KR101880651B1 - 에탄올 및 아세트알데히드 분해능을 가진 미생물, 그를 포함하는 조성물 및 키트 - Google Patents
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Abstract
에탄올 및 아세트알데히드 분해능을 가진 미생물, 그를 포함하는 조성물 및 키트를 제공한다.
Description
에탄올 및 아세트알데히드 분해능을 가진 미생물, 그를 포함하는 조성물 및 키트에 관한 것이다.
락토바실러스(lactobacillus)는 그람-양성, 기회성 혐기성(facultative anaerobic) 또는 미세호기성(microaerophilic), 간상, 비포자형성 박테리아의 속이다. 락토바실러스는 유산균(lactic acid bacter: LAB) 그룹의 주요 부분을 차지한다.
사람이 섭취한 알코올은 위와 소장의 상부에서 확산 작용에 의해 쉽게 흡수된다. 알코올 대사는 주로 간 조직에서 일어나는데, 알코올이 알코올 데히드로게나제(alcohol dehydrogenase: ADH)에 의해 아세트알데히드로 산화되고, 아세트알데히드는 알데히드 데히드로게나제(aldehyde dehydrogenase: ALDH)에 의해 아세트산으로 전환된다.
알코올 산화에 의해 생성되는 대사 산물인 아세트알데히드는 반응성이 강한 독성물질이다. 아세트알데히드는 간에서 다양한 단백질과 공유 결합하여 간 기능 및 구조를 변경시킨다. 튜불린과의 결합을 통하여, 미크로튜불의 중합화를 감소시켜 단백질 분비에 손상을 초래하여 간세포(hepatocyte)가 부어 오르게 한다. 아세트알데히드 부가물(adduct) 형성은 일부 효소 활성을 손상시킨다. 직접적으로 또는 GSH와의 결합을 통하여, 아세트알데히드는 지질 과산화(lipid peroxidation)를 유리하게 한다. 아세트알데히드는, 특히 아세트알데히드의 독성 효과에 대하여 미토콘드리아를 민감하게 하는 만성 에탄올 소비 후, 다양한 미토콘드리아 기능을 변경시킨다. 배양된 근섬유아세포에서, 아세트알데히드는 콜라겐 생산을 자극한다. 이는 만성적인 알코올 섭취자에 있어 간 섬유화의 원인이 되는 것으로 보고되고 있다. 또한, 만성적인 알코올 섭취는 지방간, 알코올성 간염, 및 간경변 등을 발생시킬 수 있다. 상기 아세트알데히드-단백질 부가물은 아세트알데히드 에피토프에 대한 항체의 생산을 자극한다. 이 면역반응은 알코올-유도된 간 손상의 악화 또는 영속화에 기여한다. 또한, 아세트알데히드는 숙취(hangover)를 야기한다.
그러나, 상기한 선행기술에 의하더라도 알코올 및 아세트알데히드 분해활성을 가진 락토바실러스 속 박테리아에 대한 요구가 존재한다.
일 양상은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) LMT1-73 (수탁번호 KCTC-13412BP) 및 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) LMT2-75 (수탁번호 KCTC-13413BP)로 이루어진 군으로부터 선택된 에탄올 및 아세트알데히드 분해능을 가진 미생물을 제공한다.
다른 양상은 상기 미생물 또는 그 파쇄물(lysate)을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 미생물 및 희석제 또는 담체를 포함하는 시료 중 에탄올 및 아세트알데히드 중 하나 이상을 제거하는 데 사용하기 위한 키트를 제공한다.
일 양상은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) LMT1-73 (수탁번호 KCTC-13412BP) 및 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) LMT2-75 (수탁번호 KCTC-13413BP)로 이루어진 군으로부터 선택된 에탄올 및 아세트알데히드 분해능을 가진 미생물을 제공한다.
상기 미생물은 에탄올 내성, 에탄올 및/또는 아세트알데히드 분해능이 우수할 뿐만 아니라, 내산성, 내담즙산성, 및 장내 정착성이 우수하다. 상기 미생물은 김치로부터 분리되었다.
다른 양상은 상기 미생물 또는 그 파쇄물(lysate)을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 식품적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다. 상기 희석제는 물, 배지 또는 PBS와 같은 버퍼일 수 있다. 상기 담체는 통상적인 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 증점제, 또는 충진제일 수 있다. 상기 희석제 또는 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제를 포함할 수 있다.
상기 조성물은 시료 중 에탄올 및 아세트알데히드 중 하나 이상을 제거하는 데 사용하기 위한 것일 수 있다. 용어 "제거"는 시료 중 에탄올 및 아세트알데히드 중 하나 이상의 농도를 감소시키는 것으로서, 완전히 제거하는 것을 포함한다. 상기 시료는 체액인 것일 수 있다. 상기 시료는 장내 액체, 또는 혈액일 수 있다. 상기 장내 액체는 위액, 십이지장액, 소장액, 또는 대장액일 수 있다.
