KR20040077553A - 견 단백질로부터 세포 생육 펩티드의 추출과 이용 - Google Patents
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Abstract
종양 세포 등의 이상한 세포에 의하여 생산된 세포 증식 인자와는 달리, 안전성이 우수하고, 비교적 저 분자량으로 안정성도 우수하고, 또한 세포 생육 촉진성이 우수한 펩티드를 얻는 것을 목적으로 한다.
견 단백질을 구성하는 비 결정부의 펩티드 사슬로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 펩티드 사슬의 부분 펩티드를 함유하여 되고, 그 부분 펩티드는 아미노산 잔기 수가 4 내지 40으로 이루어진 특정한 아미노산 배열을 갖는 펩티드인 세포 생육 촉진성이 우수한 펩티드 조성물.
분자량이 1만 이하, 바람직하게는 4,000 내지 400의 특정한 아미노산 배열을 갖는 펩티드를, 견 단백질의 비 결정부로부터 분리, 분획하는 동시에, 그들과 유사한 펩티드를 합성함으로써, 세포 생육성이 우수한 신규 펩티드를 제공할 수 있었다.
이들 펩티드를 세포 접착제, 세포 증식 촉진제, 창상 치유 촉진제, 화장료 등의 스킨 케어용 소재나 세포 배양 기재 등의 바이오 소재로서 유용 가능하다.
Description
본 발명은, 견 단백질 유래의 세포 생육 촉진성이 우수한 펩티드 및 그 제조법, 및 그 스킨 케어용 소재로서의 의약품, 의약부외품, 화장품 등의 분야에의 이용 및 바이오 소재로서 세포 배양 기재에의 이용에 관한 것이다.
견사는 수술사로서 오래전부터 쓰여져 왔던 것으로, 견 단백질은 생체 적합성 소재로 생각되어, 그 특성에 착안하여 각종 분야에서 새로운 용도의 개발이, 최근, 활발하게 이루어지고 있다.
예를 들면, 견사를 용해하여 견 단백질 수용액으로 한 후에, 이것을 응고·건조·분쇄 등에 의해 분말화하여, 화장용 첨가재로서, 또한 견 단백질 수용액을 평판상에서 캐스팅 등에 의해 필름상 물질로 하여, 세포 배양 평판이나 창상 피복재 및 코팅재로서, 또한 견 단백질 수용액을 겔상 물질로 하여, 식품이나 화장품으로서 이용하기 위한 개발이 진행되고 있다.
이와 같은 개발예로서, 예를 들면, 일본 개소 62-000415호 공보, 일본 특공평 01-044320호 공보, 일본 특개평 01-254164호 공보, 일본 특공평 06-004679호 공보, 일본 특개평 11-139986호 공보, 일본 특개평 11-276876호 공보, 일본 특허 제2997758호, 일본 특허 제2990239호, 일본 특개평 11-253155호 공보, 일본 특원 2002-230656호, 일본 특원 2002-148849호, 일본 특개 2001-163899호 공보를 들 수 있다(특허 문헌 1에서 12 참조).
이들 견 신소재 개발의 과정에서, 견 단백질은 세포 생육성, 항산화성, 항균성, 알콜 소화성, 항혈액 응고성 등, 다양한 기능을 갖는 것으로 밝혀졌다.
그러나, 그들의 기능이 견 단백질의 어떤 부위 또는 구조에 기인하는가에 대해서는 아직 밝혀지지 않았다.
본 발명자들은 견 단백질이 갖는 세포 생육 기능에 주목하고, 고치의 실 또는 견사를 용해한 후에, 이것을 분말, 필름, 겔 등으로 바꾸고, 이들을 스킨 케어 소재로 하여 창상 피복재나 화장품, 합성 섬유의 개질로서 이용하기 위한 개발과 기능의 연구를 진행해 왔다(예를 들면, 특허 문헌 8, 특허 문헌 9, 특허 문헌 10, 특허 문헌 11, 특허 문헌 12 참조).
이 과정에서, 견 단백질을 구성하는 피브로인의 H사슬과 L사슬 및 세리신의 a성분에는 인간 정상 피부 유래 섬유아세포를 생육 촉진하는 작용이 있는 것으로 밝혀졌다(예를 들면, 특허 문헌 13, 특허 문헌 14, 특허 문헌 15 참조).
한편, 고치의 실과 섬유로서 의복 이외의 분야, 예를 들면, 고치를 각종 가공 공정을 거쳐 생사, 더욱이 견직물로 가공하여, 의료(수술용 봉합사)나 화장(퍼프) 등의 분야에서 이용되고 있는데, 최근, 이와 같은 고치나 생사의 가공 공정에서 견 단백질의 분자량이 저하된다는 것을 알게 되었다.
또, 고치의 실이나 견사를 분말, 필름, 겔 등으로 바꾸는 가공 공정(특히, 고치의 실이나 견사의 용해 공정)에서도 견 단백질의 분자량은 저하하는 것으로 밝혀졌다[H.Yamada 등 저: Materials Science & Engineering C, 14, P.41-46(2001)], [쯔보우치 고우조우, 야마다 히로미, 다카스 요코: 일본 잠사학회지, 71권, 1호, P.1-5(2002)](비 특허 문헌, 비 특허 문헌 2 참조).
이와 같은 가공에 의해 분량이 저하된 견 단백질은, 전기 영동상에서는 분자량 약 1내지 20만 사이에 하나의 스미어에서 브로드한 밴드가 보일 뿐이다.
분자량 1만 정도 이하는 대부분 투석 등의 공정에서 제외되어 버리지만, 실제는 아미노산이나 펩티드 정도에까지 분자량이 저하된다.
분자량이 저하된 견 단백질은 인간 세포 생육 촉진성이 저하되고, 혹은 세포 생육을 저해하고 있는 것으로 밝혀졌다(특허 문헌 11 참조).
즉, 미분해 피브로인, 미분해 세리신은 세포 생육 촉진성이 우수한데도 불구하고, 고치 가공 과정의 산이나 알칼리, 빛, 열 등의 처리에 의한 펩티드 결합의 복잡하고, 또한 불균일한 절단으로 인해 분자량 저하와 함께 세포 생육의 저해가 일어나고 있다.
따라서, 견 단백질의 세포 생육 촉진 기능을 이용하기 위해서는 미분해 견 피브로인, 미분해 견 세리신 혹은 피브로인의 H사슬(분자량 약 35만), L사슬 또는 세리신 a(분자량 약 40만) 등을 미분해의 상태로 이용하는 것이 바람직하다.
그러나, 이들 3성분(특히 H 사슬이나 세리신 a)은 분자량이 상당히 커서, 일정한 성상으로 장기 보존하기 위한 안정성이 낮다.
또, L사슬은 피브로인중에서 10% 이하의 중량 비율로 포함되고 있는데 지나지 않아, 양적으로 적다.
또한, 이들 3성분에 대하여, 각 성분의 어느 부분에 세포 생육 촉진 작용이 있는가를 명확하게 한 보고는, 아직 이루어지지 않았다.
[특허 문헌 1] 일본 개소소, 62-000415호 공보
[특허 문헌 2] 일본 특공평 01-044320호 공보
[특허 문헌 3] 일본 개소평 O1-254164호 공보
[특허 문헌 4] 일본 특개평 04-202435호 공보
[특허 문헌 5] 일본 특공평 06-004679호 공보
[특허 문헌 6] 일본 특개평 11-139986호 공보
[특허 문헌 7] 일본 특개평 11-276876호 공보
[특허 문헌 8] 일본 특허 제2997758호
[특허 문헌 9] 일본 특허 제2990239호
[특허 문헌 10] 일본 특개평 11-253155호 공보
[특허 문헌 11] 일본 특원 2002-230656호
[특허 문헌 12] 일본 특원 2002-148849호
[특허 문헌 13] 일본 특개 2001-163899호 공보
[특허 문헌 14] 일본 특원 2001-180169호 공보
[특허 문헌 15] 일본 특개 2002-128691호 공보
[비 특허 문헌 1] H.Yamada 등 저: Materials Science & Engineering C, 14,P.41-46(2001)
[비 특허 문헌 2] 쯔보우치 고우조우, 야마다 히로미, 다카스 요코: 일본 잠사학회지, 71권, 1호, P.1-5(2002)
[비 특허 문헌 3] Tashiro Yutaka and Otsuki Eiichi, Journal of Cell Biology, Vol.46, P1(1970)
피브로인의 H사슬나 세리신의 a성분은 세포 생육 촉진성이 우수하지만, 분자량이 30만 이상의 고분자량이고, 결정화하기 쉽다.
