ES2201216T3

ES2201216T3 - Alcohol-deshidrogenasas y su utilizacion para la preparacion por via enzimatica de compuestos hidroxilicos quirales.

Info

Publication number: ES2201216T3
Application number: ES97104814T
Authority: ES
Inventors: Werner Dr. Hummel; Bettina Riebel
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1996-03-21
Filing date: 1997-03-20
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2017-03-20
Also published as: EP0796914B1; EP0796914A2; DE59710152D1; JPH1028590A; US6225099B1; JP3950196B2; EP0796914A3; US6037158A; DE19610984A1

Abstract

ENZIMA MICROBIANO ESTABLE CON ACTIVIDAD DE ALCOHOLDESHIDROGENASA CON UN MAXIMO DE ACTIVIDAD A APROXIMADAMENTE 50 (GRADOS) C, METODO PARA SU OBTENCION ASI COMO SU UTILIZACION PARA LA REDUCCION/OXIDACION ENANTIOSELECTIVA DE COMPUESTOS CETONICOS/HIDROXILADOS ORGANICOS, DE FORMA QUE SEGUN EL COMPUESTO DE PARTIDA SE OBTIENEN COMPUESTOS R - O S HIDROXILADOS. ES ESPECIALMENTE ADECUADA UNA ALCOHOLDESHIDROGENASA OBTENIDA A PARTIR DE LACTOBACILLUS BREVIS.

Description

Alcohol-deshidrogenasas y su utilización para la preparación por vía enzimática de compuestos hidroxílicos quirales.

El presente invento se refiere a nuevas alcohol-deshidrogenasas (ADH) enantioselectivas (selectivas para enantiómeros) procedentes de microorganismos, tales como por ejemplo de la especie Lactobacillus, en particular de Lactobacillus brevis. Las nuevas enzimas son especialmente ventajosas para la reducción de compuestos cetónicos orgánicos para formar los correspondientes compuestos hidroxílicos, conduciendo estas reducciones de manera enantioselectiva a los correspondientes compuestos R. El exceso enantiomérico, que se calcula de acuerdo con la ecuación

ee (%) = producto (R) - producto (S) /producto (R) + producto (S) x 100,

es en este caso por regla enteramente general de más que 95%. Los compuestos S- hidroxílicos no eran detectables en el caso de utilizarse las ADH conformes al invento. Por causa del amplio espectro de substratos, se pueden preparar con la enzima conforme al invento por ejemplo alcoholes quirales, hidroxi-ésteres quirales (por ejemplo \alpha- y
\beta-hidroxi-ésteres) o también hidroxi-ácidos.

Ciertos compuestos hidroxílicos ópticamente activos son valiosos componentes quirales, que son difícilmente accesibles con los procedimientos químicos clásicos. Por lo tanto, para la preparación de compuestos quirales se toman en consideración por regla general procedimientos de biotecnología, ya sea mediando utilización de células enteras de microorganismos o mediante enzimas aisladas. Tal como lo muestra por ejemplo la publicación de F. Aragozzini y colaboradores (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1986) 24, 175-177), los procedimientos con células enteras proporcionan con frecuencia bajos rendimientos, un exceso enantiomérico solamente pequeño (es decir, bajos valores de ee) y largos períodos de tiempo de reacción, por lo que las enzimas, que se pueden emplear en una forma purificada y concentrada, son más ventajosas. Para compuestos hidroxílicos quirales, tales como por ejemplo alcoholes, se recomiendan alcohol- deshidrogenasas, que reducen al compuesto proquiral con ayuda de una coenzima (frecuentemente NADH ó NADPH). Estas reacciones son por regla general muy enantioselectivas. Las alcohol-deshidrogenasas (ADH) hasta ahora disponibles conducen todas ellas a S-alcoholes, en parte en los casos de estas enzimas el espectro de substratos es relativamente estrecho (ADH de levadura, ADH de hígado equino). Una alcohol-deshidrogenasa dependiente de NADP, procedente de Lactobacillus kefir, se describe en el documento de patente alemana DE 40.14.573 C1. Ésta conduce a R- alcoholes. Sin embargo, se ha puesto de manifiesto que esta enzima es relativamente inestable, una purificación hasta llegar a la enzima homogénea era posible por consiguiente solamente con grandes pérdidas
(> 98%).

Por medio de un escrutinio intenso se pudo encontrar, por fin, de manera sorprendente una alcohol-deshidrogenasa específica para R con una estabilidad manifiestamente más alta. Si se determina la desactivación térmica de esta enzima en comparación con la de la más similar enzima ADH conocida con anterioridad, se pone de manifiesto que la enzima conocida con anterioridad es desactivada en un 50% ya a 45ºC, mientras que la enzima conforme al invento es desactivada en un 50% tan sólo a temperaturas de aproximadamente 65ºC. La estabilidad térmica más alta significa, además de ello, una más alta estabilidad en almacenamiento o estabilidad en determinadas condiciones de reacción.

Una correspondiente enzima ADH estable, selectiva para R, se pudo encontrar en particular en microorganismos del género Lactobacillus, tal como L. brevis, y del subgrupo Betabacterium (Grupo A). Hasta ahora no se conocía de ningún microorganismo ni organismo que éste presentase una alcohol-deshidrogenasa estable, específica para R. Con ayuda de un anticuerpo contra la proteína de ADH procedente de L. kefir se pudo mostrar finalmente que todos los lactobacilos del subgrupo Betabacterium (Grupo A) poseen una correspondiente proteína que reacciona con el anticuerpo. Por el contrario, una actividad enzimática especialmente buena se puede detectar en particular en el caso de Lactobacillus brevis. Las otras cepas de este grupo poseen sin embargo asimismo una enzima apropiada en principio para tales reacciones, aún cuando muestran una actividad algo menor en las condiciones de cultivación y ensayo indicadas. Los lactobacilos de otros subgrupos (Thermobacterium IA, Streptobacterium IB, Betabacterium del grupo B), por el contrario, ni muestran una reacción en el ensayo con anticuerpos, ni disponen de una correspondiente actividad enzimática.

La enzima estable, obtenible a partir de L. brevis, se pudo purificar hasta conseguir una homogeneidad. Datos correspondientes acerca de la secuencia proteínica se determinaron con la enzima purificada. Una comparación entre secuencias de los aminoácidos situados en el extremo terminal de N muestra que ciertamente se presentan mayores coincidencias entre la enzima estable conforme al invento y las ADH's de otros orígenes microbianos, pero que están intercambiados, sin embargo, algunos aminoácidos.

La caracterización bioquímica seguidamente reseñada muestra otras diferencias adicionales de la enzima conforme al invento con respecto a las enzimas conocidas con anterioridad correspondientemente, p.ej. en lo que se refiere a las actividades relativas frente a cetonas. La máxima estabilidad de la ADH conforme al invento se encuentra situada por ejemplo a un valor del pH de aproximadamente 9,0. Además de ello, la enzima presenta una buena estabilidad a un pH de aproximadamente 5,5. Esto es válido por ejemplo en un tampón MES 50 mM (MES = ácido 2-morfolino-etanosulfónico). En el mismo sistema de tampón, la enzima conforme al invento presenta después de aproximadamente 30 minutos a una temperatura comprendida entre 25ºC y 60ºC todavía una actividad restante situada por encima de 95%. La enzima presenta un máximo de estabilidad a aproximadamente 40ºC. Además, la enzima posee un máximo de actividad a aproximadamente 50ºC.

La enzima conforme al invento se diferencia además en el plano de la secuencia de aminoácidos con respecto de las enzimas ADH conocidas con anterioridad. Por ejemplo, el extremo terminal de N presenta cinco intercambios de aminoácidos por una longitud total de 38 aminoácidos (AA), lo cual significa una diferencia de AA de por encima de 12%. Por consiguiente, todas las comparaciones muestran que es ventajoso utilizar para aplicaciones correspondientes la alcohol-deshidrogenasa conforme al invento, en particular la que procede de Lactobacillus brevis.

Un objeto adicional del invento se refiere a la obtención de la enzima conforme al invento a partir de apropiados microorganismos. Se consiguieron buenos rendimientos enzimáticos con una cepa de Lactobacillus brevis, que se había depositado bajo el número DSM 20054 el 06.06.1972 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen = Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, de Braunschweig, y está libremente accesible.

El procedimiento para la obtención y respectivamente purificación de la enzima ADH transcurre en lo esencial a través de las siguientes etapas de procedimiento: Disgregación de las células cultivadas, por ejemplo mecánicamente mediante perlas de vidrio, realización de una cromatografía hidrófoba o de una cromatografía por interacción y una subsiguiente cromatografía con intercambio de aniones así como de afinidad. En particular, se ha manifestado como ventajoso que todos los tampones para homogeneización y respectivamente elución contengan aproximadamente de 0,5 a 5 mM de magnesio. Se ha manifestado en este caso como especialmente ventajosa una concentración de
Mg^{2+} de aproximadamente 1 mM. De esta manera, la enzima se obtiene con una actividad específica de por lo menos 400 U/mg, en muchos casos hasta de 500 U/mg.

La enzima conforme al invento se puede preparar además de ello por procedimientos de recombinación, es decir por expresión de correspondientes ADN's que codifican la enzima en el seno de una cepa procariótica o eucariótica apropiada. En particular, es apropiado un sistema que se basa en un gen estructural de ADH procedente de Lactobacillus brevis en Escherichia coli. En tal caso se ha manifestado, de modo sorprendente, como especialmente ventajoso el hecho de que la alcohol- deshidrogenasa se expresa exclusivamente como una proteína soluble y activa.