상기 조성물은 경구 투여 제형일 수 있다. 상기 조성물은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 또는 건조시럽제일 수 있다. 상기 조성물은 예를 들면, 상기 미생물을 배지 중에 배양하여 얻어진 배양물, 또는 그의 건조물일 수 있다.
상기 조성물은 식품일 수 있다. 상기 식품은 유제품, 알코올성 간질환 예방용 또는 숙취해소용 식품, 또는 식품 첨가제일 수 있다. 상기 유제품은 발효유, 버터, 치즈, 또는 분유일 수 있다. 상기 식품은 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 건강기능식품은 알코올성 간질환 예방용 또는 숙취해소용 건강기능식품일 수 있다. 상기 식품은 또한 음료류, 과자류, 다이어트바, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류일 수 있다.
상기 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다.
식품제조에 사용되는 탄수화물은 모노사카리드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카리드, 예를 들어 말토스, 수크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카리드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알콜일 수 있다. 또한 향미제로서 천연 향미제 및 사카린 및 아스파르탐과 같은 합성 향미제를 사용할 수 있다. 천연 향미제는 타우마틴, 레바우디오시드 A, 및 글리시르히진과 같은 스테비아 추출물일 수 있다.
건강기능식품은 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미한다.
상기 조성물에 있어서, 상기 미생물은 조성물 중량에 대하여 0.01 내지 50 중량 %, 또는 0.1 내지 20 중량 %의 범위일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 조성물 중량 기준으로 105 내지 1x109 CFU/g, 또는 1x105 내지 1x108 CFU/g의 세포를 포함할 수 있다.
다른 양상은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) LMT1-73 (수탁번호 KCTC-13412BP) 및 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) LMT2-75 (수탁번호 KCTC-13413BP)로 이루어진 군으로부터 선택된 에탄올 및 아세트알데히드 분해능을 가진 미생물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체 중 에탄올 및 아세트알데히드 중 하나 이상을 제거하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 에탄올 및/또는 아세트알데히드의 체내 축적과 연관된 질환을 예방 또는 치료하는 것일 수 있다. 상기 질환은 알코올성 간질환 예방용 또는 숙취일 수 있다. 상기 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 또는 사람을 제외한 포유동물일 수 있다.
다른 양상은 상기 미생물 및 희석제 또는 담체를 포함하는 시료 중 에탄올 및 아세트알데히드 중 하나 이상을 제거하는 데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 상기 미생물과 희석제 또는 담체 별도로 제공되는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 미생물, 그를 포함하는 조성물 및 키트는 시료 중 에탄올 및 아세트알데히드 중 하나 이상을 제거하는데 사용될 수 있다.
도 1은 선발된 균주가 장 상피세포에 부착하는 정도를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 알코올 및 아세트알데히드 분해능을 가진 미생물의 분리 및 동정
본 실시예에서는 김치로부터 알코올 및 아세트알데히드 분해능이 우수한 미생물을 분리하고 동정하였다. 그 결과, 이 미생물은 혈중 알코올 및 아세트알데히드 분해능이 우수하고, 내산성, 내답즙성, 및 장정착성이 우수하여 장내에서 안정성이 우수하였다.
1. 균주의 분리 및 동정
(1) 균주의 분리
4 ℃에 보관된 가정에서 직접 담군 김치를 무균적으로 20 g 취하여 0.85 % NaCl 용액 180 ml 중에 희석하고, 스토마터(stomacher)로 5 분간 균질화하였다. 균질화된 김치를 멸균된 0.85 % NaCl 용액 9 ml이 담긴 튜브에 단계적으로 희석하여 김치 시료를 준비하였다. 김치 시료를 MRS 배지(Difco, USA) 아가 평판 배지에 도말하여 37 ℃에서 2 내지 3일간 배양하였고 나타난 콜로니들을 형태 및 색깔 별로 구별하여 다시 순수 분리하였다. 분리된 콜로니를 pH 6.8의 MRS 액체 배지에서 37 ℃, 24 시간 배양하면서 배양액의 pH가 4.5 이하로 감소하는 콜로니 230종을 선별하였다. 선별된 균주에 대하여 알코올 내성, 알코올 및 아세트알데히드 분해능에 대하여 시험하여 최종적으로 알코올 및 아세트알데히드 분해능 및 장내 안정성이 우수한 2개 균주 즉, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) LMT1-73 (수탁번호 KCTC-13412BP), 및 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) LMT2-75 (수탁번호 KCTC-13413BP)를 선발하였다.
