JP3906924B2 - 絹タンパクから細胞生育ペプチドの抽出と利用 - Google Patents
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Description
本発明は、絹タンパク由来の細胞生育促進性に優れたペプチド及びその製造法、並びにそのスキンケア用素材としての医薬品、医薬部外品、化粧品等の分野への利用及びバイオ素材として細胞培養基材への利用に関する。
絹糸は手術糸として古くから使われてきたことから、絹タンパクは生体適合性素材と考えられ、その特性に着目して各種分野において新しい用途の開発が、最近、盛んになされてきている。
例えば、絹糸を溶解して絹タンパク水溶液とした後に、これを凝固・乾燥・粉砕等により粉末化し、化粧用添加材として、また絹タンパク水溶液を平板上でキャスト等によりフィルム状物とし、細胞培養床や創傷被覆材およびコーティング材として、また絹タンパク水溶液をゲル状物とし、食品や化粧品として利用するための開発が進められている。
例えば、絹糸を溶解して絹タンパク水溶液とした後に、これを凝固・乾燥・粉砕等により粉末化し、化粧用添加材として、また絹タンパク水溶液を平板上でキャスト等によりフィルム状物とし、細胞培養床や創傷被覆材およびコーティング材として、また絹タンパク水溶液をゲル状物とし、食品や化粧品として利用するための開発が進められている。
このような開発例として、例えば、開昭６２−０００４１５号公報、特公平０１−０４４３２０号公報、特開平０１−２５４１６４号公報、特公平０６−００４６７９号公報、特開平１１−１３９９８６号公報、特開平１１−２７６８７６号公報、特許第２９９７７５８号、特許第２９９０２３９号、特開平１１−２５３１５５号公報、特願２００２−２３０６５６号、特願２００２−１４８８４９号、特開２００１−１６３８９９号公報のもが挙げられる（特許文献１から１２参照）。
これらの絹新素材開発の過程で、絹タンパクは細胞生育性、抗酸化性、抗菌性、アルコール消化性、抗血液凝固性等、多様な機能を有することが明らかにされた。
しかし、それらの機能が絹タンパクのどのような部位または構造に起因するかについてはまだ明らかになってはいない。
本発明者らは絹タンパクの有する細胞生育機能に注目し、繭糸または絹糸を溶解した後に、これを粉末、フィルム、ゲル等に変え、これらをスキンケア素材として創傷被覆材や化粧品、合成繊維の改質として利用するための開発と機能の研究を進めてきた（例えば、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２参照）。
その過程で、絹タンパクを構成するフィブロインのＨ鎖とＬ鎖およびセリシンのａ成分にはヒト正常皮膚由来線維芽細胞を生育促進する作用のあることが分かった（例えば、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５参照）。
しかし、それらの機能が絹タンパクのどのような部位または構造に起因するかについてはまだ明らかになってはいない。
本発明者らは絹タンパクの有する細胞生育機能に注目し、繭糸または絹糸を溶解した後に、これを粉末、フィルム、ゲル等に変え、これらをスキンケア素材として創傷被覆材や化粧品、合成繊維の改質として利用するための開発と機能の研究を進めてきた（例えば、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２参照）。
その過程で、絹タンパクを構成するフィブロインのＨ鎖とＬ鎖およびセリシンのａ成分にはヒト正常皮膚由来線維芽細胞を生育促進する作用のあることが分かった（例えば、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５参照）。
一方、繭糸は繊維として衣服以外の分野、例えば、繭を各種加工工程を経て生糸、さらに絹織物に加工して、医療（手術用縫合糸）や化粧（パフ）等の分野で利用されているが、最近、このような繭や生糸の加工工程で絹タンパクの分子量は低下することが分かってきた。