Un objeto adicional del invento es un procedimiento para la reducción enantioselectiva de compuestos cetónicos orgánicos de acuerdo con la fórmula general (I)

1

realizándose que R' y R^{2}, diferentes o idénticos, pueden ser hidrógeno, en común o en cada caso individualmente, un radical alquilo o alquenilo lineal o ramificado, un radical arilo o arilenilo, que constan en cada caso de 1 a 20 átomos de C, que están sustituidos con uno o varios átomos de halógeno, radicales nitro, hidroxilo o alcoxi, teniendo los radicales alcoxi de 1 a 20 átomos de C, un radical heterociclilo con nitrógeno, oxígeno o azufre, eventualmente sustituido, o un radical aromático saturado y/o insaturado, policondensado, eventualmente sustituido, procedimiento que está caracterizado porque un compuesto cetónico o una correspondiente mezcla se trata con una alcohol- deshidrogenasa microbiana conforme al invento. En este caso, se pueden utilizar tanto la enzima conforme al invento propiamente dicha así como también un cultivo de microorganismos, que producen esta enzima, o respectivamente células que contienen la enzima. La reacción se efectúa preferiblemente en el seno de un tampón acuoso, p.ej. un tampón de fosfato de potasio, Tris/HCl o trietanol-amina (TEA), en presencia de iones de magnesio, a un valor del pH de 5 a 10, preferiblemente a un valor de pH de 6 a 9, y a una temperatura de 10 a 70ºC, preferiblemente de 30 a 60ºC. Además, en la tanda de reacción están presentes una correspondiente coenzima, tal como p.ej. NAD(P)H, así como un agente apropiado para la regeneración de una coenzima oxidada, tal como por ejemplo isopropanol. Cuando se ha alcanzado un grado de conversión suficiente, tal como preferiblemente un grado de conversión de 50%, la reacción se interrumpe, preferiblemente por extracción directamente subsiguiente, tal como por ejemplo en cloroformo. Sin embargo, la reacción se puede llevar a cabo también por disminución del valor del pH, por calentamiento o por adición de un apropiado agente inhibidor de enzimas. A continuación de ello, el compuesto R-hidroxílico, puro en cuanto a un enantiómero, que se ha obtenido, se extrae con un disolvente orgánico no miscible con agua y, de acuerdo con procedimientos conocidos, se separa por cromatografía o destilación con respecto del compuesto cetónico no reaccionado o de otros compuestos de partida y respectivamente componentes. La pureza en cuanto a un enantiómero se determina convenientemente a través de una GC (de Gas Chromatography = cromatografía de gases) y/o HPLC (de High Performance Liquid Chromatography = cromatografía de líquido de alto rendimiento) en presencia de un material de columna quiral o a través de un polarímetro. En particular, el procedimiento conforme al invento se ha manifestado como apropiado para la reducción de cetonas, ceto-ésteres tales como \alpha-, \beta- o \gamma-ceto-ésteres, o bien ésteres arílicos y alquílicos cíclicos, preferiblemente de los que tienen radicales sustituidos por ejemplo con halógeno o alquilo. Se pudieron conseguir resultados especialmente buenos en los casos de derivados de acetofenona, metil- ciclohexanonas, determinadas dicetonas, tales como 2,4-pentanodiona, diferentes ésteres de ácido acetoacético, así como ésteres alquílicos, tales como por ejemplo piruvato de etilo.

Un objeto adicional del invento es un procedimiento para la preparación de un compuesto hidroxílico enantioselectivo de acuerdo con la fórmula general (II)

2

teniendo R^{1} y R^{2} en cada caso los significados antes indicados, cuyo procedimiento está caracterizado porque una mezcla racémica de un compuesto hidroxílico orgánico se trata con una alcohol-deshidrogenasa microbiana conforme al invento o con células que contienen la ADH en el seno de un tampón acuoso a un valor del pH de 5 a 10, preferiblemente a un pH de 6 a 9 y a una temperatura de 10 a 70ºC, preferiblemente de 30 a 60ºC, y a continuación se aísla el compuesto S-hidroxílico puro en cuanto a un enantiómero, así obtenido. Por lo demás, son válidas las condiciones antes mencionadas o respectivamente las conocidas por un experto en la especialidad para correspondientes reacciones.

La ADH conforme al invento, o bien se puede purificar de modo total o parcial para las reacciones descritas o se puede emplear en células que la contienen. Las células pueden presentarse en tal caso en estado nativo, permeabilizado o lisado.

El invento se explica con mayor detalle en los siguientes Ejemplos:

Ejemplo 1 Escrutinio en cuanto a alcohol-deshidrogenasas para R entre cepas del género Lactobacillus

El género Lactobacillus se clasifica, por causa de características fisiológicas, taxonómicamente en tres subgrupos: Thermobacterium, Streptobacterium y Betabacterium, estas últimas todavía de nuevo en los dos subgrupos A y B. Con un anticuerpo contra la alcohol-deshidrogenasa procedente de Lactobacillus kefir se ensayaron cepas tipificadoras de todos los subgrupos, para determinar si muestran una reacción contra los anticuerpos. Sorprendentemente, todas las cepas ensayadas del subgrupo A de Betabacterium mostraron una reactividad, y por el contrario todas las otras cepas eran inactivas. Los extractos brutos de las cepas del subgrupo A de Betabacterium se ensayaron después de ello en un ensayo enzimático, para determinar si también se presenta actividad enzimática. Los resultados se recopilan en la Tabla 1. Esta muestra que, en las condiciones dadas de cultivación y ensayo, varias cepas de este subgrupo no muestran ninguna actividad enzimática o solamente muestran una débil actividad enzimática, aún cuando el ensayo para determinar anticuerpos dio un resultado positivo. Era llamativa, no obstante, una actividad enzimática especialmente alta en cuanto a una ADH presente en muestras de Lactobacillus brevis.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

Presencia de una R-alcohol-deshidrogenasa en cepas del género Lactobacillus
Cepas	Reactividad en el	Actividad enzimática
Thermobacterium:	ensayo de anticuerpos	(reducción de acetofenona)
		[U/ml]
L. acidophilus	0	0
L. helveticus	0	0
L. bulgaricus	0	0
L. delbrueckii	0	0
L. salivarius	0	0
Streptobacterium:
L. casei	0	0
L. plantarum	0	0
L. alimentarius	0	0
L. curvatus	0	0
L. coryneformis	0	0
L. farciminis	0	0
Betabacterium grupo A:
L. kefir	+	87,0
L. brevis	+	93,0
L. cellobiosus	+	0,9
L. fermentum	+	0,2
L. viridescens	+	0,2
L. confusus	+	0,3
L. buchneri	0	0,8
Betabacterium grupo B:
L. hilgardii	0	0
L. fructivorans	0	0

Ejemplo 2 Obtención y purificación de una alcohol-deshidrogenasa procedente de Lactobacillus brevis A. Cultivación de Lactobacillus brevis

Para la obtención de la enzima se cultivó Lactobacillus brevis en el siguiente medio (datos en g/l):

glucosa (20), extracto de levadura (5), triptona (10), extracto de carne (5), hidrógeno-citrato de di-amonio (2), acetato de amonio (5), sulfato de magnesio (0,1), sulfato de manganeso (0,05), hidrógeno-fosfato de di-potasio (2).

La solución se completó hasta 1 litro (l) y el valor del pH se ajustó a 6,5, a continuación el medio se esterilizó a 121ºC (2 bar) durante 10 min. La cepa se cultiva, sin aportación adicional de oxígeno ni regulación del pH, a 30ºC.

A la escala de 10 l, el medio se inoculó en un fermentador, después de haber esterilizado y atemperado a 30ºC, con un cultivo preliminar al 4% (a una densidad óptica DO_{660} de 0,35). Para esta tanda se determinaron a modo de ejemplo la evolución del crecimiento de las células y la actividad enzimática a lo largo del tiempo, sacándose en determinados momentos muestras, que luego se investigaron en cuanto a la DO660, al peso en estado recientemente obtenido y la actividad enzimática, después de haber disgregado las células. En la Figura 1 se representa una evolución de este tipo, la actividad de la alcohol-deshidrogenasa procedente de L. brevis muestra, después de haberse alcanzado la fase estacionaria del crecimiento, el valor máximo de actividad que solamente se mantiene durante 1,5 h.

\newpage

A la escala de 220 l, el organismo se cultivó en las mismas condiciones, después de 13 h a un valor del pH de 5,3 y a una DO_{660} de 2,2 se obtuvieron después de centrifugación 700 g de una masa celular. La masa celular se puede almacenar a -20ºC, sin que se pueda medir ninguna pérdida de actividad durante varios meses. La Figura 1 muestra el crecimiento (representado como densidad óptica) y la formación de la enzima (U/g de células y U/mg de proteína) en función del tiempo de fermentación.