(2) 인 비트로 알코올 내성의 확인
(2.1) 알코올에 대한 내성 검사
분리된 230종 균주를 다른 농도의 에탄올을 포함하는 배지에서 배양하여 알코올에 대한 내성을 확인하였다.
구체적으로, MRS 액체 배지에 에탄올을 5 %, 10 %, 15 %, 및 20 %가 되게 첨가하여 최종 10 ml을 멤브레인 필터 (membrane filter)로 제균하여 배지로 사용하였다. MRS 액체 배지에서 활성화된 230 종 균주 각각을 107 CFU/ml의 양으로 첨가하고 37 ℃에서 정치 배양하여 수행하였다. 균주의 생장 정도는 OD600 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다. 측정은 배양 전 및 배양 후 4 시간에 측정하였다. 표 1은 선발된 2개 균주의 에탄올 내성을 나타낸다.
| 번호 | 균주 | 알코올 농도(v/v %) | |||
| 5 | 10 | 15 | 20 | ||
| 1 | LMT1-73 | +++ | +++ | ++ | ++ |
| 2 | LMT2-75 | +++ | +++ | +++ | +++ |
표 1에서, +, ++ 및 +++는 각각 에탄올과 동량의 D.W를 첨가하여 배양한 대조군과 비교하였을 때, 80 % 이상, 90 % 이상 및 100 % 세포가 생장한 것을 나타낸다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) LMT2-75 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) LMT1-73는 20 % 알코올을 포함하는 MRS 액체 배지에서도 높은 생장을 보였다.
(2.2) 알코올 내성 비교
(2.1)에서 알코올 내성이 높은 것으로 확인된 2 개 균주의 알코올 내성을 동일 종의 다른 균주와 알코올 내성을 비교하였다. 비교 균주로서 타입 균주(type strain)인 락토바실러스 브레비스 KCTC3498T 및 락토바실러스 퍼멘텀 KCTC3112T를 사용하였으며, 이들을 KCTC로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
알코올 내성 실험은 하기 표 2에 나타낸 바와 같은 비교 균주를 사용한 것을 제외하고 (2.1)에 기재된 바와 동일하게 수행하였다. 표 2는 균주 간 알코올 내성 실험 결과를 나타낸 것이다.
| 번호 | 종 | 균주(strain) | 알코올 농도(v/v %) | |||
| 5 | 10 | 15 | 20 | |||
| 1 | L.brevis | LMT1-73 | +++ | +++ | ++ | ++ |
| 2 | KCTC3498T | ++ | + | + | ++ | |
| 3 | L.fermentum | LMT2-75 | +++ | +++ | +++ | +++ |
| 4 | KCTC3112T | ++ | ++ | + | + | |
표 2에서, +, ++ 및 +++는 표 1에 나타낸 바와 같으며, -는 세포가 성장하지 않는 것을 나타낸다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 선발된 2 개 균주는 같은 종의 비교 균주에 비하여 알코올 내성이 우수하였다.
(3) 인 비트로 알코올 및 아세트알데히드 분해능의 확인
(3.1) 에탄올 분해능의 확인
분리된 2개 균주 LMT1-73 및 LMT2-75를 MRS 액체 배지에서 37 ℃에서 18 시간 배양하여, 세포 농도가 109 CFU/3 ml 수준인 배양물을 얻고, 이 배양물 3 ml이 포함된 15 ml 시험 튜브를 준비하였다. 상기 튜브에 최종 농도 10 (v/v)%가 되도록 에탄올을 첨가한 후, 공기가 들어가지 않도록 튜브 뚜껑을 닫고 37 ℃에서 4 시간 정치시켰다.
다음으로, 배양물을 3000 rpm에서 원심분리하여 세포를 제거하고 상층액을 취하고, 상층액 중 알코올 농도를 측정하였다. 구체적으로, 상기 상층액 100 ul, 및 6 mM NAD+를 1.0M Tris/HCl (pH8.8) 버퍼 중에서 혼합하여 최종 3 ml되게 한 후 상온에서 5 분간 정치시켰다. OD340 nm에서 흡광도를 측정한 이후 (A1) 알코올 데히드로게나제(alcohol dehydrogenase: ADH)(Sigma 사)를 첨가하여 340 nm에서 흡광도를 측정하므로써(A2) NADH 소비량을 확인하고, 이를 에탄올 소비량으로 환산하였다. 에탄올 소비량은 다음 계산식에 따라 계산하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
에탄올 소비량 (%) = △A = (A2-A1)시료-(A2-A1)블랑크
에탄올 잔존량 (g/L) = (0.7256/6.3)*△A
에탄올 소비량 (%) = (에탄올 잔존량 시료 / 에탄올 잔존량 control)*100
| 번호 | 균주 | 에탄올 소비량(%) |
| 1 | LMT1-73 | 97.9 |
| 2 | LMT2-75 | 98.6 |
표 3에 나타낸 바와 같이, 선발된 2 개 균주는 약 98 %의 에탄올을 직접적으로 분해하였다. 이는 이들 균주가 장내 또는 체내 알코올을 분해하는 데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 이는 상기 균주가 숙취해소 또는 알코올로부터 간과 같은 기관을 보호할 수 있다는 것을 나타낸다.