また、繭糸や絹糸を粉末、フィルム、ゲル等に変える加工工程（特に、繭糸や絹糸の溶解工程）においても絹タンパクの分子量は低下することが分かってきた〔H.Yamadaら著：Materials Science & Engineering C,14,P.41-46(2001)〕、
〔坪内紘三、山田弘生、高須陽子：日本蚕糸学会誌、７１巻、１号、P.1-5(2002) 〕( 非特許文献、非特許文献２参照) 。
また、繭糸や絹糸を粉末、フィルム、ゲル等に変える加工工程（特に、繭糸や絹糸の溶解工程）においても絹タンパクの分子量は低下することが分かってきた〔H.Yamadaら著：Materials Science & Engineering C,14,P.41-46(2001)〕、
〔坪内紘三、山田弘生、高須陽子：日本蚕糸学会誌、７１巻、１号、P.1-5(2002) 〕( 非特許文献、非特許文献２参照) 。
このような加工により分子量の低下した絹タンパクは、電気泳動像では分子量約１から20万の間に１つのスメアーでブロードなバンドが見えるのみである。
分子量１万程度以下はほとんど透析等の工程で除外されてしまうが、実際はアミノ酸やペプチド程度にまで分子量が低下している。
分子量が低下した絹タンパクはヒト細胞生育促進性が低下し、あるいは細胞生育を阻害していることが分かった（特許文献１１参照）。
分子量１万程度以下はほとんど透析等の工程で除外されてしまうが、実際はアミノ酸やペプチド程度にまで分子量が低下している。
分子量が低下した絹タンパクはヒト細胞生育促進性が低下し、あるいは細胞生育を阻害していることが分かった（特許文献１１参照）。
つまり、未分解フィブロイン、未分解セリシンは細胞生育促進性が優れているにもかかわらず、繭加工過程の酸やアルカリ、光、熱等の処理によるペプチド結合の複雑な、または不均一な切断のため分子量低下とともに細胞生育の阻害が生じている。
したがって、絹タンパクの細胞生育促進機能を利用するためには未分解絹フィブロイン、未分解絹セリシンあるいはフィブロインのＨ鎖（分子量約３５万）、Ｌ鎖またはセリシンａ（分子量約４０万）等を未分解の状態で利用することが好ましい。
したがって、絹タンパクの細胞生育促進機能を利用するためには未分解絹フィブロイン、未分解絹セリシンあるいはフィブロインのＨ鎖（分子量約３５万）、Ｌ鎖またはセリシンａ（分子量約４０万）等を未分解の状態で利用することが好ましい。
しかし、これら３成分（特にＨ鎖やセリシンａ）は分子量が非常に大きく、一定の性状で長期保存するための安定性が低い。
また、Ｌ鎖はフィブロイン中で１０％以下の重量割合で含まれているに過ぎなく、量的に少ない。
さらに、これら３成分について、各成分のどの部分に細胞生育促進作用があるかを明らかにした報告は、未だなされていない。
また、Ｌ鎖はフィブロイン中で１０％以下の重量割合で含まれているに過ぎなく、量的に少ない。
さらに、これら３成分について、各成分のどの部分に細胞生育促進作用があるかを明らかにした報告は、未だなされていない。
フィブロインのＨ鎖やセリシンのａ成分は細胞生育促進性に優れているが、分子量が３０万以上の高分子量であり、結晶化しやすい。
これに比べてフィブロインのＬ鎖は分子量２. ５万であり、Ｈ鎖やａ成分と比較すれば分子量は小さいが、通常のタンパクと比べれば、結晶に成りやすい性質を持っている。
また、フィブロインのＨ鎖とＬ鎖の重量比はほぼ１３(Ｈ鎖) 対１(Ｌ鎖) であり、Ｌ鎖の割合は非常に少ない。
このような高分子量で結晶性のタンパクは水溶液において安定性が低い。
また、油成分等の医薬品や化粧品添加物を加えるとゲル化し易く、性状が不安定で、長期（１年以上）の貯蔵に対する安定性が低い。
これに比べてフィブロインのＬ鎖は分子量２. ５万であり、Ｈ鎖やａ成分と比較すれば分子量は小さいが、通常のタンパクと比べれば、結晶に成りやすい性質を持っている。
また、フィブロインのＨ鎖とＬ鎖の重量比はほぼ１３(Ｈ鎖) 対１(Ｌ鎖) であり、Ｌ鎖の割合は非常に少ない。
このような高分子量で結晶性のタンパクは水溶液において安定性が低い。
また、油成分等の医薬品や化粧品添加物を加えるとゲル化し易く、性状が不安定で、長期（１年以上）の貯蔵に対する安定性が低い。