B. Aislamiento de la enzima (preparación de un extracto bruto)

La puesta en libertad de la enzima a partir de las células se consiguió mediante molienda en húmedo con ayuda de perlas de vidrio (0,3 mm), pero se puede conseguir también mediante cualquier otro método para la disgregación de células bacterianas. La masa bacteriana se diluye con un tampón acetato 0,1 M de pH 4,0 + MgCl_{2} 1 mM mediando adición de un agente anti-espumante (polipropilen-glicol) a una suspensión al 40%. Ésta se sometió, mediando adición de perlas de vidrio en la relación de 1:2 en un aparato desintegrador (de la entidad IMA) a 4.000 rpm, a una disgregación durante 20 minutos con enfriamiento constante. 8 g de bacterias proporcionaron 10 ml de un extracto bruto con una actividad volumétrica de 40 U/ml y un contenido de proteína de aproximadamente 3 mg/ml. El sistema de ensayo enzimático contiene 970 \mul de un tampón de trietanol-amina (100 mM; pH 7,0, con acetofenona 11 mM), 20 \mul de NADPH (concentración final 0,19 mM) y una solución de enzima.

Definición de las unidades enzimáticas: 1 U corresponde a la cantidad de enzima, que se necesita para convertir 1 \mumol de substrato (acetofenona) por 1 min.

C. Purificación de la alcohol-deshidrogenasa procedente de Lactobacillus brevis

La enzima se puede purificar hasta conseguir homogeneidad a través de una cromatografía de interacción hidrófoba, con una cromatografía de intercambio de aniones y una cromatografía de afinidad subsiguientes. En tal caso se recomienda una adición de aproximadamente 1 mM de iones de Mg^{2+} a todos los tampones. En el caso de privación de estos iones la enzima puede ser dañada irreversiblemente.

1. Cromatografía de interacción hidrófoba

5 ml de un extracto bruto (correspondiendo al Ejemplo 2 B) se cambian de tampón a través de pequeñas columnas para filtración en gel (PD10, Pharmacia) en un tampón de trietanol-amina 50 mM de pH 7,0 con MgCl_{2} 1 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,6 M, y se aplican sobre una columna de fenil-Sepharose CL-6B (de la entidad Pharmacia, Freiburg, Alemania). La columna ha sido equilibrada con un tampón de trietanol-amina 50 mM de pH 7,0 con MgCl_{2} 1 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,6 M. Después de la aplicación y del enjuague de la columna con el tampón de equilibración, la enzima se eluye con un gradiente salino lineal decreciente ((NH_{4})_{2}SO_{4} de 6 a 0 M, caudal 1 ml/min) a (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,36 M. Las fracciones activas se reúnen y se llevan a una concentración de 1,2 M de (NH_{4})_{2}SO_{4}. Esta solución proteínica se aplica sobre una columna de octil-Sepharose, que se había equilibrado con un tampón de trietanol-amina 50 mM de pH 7,0, MgCl_{2} 1 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 1,2 M. Después de haber aplicado la solución proteínica y de haber enjuagado la columna subsiguientemente, la enzima se eluye con un gradiente salino lineal decreciente ((NH_{4})_{2}SO_{4} de 1,2 a 0 M; caudal 1 ml/min) a (NH_{4})_{2}SO_{4} 1,0 M. El enriquecimiento conseguido está recopilado en la Tabla 2.

2. Cromatografía con intercambio de iones

Las fracciones que tienen la actividad más alta de la última columna utilizada con anterioridad, se cambian de tampón a través de columnas para filtración en gel (PD10, Pharmacia) en un tampón de Tris/HCl 50 mM, de pH 9,0, con MgCl_{2} 1 mM, y se aplican sobre una columna mono-Q asimismo equilibrada (caudal 1 ml/min; presión 1,5 MPa; sistema de cromatografía FPLC (de Fast Performance Liquid Chromatography = cromatografía de líquido de rendimiento rápido) (de la entidad Pharmacia, Freiburg, Alemania). Después de haberse efectuado un enjuague de la columna, la alcohol- deshidrogenasa se eluye con un gradiente salino lineal de NaCl de 0 hasta 0,6 M, apareciendo la enzima a NaCl 0,36 M.

3. Cromatografía de afinidad

Las fracciones activas se cambian de tampón a través de columnas de filtración en gel (PD10, de la entidad Pharmacia), que se habían equilibrado con un tampón de ácido morfolino-etanosulfónico 50 mM de pH 5,5 y MgCl_{2} 1 mM, y se aplicaron sobre una columna asimismo equilibrada con 2',5'-AMP-Sepharose (de la entidad Pharmacia). A continuación, se enjuaga con NaCl 100 mM, disuelto en el mismo tampón. A continuación se efectúa la elución con un gradiente de NADP lineal de NADP de 0 a 10 mM. La deshidrogenasa se eluye a NADP 3,33 mM. La cromatografía se llevó a cabo con un caudal de 0,25 ml/min. La purificación completa de la enzima se recopila en la Tabla 2.

TABLA 2

Purificación de la alcohol-deshidrogenasa procedente de Lactobacillus brevis
Etapa de purificación	Actividad	Actividad específica	Rendimiento
	[U/ml]	[U/mg]	[%]
Extracto bruto	40,8	14,78	100
Fenil-Sepharose	17,21	45,23	42
Octil-Sepharose	4,6	92	8
Mono Q	2,47	183	4
2',5'-AMP-Sepharose	11,74	489	3

D. Purificación de la alcohol-deshidrogenasa procedente de Lactobacillus kefir

El Lactobacillus kefir posee una alcohol-deshidrogenasa intracelular dependiente de NADP (documento DE
40.14.573 C1), que se asemeja en algunas propiedades bioquímicas (producción de R-alcoholes, especificidad para una coenzima) de la alcohol-deshidrogenasa procedente de Lactobacillus brevis. Con el fin de poner en claro las diferencias entre ambas enzimas y de mostrar las ventajas de la enzima procedente de L. brevis, la alcohol-deshidrogenasa procedente de L. kefir se purificó hasta obtener homogeneidad de una manera análoga a como para la enzima L. brevis y en la evolución de la caracterización de la enzima L. brevis se comprobaron comparativamente de vez en cuando (p.ej. de la estabilidad térmica, la secuencia de aminoácidos en el extremo terminal de N). La cultivación de Lactobacillus kefir, el aislamiento de la enzima y la purificación hasta llegar a la enzima homogénea, se llevaron a cabo tal como se describe en los Ejemplos 2A) - 2C) para L. brevis. La Tabla 3 recopila la purificación de la enzima L. kefir.

TABLA 3

Purificación de la alcohol-deshidrogenasa procedente de Lactobacillus kefir
Etapa de purificación	Actividad	Actividad específica	Rendimiento
	[U/ml]	[U/mg]	[%]
Extracto bruto	57,5	9,15	100
Fenil-Sepharose	90,0	49	31
Octil-Sepharose	7,5	100	26
Mono Q	17,5	206	23
2',5'-AMP-Sepharose	48,8	174	8,5

El Ejemplo 2 acerca de la obtención y la purificación de la ADH procedente de L. brevis, muestra que esta enzima posee propiedades químicas de proteínas en parte similares a las de la enzima L. kefir. Ambas enzimas necesitan por ejemplo iones de Mg^{2+}, con el fin de evitar un daño irreversible. En particular, sin embargo, existen las siguientes diferencias:

1.: Las enzimas ADH procedentes de L. brevis y L. kefir se desprenden, después de la fijación a un material intercambiador de iones (en este caso Mono Q), por medio de concentraciones salinas significativamente diferentes. Esta diferente fuerza de fijación apunta a la existencia de diferencias en la composición de aminoácidos en lo que se refiere a los aminoácidos cargados. Esto se pudo confirmar mediante la secuenciación descrita más adelante.

2.: El rendimiento en cuanto a proteína activa enzimáticamente, purificada, es claramente mayor para la enzima procedente de L. kefir, lo cual apunta a la existencia de una enzima más estable.

Ejemplo 3 Caracterización bioquímica de la alcohol-deshidrogenasa procedente de Lactobacillus brevis A. Estabilidad frente al pH

La dependencia de la actividad de la enzima en el caso de un almacenamiento en tampones con diferentes valores del pH se investigó en el intervalo de pH de 4 a 11. Dependiendo de la actividad enzimática, se formularon diferentes tampones en el intervalo de valores del pH de 4 a 11 y la enzima homogénea se incubó allí durante 30 min. De ésta, se sacó 1 ml y se añadió a la tanda de ensayo normal de 970 \mul de un tampón de trietanol-amina (100 mM; pH 7,0 con 11 mM de acetofenona) y 20 \mul de NADPH (concentración final 0,19 mM). La reacción se vigiló durante 1 min a 30ºC y 340 nm. En tal caso se pusieron de manifiesto 2 máximos de la estabilidad frente al pH, uno más pequeño a un pH de 5,5 y uno grande a un pH de 9,0. La estabilidad se representa en la Tabla 4.

TABLA 4

Estabilidad frente al pH de la alcohol-deshidrogenasa
Valor del pH	Tampón	Actividad [U/ml]
4,0	Acetato de Na / ácido acético	6,86
4,5	Acetato de Na / ácido acético	6,22
5,0	MES / NaOH	7,04
5,5	MES / NaOH	8,73
6,0	Trietanol-amina / NaOH	5,58
6,5	Trietanol-amina / NaOH	5,80
7,0	Trietanol-amina / NaOH	6,57
7,5	Tris / HCL	5,04
8,0	Tris / HCL	3,83
8,5	Tris / HCL	8,42
9,0	Tris / HCL	17,11
10,0	Tris / HCL	1,25
11,0	Glicina / NaOH	2,43

B. Estabilidad térmica

De una manera análoga a como se ha descrito en el párrafo A, se determinó la estabilidad térmica para el intervalo de 25 a 70ºC. La solución homogénea de enzima se sometió durante 30 min a las respectivas temperaturas y a continuación se midió directamente a 30ºC con la anterior tanda de ensayo. La alcohol-deshidrogenasa es estable en el intervalo de temperaturas comprendidas entre 25 y 60ºC para el período de tiempo indicado (véase la Tabla 5), ella muestra un máximo a 40ºC. Por el contrario, la ADH procedente de L. kefir es estable solamente hasta 40ºC con un máximo a 37ºC, después de ello la actividad disminuye rápidamente. El máximo de esta enzima está situado en 37ºC.