(3.2) 아세트알데히드 분해능의 확인
분리된 2개 균주 LMT1-73 및 LMT2-75를 MRS 액체 배지에서 37 ℃에서 18 시간 배양하여, 세포 농도가 109 CFU/2.7 ml 수준인 배양물을 얻고, 이 배양물 2.7 ml이 포함된 15 ml 시험 튜브를 준비하였다. 상기 튜브에 최종 농도 0.01 M이 되도록 아세트알데히드를 첨가한 후, 공기가 들어가지 않도록 튜브 뚜껑을 닫고 37 ℃에서 4 시간 정치시켰다.
반응이 완료된 후, 배양물을 0.2 um 멤브레인 필터로 여과하고, 세포가 제거된 여액(filtrate) 시료에 대하여 아세트알데히드 검출 키트(acetaldehyde detection kit, r-biopharm)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 시료 내 잔존 아세트알데히드의 양을 측정하였다. 아세트알데히드 소비량은 다음 계산식에 따라 계산하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
아세트알데히드 소비량 (%) = (A2-A1)시료-(A2-A1)블랑크
아세트알데히드 잔존량 (g/L) = (0.7158/6.3)*△A
아세트알데히드 소비량 (%) = (아세트알데히드 잔존량 시료 / 아세트알데히드 잔존량 control)*100
| 번호 | 균주 | 아세트알데히드 소비량(%) |
| 1 | LMT1-73 | 98.2 |
| 2 | LMT2-75 | 95.0 |
표 4에 나타낸 바와 같이, 선발된 2 개 균주는 각각 98.2 % 및 95.0 %의 아세트알데히드를 소비하였다. 이는 이들 균주가 알코올 산화에 의해 생성된 숙취의 주요 원인으로 알려진 아세트알데히드의 농도를 감소시킴으로써 알코올 섭취 후 신체에 일어나는 유해한 증상들을 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
(4) 인 비보 알코올 및 아세트알데히드 분해능의 확인
랫트에 알코올과 함께 선발된 균주를 경구 투여하고, 혈중 알코올 및 아세트알데히드 농도에 미치는 영향을 확인하였다. 랫트는 5 내지 6 주령(무게 140 g 내지 160 g)의 웅성 SD(Sprague Dawley)계 랫트(㈜오리엔트바이오, 성남, 대한민국)를 사용하였다.
상기 랫트를 고형 사료와 수돗물을 자유 섭취하게 하여 1 주간 예비사육 후 정상군, 대조군, 및 실험군으로 구분하였다(군당 3 마리). 정상군은 랫트에 PBS를 투여한 것이고, 대조군은 40 % EtOH을 투여한 것이고, 실험군 1 및 실험군 2는 각각 (락토바실러스 브레비스 LMT1-73 1x108 CFU/rat/day + 40 % EtOH) 및 (락토바실러스 퍼멘텀 LMT2-75 1x108 CFU/rat/day + 40 % EtOH)을 투여한 것이다.
예비 사육 후, 18 시간 절식 후, 실험군들은 랫트 당 1x108 CFU/day의 생균을 완충용액(Phosphate Buffered Saline:PBS, biosesang)에 혼탁하여 1회 투여하였다.
30 분 후, 상기 대조군, 및 실험군에 40 (v/v)% 농도의 에탄올 1.5 ml를 경구 투여하고, 5 시간 후 심장 채혈로 1.5 ml의 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 상온에서, 13,000 rpm에서 10 분간 원심 분리를 수행하여 혈장을 분리하였다. 혈장에 대하여 에탄올 측정 키트 (Roche, USA)를 이용하여 에탄올의 농도를 측정하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.
| 대조군 | 실험군1 | 실험군2 | |
| 알코올 잔존량(%) | 100 | 24 | 79.3 |
표 5에 나타낸 바와 같이, 두 실험군에서 대조군과 비교해 혈장에서 알코올 검출량이 낮음을 확인하였다.