이것에 비해 피브로인의 L사슬는 분자량 2.5만이고, H사슬이나 a성분과 비교하면 분자량은 작지만, 통상의 단백질과 비교하면, 결정으로 되기 쉬운 성질을 갖고 있다.
또, 피브로인의 H사슬과 L사슬의 중량비는 거의 13(H사슬) 대 1(L사슬)이며, L사슬의 비율은 상당히 적다.
이와 같이 고 분자량이고 결정성인 단백질은 수용액에서 안정성이 낮다.
또, 유성 성분 등의 의약품이나 화장품 첨가물을 가하면 겔화하기 쉽고, 성상이 불안정하여, 장기간(1년 이상)의 저장에 대한 안정성이 낮다.
한편, 견 피브로인 H사슬나 세리신 a보다 분자량이 낮고, 세포 생육성이 우수한 물질로서는 각종 세포의 증식 인자, 예를 들면 분자량 1.77내지 1.9만의 섬유아 세포 증식 인자(FGF)가 있다.
이들은 종양이나 암화한 세포, 또는 급격하게 증식하고 있는 세포로부터 분비되고, 그 중에는 피부 궤양 치료제로서 사용되고 있는 것도 있지만(피블라스트 스프레이, 가켄 야쿠힌 가부시키가이샤제), 안전성에 문제가 있다.
본 발명은, 이와 같은 문제점을 해결하기 위해 이루어진 것이다.
즉, 종양 세포 등의 이상한 세포에 의하여 생산된 세포 증식 인자와는 달리, 안전성이 우수하고, 비교적 저 분자량으로 안정성도 우수하고, 또한 세포 생육 촉진성이 우수한 펩티드를 얻는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 상기 문제점을 해결하기 위해, 예의 연구를 거듭한 결과, 견 피브로인의 특정 부위의 펩티드 사슬에 세포 생육 촉진 기능이 있는 것을 규명하는것에 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이른 것이다.
즉, 본 발명은, <1> 견 단백질을 구성하는 비 결정부의 펩티드 사슬로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 펩티드 사슬의 부분 펩티드를 함유하여 되고, 그 부분 펩티드는 아미노산 잔기 수가 4내지 40으로 이루어진 특정한 아미노산 배열을 갖는 펩티드인 것을 특징으로 하는 세포 생육 촉진성이 우수한 펩티드 조성물에 있다.
보다 상세하게는, 가잠의 견 피브로인의 H사슬을 구성하는 N말단부(Ⅰ), 비 결정부(A), 및 C말단부(a)의 각 펩티드 사슬, L사슬의 펩티드 사슬, 및 천잠과 같은 안테레아(Antheraea)에 속하는 야잠의 견 피브로인을 구성하는 N말단부(Ⅰ), 비 결정부(A), 및 C말단부(a)의 각 펩티드 사슬로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 펩티드 사슬의 부분 펩티드를 함유하여 되고, 그 부분 펩티드는 아미노산 잔기 수가 4내지 40으로 이루어진 특정한 아미노산 배열을 갖는 펩티드인 세포 생육 촉진성이우수한 펩티드 조성물에 있다.
그리고, <2>, 상기 특정한 아미노산 배열을 갖는 펩티드 사슬이, 다음 (1)내지 (8)중 어느 아미노산 배열을 갖는 펩티드 조성물에 있다.
그리고 또, <3>, 다음의 (1)내지 (8)중 어느 아미노산 배열을 함유하는 세포 생육 촉진성이 우수한 펩티드에 있다.
그리고 또, <4>, 가잠의 미분해 견 단백질 또는 안테레아에 속하는 야잠의 미분해 견 피브로인을, 가수분해한 후, 분자량 분획에 의해 세포 생육 촉진성이 우수한 비 결정부의 펩티드를 분리, 취득하는 방법에 있다.
그리고 또, <5>, 가수분해를 희석 산, 히드록실아민 또는 단백질 분해 효소에 의해 행하는 것을 특징으로 하는 상기 제 4의 발명의 세포 생육 촉진성이 우수한 비 결정부의 펩티드를 분리, 취득하는 방법에 있다.
그리고 또, <6>, <7>, 각각 상기 (1), (2)의 펩티드 조성물 및 (3)의 펩티드를 함유하는 세포 증식 촉진제에 있다.
그리고 또, <8>, <9>, 각각 상기 (1), (2)의 펩티드 조성물 및 (3)의 펩티드를 함유하는 세포 접착제에 있다.
그리고 또, <10>, <11>, 각각 상기 (1), (2)의 펩티드 조성물 및 (3)의 펩티드를 함유하는 창상 치유 촉진제에 있다.
그리고 또, <12>, <13>, 각각 상기 (1), (2)의 펩티드 조성물 및 (3)의 펩티드를 함유하는 화장료에 있다.
그리고 또, <14>, <15>, 각각 상기 (1), (2)의 펩티드 조성물 및 (3)의 펩티드를 함유하는 세포 배양 기재에 있다.
(발명을 실시하기 위한 최선의 형태)
본 발명의 세포 생육 촉진성이 우수한 견 단백질의 비 결정부의 펩티드 또는 그들의 펩티드 조성물은, 다음 조작에 의해 취득하는 동시에, 그 아미노산 배열을 결정했다.
1. 가잠 또는 천잠과 같은 안테레아에 속하는 야잠의 고치층을 정련하고, 정련한 고치층을 LiSCN 수용액에 용해하고 원심분리기에 걸어, 그 상청액을 분리, 회수하여 물에 대하여 투석하고, 투석액을 다시 원심분리기에 걸어서 상청액을 분리, 회수한다.
2. 분리, 회수한 정제 상청액에, 키모트립신 등의 단백질 분해 효소를 첨가하여 가수분해처리한다.
3. 가수분해 처리한 용액의 상청액(비 결정 부분)을 침전층(결정 부분)으로부터 분리, 회수한다.
4. 상청액(비 결정 부분)을 역상 크로마토그래피에 의해 분획한다.
5. 역상 크로마토그래피에 의해 분획된 각 분획에 대하여 세포 배양을 행한다.
6. 세포 생육성이 우수한 분획에 대하여 겔 여과 크로마토그래피에 의해 분자량 분획하고, 대조군보다 2배 이상의 세포 생육율을 갖는 분획(펩티드 사슬)에 대하여 아미노산 배열을 결정한다.
7. 얻어진 펩티드를 기초하여 세포 생육 촉진성이 우수한 펩티드를 설계하고 합성한다.
그리고, 본 발명은, 분자량이 1만 이하, 바람직하게는 4,000내지 400인 우수한 세포 생육 촉진성을 갖는 펩티드를 견 단백질의 비 결정부로부터 분리, 분획하는 동시에, 그들과 유사한 펩티드를 합성하고, 그들 펩티드를 세포 접착제, 세포 증식 촉진제, 창상 치유 촉진제, 화장료 등의 스킨 케어용 소재나 세포 배양 기재 등의 바이오 소재로서 제공할 수 있는 것이다.
본 발명에서의 견 단백질 유래의 세포 생육 촉진 펩티드란, 실시예 1내지 실시예 3에서 서술하는 바와 같이 3일간의 세포 배양 시험에 두어, 펩티드를 첨가하지 않고서 세포를 배양하는 대조군보다 2배 이상의 세포 생육율을 갖는 펩티드를 말한다.
가잠 피브로인의 1차 구조
가잠의 경우, 누에는 고치를 준비할 때에 견 단백질을 토사하여, 고치(고치의 실과 번데기로 구성)을 만들다.
고치의 실에는 중심부에 피브로인, 주위부에 세리신이 존재하고, 존재비는, (70내지 80% 피브로인):20내지 30%(세리신)인 것으로 알려져 있다.