TABLA 5

Estabilidad térmica de la alcohol-deshidrogenasa procedente de L. brevis
L. brevis	L. brevis	L. kefir	L. kefir
Temperatura [ºC]	Actividad [U/ml]	Temperatura [ºC]	Actividad [U/ml]
25	9,43	25	36,5
30	8,74	30	30,2
37	12,06	37	35,8
40	12,15	40	32
42	11,16	45	26,2
45	10,81	50	2,4
47	8,23	55	0
50	8,37
60	8,51
70	0,56

C. Valor óptimo de temperatura

Para la determinación de la temperatura óptima de ensayo, la actividad enzimática se midió entre 25 y 70ºC. La tanda de ensayo correspondía a las concentraciones patrones de acetofenona y NADPH y se incubó en cada caso durante 5 min a las temperaturas indicadas. La enzima tenía su temperatura de ensayo óptima a 50ºC, tal como puede observarse en la Tabla 6. Por el contrario, la alcohol-deshidrogenasa procedente de L. kefir tiene un valor óptimo de 37ºC y a unas temperaturas de ensayo más altas que 45ºC la actividad disminuye rápidamente (Tabla 6).

TABLA 6

Valor óptimo de temperatura para la actividad de la alcohol- deshidrogenasa
procedente de Lactobacillus brevis (en comparación con la alcohol- deshidrogenasa
procedente de Lactobacillus kefir)
L. brevis	L. brevis	L. kefir	L. kefir
Temperatura [ºC]	Actividad [U/ml]	Temperatura [ºC]	Actividad [U/ml]
25	10,31	20	28,0
30	9,66	25	28,2
37	9,76	30	35,2
40	17,78	35	36,2
42	16,93	40	34,4
45	18,06	45	35,4
47	19,13	50	26,0
50	31,46	55	3,0
55	24,48	60	0
60	23,69
65	1,98
70	0,58

D. Espectro de substratos de la alcohol-deshidrogenasa

En lugar de acetofenona se tomaron una serie de otras cetonas y otros ceto- ésteres, y se ensayaron para determinar si se pueden reducir de manera catalizada por una enzima.

Se utilizó para ello la siguiente tanda de ensayo:

970 \mul de un tampón de trietanol-amina (50 mM; pH 7,0, con 10 mM de un compuesto cetónico)

20 \mul de NADPH (0,19 mM en el ensayo)

10 \mul de una enzima purificada (véase el Ejemplo 2, después de cromatografía de afinidad, diluida a 1:10).

Parcialmente, las cetonas se ensayaron también en una concentración de 1 mM, con el fin de verificar una posible inhibición del substrato a 10 mM. Se comprobó, sin embargo, que tal inhibición en exceso no aparecía en el caso de una concentración de cetona de 10 mM. Las actividades obtenidas para los correspondientes substratos se reproducen en la Tabla 7.

Para substratos tales como p-Cl-acetofenona, metil-1-naftil-cetona y metil- ciclohexanona se puede realizar, basándose en los datos de la bibliografía, una comparación directa entre la alcohol-deshidrogenasa procedente de L. kefir y la procedente de L. brevis (Hummel, W. Appl. Microbiol. Biotechnol. (1990), 34, 15-19). Esta comparación muestra que la ADH conforme al invento convierte a los compuestos mencionados con una actividad más alta; las actividades están situadas en valores más altos aproximadamente en 50 a 100% que los valores para la ADH procedentes de L. kefir.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 7

Espectro de substratos de la alcohol-deshidrogenasa procedente de L. brevis
Substrato	Actividad [U/ml]	Actividad relativa [%]
Acetofenona	3,26	100
4-Cl-Acetofenona	6,63	203
3-Cl-Acetofenona	4,80	147
2-Cl-Acetofenona	0,33	10
4-Etil-acetofenona	2,13	65
2-Metil-ciclohexanona	6,25	192
Éster etílico de ácido 2-oxo-4-fenil-butírico	4,60	141
2,4-Pentanodiona	4,22	130
Éster bencílico de ácido acetoacético	4,11	126
Éster metílico de ácido acetoacético	3,81	117
Éster etílico de ácido acetoacético	3,54	109
Bencil-acetona	3,24	99
Piruvato de metilo	3,22	98
Piruvato de etilo	8,10	248
Éster etílico de ácido 4-Cl-acetoacético	3,04	93
Éster etílico de ácido levulínico	2,99	92
Éster etílico de ácido 4-acetil-butírico	2,84	87
Éster etílico de ácido 3-oxo-n-valeriánico	2,29	70
Éster metílico de ácido 3-oxo-n-valeriánico	2,26	69
Butiril-acetato de etilo	2,21	68
Éster butílico de ácido acetoacético	2,07	64
Éster etílico de ácido isobutiril-acético	1,93	59
Metil-1-naftil-cetona	1,21	37
Éster etílico de ácido benzoíl-acético	1,14	35
2-Metil-acetoacetato de etilo	0,84	26
1,4-Butanodiol-diglicidil-éter	0,77	24
Hidroxi-acetona	0,74	23
Propiofenona	0,55	17
Éster etílico de ácido trifluoroacético	0,50	15
Éster etílico de ácido ciclohexanona-2-carboxílico	0,41	13
2-Oxo-4-fenil-butirato de etilo	0,40	12
Bencil-metil-cetona	0,36	11
Ácido 4-acetil-butírico	0,32	10
Benzaldehído	0,30	9
Ácido ceto-valeriánico	0,27	8
Éster etílico de ácido ciclohexanona-2-acético	0,14	4

El espectro de substratos de la enzima conforme al invento es por consiguiente similarmente amplio que el de la enzima procedente de L. kefir. Ambas enzimas convirtieron a derivados de acetofenona, 2- y 3-oxo-ésteres, cetonas cíclicas y de cadena abierta, con alta actividad, y están capacitadas para formar R-alcoholes mediante la reducción de cetonas.

E. Peso molecular de la alcohol-deshidrogenasa procedente de Lactobacillus brevis

Una alcohol-deshidrogenasa purificada procedente de Lactobacillus brevis se aplicó sobre una columna para filtración en gel Superdex G-200 (entidad Pharmacia, Freiburg). El peso molecular se determinó mediante una recta de calibración, que se había obtenido con proteínas de peso molecular conocido. El tampón, en el caso de la filtración en gel, tenía el valor de pH de 7,0 usual para la purificación (TEA 100 mM, de pH 7,0, NaCl 0,2 M, MgCl_{2} 1 mM). En estas condiciones, se determinó para la ADH procedente de L. brevis un peso molecular de aproximadamente 104 kD, lo cual corresponde a la de la ADH procedente de L. kefir. Además, ambas enzimas constan de cuatro subunidades.

F. Determinación de la secuencia en el extremo terminal de N de la alcohol-deshidrogenasa

La secuencia en el extremo terminal de N se determinó con un secuenciador de líquido pulsante modelo 477A, con una HPLC on-line (en línea) del modelo 120A de la entidad Applied Biosystems / EE.UU. y se comparó con la secuencia en el extremo terminal de N de la alcohol-deshidrogenasa procedente de L. kefir.

S-N-R-L-D-G-K-V-A-I-V-T-G-G-T-L-G-I-G-L-A-I-A-T-K-F-V-E-E-G-A-K-V-M-I-T-T-R (SEQ. ID NO: 1)

En comparación con la secuencia procedente de L. kefir se consignaron en los primeros 38 aminoácidos (AA) los siguientes cinco intercambios de aminoácidos:

: Posición 1, de Thr a Ser (ninguna diferencia en el comportamiento químico de los AA);

: Posición 2, de Asp a Asn (el AA ácido cargado se intercambia por uno no cargado);

: Posición 5, de Lys a Asp (el AA básico se intercambia por un AA ácido);

: Posición 24, de Asp a Thr (el AA ácido se intercambia por un AA hidrófilo);

: Posición 34, de Val a Met (el AA hidrófobo se intercambia por un AA que contiene azufre).

En cuatro de cinco casos se presentan los intercambios de aminoácidos del tipo que provocan propiedades opuestas de polaridad en estas posiciones en la enzima.