또한 혈장에 대하여 에탄올 분해 산물인 아세트알데히드 측정 키트 (Roche, USA)를 이용하여 아세트알데히드의 농도를 측정하였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.
| 대조군 | 실험군1 | 실험군2 | |
| 아세트알데히드 잔존량(%) | 100 | 4.4 | 47.6 |
표 6에 나타낸 바와 같이, 두 실험군에서 대조군과 비교해 혈장에서 아세트알데히드가 낮게 검출되었다. 따라서, 균주가 실험동물 모델에서 알코올 및 아세트알데히드의 농도를 감소시킴으로써 알코올 섭취 후 신체에 일어나는 유해한 증상들을 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
(5) 선발된 균주에 대한 유전적 분석
(5.1) 16S
rDNA
분석
서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 세트와 상기 분리된 2개 균주 LMT1-73 및 LMT2-75의 게놈을 주형으로 하여 PCR를 수행하여, 16S rDNA 증폭 산물을 얻었다. 상기 증폭 산물의 뉴클레오티드 서열을 시퀀싱을 통하여 확인하였다. 그 결과, LMT1-73 및 LMT2-75의 16S rDNA는 각각 서열번호 1 및 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
또한, 상기 16S rDNA의 뉴클레오티드 서열을 NCBI blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 사용하여 해석하였다. 그 결과, LMT1-73 및 LMT2-75의 16S rDNA는 각각 락토바실러스 브레비스 종 및 락토바실러스 퍼멘텀 종과 서열 동일성이 각각 99.9% 및 100.0% 이었다. 또한, 계통수 분석 결과, LMT1-73은 락토바실러스 브레비스 종과 같았으며, LMT2-75는 락토바실러스 퍼멘텀 종과 같았다. 그 결과, LMT1-73 및 LMT2-75 균주는 새로운 락토바실러스 브레비스 종 및 락토바실러스 퍼멘텀 종에 속하는 새로운 균주로 확인되었다. 이 2 균주는 각각 브레비스(Lactobacillus brevis) LMT1-73 및 락토바실러스 브레비스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) LMT2-75로 명명하고 이를 한국생명공학연구원 소재 한국세포주은행 한국세포주은행(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2017년 12월 5일자로 기탁번호 KCTC 13412BP 및 KCTC 13413BP로 기탁하였다.
(5.2) 알코올 및 아세트알데히드 분해에 관련된 효소 유전자의 확인
LMT1-73 및 LMT2-75를 MRS 액체 배지에서 37 ℃에서 18 시간 배양하고, 균체를 회수하였다. 균체로부터 게놈 DNA 키트(genomic DNA kit)를 이용하여 게놈 DNA를 얻었다. 표 7에 나타낸 프라이머 세트를 프라이머로 사용하고 상기 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR을 수행하여, ADH, ALDH 및 이기능적 아세트알데히드-CoA/알코올 데히드로게나제(bifunctional acetaldehyde-CoA/alcohol dehydrogenase: ADHE) 유전자의 존재를 확인하였다.
그 결과, LMT1-73 및 LMT2-75에 대하여 ADH, ALDH 및 ADHE 유전자 증폭 산물을 얻었다. 이들 산물에 대하여 시퀀싱을 수행하고, 얻어진 서열을 NCBI blast를 사용하여 다른 서열과 비교한 결과, LMT1-73의 ADH, ALDH 및 ADHE 유전자는 각각 WP_011668736, WP_011668306, 및 WP_024855276과 일치하였고, LMT2-75의 ADH, ALDH 및 ADHE 유전자는 각각 NZ_CP019030, CP002033.1 및 NC_010610.1과 일치하였다.
| 번호 | 균주 | 표적 유전자 | 프라이머(서열번호) |
| 1 | LMT1-73 | L. brevis ADH | 5 |
| 6 | |||
| 2 | L. brevis ALDH | 7 | |
| 8 | |||
| 3 | L. brevis ADHE | 9 | |
| 10 | |||
| 4 | LMT2-75 | L. fermentum ADH | 11 |
| 12 | |||
| 5 | L. fermentum ALDH | 13 | |
| 14 | |||
| 6 | L. fermentum ADHE | 15 | |
| 16 |
(6) 선발된 균주에 대한 형태학적 및 생리적 특성 조사
(6.1) 형태학적 특성 분석
선발된 2종 LMT1-73와 LMT2-75을 MRS 아가 평판 배지에 도말하여 37 ℃에서 배양하고 형성되는 콜로니의 형태를 관찰하였다. 표 8은 LMT1-73와 LMT2-75의 형태적 특성을 나타낸다.
| LMT1-73 | LMT2-75 | |
| 형태 | 원형 | 원형 |
| 크기 | 2 mm | 1 mm |
| 색 | 크림색 | 크림색 |
| 불투명도 | 불투명 | 불투명 |
| 융기 | 볼록 | 볼록 |
| 표면 | 매끄러움 | 매끄러움 |
| 호기적 생장 | + | + |
| 혐기적 생장 | + | + |
(6.2) 선발된 균주의 당 발효 특성
당 발효 특성은 API 50 CHL 키트(Biomerieux, France)를 이용하여 공급회사의 실험 지침에 따라 조사하였다. 표 9는 LMT1-73와 LMT2-75의 당 발효 특성을 나타낸다.