고치의 실(피브로인과 세리신을 합하여, 혹은 단독으로 견 단백질이라고 한다)의 피브로인은 분자량 약 37만이다. [Tasiro Yutaka and Otsuki Eiichi, Journal of Cell Biology, Vol.46, P1(1970)](비특허 문헌 3참조).
분자량 약 37만의 피브로인은 분자량 약 35만(H사슬)과 약 2.5만(L사슬)이 S-S 결합하고 있다.
피브로인의 H사슬는 상당히 고분자량이지만, 유사한 아미노산 잔기 배열의 반복으로 구성되어 있다.
게놈 뱅크(Gen Bank, accession no. AF 226688)에 의하면, H사슬의 전구체 단백질은 다음과 같이 N말단부(Ⅰ), 결정부(R)와 비 결정부(A)의 반복부, C말단부(a)로 이루어져 있다.
반복부는 12의 결정부(RO1내지 R12)가 11의 비 결정부(AO1내지 A11)를 통하여 반복하고 있다.
결정부는, 결정성이 높은 (Gly-X)의 디펩티드의 긴 반복으로 이루어져 있다.
X로서는 결정성이 높은 Ala(A) 외에 Ser(S)가 주이고, 그 밖에 Tyr(Y), Val(V) 등이 마이너 성분으로서 존재하고 있다.
특히, GAGAGS, 또는 GA의 반복이 많다.
그 결과, 결정부에서는 G와 A의 합이 50%를 초과하여, 70%정도 이상으로 되어 있다.
비 결정부의 AO1내지 A11의 펩티드는 아미노산 배열은 비슷하지만, 각 펩티드의 아미노산 배열에 조금의 차이가 보인다.
또, 비 결정부(AO1내지 A11)의 G와 A의 합은 50% 이하이다.
N말단부와 C말단부는 아미노산 배열 및 아미노산 조성으로부터, 비 결정부라고 생각되며, AO1내지 A11과 마찬가지로 G와 A의 합은 50% 이하이다.
그런데, 비 결정부중에서도 6~10잔기 정도의 부분 펩티드로서는, G와 A의 합이 50%를 초과하는 부분이 존재한다.
<피브로인 H사슬 전구체>
N말단부: I
N말단부(Ⅰ)는 개시 펩티드의 부분으로, 아미노산 배열은 다음과 같다.
결정부: RO1, RO2, …, R12
RO1, RO2, …, R12는 모두 결정부라고 하는 부위로, 각 아미노산 잔기 수는 모두 300 이상이다. 단, R12의 아미노산 잔기 수는 54이다.
(AO1~A11) 어느 것의 결정부도 G와 A의 합이 70% 정도 이상이다.
비 결정부: AO1, AO2,…, A11
아미노산 잔기 수 28~32로 이루어지고, 비 결정부(A)라고 한다.
그들 아미노산 배열은 다음과 같다.
C말단부: a
C 말단측의 비 결정 부위에서 아미노산 배열은 다음과 같이 이루어져 있다.
본 발명의 이해의 편의, 참고를 위해, 이하에, 단백질에서의 아미노산 또는 아미노산 잔기의 표기법, 아미노산의 전하 특성 등에 대하여 표 1에 기재해 둔다.
아미노산은 측쇄의 특징으로부터 하기와 같은 산성 아미노산, 극성 비전하 아미노산, 비극성 아미노산, 염기성 아미노산의 4개로 나눠져 있다.
1. 산성 아미노산 : E, D
2. 극성 비전하 아미노산 : N, S, Q, Y, T, C, F
3. 비극성 아미노산 : A, G, V, P, L, I, W
4. 염기성 아미노산 : H, K, R
다음에 나타내는 피브로인 L사슬은 H사슬의 결정부와 비 결정부의 아미노산 배열과 비교하면 비 결정부이다.
<피브로인 L사슬의 아미노산 배열>
이것에 대하여, 야잠의 견 단백질의 아미노산 배열은 가잠과 다르지만, 야잠중에서 안테레아에 속하는 천잠(Antheraea yamamai), 작잠(Antheraea pernyi), 에리 누에(Samia cynthia ricini), 무가 누에(Antheraea assama), 타사르 누에(Antheraea militta) 등은 거의 같은 아미노산 배열을 하고 있다.
천잠 피브로인으로는 10잔기 이상의 알라닌(A)만의 반복으로 이루어져 있는 부분을 결정부, 그 이외를 비 결정부라고 한다.
가잠 피브로인과 비교하여, 안테레아에 속하는 야잠 피브로인에서는 결정부와 비 결정부의 각 반복부의, 잔기 수가 적다.
10잔기 이상 알라닌이 계속되고 있는 결정부를 제외하고 천잠 피브로인의 비 결정부의 아미노산 배열을 다음에 나타낸다.
아미노산 조성으로부터 N말단부 및 C말단부도 비 결정부이다.
<천잠 피브로인의 비 결정부의 1차 구조>
N말단부: 개시 펩티드
비 결정부:
C말단부:
그런데, 본 발명에서는 세포 생육 촉진성이 우수한 견 단백질 성분에 대하여, 각 성분의 어느 부분에 세포 생육 촉진성이 있는가를 분석해 온 바, 비 결정부에 세포 생육 촉진성이 있는 것이 밝혀졌다.
피브로인의 비 결정부란 상기한 아미노산 배열 부분이다.
따라서, 비 결정부에는 N말단부 및 C말단부도 포함되어 있다.
가잠 피브로인의 비 결정부의 AO1~A11(28~32 잔기의 펩티드)에서는, 모두 동일한 우수한 세포 생육성을 나타내지만, AO1~A11은 완전히 같은 아미노산 배열은 아니다.
A11의 경우, 다른 AO1~A10과는 32잔기중 8잔기 이내에서 아미노산 잔기 배열이 다르다.
따라서, 30%정도 이하의 아미노산 잔기 배열에 차이가 있어도 세포 생육성에 영향은 없다.
또, 20%정도 이내에 아미노산 잔기 수에 증감이 있어도 세포 생육성에 영향은 적다.
그러나, 세포 생육 촉진성을 유지하는데는 아미노산 배열의 차이는 50% 이하가 바람직하다.
한편, 아미노산 잔기 수가 상당히 적은 펩티드에서는 세포 생육 촉진성이 발현하지 않는다.
특히, 아미노산이 2잔기 이하에서는 세포 생육을 저해하는 일이 있다.
따라서, 세포 생육 촉진 펩티드로서는 4~40잔기, 바람직하게는 6~32잔기의 펩티드가 좋다.
또한, 비 결정부에서도 염기성 아미노산 잔기를 거의 포함하지 않고, 산성아미노산 잔기 및/또는 극성 비전하 아미노산을 많이 포함하는 부분 펩티드가 세포 생육 촉진성이 우수하다는 것이 밝혀졌다.
특히, 산성 아미노산 잔기는 극히 우수한 세포 생육 촉진성을 나타냈다.
비 결정부는, 전체로서는 우수한 세포 생육 촉진성을 나타내지만, 부분으로서는 G와 A의 합이 55%를 초과하고, 또 염기성 아미노산 잔기가 많기 때문에, 세포 생육율이 낮은 아미노산 배열부가 있다.
그래서, 피브로인의 비 결정부에서 산성 아미노산이 존재하고, 그래서 또 극성 비전하 아미노산이 존재한다.
또, 염기성 아미노산이 거의 존재하지 않는 부분 펩티드를 분리, 회수한다.
회수한 부분 펩티드중에서 아미노산 잔기 수가 40이하로, 세포 생육율이 펩티드 무첨가를 대조구로 하여, 실시예 1~실시예 3과 같은 세포 배양 시험에서 세포 생육율이 대조구의 2배 이상의 값을 나타내는 펩티드를 SDFGP라고 한다.
또, 아미노산 잔기 수 4~40의 복수의 펩티드의 혼합물이라도, 세포 생육율이 대조구의 2배 이상이면 SDFGP라고 한다.
그 조건으로서는, 비 결정부의 부분 펩티드에 있어서
1. G와 A의 잔기 수의 합이 펩티드의 전체 잔기 수에 대하여 55% 이하이다.
G나 A가 많으면 결정이 되기 쉽기 때문이다.
