |
| Acetophenon | 50
g in 250 g XAD4 in 500 ml Phosphatpuffer pH 6,5 |
| Glucose | 50
g/l |
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Die
Lactobacillus kefiri Kultur wurde in dem Bioreaktor gezüchtet,
nach einem Wachstum von 24 h wurde der Umlauf durch die Säule
mit dem Adsorbermaterial (XAD4) und dem Acetophenon zugeschaltet.
Der Verlauf der Umsetzung ist in 6 dargestellt.
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Der
Durchfluss im Reaktionskreislauf wurde so gewählt, dass
eine homogene Durchmischung von Bioreaktor und Adsorbersäule
gewährleistet wird. Das zeigt sich auch an den nahezu gleichen
Analysenergebnissen in 6 bei Bioreaktor und Adsorber-Ablauf.
Im Reaktionsverlauf ergab sich eine vollständige Umsetzung
nach 140 Stunden Versuchslaufzeit.
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Beispiel 6: Umsetzung von 2-Oktanon zu
(R)-2-Oktanol im Reaktor
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Der
Ansatz zur Ganzzell-Biotransfomation von 2-Oktanon zu (R)-2-Oktanol
mit Lactobacillus kefiri im Reaktorsystem mit Adsorbermaterialien
wurde wie folgt zusammengestellt:
| Lactobacilus
kefiri Kultur | 24
h, 1,5 Liter in gerührtem anaeroben Bioreaktor |
| 2-Oktanon | 40
g in 200 g XAD4 in 500 ml Phosphatpuffer pH 6,5 |
| Glucose | 100
g |
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Die
Lactobacillus kefiri Kultur wurde in dem Bioreaktor gezüchtet,
nach einem Wachstum von 24 h wurde der Umlauf durch die Säule
mit dem Adsorbermaterial (XAD4) und dem 2-Oktanon zugeschaltet.
Der Verlauf der Umsetzung ist in 7 dargestellt.
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Der
Durchfluss im Reaktionskreislauf wurde in diesem Beispiel so gewählt,
dass weniger Ausgangsmaterial in den Bioreaktor nachgeliefert wurde,
als umgesetzt wurde. Dadurch war der Produktgehalt im Bioreaktor
höher als in der Adsorbersäule. Durch diese Verfahrensvariante
kann eine Dosierung der Ausgangsstoffzugabe entsprechend zur Produktumsetzung
eingestellt werden. Es zeigte sich auch in Verbindung mit 2-Octanon
eine gute Nutzbarkeit des Systems mit Adsorbermaterial und Lactobacillus
kefiri.
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Beispiel 7:
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In 5 wird
eine Anordnung zur biokatalytischen Reduktion von schwer wasserlöslichen
hydrophoben prochiralen Ketonen mittels Mikroorganismen schematisch
dargestellt. Dieses Reaktorkonzept für die Umsetzung mit
Mikroorganismen und Adsorbermaterialien mit integrierter Produktgewinnung
wurde insbesondere für die technische Umsetzung von hydrophoben
zellschädigenden Edukten entwickelt, womit die Kopplung
eines Bioreaktors 01 und einer Adsorbersäule 02 in
separater Anordnung mit einer nachfolgenden integrierten Produktgewinnung
(Produktablauf 06) ermöglicht wird. Nach dem Beladen
der Adsorbersäule 02 mit dem umzusetzenden Edukt,
in diesem Falle die prochiralen Ketone, wird das die Mikroorganismen
enthaltende Reaktionsmedium über Rohrleitungen 07 im
Kreislauf gepumpt. Ein Zellrückhaltefilter 03 sorgt
dafür, dass die ganzzelligen Mikroorganismen im Bioreaktor 01 verbleiben,
während das wässrige Reaktionsmedium in die Adsorbersäule 02 geleitet
wird und von dort ein Teil des Eduktes löst und über
die Rohrleitung 07 dem Bioreaktor 01 zuführt,
so dass im Bioreaktor 01 dann die Reduktion des Eduktes
stattfinden kann. Der im Ergebnis der Reduktion entstehende Alkohol
wird in der Adsorbersäule 02 fixiert. Das wässrige
Reaktionsmedium wird solange im Kreislauf geführt, bis
die Reduktion des Eduktes im Wesentlichen abgeschlossen ist. Aus
einem Lösungsmittelspeicher 04 wird Lösungsmittel
durch die Adsorbersäule 02 geleitet, um das Reaktionsprodukt über
einen Produktablauf 06 abzuziehen. Ventile 05 dienen
der Umschaltung auf den Extraktionszyklus der Reaktionsprodukte.
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- 01
- Bioreaktor
- 02
- Adsorbersäule
- 03
- Zellrückhaltefilter
- 04
- Lösungsmittelspeicher
- 05
- Ventile
- 06
- Produktablauf
- 07
- Rohrleitung
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - US 6037158 [0004]
- - EP 1067195 A2 [0004]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Tetrahedron
54 (1998) 15017–15026 [0003]
- - Tetrahedron Asymmetry 14 (2003) 43–45 [0003]
- - Vicenzi et al., Enz. Microbial. Technol. 20, 494 (1997) [0003]
- - Vicenzi, J. T., Zmijewski, M. J., Reinhard, M. R., Landen,
B. E., Muth, W. L., Marler, P. G. (1997) Enzyme Microb. Technol.
20, 494–499 [0003]
- - Hummel, W. und Riebel, B. (2000): „Alcohol dehydrogenase
and its use for the enzymatic production of chiral hydroxy compounds” [0004]
- - www.dsmz.de [0035]