| LMT1-73 | LMT2-75 | |
| 글리세롤 | - | - |
| 에리트리톨 | - | - |
| D-아라비노스 | - | - |
| L-아라비노스 | + | + |
| D-리보스 | + | + |
| D-자일로스 | + | - |
| L-자일로스 | - | - |
| D-아도니톨 | - | - |
| 메티로-β D-자일로피라노시드 | - | - |
| D-갈락토스 | + | + |
| D-글루코스 | + | + |
| D-프럭토스 | + | + |
| D-만노스 | - | + |
| L-소르보스 | - | - |
| L-람노스 | - | - |
| 둘시톨 | - | - |
| 이노시톨 | - | - |
| 마니톨 | - | - |
| D-소르비톨 | - | - |
| 메틸 αD-만노피라노시드 | - | - |
| 메틸 αD-글루코피라노시드 | + | - |
| N-아세틸글루코스아민 | + | - |
| 아미그달린 | - | - |
| 아르부틴 | - | - |
| 에스쿨린 | - | - |
| 살리신 | - | - |
| D-셀로비오스 | - | + |
| D-말토스 | + | + |
| D-락토스 | - | - |
| D-멜리비오스 | + | - |
| D-사카로스 | - | - |
| D-트레할로스 | - | - |
| 이눌린 | - | - |
| D-멜레지토스 | - | - |
| D-라피노스 | - | - |
| 아미돈 | - | - |
| 글리코겐 | - | - |
| 자일리톨 | - | - |
| 겐티비오스 | - | - |
| D-투라노스 | - | - |
| D-릭소스(lyxose) | - | - |
| D-타가토스 | - | - |
| D-푸코스 | - | - |
| L-푸코스 | - | - |
| D-아라비톨 | - | - |
| L-아라비톨 | - | - |
| 포타슘 글루네이트 | + | - |
| 포타슘 2-케토글루네이트 | - | - |
| 포타슘 5-케토글루네이트 | + | - |
(7) 선발된 균주의 장내 안정성
(7.1)
내산성
조사
선발된 균주가 장내에서 프로바이오틱스로서의 효능을 발휘하기 위해서는 섭취 후 낮은 pH의 위를 통과해야 한다.
선발된 두 균주를 멸균된 MRS 액체 배지에 접종 후 37 ℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 그 다음 HCl로 pH 2.5로 조정하여 멸균한 MRS 액체 배지에 상기 선발된 균주를 1 % 양으로 접종하여 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 균주 접종 직후와 2 시간 배양 후의 시료를 회수하여 MRS 액체 배지에 희석하고 MRS 평판 배지에 도말한 다음 37 ℃에서 24 시간 동안 배양한 후 평판 배지 위의 집락 수를 계수하여 세포 수를 측정하였다. 대조군으로서 pH가 조정되지 않은 MRS (pH 6.8) 액체 배지에서 동일하게 진행하여 세포 수를 계수하였다. 비교 균주로서 타입 균주(type strain)인 락토바실러스 브레비스 KCTC3498T 및 락토바실러스 퍼멘텀 KCTC3112T를 사용하였으며, 이들을 KCTC로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 표 10은 내산성 측정 결과를 나타낸 것이다.
| 세포(CFU/ml) | ||||
| LMT1-73 | LMT2-75 | KCTC3498T | KCTC3112T | |
| MRS (pH 6.8) | 6.7x109 | 8.6x109 | 5.5x109 | 3.9x109 |
| MRS (pH 2.5) | 9.0x108 | 3.6x109 | 5.8x108 | 9.1x106 |
표 10에 나타낸 바와 같이, 선발된 균주는 pH 2.5에서 산성에 대한 내성이 대비교 균주에 비하여 우수하였다. 구체적으로, 선발된 LMT1-73 및 LMT2-75는 13.4 % 및 41.2 %가 생존한 반면, 비교 균주 락토바실러스 브레비스 KCTC3498T 및 락토바실러스 퍼멘텀 KCTC3112T는 각각 10.6 % 및 0.2 %만이 생존하였다. 이러한 선발된 균주의 특징은 위의 생리적 pH와 가까운 pH 3보다 낮은 pH에서 적정 세포 수를 유지하였기 때문에 위산 분비로 인한 낮은 pH에서도 안정하게 생균 수가 유지 가능하며 섭취 시 장내 도달율이 매우 높을 것이라는 것을 나타낸다.