一方、絹フィブロインＨ鎖やセリシンａより分子量が低く、細胞生育性に優れた物質としては各種細胞の増殖因子、例えば分子量１．７７から１．９万の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）がある。
これらは腫瘍やガン化した細胞、または急激に増殖している細胞から分泌され、その中には皮膚潰瘍治療剤として使われているものもある（フィブラストスプレー、科研薬品株式会社）が、安全性に問題がある。
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものである。
即ち、腫瘍細胞などの異常な細胞によって産生された細胞増殖因子とは異なり、安全性に優れ、比較的低分子量で安定性にも優れ、かつ細胞生育促進性に優れたペプチドを得ることを目的とする。
これらは腫瘍やガン化した細胞、または急激に増殖している細胞から分泌され、その中には皮膚潰瘍治療剤として使われているものもある（フィブラストスプレー、科研薬品株式会社）が、安全性に問題がある。
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものである。
即ち、腫瘍細胞などの異常な細胞によって産生された細胞増殖因子とは異なり、安全性に優れ、比較的低分子量で安定性にも優れ、かつ細胞生育促進性に優れたペプチドを得ることを目的とする。
本発明者らは、上記問題点を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、絹フィブロインの特定の部位のペプチド鎖に細胞生育促進機能があることを突き止めることに成功し、本発明を完成するに至ったものである。
即ち、本発明は、絹タンパクを構成する非結晶部のペプチド鎖から選ばれる１又は２以上のペプチド鎖の部分ペプチドを含有してなり、該部分ペプチドはアミノ酸残基数が４から４０からなる特定のアミノ酸配列を有するペプチドであり、該特定のアミノ酸配列を有するペプチド鎖が、次の（１）から（８）のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする細胞生育促進性に優れたペプチド組成物に存する。
（１）Ａ−6−２ VITTDSDGNE
（２）Ａ−6−６ NINDFDED
（３）SfHE AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKN
（４）SfHA GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT
（５）AfH１ YGWGDGGYGSDS
（６）AfH５ DEYVDN
（７）AfH６ VETIVLEEDPYGHEDIYEED
（８）AfH７ DDGFVLDGGYDSE
更に詳しくは、家蚕の絹フィブロインのＨ鎖を構成するＮ末端部（Ｉ）、非結晶部（Ａ）、及びＣ末端部（ａ）の各ペプチド鎖、Ｌ鎖のペプチド鎖、並びに天蚕のようなＡｎｔｈｅｒａｅａに属する野蚕の絹フィブロインを構成するＮ末端部（Ｉ）、非結晶部（Ａ）、及びＣ末端部（ａ）の各ペプチド鎖、から選ばれる１又は２以上のペプチド鎖の部分ペプチドを含有してなり、該部分ペプチドはアミノ酸残基数が４から４０からなる特定のアミノ酸配列を有するペプチドであり、該特定のアミノ酸配列を有するペプチド鎖が、上記（１）から（８）のいずれかのアミノ酸配列を有する細胞生育促進性に優れたペプチド組成物に存する。
即ち、本発明は、絹タンパクを構成する非結晶部のペプチド鎖から選ばれる１又は２以上のペプチド鎖の部分ペプチドを含有してなり、該部分ペプチドはアミノ酸残基数が４から４０からなる特定のアミノ酸配列を有するペプチドであり、該特定のアミノ酸配列を有するペプチド鎖が、次の（１）から（８）のいずれかのアミノ酸配列を有することを特徴とする細胞生育促進性に優れたペプチド組成物に存する。
（１）Ａ−6−２ VITTDSDGNE
（２）Ａ−6−６ NINDFDED
（３）SfHE AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKN
（４）SfHA GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT
（５）AfH１ YGWGDGGYGSDS
（６）AfH５ DEYVDN
（７）AfH６ VETIVLEEDPYGHEDIYEED
（８）AfH７ DDGFVLDGGYDSE
更に詳しくは、家蚕の絹フィブロインのＨ鎖を構成するＮ末端部（Ｉ）、非結晶部（Ａ）、及びＣ末端部（ａ）の各ペプチド鎖、Ｌ鎖のペプチド鎖、並びに天蚕のようなＡｎｔｈｅｒａｅａに属する野蚕の絹フィブロインを構成するＮ末端部（Ｉ）、非結晶部（Ａ）、及びＣ末端部（ａ）の各ペプチド鎖、から選ばれる１又は２以上のペプチド鎖の部分ペプチドを含有してなり、該部分ペプチドはアミノ酸残基数が４から４０からなる特定のアミノ酸配列を有するペプチドであり、該特定のアミノ酸配列を有するペプチド鎖が、上記（１）から（８）のいずれかのアミノ酸配列を有する細胞生育促進性に優れたペプチド組成物に存する。
そしてまた、（１）、次の（１）から（８）のいずれかのアミノ酸配列からなる細胞生育促進性に優れたペプチドに存する。
（１）Ａ−6−２ VITTDSDGNE
（２）Ａ−6−２ NINDFDED
（３）SfHE AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKN
（４）SfHA GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT
（５）AfH１ YGWGDGGYGSDS
（６）AfH５ DEYVDN
（７）AfH６ VETIVLEEDPYGHEDIYEED
（８）AfH７ DDGFVLDGGYDSE
（１）Ａ−6−２ VITTDSDGNE
（２）Ａ−6−２ NINDFDED
（３）SfHE AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKN
（４）SfHA GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT
（５）AfH１ YGWGDGGYGSDS
（６）AfH５ DEYVDN
（７）AfH６ VETIVLEEDPYGHEDIYEED
（８）AfH７ DDGFVLDGGYDSE
そしてまた、（２）、家蚕の未分解絹タンパク又はAntheraeaに属する野蚕の未分解絹フィブロインを、加水分解した後、分子量分画により細胞生育促進性に優れた非結晶部のペプチドを分離、取得する方法に存する。
そしてまた、（３）、加水分解を希酸、ヒドロキシルアミン又は蛋白分解酵素により行うことを特徴とする上記第２の発明の細胞生育促進性に優れた非結晶部のペプチドを分離、取得する方法に存する。
そしてまた、（４）、上記（１）のペプチドを含有する試験管内で用いられる細胞増殖促進剤に存する。
そしてまた、（５）、上記（１）のペプチドを含有する試験管内で用いられる細胞接着剤に存する。
そしてまた、（６）、上記（１）のペプチドを含有する化粧料に存する。
そしてまた、（７）、上記（１）のペプチドを含有する細胞培養基材に存する。
本発明は、分子量が1 万以下、好ましくは４, ０００から４００の特定のアミノ酸配列を有するペプチドを、絹タンパクの非結晶部から分離、分収すると共に、それらと類似のペプチドを合成することにより、細胞生育性に優れた新規ペプチドを提供できた。
これらのペプチドを細胞接着剤、細胞増殖促進剤、創傷治癒促進剤、化粧料等のスキンケア用素材や細胞培養基材などのバイオ素材として有用可能である。
これらのペプチドを細胞接着剤、細胞増殖促進剤、創傷治癒促進剤、化粧料等のスキンケア用素材や細胞培養基材などのバイオ素材として有用可能である。
本発明の細胞生育促進性に優れた絹タンパクの非結晶部のペプチドまたはそれらのペプチド組成物は、次の操作により取得すると共に、そのアミノ酸配列を決定した。
（１）家蚕又は天蚕のようなAntheraeaに属する野蚕の繭層を精練し、精練した繭層をＬｉＳＣＮ水溶液に溶解し