Ejemplo 4 Determinación de secuencias parciales de aminoácidos después de disociación de la enzima

Una alcohol-deshidrogenasa homogénea procedente de Lactobacillus brevis se sometió a una disociación con la endoproteinasa Lys-C proteasa (Boehringer Mannheim, 476.986). Para ello, la enzima tuvo que ser previamente desnaturalizada y carboximetilada. La muestra de ADH se recogió directamente en 60 \mul de un tampón de guanidinio de pH 8,5 [2 mg/ml] y se incubó a TA (temperatura ambiente) durante 30 min. Después de haber transcurrido la incubación, se añadieron a ello 1/10 volúmenes de una solución 111 mM de DTT y se incubó de nuevo a 37ºC durante 30 min. Finalmente, se añadieron a ello 1/10 volúmenes de una solución 360 mM de ácido yodo-acético y la muestra se incubó a 37ºC en la oscuridad durante 30 min. La reacción se detuvo con \beta-mercapto-etanol. Después de haber cambiado de tamponamiento a un tampón que contenía urea (2 M), se añadieron a ello 1% (concentración final) de Triton X- 100 (reducido) y 4,6 \mug de Lys-C proteasa (1/25 de la cantidad de proteína [p/p = peso/peso]) y se incubó a 37ºC durante una noche. Después de haber transcurrido el período de tiempo (como mínimo durante 16-18 h), la reacción se detuvo por adición de 1/10 volúmenes de TFA al 10%. De la tanda se inyectaron tres veces cada vez x 150 \mul y finalmente 1 x 100 \mul en la HPLC. Cada pico que contenía proteína se recogió por separado y después de haber comparado las fracciones pasadas individuales, los picos iguales se reunieron y se concentraron por evaporación en una centrífuga en vacío. Estas muestras (en total 18) se utilizaron luego directamente para la secuenciación.

Los datos de secuencias (se exponen solamente los datos más importantes de fracciones con información total e inequívoca de las secuencias):

La proteína en la fracción de pico con el número 3 tiene la siguiente secuencia V-M-I-T-G-R-H-S-D-V-G-E-K (SEQ. ID NO: 2) y con ello se unía directamente al extremo terminal de N.

Se pudieron determinar también las secuencias de las fracciones proteínicas número 5 (D-Y-D-V-R-V-N-T-V-H-P-G-Y-I-K (SEQ ID. NO: 3)) y número 6.

En el caso de esta última, F-A-T-G-S-E-F-V-V-D-G-G-Y-T-A-Q (SEQ ID. NO: 4)

se trata del extremo terminal de C del monómero de la ADH procedente de Lactobacillus brevis.

Las secuencias de las restantes 12 fracciones no se reseñan aquí. Todas las secuencias parciales se pudieron confirmar sin embargo mediante correspondientes experimentos de clonación.

Un correspondiente experimento para la disociación con la proteasa LysC de una ADH purificada procedente de L. kefir, tuvo éxito. En el caso de la separación de los péptidos mediante una HPLC se estableció un cuadro de disociación similar en alta medida al que se producía en la disociación de la enzima procedente de L. brevis. A partir de esta disociación, después de una secuenciación de los trozos de disociación de péptidos, se pudo obtener casi la secuencia completa de aminoácidos de la enzima procedente de L. kefir. Si las partes de secuencias detectadas se comparan con la secuencia de la ADH procedente de L. brevis (véase la Figura 2), se pone de manifiesto que los trozos parciales de la secuencia procedente de L. kefir corresponden en lo esencial a la secuencia de L. brevis, pero que faltan en la secuencia de L. kefir dos trozos parciales decisivos. Estos trozos parciales están caracterizados en la Figura 2 por X_{26}, es decir, un trozo parcial que tenía que abarcar 26 aminoácidos, con el fin de conseguir una igualación con la secuencia de L. brevis, y por X_{2} para un trozo parcial que abarcaba dos aminoácidos.

Una comparación entre secuencias de las ADH's procedentes de L. brevis y de L. kefir muestra que - dejando aparte los trozos parciales X_{26} y X_{2} que faltan - se han intercambiado 18 aminoácidos, es decir aproximadamente un 10%.

Ejemplo 5 Clonación de la enzima A. Preparación de un ADN genómico procedente de Lactobacillus brevis

Células de Lactobacillus brevis se lavaron con 50 ml de un tampón alto en TE (Tris 25 mM, EDTA 10 mM, de pH 8,0) y se centrifugaron a 6.000 rpm. El sedimento se volvió a suspender en 10 ml de TE (Tris 25 mM, EDTA 10 mM de pH 8,0) y se incubó a 37ºC durante 1,5 h mediando adición de 100 \mul de lisozima (100 mg/ml). A continuación se desnaturalizó la proteína celular durante una noche a 50ºC mediando adición de 340 \mul de lauril-sarcosina al 30%, 100 \mul de una proteasa Qiagen (Qiagen, Hilden; 20 mg/ml) y 25 \mul de RNAsa A (40 mg/ml) a las células lisadas, y el ARN se descompuso. En la siguiente etapa, a partir del material lisado celular se separó el ADN mediante precipitaciones con fenol con respecto del contenido celular restante. (Para ello se añadieron a la fase acuosa, siempre en la relación en volumen 1:1, primeramente fenol puro (saturado con TE), luego una mezcla de fenol, IAA y CHCl_{3} (25:24:1) (IAA = alcohol isoamílico) y finalmente una mezcla de IAA y CHCl_{3} (24:1)). Las fases acuosas depuradas se mezclaron durante aproximadamente 5 min por suave basculación y luego se separaron por centrifugación a 20.000 rpm. La última fase superior acuosa se mezcló con 0,0625 volúmenes de LiCl 8 M y luego se cubrió cuidadosamente con dos partes en volumen de etanol frío (al 100%). El ADN genómico, que precipitó junto a la capa límite, se reveló en una pipeta de Pasteur y se lavó dos veces con etanol al 70%, frío. Después de haber secado en la centrífuga en vacío, el ADN se recogió en 2 ml de TE (10 mM de Tris, 1 mM de EDTA) de pH 8,0. Para la comprobación del grado de pureza del ADN aislado, la solución se diluyó a 1:50, y se determinó fotométricamente que el cociente de 260:280 nm era de 2,0. Con ello se pudieron excluir las impurezas proteínicas. Se determinó a partir del gel que la concentración del ADN era de 70 ng/\mul, a partir de 3 g de células se aislaron 140 \mug de ADN genómico.

B. Oligonucleótidos como cebadores en 5' y 3' para la PCR (Polymerase Chain Reaction = reacción en cadena de polimerasa)

Por causa de disociaciones enzimáticas de péptidos (véase el Ejemplo 4) se pudieron determinar los extremos terminal de N y terminal de C de la secuencia proteínica de la ADH procedente de L. brevis. Con ayuda de estas informaciones se sintetizaron cebadores para la PCR. En tal caso se tomaron en consideración preferencias conocidas para determinados codones en lactobacilos. Delante de cada cebador en 5' se antepuso el codón ATG (Met) como codón de partida, que le falta a la secuencia de proteínas, y detrás de cada cebador en 3' se situaron 2 codones de detención para la terminación asegurada de la traducción. Las estructuras artificiales de cebadores se enumeran a continuación (entre paréntesis se exponen los ácidos nucleicos variables, que se habían incorporado de manera alternativa al ácido nucleico puesto delante del paréntesis, de manera tal que el cebador realmente empleado es una mezcla de las combinaciones que se establecen):

Cebador en 5' 5'LB:

5'ATG-TCA-AAC-CGT-TTA(G)-GAT-GGT(C)-AAG-GTT(A)-GCT(A)-ATT(C)-3'

(SEC.ID NO: 5)

Cebador en 3' 3'LB:

5'CTA-CTA-TTG-A(T)GC-AGT-GTA-A(G)CC-A(G)CC-ATC-A(T)AC-A(T)AC-GAA-3'

(SEC.ID NO: 6)

Los cebadores sintetizados se eluyeron con NH_{3} frío fuera de las columnas. Esta solución de NH_{3} se incubó a 70ºC durante 1 h y a continuación se extrajo por agitación con 1 ml de butanol. Las muestras se separaron por centrifugación durante 2 min a 14.000 rpm y el material sobrenadante resultante se separó por decantación. Las muestras se dispusieron, para su desecación, durante 5 min en la centrífuga a vacío, y el sedimento se recogió en 500 \mul de H_{2}O. Los cebadores se emplearon en una concentración de 100 pmol/\mul.

C. PCR (reacción en cadena de polimerasa) con el ADN genómico procedente de L. brevis

A continuación se hizo variar la concentración del molde (ADN genómico), todos los otros parámetros se mantuvieron constantes. Como temperatura de reanillamiento se escogió la de 52ºC.

TABLA 8

Tanda para PCR
Tanda	Molde [ng]	Cebador en 5' [pmol]	Cebador en 3' [pmol]	dNTP [nM]	Tampón [10x]	Taq [U]	H_{2}O [\mul]
1	700	100	100	1,6	10 \mul	2,5	61,5
2	70	100	100	1,6	10 \mul	2,5	70,5

Las respectivas tandas tenían un volumen de 100 \mul, los datos en moles han de entenderse como concentraciones finales, el molde y la polimerasa de ADN Taq (Boehringer Mannheim) se añadieron a la tanda total en la cantidad reseñada en la Tabla 8. El tampón (tampón para reacción de PCR, Boehringer Mannheim) se presentaba en una concentración 10 veces mayor. La PCR se formuló durante 25 ciclos durante una noche. Se utilizó un aparato para PCR de Perkin Elmer con tapa calentable.

Para la analítica, un 10% de la tanda (proporción en volumen) se aplicó a un gel de agarosa al 1% y se separó por electroforesis a 100 V constantemente. La PCR muestra una manifiesta amplificación de un fragmento de ADN de aproximadamente 750 pb (pares de bases). La señal está situada entre las bandas de marcadores de 697 pb y 925 pb, llegando a estar más próxima a la de 697 pb. En el caso de un peso molecular del monómero de la ADH de 27 kD (245 AA), que se ha determinado por SDS-PAGE, se encuentra aquí una buena coincidencia de la longitud de los aminoácidos de la proteína de ADH y de la longitud de pares de bases para el gen buscado.