2. 염기성 아미노산 잔기 수는 펩티드의 전체 잔기 수에 대하여 25% 이하이다.
3. 산성 아미노산 및/또는 극성 비전하 아미노산이 존재한다.
라고 하는 사항을 충족시키는 것이 필요하고, 이것은 표 6에 나타난 점으로부터 용이하게 추고할 수 있다.
또, 이들을 충족시키지 않을 경우, 세포 생육성을 저해하는 것이 있다.
그와 관련하여, 아미노산 또는 펩티드의 성질은 측쇄의 화학 구조에 따라서 다르다.
산성 아미노산은 세포 생육 촉진성이 우수하여도, E와 D에서는 측쇄의 길이가 다르기 때문에, 측쇄나 주쇄의 유연성이나 입체 구조가 달라, 같은 세포 생육 촉진성을 나타내지 않는다.
이것은 극성 비전하 아미노산이나 염기성 아미노산이라 말할 수 있는 각종의 아미노산에 대해서도, 동일하게 말할 수 있는 것으로, 물리 화학적 성질이 각각 다르기 때문에 같은 세포 촉진성이나 저해성을 나타내는 것은 아니다.
우리 몸을 만들고 있는 세포는 크게는 부착성의 세포와 부유성의 세포로 나눠진다.
부착성의 세포에는 피부 세포, 혈관 세포, 선 세포 등이 있다. 부유 세포에는 혈액 세포 등이 있다.
부착성의 세포의 생육 과정은, 먼저 접착하고 나서 증식하기 때문에, 크게는 접착과 증식으로 나눠진다.
본 발명의 SDFGP는 접착성, 증식성의 성질을 갖는데 비하면 접착성이 우수하다.
증식성이 우수한 것은, 세포를 이상하게 증식시키는 것이 되어, 장기에 사용할 경우, 안전성에 과제가 남는다.
따라서, 접착성이 우수하고, 증식 촉진성을 갖고, 세포 생육을 저해하지 않는 본 발명의 SDFGP는 스킨 케어 소재로서 또 바이오 소재로서 극히 우수하다.
실제로, 견 단백질로부터 부분 펩티드를 분리, 회수할 경우는 특이적인 펩티드 결합을 절단하는 단백질 분해 효소 또는 그 밖의 화학물질로 견 단백질을 절단하고, 단편중에서 비 결정부에 속하는 아미노산 잔기 수 40이하의 펩티드를 회수한다.
또, 얻어진 부분 펩티드를 기초로 세포 생육이 우수한 펩티드를 설계하고, 합성할 수 있다.
1. 견 단백질로부터 펩티드의 분리, 회수
견 단백질의 비 결정부를 분리, 회수하는데는, 비 결정부의 특징을 이용하면 좋다.
비 결정부는 물에 쉽게 용해되기 때문에, 견 물질을 중성 부근(pH 5.0~9.0)의 물에 침지하면 좋다.
그러나, 간단히 견 물질을 침지하는 것만으로는 효율좋게 비 결정부의 펩티드를 얻을 수 없다.
그래서, 견 단백질의 특이적인 펩티드 결합을 적극적으로 절단한다.
이와 같은 펩티드 결합의 절단 방법으로서는, 특이적인 펩티드 결합을 적극적으로 절단하는 화학 물질이나 효소 등을 사용하는 것이 바람직하다.
이하에 이것을 서술한다.
1) 원료
가잠으로는 피브로인의 H사슬, L사슬 및 세리신의 a성분이 남아있는 견 단백질을 원료로 한다.
야잠(천잠, 작잠, 에리 누에, 무가 누에, 타살 누에 등)으로는, 피브로인의 전기 영동상에 가잠 피브로인의 H사슬과 동일한 정도로 명확한 밴드가 확인되는 경우를 원료로 한다.
원료는 피브로인, 세리신 단독이라도 피브로인과 세리신이 동시에 존재하고 있어도 좋다.
따라서, 본 발명의 원료 물질은 고치의 실, 생사, 견 직편물, 견사(피브로인 섬유), 그들의 잔사, 또는 그들을 원료로 한 섬유, 분말, 필름 등, 가잠 및 야잠 등의 견사충류(絹絲蟲類)가 토사하는 단백질 섬유 물질(견 물질) 전부를 대상으로 할 수 있다.
그러나, 이들 원료에는 가잠 피브로인 H사슬, 세리신의 a성분, 야잠으로는 그들에 상당하는 성분이 존재할 필요가 있다.
피브로인의 H사슬은 L사슬보다 분해하기 쉽기 때문에, H사슬의 일부라도 남아 있으면 L사슬의 대부분이 분해하지 않고 남아 있다.
2) 원료의 용해
중성염으로 용해되는 상기 1)의 원료는 정련물, 반 정련물, 미 정련물 및 그들의 중간물이라도 좋다.
세리신 누에 고치의 실이라도 좋다.
중요한 것은 그들 견 단백질이 미분해이거나, 혹은 각종의 가공 공정을 거치고도 피브로인의 H사슬, 세리신의 a성분 및 그들에 상당하는 단백질의 일부가 미분해로 남아 있는 것이다.
H사슬나 a성분 등이 존재하는지 여부의 확인은 전기 영동상에서, 각각에 상당하는 밴드의 존재를 확인하는 것으로 행한다.
원료 견사의 용해제인 중성염으로서는, 예를 들면 염화 칼슘, 구리 에틸렌 디아민, 티오시안산 나트륨, 티오시안산 리튬, 브롬화 리튬, 질산 마그네슘 등의 중성염을 들 수 있다.
해당 중성염에서도 포화 수용액 또는 50%[중량(g)/용량(ml)] 포화 이상의 농도가 바람직하다.
피브로인과 세리신이 포함되어 있을 경우, 예를 들면 고치의 실이나 미 정련물, 반 정련 등은 상기 중성염에서 견사와 마찬가지로 용해한다.
한편, 세리신 누에 고치의 실과 같이 세리신이 98% 이상인 경우는 8M 요소로 70~90℃, 10분 이내에 용해한다.
또, 세리신 누에 고치의 실은, 9MLiBr로도 실온(20~30℃)에서 30분 이내에 용해할 수 있다.
용해시의 조건은 이들 조건에 준하여 바꾸어 행한다.
견 물질을 중성염 용액에 용해하는 공정에서는, 중성염에 메틸알콜, 에틸알콜, 프로필알콜 등의 알콜을 첨가해도 좋다.
중성염으로서 염화 칼슘을 사용할 경우는 94℃ 이하의 온도에서, 바람직하게는 75~85℃ 정도의 온도에서 행한다.
브롬화 리튬을 사용할 경우는 50℃정도 이하의 온도에서 원료를 용해하는 등, 중성염에 따라서 용해 조건은 다르지만, 피브로인의 H사슬, 세리신의 a성분이 남아 있는 또는 그것에 상당하는 용해 방법을 행한다.
견 물질의 용해에 있어서는,
1. 교반함으로써 용해를 촉진할 수 있다.
2. 용해 온도가 낮으면 용해하기 어렵다.
용해 온도가 높으면 용해하기 쉽지만, 분자량 저하가 심하게 일어난다.
견을 중성염에서 용해한 용해액에는, 피브로인 혹은 피브로인과 세리신의 혼합물외에 중성염, 알콜 등이 포함되어 있다.
이 용해액으로부터, 먼저 불용물을 제거하고, 뒤이어 투석막이나 투석 장치를 사용하여 분자량 약 5,000 이하의 저 분자물을 제거한다.
이와 같은 투석에 의하여 견 단백질 수용액을 얻는다.
3) 효소에 의한 분해와 회수
일반적으로, 단백질 분해 효소에 의한 단백질의 절단은 특이적인 펩티드 결합에서 일어나고, 절단이 온화한 조건하에서 행해지기 때문에, 아미노산 잔기 측쇄의 변형이 일어나지 않는다고 말해지고 있다.
또, 단백질의 비 특이적 절단에 의한 단편의 복잡화를 피하는 것도 가능하다.
이와 같은 효소에는, 리실엔도펩티다아제, 세린프로테아제, 메타로엔도펩티다아제, 아르기닐엔도펩티다아제, 메타로프로테아제, 키모트립신, 파파인, 알카라아제, 펩신, 렌닌, 판크레아틴, 엘라스타아제, 카르복시펩티다아제, 아미노펩티다아제, 디펩티다아제 등이 있다.