て遠心分離機にかけ、その上清液を分離、回収して水に対して透析し、透析液を再度遠心分離機にかけて上清液を分離、回収する。
（２）分離、回収した精製上清液に、キモトリプシン等の蛋白分解酵素を添加して加水分解処理する。
（３）加水分解処理した液の上清液（非結晶部分）を沈澱層（結晶部分）から分離、回収する。
（４）上清液（非結晶部分）を逆相クロマトグラフィーにより分画する。
（５）逆相クロマトグラフィーにより分画した各画分について細胞培養を行う。
（６）細胞生育性に優れている画分についてゲルろ過クロマトグラフィーにより分子量分画し、対照区より２倍以上の細胞生育率を有する画分（ペプチド鎖）についてアミノ酸配列を決定する。
（７）得られたペプチドをもとに細胞生育促進性に優れたペプチドを設計して合成する。
て遠心分離機にかけ、その上清液を分離、回収して水に対して透析し、透析液を再度遠心分離機にかけて上清液を分離、回収する。
（２）分離、回収した精製上清液に、キモトリプシン等の蛋白分解酵素を添加して加水分解処理する。
（３）加水分解処理した液の上清液（非結晶部分）を沈澱層（結晶部分）から分離、回収する。
（４）上清液（非結晶部分）を逆相クロマトグラフィーにより分画する。
（５）逆相クロマトグラフィーにより分画した各画分について細胞培養を行う。
（６）細胞生育性に優れている画分についてゲルろ過クロマトグラフィーにより分子量分画し、対照区より２倍以上の細胞生育率を有する画分（ペプチド鎖）についてアミノ酸配列を決定する。
（７）得られたペプチドをもとに細胞生育促進性に優れたペプチドを設計して合成する。
そして、本発明は、分子量が１万以下、好ましくは４，０００から４００の優れた細胞生育促進性を有するペプチドを絹タンパクの非結晶部から分離、分収すると共に、それらと類似のペプチドを合成し、それらペプチドを細胞接着剤、細胞増殖促進剤、創傷治癒促進剤、化粧料等のスキンケア用素材や細胞培養基材などのバイオ素材として提供することができるものである。
本発明における絹タンパク由来の細胞生育促進ペプチドとは、実施例１から実施例３で述べるように３日間の細胞培養試験に置いて、ペプチドを添加しないで細胞を培養する対照区より２倍以上の細胞生育率を有するペプチドを言う。
家蚕フィブロインの１次構造
家蚕の場合、蚕は営繭時に絹タンパクを吐糸して、繭（繭糸と蛹で構成）を作る。
繭糸には中心部にフィブロイン、周囲部にセリシンが存在し、存在比は、（７０から８０％フィブロイン）：２０から３０％（セリシン）であることが知られている。
繭糸（フィブロインとセリシンをまとめて、あるいは単独で絹タンパクという）のフィブロインは分子量約３７万である。
〔Tasiro Yutaka and Otsuki Eiichi , Journal of Cell Biology, Vol, 46, P1(1970)〕（非特許文献３参照）。
家蚕の場合、蚕は営繭時に絹タンパクを吐糸して、繭（繭糸と蛹で構成）を作る。
繭糸には中心部にフィブロイン、周囲部にセリシンが存在し、存在比は、（７０から８０％フィブロイン）：２０から３０％（セリシン）であることが知られている。
繭糸（フィブロインとセリシンをまとめて、あるいは単独で絹タンパクという）のフィブロインは分子量約３７万である。
〔Tasiro Yutaka and Otsuki Eiichi , Journal of Cell Biology, Vol, 46, P1(1970)〕（非特許文献３参照）。
分子量約３７万のフィブロインは分子量約３５万（Ｈ鎖）と約２. ５万（Ｌ鎖）がＳ−Ｓ結合している。
フィブロインのＨ鎖は非常に高分子量であるが、類似したアミノ酸残基配列の繰り返しで構成されている。
フィブロインのＨ鎖は非常に高分子量であるが、類似したアミノ酸残基配列の繰り返しで構成されている。
ゲノムバンク（Gen Bank accession no. AF 226688）によれば、Ｈ鎖の前駆体タンパクは次のようにＮ末端部( Ｉ) 、結晶部（Ｒ）と非結晶部（Ａ）の繰り返し部、Ｃ末端部（ａ）から成っている。
繰り返し部は１２の結晶部（Ｒ０１からＲ１２）が１１の非結晶部（Ａ０１からＡ１１）を介して繰り返している。