(7.2)
내담즙성
조사
선발된 두 균주가 담즙산을 함유하는 배지 중에서 배양하여, 담즙산이 두 균주의 성장에 미치는 영향을 확인하였다.
구체적으로, 선발된 균주를 멸균된 MRS 액체 배지에 접종 후 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였고 장관 내 담즙산 염 농도가 0.1 % 내외임을 감안하여, 0.3 %의 담즙산염(bile salts)(Sigma, USA)이 함유된 MRS 액체 배지에 상기 균주를 1 %양으로 접종하고, 37 ℃에서 2 시간 동안 각각 배양하였다. 균주 접종 직후와 2 시간 배양 후의 시료를 회수하여 MRS 액체 배지에 희석하고 MRS 평판 배지에 도말한 다음 37 ℃에서 24 시간 동안 배양한 후 평판 배지 위의 집락 수를 계수하여 균주 세포 수를 측정하였다. 대조군으로서 0.3 %의 담즙염산이 함유되지 않은 MRS 액체 배지에서 동일하게 배양을 진행하고 균주 세포 수를 계수하였다. 비교 균주로서 타입 균주(type strain)인 락토바실러스 브레비스 KCTC3498T 및 락토바실러스 퍼멘텀 KCTC3112T를 사용하였으며, 이들은 KCTC로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 표 11은 내담즙산염을 측정한 결과이다.
| 세포 (CFU/ml) | ||||
| LMT1-73 | LMT2-75 | KCTC3498T | KCTC3112T | |
| MRS | 6.7x109 | 8.6x109 | 5.5x109 | 3.9x109 |
| MRS (0.3 % 담즙산염) | 8.7x108 | 1.3x108 | 6.1x108 | 3.9x107 |
표 11에 나타낸 바와 같이, 선발된 균주는 장내 실제 농도와 유사한 0.1 % 보다 더 높은 0.3 %에서도 적정 세포 수를 유지하였다. 구체적으로, 선발된 균주 LMT1-73 및 LMT2-75는 각각은 12.9 % 및 1.5 % 생존한 반면, 비교 균주 락토바실러스 브레비스 KCTC3498T 및 락토바실러스 퍼멘텀 KCTC3112T은 각각 11.7 % 및 1.0 % 생존하였다. 따라서, 이는 선발된 LMT1-73와 LMT2-75는 인체나 동물의 장 내에서도 충분히 생존할 수 있고 장내 도달율이 매우 높을 것이라는 것을 나타낸다.
(7.3) 장내 정착성 조사
선발된 균주를 장 상피세포인 Caco-2와 공동 배양하고, 상기 상피세포에 결합된 선발된 균주의 세포를 계수하여, 선발된 균주가 장에 부착하는 정도를 측정하였다. Caco-2 세포는 인간 상피 직장 아데노암종 세포(human epithelial colorectal adenocarcinoma cell)으로서, 한국세포주은행(KCLB 30037.1)에서 구입하였다.
구체적으로, 세포 배양 배지를 이용하여 Caco-2 세포를 7x104 cell/100 ㎕이 되게 하여 배양 96 웰 플레이트의 웰에 첨가하고 5 % CO2, 37 ℃ 조건에서 배양하여 세포 단일층을 형성하게 하였다. 사용된 배양 플레이트와 배지는 96-웰 세포 배양 플레이트 (Corning, USA) 및 10 % 우태아혈청(fetal bovine serum: FBS) (Gibco, USA)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)(Gibco, USA) 배지이었다.
다음으로, MRS 액체 배지에서 배양된 LMT1-73와 LMT2-75를 인산완충 염수(Phosphate Buffered Saline: PBS)로 세척한 다음 항생제가 첨가되지 않은 DMEM 배지에 현탁하고, 상기한 Caco-2 세포 단일층에 균주의 양이 1x107 CFU가 되도록 첨가하고, 5 % CO2, 37 ℃ 조건에서 2 시간 동안 배양하였다. Caco-2 세포에 부착하지 못한 세포를 제거하기 위해 PBS로 5번 세척하고, 100 ㎕의 0.1 % 트리톤 x-100으로 부착된 세포를 떼어낸 다음 이를 MRS 고체 배지에 도말한 후 37 ℃에서 24 시간 동안 배양한 후 평판 배지 위의 집락 수를 계수하여 선발된 균주의 장내 정착성을 조사하였다.
도 1은 선발된 균주가 장 상피세포에 부착하는 정도를 나타낸 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 선발된 LMT1-73 및 LMT2-75는 각각 73.7 % 및 72.9 %가 부착한 반면, 비교 균주 락토바실러스 브레비스 KCTC3498T 및 락토바실러스 퍼멘텀 KCTC3112T는 각각 68.0 %, 및 58.3 %가 부착하였다.