이들중에서, 결정부와 비 결정부를 나누는데는, 키모트립신이 특히 바람직하다.
견 단백질 수용액에 단백질 분해 효소를 첨가하면, 견 단백질은 특이한 펩티드 결합사이에서 절단된다.
절단된 견 단백질 유래의 펩티드가 주로 견 단백질의 결정부 유래의 단편이면 응집되기 쉽고, 응집(응고, 혹은 결정화)하면 침전한다.
응집되기 어려운 경우에도, 결정부 유래의 펩티드만큼 응집되기 쉽기 때문에, 응집제로서 알콜(메틸 알콜, 에틸 알콜 등)등을 첨가하면 결정부 유래 펩티드로부터 응집되고 시작하여, 침전한다.
침전물을 제거하면, 나머지는 비 결정부 유래 펩티드의 용액이다.
침전물의 제거에는, 침전물을 포함한 용액을 원심 분리기(1,000~10,000G)로 나누어, 침전물을 제거한다.
침전물을 제거한 용액은 비 결정부로부터 분리된 비 결정 부분의 펩티드의 수용액이다.
이것을 건조하면, 필름상 혹은 분말상의 펩티드를 얻을 수 있다.
단, 비 결정부 유래의 펩티드 수용액에 알콜을 첨가한 경우, 알콜 농도가 진해짐에 따라 비 결정부 유래의 펩티드도 순차적으로 응집되어, 침전된다.
이 비 결정부 유래의 펩티드에 결정부의 부분 펩티드가 50%정도 이하이면 포함되어 있어도 좋다.
그러나, 비 결정성부 유래의 펩티드라도 세포 생육 촉진성이 우수한 펩티드를 얻는데는, 글리신과 알라닌 잔기 수의 합이, 55%를 넘지 않는 것이 바람직하다.
또, 염기성 아미노산 잔기 수가 펩티드 구성 잔기 수의 25%이하인 것이 바람직하다.
한편, 산성 아미노산 잔기나 비극성 전하 아미노산 잔기는 많을수록 좋다.
특히, 산성 아미노산 잔기 수가 많으면 세포 생육 촉진성이 우수하다.
건조는 동결 건조법이나 스프레이 드라이법으로 건조한다.
비 결정부 유래의 펩티드는 건조후에 결정화하고 있어도, 저 분자량이기 때문에 물에 용해되기 쉽다.
2. 견 단백질 유래 섬유아세포 증식 펩티드(SDFGP)의 합성
견 단백질로부터 분리, 회수한 SDFGP로서는 다음의 펩티드가 있다.
이들은, SDFGP의 일례이다.
또한 전술한 SDFGP의 조건을 충족시키는 많은 SDFGP가 존재하는 것은 말할 것도 없다.
우수한 세포 생육 촉진성은 이들 SDFGP의 일부의 아미노산 배열만이라도 SDFGP가 될 수 있다.
또, 40잔기 이내에 이들 펩티드가 반복되거나, 다른 펩티드와 연결해도 좋다.
그러나, 아미노산의 상태에서는 세포 생육 촉진 기능을 갖고 있지 않다.
기능을 갖는 세포 생육 아미노산 잔기 수는 4잔기 이상 필요로 한다.
그러나, 펩티드 합성의 효율로부터 40잔기 이하가 바람직하다.
SDFGP의 합성은, 견 단백질의 비 결정부의 아미노산 배열을 모방하고, 전술한 SDFGP의 조건을 충족시키는 펩티드를 합성한다.
합성 펩티드의 아미노산 잔기는 4~40, 바람직하게는 6~32 잔기이다.
이 경우, 견 단백질의 아미노산 배열과 완전하게 같지 않아도 좋다.
예를 들면, 피브로인 H사슬의 비 결정부(AO1~A11)의 아미노산 배열은 전부가 같지 않지만, 세포 생육 촉진성은 거의 같아, 모두 SDFGP이다.
따라서, 아미노산 배열에 30%정도 이하의 차이가 있어도 좋지만, 아미노산 배열의 차이는 50% 이하가 바람직하다.
이 경우, 산성 아미노산은 많을수록 좋고, 극성 비전하 아미노산은 있는 쪽이 바람직하다.
그러나, 염기성 아미노산은 거의 없는 쪽이 바람직하다.
즉, 각 SDFGP의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되어도 좋다.
이 경우, 염기성 아미노산 잔기는 펩티드를 구성하는 아미노산 잔기 수의 적어도 25% 이하가 되도록 한다.
한편, 펩티드(SDFGP)에서의 산성 아미노산은 많은 쪽이 바람직하다.
전체 아미노산 잔기가 산성 아미노산 및/또는 비극성 전하 아미노산으로 구성되어 있어도 좋다.
따라서, A-6-2로부터 DSDGDE, A-6-6으로부터 DEDEDE, EDEDED, SfHA로부터 SSESSE나 YGGYEY, AfH1으로부터 DGGYGGD, AfHS로부터 DEYDEY, AfHG로부터 YEEDYEED등, 또한, EEEE, EEEEEE, EYEYEY, EEYEEY, YYYYYY, EGSEGS 등 많은 펩티드가 SDFGP가 될 수 있다.
전술한 SDFGP의 조건의 범위에서, 이들 펩티드가 반복되거나, 다른 펩티드와 연결해도, 분자량 1만 이하이고, 바람직하게는 4,000~400의 범위이면 좋다는 것은 말할 필요도 없다.
그리고 또, 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 삽입 변형되어 있어도 좋다.
4. 이용
견 단백질의 비 결정부로부터 얻은 펩티드 집합물 및 SDFGP는 세포 생육 촉진성이 우수할 뿐만 아니라, 물에 용해되기 쉽다.
또, 분자량이 4,000정도 이하이기 때문에 용해하고 있는 상태에서도 장기간 형태가 안정하다.
또한, 각종의 SDFGP를 혼합하면 단독으로 있는 것보다 세포 생육은 촉진된다.
따라서, 세포 배양액, 화장수, 유액, 크림, 연고, 안약, 식품 등에 이들을 혼합하여 첨가한다.
본 발명의 펩티드 집합물 및 SDFGP는 피부 세포를 생육 촉진하는 작용이 우수하기 때문에, 스킨 케어용 소재로서, 또, 세포 배양 소재로서 상기 이외의 분야, 예를 들면 의류 섬유, 화장 분말, 수지 등의 개량에도 우수한 소재이다.
[실시예 1]
견 피브로인의 효소 분해물의 세포 생육 활성
1. 견 단백질의 비 결정부를 효소로 분해, 분리, 분획
가잠의 고치를 절개하여 번데기를 제거하고, 고치층(10g)을 30배 양의 8M 요소, 90℃에 10분 침지하고, 세리신을 추출했다.
추출 잔여물은 물세척, 건조하여 이것을 피브로인이라고 했다.
피브로인 1.0g을 9M LiSCN 10ml에 침지하여 녹이고, 이것에 증류수 10ml를 가하고, 이것을 3,000mp, 10분간 원심했다.
상청액을 반투막에 넣고 50배 양의 물에 대하여 투석했다.
투석은, 30분마다 투석 외액의 물을 바꾸어 4회 행했다.
투석후에 용액을 다시 원심하고, 상청액에 0.1M 인산 수소 2나트륨(pH 8.5)을 가하여, pH를 7~8로 조제했다.
거기에 피브로인 양의 100분의 1양의 키모트립신을 넣고, 40℃에서 4시간 두었던 바 침전이 생겼다.
이때의 상청액의 단백질을 혹은 펩티드에 대하여, 피브로인의 비 결정부(A)로부터 얻어진 것을 비 결정 부분(A'), 침전물의 단백질 또는 펩티드를 결정부(C)로부터 얻어진 것을 결정 부분(C')이라고 했다.
결정 부분은 물세척하고, 9M LiSCN 1ml에 용해하고, 50배량의 물에서 전술과 마찬가지로 반투막으로 투석하여, 수용액의 단백질 양을 측정했다.