繰り返し部は１２の結晶部（Ｒ０１からＲ１２）が１１の非結晶部（Ａ０１からＡ１１）を介して繰り返している。
結晶部は、結晶性の高い（Gly-Ｘ）のジペプチドの長い繰り返しから成っている。
Ｘとしては結晶性の高いAla(Ａ) の他にSer(Ｓ) が主で、その他にTyr(Ｙ) 、Val (Ｖ) などがマイナー成分として存在している。
特に、GAGAGS、またはGAの繰り返しが多い。
その結果、結晶部ではＧとＡの和が５０％を超え、７０％程度以上になっている。
Ｘとしては結晶性の高いAla(Ａ) の他にSer(Ｓ) が主で、その他にTyr(Ｙ) 、Val (Ｖ) などがマイナー成分として存在している。
特に、GAGAGS、またはGAの繰り返しが多い。
その結果、結晶部ではＧとＡの和が５０％を超え、７０％程度以上になっている。
非結晶部のＡ０１からＡ１１のペプチドはアミノ酸配列は似ているが、各ペプチドのアミノ酸配列に少しの違いが見られる。
また、非結晶部（Ａ０１からＡ１１）のＧとＡの和は５０％以下である。
Ｎ末端部とＣ末端部はアミノ酸配列およびアミノ酸組成から、非結晶部と考えられ、Ａ０１からＡ１１と同様にＧとＡの和は５０％以下である。
ところが、非結晶部の中でも６〜１０残基程度の部分ペプチドとしては、ＧとＡの和が５０％を超える部分が存在する。
また、非結晶部（Ａ０１からＡ１１）のＧとＡの和は５０％以下である。
Ｎ末端部とＣ末端部はアミノ酸配列およびアミノ酸組成から、非結晶部と考えられ、Ａ０１からＡ１１と同様にＧとＡの和は５０％以下である。
ところが、非結晶部の中でも６〜１０残基程度の部分ペプチドとしては、ＧとＡの和が５０％を超える部分が存在する。
<フィブロインＨ鎖前駆体>
I-R01A01R02A02R03A03R04A04R05A05R06A06R07A07R08A08R09A09R10A10R11A11R12-ａ
I-R01A01R02A02R03A03R04A04R05A05R06A06R07A07R08A08R09A09R10A10R11A11R12-ａ
Ｎ末端部：Ｉ
Ｎ末端部（Ｉ）はイニシアルペプチドの部分で、アミノ酸配列は次の通りである。
MRVKTFVILCCALQYVAYTNANINDFDEDYFGSDVTVQSSNTTDEIIRDASGAVIEEQITTKKMQRKNKNHGILGKNEKMIKTFVITTDSDGNESIVEEDVLMKTLSDGTVAQSYVAADAGAYSQSGPYVSNSGYSTHQGYTSDFSTSAAV
Ｎ末端部（Ｉ）はイニシアルペプチドの部分で、アミノ酸配列は次の通りである。
MRVKTFVILCCALQYVAYTNANINDFDEDYFGSDVTVQSSNTTDEIIRDASGAVIEEQITTKKMQRKNKNHGILGKNEKMIKTFVITTDSDGNESIVEEDVLMKTLSDGTVAQSYVAADAGAYSQSGPYVSNSGYSTHQGYTSDFSTSAAV
結晶部：Ｒ０１、Ｒ０２、…、Ｒ１２
Ｒ０１、Ｒ０２、…、Ｒ１２はいずれも結晶部と言われている部位で、各アミノ酸残基数はいずれも３００以上である。ただし、Ｒ１２のアミノ酸残基数は５４である。
（Ａ０１〜Ａ１１）いずれの結晶部もＧとＡの和が７０％程度以上である。
Ｒ０１、Ｒ０２、…、Ｒ１２はいずれも結晶部と言われている部位で、各アミノ酸残基数はいずれも３００以上である。ただし、Ｒ１２のアミノ酸残基数は５４である。
（Ａ０１〜Ａ１１）いずれの結晶部もＧとＡの和が７０％程度以上である。
非結晶部：Ａ０１、Ａ０２、…、Ａ１１
アミノ酸残基数２８〜３２から成り、非結晶部（Ａ）と言われている。
それらのアミノ酸配列は次の通りである。
Ａ０１ GSSGFGPYVANGGYSRSDGYEYAWSSDFGT
Ａ０２ GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT
Ａ０３ GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGT
Ａ０４ GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT
Ａ０５ GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT
Ａ０６ GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGT
Ａ０７ GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGT
Ａ０８ GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGT
Ａ０９ GSSGFGPYVNGGYSGYEYAWSSESDFGT
Ａ１０ GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGT
Ａ１１ GSSGFGPYVANGGYSRREGYEYAWSSKSDFET
アミノ酸残基数２８〜３２から成り、非結晶部（Ａ）と言われている。
それらのアミノ酸配列は次の通りである。
Ａ０１ GSSGFGPYVANGGYSRSDGYEYAWSSDFGT
Ａ０２ GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT
Ａ０３ GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGT
Ａ０４ GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT
Ａ０５ GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT
Ａ０６ GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGT
Ａ０７ GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGT
Ａ０８ GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGT
Ａ０９ GSSGFGPYVNGGYSGYEYAWSSESDFGT
Ａ１０ GSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGT
Ａ１１ GSSGFGPYVANGGYSRREGYEYAWSSKSDFET
Ｃ末端部：ａ
Ｃ末端側の非結晶部位でアミノ酸配列は次のように成っている。
AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKNCGIPRRQLVVKFRALPCVNC
Ｃ末端側の非結晶部位でアミノ酸配列は次のように成っている。
AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKNCGIPRRQLVVKFRALPCVNC
本発明の理解の便宜、参考のために、以下に、タンパクにおけるアミノ酸またはアミノ酸残基の表記法、アミノ酸の荷電特性等について表１０に記載しておく。
アミノ酸は側鎖の特徴から下記のように酸性アミノ酸、 極性非荷電アミノ酸、非極性アミノ酸，塩基酸アミノ酸の４つに分けられている。
（１） 酸性アミノ酸 ：Ｅ、Ｄ
（２） 極性非荷電アミノ酸 ：Ｎ、Ｓ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｃ、Ｆ
（３） 非極性アミノ酸 ：Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｗ
（４） 塩基性アミノ酸 ：Ｈ、Ｋ、Ｒ
（１） 酸性アミノ酸 ：Ｅ、Ｄ
（２） 極性非荷電アミノ酸 ：Ｎ、Ｓ、Ｑ、Ｙ、Ｔ、Ｃ、Ｆ
（３） 非極性アミノ酸 ：Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｌ、Ｉ、Ｗ
（４） 塩基性アミノ酸 ：Ｈ、Ｋ、Ｒ
次に示すフィブロインL 鎖はＨ鎖の結晶部と非結晶部のアミノ酸配列と比べれば非結晶部である。
<フィブロインL 鎖のアミノ酸配列>