따라서, 선발된 균주 락토바실러스 브레비스 LMT1-73과 락토바실러스 퍼멘텀 LMT2-75는 비교 균주보다 장 상피 세포인 Caco-2 세포에 정착력이 우수하였다.
<110> Medytox Inc.
<120> Microorganism capable of degrading ethanol and acetaldehyde,
composition and kit comprising the same
<130> PN120569KR
<160> 16
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1369
<212> DNA
<213> Lactobacillus brevis LMT1-73
<400> 1
ttgcactgat ttcaacaatg aagcgagtgg cgaactggtg agtaacacgt gggaaatctg 60
cccagaagca ggggataaca cttggaaaca ggtgctaata ccgtataaca acaaaatccg 120
catggatttt gtttgaaagg tggcttcggc tatcacttct ggatgatccc gcggcgtatt 180
agttagttgg tgaggtaaag gcccaccaag acgatgatac gtagccaacc tgagagggta 240
atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat 300
cttccacaat ggacgaaagt ctgatggagc aatgccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc 360
tcgtaaaact ctgttgttaa agaagaacac ctttgagagt aactgttcaa gggttgacgg 420
tatttaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc 480
aagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttttta agtctgatgt 540
gaaagccttc ggcttaaccg gagaagtgca tcggaaactg ggagacttga gtgcagaaga 600
ggacagtgga actccatgtg tagcggtgga atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg 660
cgaaggcggc tgtctagtct gtaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag 720
gattagatac cctggtagtc catgccgtaa acgatgagtg ctaagtgttg gagggtttcc 780
gcccttcagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg accgcaaggt 840
tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 900
agctacgcga agaaccttac caggtcttga catcttctgc caatcttaga gataagacgt 960
tcccttcggg gacagaatga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020
ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttattatcag ttgccagcat tcagttgggc 1080
actctggtga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat 1140
gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggacg gtacaacgag tcgcgaagtc 1200
gtgaggctaa gctaatctct taaagccgtt ctcagttcgg attgtaggct gcaactcgcc 1260
tacatgaagt tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg 1320
ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg agagtttgta acacccaaa 1369
<210> 2
<211> 1272
<212> DNA
<213> Lactobacillus fermentum LMT2-75
<400> 2
aacagatgct aataccgcat aacagcgttg ttcgcatgaa caacgcttaa aagatggctt 60
ctcgctatca cttctggatg gacctgcggt gcattagctt gttggtgggg taacggccta 120
ccaaggcgat gatgcatagc cgagttgaga gactgatcgg ccacaatggg actgagacac 180
ggcccatact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatgggcg caagcctgat 240
ggagcaacac cgcgtgagtg aagaagggtt tcggctcgta aagctctgtt gttaaagaag 300
aacacgtatg agagtaactg ttcatacgtt gacggtattt aaccagaaag tcacggctaa 360
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttatccggat ttattgggcg 420
taaagagagt gcaggcggtt ttctaagtct gatgtgaaag ccttcggctt aaccggagaa 480
gtgcatcgga aactggataa cttgagtgca gaagagggta gtggaactcc atgtgtagcg 540
gtggaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctacct ggtctgcaac 600
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ccgttctcag ttcggactgc aggctgcaac tcgcctgcac gaagtcggaa tcgctagtaa 1200
tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1260
ccatgagagt tt 1272
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
cttatgcagg gatttgtggg actg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
cttgttccag actaacttcg tggc 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
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Claims (10)
- 에탄올 및 아세트알데히드 분해능을 가진 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) LMT2-75 (수탁번호 KCTC-13413BP) 미생물.
- 청구항 1의 미생물 및 희석제 또는 담체를 포함하는 조성물로서, 알코올성 간질환 예방용 또는 숙취해소용인 것인 조성물.
- 청구항 2에 있어서, 시료 중 에탄올 및 아세트알데히드 중 하나 이상을 제거하는 데 사용하기 위한 것인 조성물.
- 청구항 3에 있어서, 상기 시료는 위액, 십이지장액, 소장액, 또는 대장액을 포함한 장내 액체, 또는 혈액인 것인 조성물.
- 청구항 2에 있어서, 식품인 것인 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 식품은 유제품, 또는 식품 첨가제인 것인 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 유제품은 발효유, 버터, 치즈, 또는 분유인 것인 조성물.
- 청구항 2에 있어서, 액체, 분말, 과립, 정제 또는 캅셀 형태인 것인 조성물.
- 청구항 1의 미생물 및 희석제 또는 담체를 포함하는 시료 중 에탄올 및 아세트알데히드 중 하나 이상을 제거하는 데 사용하기 위한 키트.
- 삭제
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