상청은 그 자체로 단백질 양을 측정했다.
2. 세포 배양 용기에 코팅
이들 결정 부분(C') 및 비 결정 부분(A')의 수용액을 각각 0.025%, 0.0025%의 농도가 되도록 70% 에탄올을 가하여 조제하고, 그것을 폴리스티렌의 샬레(35mm￠, 팔콘)에 1ml씩 넣고 풍건했다.
대조구용 샬레는 70% 에탄올만을 1ml 넣고 풍건했다.
3. 세포 배양
세포는 산코 준야쿠에서 구입한 (동결)인간 피부 섬유아세포(성인의 정상 피부 유래)를 사용했다.
배지는 쿠라보로부터 구입한 인간 피부 섬유아세포 증식용 저 혈청 배지[Medium 106S(피부 섬유아세포 기초 배지) 500ml에 LSGS(저 혈청 증식 첨가제) 10ml을 첨가]를 사용했다.
또한, LSGS에는 세포 증식성이 있다.
샬레 1장에 부착 배지 2ml을 넣고, 8만 개의 세포를 접종하고, 3일간 배양했다.
4. 알라머 블루 색소로의 생 세포 수의 측정
샬레 1장에 부착 배지 2ml, 알라머 블루(IWAKI) 0.1ml의 비율로 넣고, 37℃, 2시간 배양한 후, 570nm, 600nm의 흡광도로부터 계산한 알라머 블루 색소의 환원량을 생 세포수라고 했다.
견 단백질의 성분 무첨가의 경우를 대조군(100%)이라고 한, 결정 부분 및 비 결정 부분을 코팅한 샬레에서의 인간 피부 섬유아세포의 생육을 표 2에 나타낸다.
견 단백질 성분을 코팅한 샬레에서의 세포 생육율은 대조구와 비교하여 모두 높은 값을 나타내었다.
특히, 비 결정 부분(C')의 0.025% 농도의 생육율이 높고, SDFGP의 혼합물이다.
결정 부분에서는 농도가 진한 쪽(0.025%)이 옅은 쪽(0.0025%)보다 생육이 나빴다.
이것은, 결정 부분의 견 단백질은 세포 생육을 저해하고 있기 때문이라고 생각된다.
[실시예 2]
세포 생육 촉진 펩티드의 아미노산 배열
피브로인의 비 결정부는 결정부보다 세포 생육을 촉진하는 것이 실시예 1에서 밝혀졌다.
그러나, 실시예 1에서 분취한 비 결정 부분은 효소로 절단된 펩티드의 혼합물이라고 생각된다.
그래서, 비 결정 부분을 더욱 분리하여, 세포 생육 촉진 부위의 특정을 행했다.
먼저, 실시예 1의 비 결정 부분에 포함되는 펩티드를 극성의 차이로 나누기 위해, 역상 크로마토그래피로 분리했다.
칼럼은 RESOURCER RPCk 3ml를 사용했다.
A 펌프에 0.1% TFA(트리플루오로 아세트산)를, B 펌프에 0.1% TFA/90% 아세토니트릴을 사용하여, 0~15분에서 B가 0~75%가 되는 그래디언트로 크로마토크래피를 행했다.
그 결과, 6개의 피크(A-1, …, A-6)를 확인할 수 있었다.
각각의 피크를 회수하고, 증발기에서 건조하고, 소량의 버퍼(PBS)로 용해했다.
A-1~A-6의 각각의 농도가 0.025%가 되도록 70% 에탄올로 조정하고, 세포 배양용 폴리스티렌의 샬레(35mmØ, 팔콘)에 1ml씩 넣어 풍건했다.
대조구용 샬레는 70% 에탄올만을 1ml 넣어 풍건했다.
이들 샬레를 사용하여 세포 배양을 행했다.
세포 배양 방법은 [실시예 1]과 동일한 방법으로 행했다.
비 결정 부분의 펩티드 단편을 코팅한 샬레에서의 인간 피부 섬유아세포의 생육율을 표 3에 나타낸다.
비 결정 부분중, A-6의 생육이 대조구의 약 4배로 현저하게 우수했다.
다음에, 세포 생육성이 가장 우수한 A-6에 포함되어 있는 펩티드를 분자량으로 나누기 위해, Superdex peptide HR 10/30(겔 여과 크로마토크래피)로 분리했다.
그 결과, A-6-1~A-6-7까지의 7개의 피크를 확인할 수 있었다.
모두 분자량 2,500 이하이다.
7개의 피크의 중에서, 피크가 샤프하고 명확한 5개의 피크(A-6-2, A-6-3, A-6-4, A-6-6, A-6-7)의 펩티드를 회수하고, 각 펩티드를 세포 배양 용기에 코팅하고, 거기에 배지와 세포를 접종하고, 2일간 배양하여, 세포 생육성을 측정했다.
세포 생육성의 실험은 [실시예 1]과 동일하다.
세포 생육율의 측정 결과를 표 4에 나타낸다.
A-6-2와 A-6-6은 대조구와 비교하여, 2일간 배양으로 생육율이 1.5배를 나타내고, 세포 생육 촉진성이 우수했다.
3일간 배양으로는 생육율은 2배를 넘고 있다.
그래서, A-6-2와 A-6-6의 아미노산 배열을 펙만 주식회사의 LF3000 Protein Sequencor로 분석한 결과, 아미노산 배열은
이 됐다.
A-6-2 및 A-6-6 모두 피브로인의 N말단측의 펩티드이었다.
N말단부는 아미노산 조성으로 생각되어, 비 결정부이다.
그래서, A-6-2와 A-6-6의 펩티드를 합성하고, (홋카이도 시스템 사이언스 가부시키가이샤에 위탁), 전술과 마찬가지로 3일간 배양하여 합성 펩티드의 생리 활성을 측정한 바, 견 단백질로부터의 추출물과 마찬가지로 세포 생육 촉진성이 있는 것을 확인했다.
또, 합성한 펩티드 A-6-2와 A-6-6을 혼합한 경우, 각각을 단독으로 세포 배양한 경우보다 세포 생육 촉진성이 우수했다.
[실시예 3]
합성 펩티드의 세포 생육율
가잠 피브로인 H사슬 및 천잠 피브로인의 아미노산 배열을 기초로, 각각 합계 12부위에 대하여 합성한 펩티드(홋카이도 시스템 사이언스 가부시키가이샤에 위탁)의 세포 활성을 측정했다.
1. 펩티드 합성
가잠 피브로인의 결정부로부터 2곳의 부분 펩티드(SfHC-1, SfHC-2), 및 비 결정부로부터 2곳의 부분 펩티드(SfHE, SfHA)를 택했다.
또, 천잠 피브로인은 결정부로서 Ala(A)의 반복 부분(AfHO), 및 비 결정부의 7부분 펩티드(AfH1~AfH7)를 택하고, 그것들을 합성했다.
가잠의 피브로인 H사슬의 부분 펩티드는 4종류, 천잠의 피브로인의 부분 펩티드는 8종류(AfHO~AfH7)있고, 각각의 펩티드의 아미노산 배열을 이하에 나타낸다.
가잠 피브로인 H사슬의 부분 펩티드(4 종류)
천잠 피브로인의 부분 펩티드(8 종류)
2. 합성 펩티드의 샬레에의 코팅
각각의 합성 펩티드를 약 1mg씩 취하고, PBS 200㎕에 용해했다. 용해한 펩티드 용액은 70% 에탄올로 희석하고, 0.025% 및 0.0025%의 농도로 조제하고, 그들을 1ml씩 샬레에 넣어 건조했다.
SfHC-1, SfHC-2, SfHE는 용해하기 어렵기 때문에, 9M LiSCN 1ml을 추가하여 용해했다.
용해액을 반투막에 넣고 100배량의 물에서 30분마다 외액을 바꾸어 투석하여, 275nm의 흡광도로 단백질 양을 확인했다.
SfHC-2는 티로신 등이 없기 때문에, 흡광도의 측정은 가능하지 않았지만, SfHC-1, SfHE는 용해전과 거의 동량 존재하고 있기 때문에, SfHC-2도 동량있다고가정하고, 다른 펩티드와 마찬가지로 70% 에탄올로 희석하여 샬레에 넣고 건조했다.