D. Purificación de los productos de PCR con el estuche de purificación de PCR Qiaquick® (Qiagen, Hilden)

A 100 \mul de una solución para PCR se les añadieron con pipeta 500 \mul del tampón PB y se aplicaron directamente sobre una columna Quiaquick® (sin equilibración). El ADN se fijó a la columna por centrifugación (durante 1 min a 14.000 rpm) y la fracción que pasaba se desechó. La columna se lavó con 750 \mul de un tampón PE por centrifugación (durante1 min a 14.000 rpm) y la fracción que pasaba se desechó. La columna se centrifugó de nuevo brevemente, con el fin de eliminar restos del etanol contenido en el tampón PE. A continuación, la columna se eluyó por centrifugación (durante 1 min a 14.000 rpm) mediando adición de 50 \mul de un tampón Tris/HCl 2 mM de pH 8,0. De este material eluido se aplicó en cada caso 1 \mul sobre un gel analítico de agarosa al 0,8% y se separó por electroforesis a 60 V constantemente. La determinación de las concentraciones dio unos valores de 70 ng/\mul para la PCR 3/1 y de 90 ng/\mul para la PCR 3/2. La PCR 3/2 se trató ulteriormente, y la PCR 3/1 se conservó a -20ºC. La PCR 3/2 se concentró por evaporación hasta 16 \mul en el aparato Speed vac y se empleó directamente para la reacción de terminación en extremo romo y cinasación del estuche Sureclone (16 \mul de PCR, 1 \mul del fragmento de Klenow, 2 \mul de 10x tampón, 1 \mul de polinucleótido-cinasa, hay que incubar durante 30 min a 37ºC). La mezcla de reacción se aplicó directamente sobre un gel preparativo de agarosa al 0,8% (2 h, constante a 80 V). La banda visible a 750 pb se recortó a partir del gel y se aisló desde el gel a través de Jetsorb® (de Genomed, Bad Oeynhausen). El ADN de plásmido se eluyó a partir del material Jetsorb con 50 \mul de Tris/HCl 2 mM de pH 8,0. Esta solución se concentró por evaporación hasta 9 \mul con ayuda de una centrífuga de vacío. De ésta se utilizó 1 \mul para un gel analítico de agarosa.

A partir de la concentración del fragmento de PCR en el gel (150 ng/\mul) se establece una concentración total de ADN de 1,2 \mug. Esta muestra se empleó en la tanda con ligasa del estuche Sureclone.

E. Aislamiento de ADN de Jetsorb® a partir del gel

Por cada 100 mg de material de gel se mezclaron 300 \mul del tampón A1 y 10 \mul de la suspensión de Jetsorb y se incubaron durante 15 min a 50ºC. En tal caso, de tiempo en tiempo, se mezcló de nuevo la solución, a fin de garantizar una fijación completa al material Jetsorb. A continuación, la suspensión se separó por centrifugación durante 30 s (segundos) a 11.000 rpm, el material sobrenadante se desechó, el sedimento se volvió a suspender en 300 \mul del tampón A2 y se separó por centrifugación de nuevo a 11.000 rpm. Esta etapa se repitió completamente, y a continuación el material sobrenadante se separó por pipeteo nítidamente y el sedimento se secó durante 5 min a 50ºC. Luego, el sedimento se volvió a suspender en 30 \mul de Tris/HCl 2 mM de pH 8,0, y se incubó a 50ºC durante 5 min. Después de haberse efectuado la centrifugación (a 11.000 rpm, durante 30 s) el material sobrenadante se recogió y reunió, y el sedimento se volvió a suspender de nuevo en 20 \mul de Tris/HCl 2 mM de pH 8,0, y se trató ulteriormente como antes se indica. Los materiales sobrenadantes resultantes se reunieron y se concentraron por evaporación hasta 18 \mul en el aparato Speed vac. De éstos, se aplicó 1 \mul sobre un gel analítico de agarosa. La determinación de concentraciones a través de este gel dio una concentración de ADN de 10 ng/\mul, es decir una concentración total de 160 ng.

F. Ligación con el estuche Sureclone (entidad Pharmacia)

Se emplearon 7 \mul de PCR (1 \mug), 1 \mul del vector pUC18 (50 ng), 1 \mul de DTT, 10 \mul de un tampón de ligasa doble y 1 \mul de ligasa. De esta tanda se sacaron 3 \mul y se emplearon en una nueva tanda de ligasa, a fin de disminuir la concentración de los fragmentos de PCR. Una segunda tanda se corresponde en su composición, excepto en la concentración de ADN de PCR (157 ng, es decir una relación de 1:3 de vector : PCR), a la primera tanda (relación de 1:20 del vector : PCR). Ambas tandas se incubaron durante 1,5 h a 16ºC y a continuación se transformaron con ellas 100 \mul de células competentes (Escherichia coli XL, 1 Blue). De la tanda de ligasa 1 se pipeteó 1 \mul y de la tanda de ligasa 2 se pipetearon 4 \mul a las células competentes. De la suspensión de células se sembraron en placas cada vez 300 \mul sobre placas de agar LB_{amp} (LB-peptona de caseína / extracto de levadura; de pH 7,5).

Colonias crecidas se separaron por inoculación y se cultivaron en 4 ml de un cultivo líquido (medio LB_{amp}) durante una noche a 37ºC. De esta suspensión celular se emplearon cada vez 2 ml para la preparación del plásmido (correspondientemente al protocolo de Qiagen miniprep (Qiagen, Hilden); véase más adelante). El ADN de plásmido se precipitó a partir de la solución exenta de células directamente con 0,7 partes en volumen de isopropanol, se lavó con etanol frío al 70%, se secó en la centrífuga de vacío y se recogió en 10 \mul de un tampón de Tris/HCl 2 mM (de pH 8,0). De esta preparación de plásmido se formuló un material digerido por restricción con Eco R1 y Hind III (1 U/\mul de enzima, 6 \mul de ADN de plásmido, 37ºC, 1 h). El material digerido completo se aplicó sobre un gel de agarosa al 0,8%. Se separó por electroforesis durante 2 horas a 80 V constantemente (detección del inserto de 750 kb) y después de ello los plásmidos se emplearon eventualmente para la secuenciación.

G. Preparación de plásmidos (Qiagen Miniprep)

4 ml del cultivo líquido se separaron por centrifugación durante 5 min a 5.000 rpm y el sedimento se suspendió en 300 \mul del tampón P1. A esta suspensión se le añadieron 300 \mul del tampón P2 y la suspensión de células se incubó durante 5 min a la temperatura ambiente. A continuación se añadieron con pipeta a las células lisadas 300 \mul del tampón P3 frío y se incubaron durante 10 min sobre hielo mediando basculación múltiple, con el fin de desnaturalizar a los ácidos nucleicos y a las proteínas. Los constituyentes desnaturalizados se separaron por centrifugación (a 11.000 rpm, durante 15 min); el material sobrenadante se vertió directamente sobre nuevas columnas de Qiagen 20 Tip (Qiagen, Hilden) equilibradas con 1 ml del tampón QBT (Qiagen, Hilden). Las columnas se lavaron con 4 x (veces) 1 ml del tampón QC y a continuación el ADN de plásmido se eluyó desde las columnas con 0,8 ml del tampón QF. A partir de esta solución, el ADN se precipitó con 0,7 volúmenes de isopropanol después de haber centrifugado durante 30 min a 14.000 rpm. El sedimento resultante se lavó 2 x (veces) 10 min con etanol al 70% durante la centrifugación a 14.000 rpm y luego se secó en una centrífuga a vacío. El ADN se recogió en 10 \mul de tampón Tris/HCl 2 mM de pH 8,0 y se empleó por ejemplo para los análisis mediante enzimas de restricción.

H. Secuenciación del ADN de los plásmidos a. Acabado del gel de secuenciación

La secuenciación se llevó a cabo con el secuenciador fluorescente de láser con auto- lectura = autoread laser fluorescent (ALF) de la entidad Pharmacia, correspondientemente se utilizó el estuche de secuenciación Autoread (de Pharmacia) para la reacción de secuenciación. El gel tenía de manera normalizada un espesor de 0,5 mm. En el sitio del paso del láser se empleó una plaquita de vidrio correspondiente (con un espesor de 0,35 mm). Gel de secuenciación: 21 g de urea (ultra pura), 12 g de H_{2}O (Millipore), 7,5 ml de acrilamida (Roth, para la secuenciación de ADN), 200 \mul de APS, 45 \mul de TEMED, 6 ml de TBE de 10 veces. Como tampón de elución sirvió el 0,6 x TBE (tampón de Tris/ borato / EDTA correspondientemente a los datos de Pharmacia).

b. Reacción se secuenciación con el estuche de secuenciación AutoRead®

De los plásmidos se emplearon en cada caso 5 \mul (4 \mug) de un ADN por cada cebador de secuenciación.