또, AfHO도 용해하기 어렵지만, 투석하면 분자량이 작기 때문에 빠져나가 버릴 가능성이 있기 때문에, 잘 교반하여 70% 에탄올로 희석하고 샬레에 넣어 건조했다.
3. 배양
세포는 산코 준야쿠에서 구입한 (동결)인간 피부 섬유아세포(성인의 정상 피부 유래)를 사용했다.
배지는, 쿠라보로부터 구입한 인간 피부 섬유아세포 증식용 저 혈청 배지를 사용했다.
샬레 1장에 부착 배지 2ml을 넣고, 약 8만개의 세포를 접종하고, 3일간 배양했다.
그 후, 알라머 블루(IWAKI)을 0.1ml 넣고, 37℃, 2시간 배양한 후 570nm, 600nm의 흡광도로부터 계산한 색소의 환원량을 생 세포수라고 했다.
이들 세포 배양에 관한 측정 방법은 실시예 1과 동일하다.
결과를 표 5, 표 6에 나타낸다.
가잠 피브로인에서는, 피브로인의 결정부의 부분 펩티드 SfHC-1, SfHC-2보다, 비 결정부의 부분 펩티드인 SfHE, SfHA의 생육율이 높고, 대조구의 2배 이상의 값을 나타내며, 비 결정부의 부분 펩티드, 또는 그 혼합물은 SDFGP이다.
천잠 피브로인의 결정부의 부분 펩티드인 AfH0에는 활성은 거의 없고, 농도가 진한 쪽(0.025%)이 생육율이 낮기 때문에, 세포 생육을 저해하고 있다고 생각된다.
비 결정부의 부분 펩티드 합성물 AfH1~AfH7은 세포 생육 촉진성을 나타냈지만 생육율에 차이가 나타냈다.
예를 들면, AfH3과 AfH6은 모두 염기성 아미노산을 1잔기 포함하지만, AfH3은 산성 아미노산 잔기가 적고, AfH6은 산성 아미노산 잔기가 많기 때문에, AfH6의 쪽이 높은 세포 생육 촉진성을 나타냈다.
특히 AfH1, AfH5, AfH6, AFH7은 우수한 세포 생육 촉진성을 나타내고, 모두 합성에 의해 얻어진 SDFGP이다.
표 6에서 나타낸 바와 같이, 비 결정부로부터 얻은 부분 펩티드의 세포 생육율은 모두가 높아 SDFGP가 되는 것만은 아니다.
그것은, 표 7에서 나타낸 바와 같이 각 펩티드를 구성하는 아미노산 측쇄의 화학 구조의 차이에 따른다.
[실시예 4]
합성 펩티드의 세포 생육 활성
실시예 1~실시예 3의 결과를 기초로 세포 생육 활성을 나타낸다고 생각되는 산성 아미노산 및 극성 비전하 아미노산을 주성분으로 한 합성 펩티드(홋카이도 시스템 사이언스 가부시키가이샤에 합성을 위탁)의 섬유아세포 생육 활성을 측정했다.
세포 생육 활성의 측정 방법은 [실시예 1]과 동일하게 행했다.
세포 배양은 3일간 행하고, 펩티드 농도 0.025㎍/cm2의 경우에 대하여 결과를 표 8에 나타낸다.
글루탐산에서는 4잔기 이상의 배열이 되면 세포 생육 활성이 우수했다.
[실시예 5]
합성 펩티드의 세포 접착 및 증식 촉진성
견 단백질 유래의 합성 펩티드 또 산성 아미노산 또는 극성 비전하 아미노산을 주로 한 합성 펩티드 등이 갖는 세포 생육 활성에 대하여, 세포 생육성을 더욱 상세하게 세포 접착성과 증식성으로 나누어 측정했다.
이 측정 방법은 [실시예 1]에서의 3. 세포 배양의 방법과는 방법이 일부 다르다.
여기에서의 세포 배양에서는, 세포는 산코 준야쿠에서 구입한 (동결)인간 피부 섬유아세포(성인의 정상적인 피부 유래)를 사용했다.
배지는 쿠라보로부터 구입한 인간 피부 세포 아세포 증식용 저 혈청 배지(Medium 106S 500m)를 사용했다.
Medium 106S는 피부 섬유아세포 기초 배지이다.
여기에서는 LSGS(저 혈청 증식 첨가제)는 사용하지 않는다.
접착성을 측정할 경우는, 배지에 세포를 접종한 5시간 후에 배지에 부유하고 있는 세포를 제거하고, 샬레의 바닥에 접착하고 있는 생 세포수를 측정했다.
증식성을 측정할 경우는, 배지에 세포를 접종한 때로부터 3일간 배양한 후의 생 세포수를 측정했다.
세포 배양법외는, [실시예 1]과 마찬가지로, 펩티드의 세포 배양 용기에의 코팅, 알라머 블루 색소에 의한 생 세포수의 측정 등을 행했다.
펩티드를 세포 배양 용기에 코팅하지 않은 경우의 생 세포수를 대조구(100%)로 하여, 얻어진 접착성의 결과를 표 9에, 또 증식성의 결과를 표 10에 나타낸다.
즉, 표 9는, 각종 펩티드를 코팅한 샬레에서 인간 피부 섬유아세포를 5시간 배양한 후의 접착성을 나타낸다.
여기에서 합성 펩티드는 기호 또는 아미노산 배열로 나타냈다.
이 경우, 각 샬레에 코팅한 때의 각 펩티드의 농도는 0.025㎍/cm2이다.
펩티드를 코팅하지 않은 경우의 접착율(%)을 100으로 했다.
표 10은, 각종 펩티드를 코팅한 샬레에서 인간 피부 섬유아세포를 3일간 배양한 후의 증식성을 나타낸다.
여기에서 합성 펩티드는 기호 또는 아미노산 배열로 나타냈다.
이 경우, 각 샬레에 코팅한 때의 각 펩티드의 농도는 0.025㎍/cm2이다.
펩티드를 코팅하지 않은 경우의 증식율(%)을 100으로 했다.
단, 3일간 배양한 후의 대조구에서의 생 세포수는 배양중에 약 150%로 증식하고 있지만, 대조구의 값(100%)은 3일간 배양한 후의 생 세포수를 기초로 하고 있다.
따라서, 3일간의 배양중에 세포수가 증감하지 않은 경우의 증식율은 약 70%가 된다.
본 발명은, 분자량이 1만 이하, 바람직하게는 4,000에서 400의 특정한 아미노산 배열을 갖는 펩티드를, 견 단백질의 비 결정부로부터 분리, 분획하는 동시에, 그것들과 유사한 펩티드를 합성함으로써, 세포 생육성이 우수한 신규 펩티드를 제공할 수 있었다.
이들의 펩티드를 세포 접착제, 세포 증식 촉진제, 창상 치료 촉진제, 화장료 등의 스킨 케어용 소재나 세포 배양 기재 등의 바이오 소재로서 유용 가능하다.