Se pipetearon conjuntamente 5 \mul de un ADN de plásmido, 5 \mul de H_{2}O, 2 \mul de un cebador (universal o invertido), 1,5 \mul de NaOH 1 M, y se incubaron durante 5 min a 65ºC para la desnaturalización del ADN. Luego, las muestras se transfirieron directamente a 37ºC y la tanda de reacción se neutralizó con 1,5 \mul de HCl 1 M. Se añadieron a ello 2 \mul de tampón de reanillamiento, se separó por centrifugación brevemente (durante 15 s, a 14.000 rpm) y se incubó durante 10 min a 37ºC, y a continuación durante 10 min adicionales a la temperatura ambiente. Después de haberse efectuado la centrifugación, se mezclaron con la tanda 1 \mul de un tampón para extensión y 3,5 \mul de dimetil-sulfóxido, y por cada tanda se pipetearon 2 \mul de la polimerasa de T7 diluida con el tampón para dilución de la enzima. 5,2 \mul de esta solución se pipetearon directamente en una placa previamente incubada a 37ºC, que por cada plásmido contenía 4 trazas con 3 \mul de la respectiva mezcla de NTP (nucleótidos) (A, C, G, T en el orden de sucesión). Después de haber incubado durante 5 min a 37ºC, la reacción de secuenciación de acuerdo con Sanger (Sanger, F., Nickler, S., Coulson, A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) se detuvo por adición de 6 \mul de Stopmix (mezcla para detención), y la mezcla de reacción se calentó a 90ºC durante 2-3 min, después de ello se enfrió directamente sobre hielo, con el fin de impedir una renaturalización de las cadenas. Luego se vertieron directamente 6 \mul de esta mezcla sobre el gel de secuenciación y el secuenciador se puso en marcha. De los plásmidos seleccionados, solamente el plásmido 3/1 tenía la secuencia de ADN correcta; estos datos se pueden traducir luego en la correspondiente secuencia de proteínas (Figura 1). El cebador universal muestra el extremo terminal de C de la secuencia y el cebador inverso muestra el extremo terminal de N (cadena codificadora en 5'). Por lo tanto, el inserto está colocado en la orientación correcta. La secuencia, por causa de la secuenciación del ADN, muestra una total coincidencia con los datos de secuencia obtenidos mediante secuenciación de las proteínas.

Ejemplo 6 A. Construcción del plásmido de expresión pADH

Para la expresión de la alcohol-deshidrogenasa, el gen estructural se clonó en el vector de expresión pKK177, de tal manera que el gen estructural sea insertado en la orientación correcta bajo el control de un apropiado promotor inducible por IPTG, de modo preferido el promotor de Tac. Para ello, el gen estructural para la alcohol- deshidrogenasa se cortó mediante EcoRI e HindIII a partir del vector pUC con el gen de ADH, la tanda de restricción se separó por electroforesis en gel de agarosa y el fragmento con un tamaño de aproximadamente 750 pb se aisló a partir del gel de agarosa. Al mismo tiempo, el plásmido de expresión pKK177 se cortó con EcoRI e HindIII, la tanda de restricción se separó mediante electroforesis en gel de agarosa y el fragmento de vector con un tamaño de aproximadamente 2,8 kpb se aisló a partir del gel de agarosa. Los fragmentos así obtenidos se ligaron unos con otros tal como se ha descrito. El plásmido que resultó de nuevas se denominó pADH-1. La inserción correcta del gen se comprobó posteriormente mediante análisis por restricción y secuenciación.

B. Transformación del plásmido de expresión pADH-1 en diferentes cepas de expresión de Escherichia coli

Células competentes de diferentes cepas de Escherichia coli, preferiblemente las E. coli B HB101 y E. coli K12 NM522, se produjeron correspondientemente al método de acuerdo con Hanahan (J. Mol. Biol. 166 (1983), páginas 557 y siguientes). 200 \mul de células preparadas de esta manera se mezclaron con 20 ng de ADN del plásmido pADH-1 aislado. Después de una incubación durante 30 min sobre hielo, se efectuó un choque de calor (durante 90 s a 42ºC). A continuación, las células se transfirieron a 1 ml de un medio LB y para la expresión fenotípica se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Partes alícuotas de esta tanda de transformación se sembraron sobre placas LP con ampicilina como marcador de selección, y se incubaron a 37ºC durante 15 horas.

C. Expresión de la alcohol-deshidrogenasa procedente de Lactobacillus brevis en Escherichia coli

Los transformandos, que habían recibido el plásmido de expresión pADH-1, se entresacaron y se sobreinocularon individualmente en 3 ml de un medio líquido LB con ampicilina y se incubaron a 37ºC en un frasco rodante. A una densidad óptica (a la longitud de onda de medición de 550 nm) de 0,5, las células se indujeron con 1 mM de IPTG. Como testigo se trató conjuntamente en cada caso un clon con un plásmido de expresión, pero sin inducción, y el respectivo WT de E. coli sin plásmido de expresión, pero inducido por IPTG. A las 4 horas después de la inducción y después del crecimiento durante una noche, se sacó de cada tubito una parte alícuota, que correspondía a una densidad óptica de DO_{550} = 5. Las células se separaron por centrifugación (durante 10 min a 6.000 rpm, a 4ºC), se recogieron en 300 \mul del tampón TE (Tris-HCl 50 mM, EDTA 50 mM, de pH 8,0) y se disgregaron mediante ultrasonidos (en un Branson Sonifire 450/2 x 30 segundos en la etapa 2 sobre hielo). Por centrifugación (durante 10 min, a 14.000 rpm) las proteínas solubles se separaron con respecto de las proteínas insolubles y de los constituyentes de paredes celulares. En este punto se sacó una parte alícuota para la realización del ensayo de actividad. El material sobrenadante restante se mezcló para la preparación previa con el fin de realizar la electroforesis en gel de SDS-poli(acrilamida) con 50 \mul de 5 x tampón de aplicación (Tris-HCl 60 mM de pH 6,8, SDS al 1,2%, glicerol al 10%, 2-mercapto-etanol 0,7 M, azul de bromofenol al 0,05%). El sedimento proteínico (proteínas insolubles y constituyentes de paredes celulares) se recogió de nuevo en 300 \mul del tampón TE (Tris-HCl 50 mM, EDTA 50 mM, de pH 8,0) y se volvió a suspender mediante 5 impulsos de ultrasonidos (en el Branson Sonifire 450). También estas muestras se mezclaron con el correspondiente volumen de 5 x tampón de aplicación. Finalmente, todas las muestras se calentaron a 95ºC durante 5 min a fin de desnaturalizar totalmente a las proteínas.

D. Electroforesis en gel de SDS-poli(acrilamida) (SDS-PAGE)

La SDS-PAGE se llevó a cabo de acuerdo con el método de U.K. Laemmli (1970, Nature 227, páginas 680-685). Las fracciones de proteínas solubles e insolubles se separaron por separado en un gel para separación al 15% y las bandas de proteínas se tiñeron a continuación con una solución de tinción de Coomassie (0,2% de Coomassie, 30% de etanol, 10% de ácido acético).

La alcohol-deshidrogenasa procedente de Lactobacillus brevis de las cepas de E. coli utilizadas se expresó exclusivamente en forma de una proteína soluble. Esto se pudo mostrar con ayuda de una banda proteínica adicional con el tamaño ya determinado previamente en una SDS-PAGE de \sim27 kDA exclusivamente en el caso de las fracciones proteínicas solubles. Esta banda proteínica adicional no podía observarse en los testigos (clon que contiene un plásmido, no inducido, y clon sin ningún contenido de plásmido, inducido), así como en las muestras con la fracción proteínica insoluble.

Un ensayo de actividad llevado a cabo con el extracto bruto mostró también que la alcohol-deshidrogenasa había sido expresada no solamente en forma soluble, sino además de ello en forma activa.

\newpage

Ejemplo 7 Preparación, catalizada por una enzima, de R-fenil-etanol

Para la síntesis, catalizada por una enzima, de (R)-fenil-etanol a partir de acetofenona se emplearon una enzima purificada (del Ejemplo 2C) y la coenzima necesaria (NADP). La coenzima oxidada se regeneró de un modo continuo mediante isopropanol que estaba presente al mismo tiempo, de manera tal que la reacción exige solamente cantidades catalíticas de coenzima. La tanda contenía en particular (se exponen entre paréntesis las concentraciones finales de los componentes en el ensayo): 20 \mul de NADP (0,05 mM), 7,7 \mul de isopropanol (0,1 M), 0,6 \mul de acetofenona (5 mM), 921,7 \mul de tampón de trietanol-amina (50 mM, de pH 7,0, con MgCl_{2} 1 mM) y 50 \mul de alcohol-deshidrogenasa procedente de Lactobacillus brevis (4,5 unidades). Esta tanda con un volumen total de 1 ml se incubó durante 24 h (horas) a 30ºC, luego una muestra se analizó por cromatografía de gases. Para ello, se sacaron 100 \mul, se extrajeron por agitación con 100 \mul de cloroformo, las fases se separaron por centrifugación, y a partir de la fase inferior (de cloroformo) se sacó una parte alícuota para la GC.

Las condiciones de separación para efectuar la separación de los (R)- y (S)- fenil-etanoles en el cromatógrafo de gases son: Fase estacionaria: Lipodex E, columna con CD (Macherey y Nagel, Duren), fase móvil: helio, volumen de inyección: 1 \mul, detección: FID, temperatura: 110ºC. En estas condiciones, el substrato acetofenona se eluye a los 10,5 min, el (S)-fenil-etanol se eluye a los 13,8 min y el (R)-fenil-etanol se eluye a los 14,2 min. Los valores de retención para los (S)- y (R)-fenil-etanoles se pueden obtener con una mezcla racémica obtenible comercialmente (de la entidad Fluka, Buchs, Suiza). Después de 24 h se ha convertido más de un 95% del substrato, el cromatograma de GC muestra los siguientes valores: acetofenona (tiempo de retención 10,5 min), área = 9.800; (S)-fenil-etanol (tiempo de retención 13,8 min); área = < 500; (R)-fenil-etanol (tiempo de retención 14,2 min); área = 240.000.