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<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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1 5
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<213> Bombyx mori
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20
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<212> PRT
<213> Bombyx mori
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Gly Ser Ser Gly Phe Gly Pro Tyr Val Ala His Gly Gly Tyr Ser Gly
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Tyr Glu Tyr Ala Trp Ser Ser Glu Ser Asp Phe Gly Thr
20 25
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<213> Antheraea yamamai
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<212> PRT
<213> Antheraea yamamai
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Tyr Glu Glu Asp
20
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<212> PRT
<213> Antheraea yamamai
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<212> PRT
<213> Bombyx mori
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1 5 10 15
Ala Tyr Thr Asn Ala Asn Ile Asn Asp Phe Asp Glu Asp Tyr Phe Gly
20 25 30
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<213> Bombyx mori
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Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys Val Asn Cys
35 40
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<213> Bombyx mori
<400> 11
Gly Ser Ser Gly Phe Gly Pro Tyr Val Ala Asn Gly Gly Tyr Ser Arg
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Ser Asp Gly Tyr Glu Tyr Ala Trp Ser Ser Asp Phe Gly Thr
20 25 30
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Gly Ser Ser Gly Phe Gly Pro Tyr Val Ala Asn Gly Gly Tyr Ser Arg
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20 25 30
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<213> Bombyx mori
<400> 22
Met Lys Pro Ile Phe Leu Val Leu Leu Val Ala Thr Ser Ala Tyr Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ser Val Thr Ile Asn Gln Tyr Ser Asp Asn Glu Ile Pro Arg
20 25 30
Asp Ile Asp Asp Gly Lys Ala Ser Ser Val Ile Ser Arg Ala Trp Asp
35 40 45
Tyr Val Asp Asp Thr Asp Lys Ser Ile Ala Ile Leu Asn Val Gln Glu
50 55 60
Ile Leu Lys Asp Met Ala Ser Gln Gly Asp Tyr Ala Ser Gln Ala Ser
65 70 75 80
Ala Val Ala Gln Thr Ala Gly Ile Ile Ala His Leu Ser Ala Gly Ile
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Pro Gly Asp Ala Cys Ala Ala Ala Asn Val Ile Asn Ser Tyr Thr Asp
100 105 110
Gly Val Arg Ser Gly Asn Phe Ala Gly Phe Arg Gln Ser Leu Gly Pro
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Ile Asn Pro Gly Gln Leu Arg Tyr Ser Val Gly Pro Ala Leu Gly Cys
145 150 155 160
Ala Gly Gly Gly Arg Ile Tyr Asp Phe Glu Ala Ala Trp Asp Ala Ile
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Leu Ala Ser Ser Asp Ser Ser Phe Leu Asn Glu Glu Tyr Cys Ile Val
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Ser Ala Gly Ser Ile Thr Asp Leu Leu Arg Gly Val Gly Asn Gly Asn
225 230 235 240
Asp Ala Thr Gly Leu Val Ala Asn Ala Gln Arg Tyr Ile Ala Gln Ala
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Ala Ser Gln Val His Val
260
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<213> Antheraea yamamai
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Met Arg Val Thr Ala Phe Val Ile Leu Cys Cys Ala Leu Gln Tyr Ala
1 5 10 15
Thr Ala Asn Asn Leu His His His Asp Glu Tyr Val Asp Asn His Gly
20 25 30
Gln Leu Val Glu Arg Phe Thr Thr Arg Lys His Tyr Glu Arg Asn Ala
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Ala Ser His Gly Ala Gly Gly Ala
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Ser Ser Ser Gly Arg Ser Thr Glu Gly His Pro Leu Leu Ser Ile Cys
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Cys Arg Pro Cys Ser His Arg His Ser Tyr Glu Ala Ser Arg Ile Ser
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Val His
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Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ser Ser Ala Arg Gly Gly
1 5 10 15
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Ser Gly Phe Tyr Glu Thr His Asp Ser Tyr Ser Ser Tyr Gly Ser Gly
1 5 10 15
Ser Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ser Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly
20 25 30
Gly Tyr Gly Trp Gly Asp Gly Gly Tyr Gly Ser Asp Ser
35 40 45
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<211> 17
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Gly Ser Gly Ala Gly Gly Arg Gly Asp Gly Gly Tyr Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Ser
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<211> 27
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Arg Arg Ala Gly His Asp His Ala Ala Gly Ser Ser Gly Gly Gly Tyr
1 5 10 15
Ser Trp Asp Tyr Ser Ser Tyr Gly Ser Glu Ser
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Gly Ser Gly Ala Gly Gly Val Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Asp Gly
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Ser Gly Ser Ser
20
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Arg Arg Ala Gly His Asp Arg Ala Ala Gly Ser
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Ser Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Gly Asp Gly Gly
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Tyr Gly Ser Asp Ser
20
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Gly Ser Gly Ala Gly Arg Ala Gly
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Gly Asp Tyr Gly Trp Gly Asp Gly Gly Tyr Gly Ser Asp Ser
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Tyr Gly Ser Asp Ser
20
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Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Asp Tyr Gly Trp Gly Asp Gly
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Gly Tyr Gly Ser Asp
20
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Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Asp Tyr Gly Trp Gly Asp Gly
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Gly Tyr Gly Ser Asp Ser
20
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Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Gly Asp Gly Gly
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Tyr Gly Ser Asp Ser
20
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Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Gly Tyr Gly Ser Asp Ser
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Ser Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Gly Asp Gly Gly
1 5 10 15
Tyr Gly Ser Gly Ser
20
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<400> 41
Gly Ser Gly Ala Gly Gly Val Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Gly Asp Gly
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Gly Tyr Gly Ser Asp Ser
20
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<400> 42
Ser Gly Ala Gly Gly Arg Gly Asp Gly Gly Tyr Gly Ser Gly Ser Ser
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<211> 22
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Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Gly Asp Gly
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Gly Tyr Gly Ser Asp Ser
20
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Arg Arg Ala Gly His Asp Arg Ala Ala Gly Cys
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<211> 21
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Ser Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Gly Asp Gly Gly
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Tyr Gly Ser Asp Ser
20
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Ser Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Gly Asp Gly Gly
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20
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<400> 47
Ser Gly Ala Gly Arg Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Gly Asp Gly Gly
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Tyr Ser Ser Asp Ser
20
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<400> 49
Gly Ser Gly Ala Gly Gly Val Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Gly Asp Gly
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<400> 50
Gly Ser Gly Ala Gly Gly Val Gly Gly Gly Tyr Gly Arg Gly Asp Ser
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Gly Tyr Gly Ser Gly Ser Ser
20
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Gly His Gly Arg Ser Ser Gly Ser
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Ser Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Asp Tyr Gly Ser
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<213> Antheraea yamamai
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<212> PRT
<213> Antheraea yamamai
<400> 54
Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Gly Asp Gly
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Ser Asp Ser
20
<210> 55
<211> 14
<212> PRT
<213> Antheraea yamamai
<400> 55
Ser Arg Arg Ala Gly His Asp Arg Ala Tyr Gly Ala Gly Ser
1 5 10
<210> 56
<211> 28
<212> PRT
<213> Antheraea yamamai
<400> 56
Gly Ala Gly Ala Ser Arg Pro Val Gly Ile Tyr Gly Thr Asp Asp Gly
1 5 10 15
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<211> 22
<212> PRT
<213> Bombyx mori
<400> 57
Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Ala Gly Tyr
20
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<211> 22
<212> PRT
<213> Bombyx mori
<400> 58
Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Ala Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ala
1 5 10 15
Gly Ala Gly Ala Gly Thr
20
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<211> 10
<212> PRT
<213> Antheraea yamamai
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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<213> Antheraea yamamai
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<213> Antheraea yamamai
<400> 62
Arg Arg Ala Gly His Asp Arg Ala Ala Gly Ser
1 5 10
Claims (15)
- 견 단백질을 구성하는 비 결정부의 펩티드 사슬로부터 선택되는 1 또는 2이상의 펩티드 사슬의 부분 펩티드를 함유하여 되고, 그 부분 펩티드는 아미노산 잔기 수가 4내지 40으로 이루어진 특정한 아미노산 배열을 갖는 펩티드인 것을 특징으로 하는 세포 생육 촉진성이 우수한 펩티드 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 특정한 아미노산 배열을 갖는 펩티드 사슬이, 다음의 (1)에서 (8)중 어느 아미노산 배열을 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드 조성물.
- 다음의 (1)내지 (8)중 어느 아미노산 배열을 함유하는 것을 특징으로 하는세포 생육 촉진성이 우수한 펩티드.
- 가잠의 미분해 견 단백질 또는 안테레아에 속하는 야잠의 미분해 견 피브로인을 가수분해한 후, 분자량 분획에 의해 세포 생육 촉진성이 우수한 펩티드를 분리, 취득하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 가수분해를 희석 산, 히드록실아민 또는 단백질 분해 효소에 의해 행하는 것을 특징으로 하는 세포 생육 촉진성이 우수한 펩티드를 분리, 취득하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 펩티드 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 증식 촉진제.
- 제 3 항에 기재된 펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 증식 촉진제.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 펩티드 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 접착제.
- 제 3 항에 기재된 펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 접착제.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 펩티드 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 창상 치유 촉진제.
- 제 3 항에 기재된 펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 창상 치유 촉진제.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 펩티드 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료.
- 제 3 항에 기재된 펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 펩티드 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재.
- 제 3 항에 기재된 펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 기재.
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