Ejemplo 8 Preparación de alcoholes por reducción de cetonas con células enteras de Lactobacillus brevis

Una reducción de cetonas para formar alcoholes quirales es posible además de ello con células enteras de L. brevis. Se puede prescindir en este contexto de una adición de NADP, puesto que en este caso se aprovecha la coenzima presente intracelularmente. La regeneración de la coenzima se puede conseguir mediante isopropanol o mediante substratos metabolizables tales como glucosa.

Tanda de ensayo: 50 mg de células de L. brevis (peso en húmedo después de haber separado por centrifugación) se suspenden en 860 \mul de un tampón de trietanol-amina (50 mM; de pH 7,50; adición de 1 mM de MgCl^{2+}), que contiene 0,1 M de glucosa y 10 mM de acetofenona. Las muestras se analizan mediante cromatografía de gases. Después de incubación durante 2 h a 30ºC ya no se puede detectar nada de acetofenona, en vez de ello se ha formado una cantidad correspondiente de fenil- etanol. Puesto que la cuantificación se había llevado a cabo mediante separación por GC en una fase estacionaria quiral, se pudo mostrar al mismo tiempo que el fenil-etanol formado es de alta pureza óptica, y no se pudo detectar nada de (S)-alcohol cuantificable. La pureza óptica es claramente > 95% para el (R)-alcohol. Esto muestra que las células de L. brevis no contienen aparentemente ninguna cantidad más de alcohol-deshidrogenasa, puesto que la pureza óptica de los alcoholes formados podría perturbar, por lo que los alcoholes quirales se pueden preparar también por esta vía mediando utilización de células enteras.

Leyendas acerca de la Figura 1

Las secuencias de ADN y de proteínas de la ADH recombinante procedente de L. brevis en E. coli (línea superior, en cada caso la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ. ID NO: 7), debajo de ella la correspondiente secuencia de aminoácidos que corresponde al código de tripletes (en el código de una sola letra, SEQ. ID NO: 8)). La secuencia comienza con metionina, que ha sido introducida a través de un codón de iniciación. Esta metionina no es encontrada en el caso de la correspondiente secuencia de aminoácidos, que se había obtenido por secuenciación de la proteína pura (extremo terminal de N; véanse el Ejemplo 3F y el Ejemplo 4).

Leyendas acerca de la Figura 2

La secuencia de aminoácidos (SEQ. ID NO: 9) de la alcohol-deshidrogenasa procedente de Lactobacillus kefir, obtenida por secuenciación de péptidos después de disociación de la enzima mediante una LysC-proteasa.

(1) DATOS GENERALES:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE: BOEHRINGER MANNHEIM GBMH

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CALLE: Sandhofer Str. 116

\vskip0.333000\baselineskip

(C): LOCALIDAD: Mannheim

\vskip0.333000\baselineskip

(E): PAÍS: Alemania

\vskip0.333000\baselineskip

(F): NÚMERO DE CÓDIGO POSTAL: 68305

\vskip0.333000\baselineskip

(G): TELÉFONO: 06217593277

\vskip0.333000\baselineskip

(H): TELEFAX: 06217594457

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): DENOMINACIÓN DEL INVENTO: Alcohol-deshidrogenasa y su utilización para la preparación enzimática de compuestos hidroxílicos quirales

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 9

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): REDACCIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): SOPORTE DE DATOS: Disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATORIO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D): SISTEMA LÓGICO - SOFTWARE:

\vskip1.000000\baselineskip

: Patentin Release nº 1.0, versión nº 1.30 (EPA)

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 38 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): FORMA DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Asn Arg Leu Asp Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr}

\sac{Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Thr Lys Phe Val Glu Glu Gly}

\sac{Ala Lys Val Met Ile Thr Thr Arg}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): FORMA DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Met Ile Thr Gly Arg His Ser Asp Val Gly Glu Lys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): FORMA DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): FORMA DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Ala Thr Gly Ser Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): FORMA DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ATGRCAAACC GTTTRGATGG YAAGGTRGCR ATY

\hfill

33

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): FORMA DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTACTATTGY GCAGTGTARC CRCCATCYAC YACGAA

\hfill

36

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 756 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): FORMA DE CADENA: bicatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1...756

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

3

4

5

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 252 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

6

7

\vskip0.666000\baselineskip

(2) DATOS ACERCA DE SEQ ID NO: 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 251 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): FORMA DE CADENA: monocatenaria

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

8

9

Claims

1. Enzima microbiana estable con actividad de una alcohol-deshidrogenasa, caracterizada porque después de 30 minutos a 50 hasta 60ºC presenta una actividad enzimática estable, y en las posiciones de aminoácidos 1, 2, 5, 24 y/o 34 tiene de modo correspondiente sendos radicales de serina, asparagina, ácido aspártico, treonina y/o metionina, y es purificable excepto en una actividad específica de 400 U/mg hasta conseguir la homogeneidad de la enzima.

2. Enzima de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque presenta un máximo de estabilidad a 40ºC y a un pH de 9,0.

3. Enzima de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la enzima presenta un máximo de estabilidad a un pH de 5,5.

4. Enzima de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizada porque el máximo de actividad de la enzima se presenta a 50ºC.

5. Enzima de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque presenta un peso molecular de 104 kDa (por filtración a través de gel).

6. Enzima de acuerdo con una de las precedentes reivindicaciones, caracterizada porque la enzima es obtenible a partir de cepas del género Lactobacillus.

7. Enzima de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, obtenible a partir de Lactobacillus brevis (DSM 20054).

8. Alcohol-deshidrogenasa estable, caracterizada porque la enzima presenta en lo esencial una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ. ID NO:8.

9. Alcohol-deshidrogenasa estable a la que codifican por una secuencia de acuerdo con SEQ. ID NO:7 o correspondientes secuencias análogas.

10. Procedimiento para la obtención de la enzima de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se disgrega una muestra de microorganismos, eventualmente transformada con un gen que codifica una ADH, y a continuación se la somete a una cromatografía de interacción hidrófoba, a una cromatografía con intercambio de aniones y de afinidad en apropiados sistemas de tampones, que contienen iones de magnesio.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque en el caso del microorganismo se trata de Lactobacillus brevis (DSM 20054).

12. Procedimiento para la reducción enantioselectiva de compuestos cetónicos orgánicos, caracterizado porque un compuesto de la fórmula general (I)

1

realizándose que R'y R^{2}, diferentes o idénticos, pueden ser hidrógeno, en común o en cada caso individualmente, un radical alquilo, alquenilo, arilo o arilenilo, en cada caso lineal o ramificado, que consta de 1 a 20 átomos de C, que están sustituidos con uno o varios átomos de halógeno, radicales nitro, hidroxilo o alcoxi, teniendo los radicales alcoxi de 1 a 20 átomos de C, un grupo alquileno de C1-C10 eventualmente sustituido, que están sustituidos con radicales heterociclilo saturados, insaturados o aromáticos con nitrógeno, oxígeno o azufre, o pueden ser un radical saturado y/o aromático, policondensado, eventualmente sustituido,

caracterizado porque un compuesto cetónico o una correspondiente mezcla se incuba en presencia de una alcohol-deshidrogenasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9, o las células que contienen la enzima se incuban entre aproximadamente 20ºC y 60ºC durante un período de tiempo desde aproximadamente 15 minutos hasta 3 horas y se aísla el correspondiente compuesto R-hidroxílico.

13. Procedimiento para la síntesis enantioselectiva de compuestos hidroxílicos orgánicos de acuerdo con la fórmula general (II)

2

realizándose que R' y R^{2}, diferentes o idénticos, pueden ser hidrógeno, en común o en cada caso individualmente, un radical alquilo, alquenilo, arilo o arilenilo, en cada caso lineal o ramificado, que consta de 1 a 20 átomos de C, que están sustituidos con uno o varios átomos de halógeno, radicales nitro, hidroxilo o alcoxi, teniendo los radicales alcoxi de 1 a 20 átomos de C, un grupo alquileno de C1-C10 eventualmente sustituido, que están sustituidos con radicales heterociclilo saturados, insaturados o aromáticos con nitrógeno, oxígeno o azufre, o pueden ser un radical saturado y/o aromático, policondensado, eventualmente sustituido,

caracterizado porque una mezcla racémica del compuesto hidroxílico orgánico se incuba con una alcohol-deshidrogenasa de acuerdo las reivindicaciones 1 a 9, o con células que contienen la enzima, a unas temperaturas comprendidas entre aproximadamente 20º y 60ºC durante un período de tiempo desde aproximadamente 15 minutos hasta 3 horas, y se aísla el correspondiente compuesto R-hidroxílico.

14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque están presentes iones de magnesio y el valor del pH está situado entre 6 y 9.

15. Procedimiento para la preparación recombinante de una alcohol- deshidrogenasa estable, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ. ID NO:7 se expresa en una célula eucariótica o procariótica.

16. Fragmento de ADN aislado, que codifica una alcohol-deshidrogenasa estable, caracterizado porque contiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ. ID NO:7 o una secuencia que se hibrida con ella.