MKPIFLVLLVATSAYAAPSVTINQYSDNEIPRDIDDGKASSVISRAWDYVDDTDKSIAILNVQEILKDMASQGDYASQASAVAQTAGIIAHLSAGIPGDACAAANVINSYTDGVRSGNFAGFRQSLGPFFGHVGQNLNLINQLVINPGQLRYSVGPALGCAGGGRIYDFEAAWDAILASSDSSFLNEEYCIVKRLYNSRNSQSNNIAAYITAHLLPPVAQVFHQSAGSITDLLRGVGNGNDATGLVANAQRYIAQAASQVHV
<フィブロインL 鎖のアミノ酸配列>
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これに対し、野蚕の絹タンパクのアミノ酸配列は家蚕と異なるが、野蚕の中でAntheraea に属する天蚕、サク蚕、エリ蚕、ムガ蚕、タサール蚕等はほぼ同じアミノ酸配列をしている。
天蚕フィブロインでは１０残基以上のアラニン（Ａ）のみの繰り返しから成っている部分を結晶部、それ以外を非結晶部とする。
家蚕フィブロインと比べ、Antheraeaに属する野蚕フィブロインでは結晶部と非結晶部の各繰り返し部の、残基数が少ない。
１０残基以上アラニンが続いている結晶部を除き天蚕フィブロインの非結晶部のアミノ酸配列を次に示す。
アミノ酸組成からＮ末端部及びＣ末端部も非結晶部である。
天蚕フィブロインでは１０残基以上のアラニン（Ａ）のみの繰り返しから成っている部分を結晶部、それ以外を非結晶部とする。
家蚕フィブロインと比べ、Antheraeaに属する野蚕フィブロインでは結晶部と非結晶部の各繰り返し部の、残基数が少ない。
１０残基以上アラニンが続いている結晶部を除き天蚕フィブロインの非結晶部のアミノ酸配列を次に示す。
アミノ酸組成からＮ末端部及びＣ末端部も非結晶部である。
<天蚕フィブロインの非結晶部の一次構造>
Ｎ末端部：イニシアルペプチド
MRVTAFVILCCALQYATANNLHHHDEYVDNHGQLVERFTTRKHYERNAATRPHLSGNERLVETIVLEEDPYGHEDIYEEDVVINRVPGASSSAAAASSASAGSGQTIIVERQASHGAGGA
Ｎ末端部：イニシアルペプチド
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非結晶部：
AGAAAGAAAGSSARGG
SGFYETHDSYSSYGSGSSSAAAASSGAGGAGGGYGWGDGGYGSDS
GSGAGGRGDGGYGSGSS
RRAGHDHAAGSSGGGYSWDYSSYGSES
GSGAGGVGGGYGGGDGGYGSGSS
RRAGHDRAAGS
SGAGGSGGGYGWGDGGYGSDS
GSGAGRAG
GDYGWGDGGYGSDS
RQAGHERAAGS
SGAGGSGRGYGWGDGGYGSDS
GSGAGGAGGDYGWGDGGYGSD
GSGAGGAGGDYGWGDGGYGSDS
SGAGGAGGGYGWGDGGYGSDS
SGAGGAGGYGGYGSDS
SGAGGSGGGYGWGDGGYGSGS
GSGAGGVGGGYGWGDGGYGSDS
SGAGGRGDGGYGSGSS
GSGAGGAGGGYGWGDGGYGSDS
RRAGHDRAAGC
SGAGGTGGGYGWGDGGYGSDS
SGAGGSGGGYGWGDGGYGSNS
SGAGRSGGGYGWGDGGYSSDS
SGAGGSGGYGGYGSDS
GSGAGGVGGGYGWGDGGYGGYGSDS
GSGAGGVGGGYGRGDSGYGSGSS
GHGRSSGS
SGAGGSGGGYGWDYGSYGSDS
SSGAGGSGGGYGWDYGGYGSDS
GSGAGGSGGGYGWGDGGYGSDS
SRRAGHDRAYGAGS
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GSGAGGSGGGYGWGDGGYGSDS
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Ｃ末端部：
SSSGRSTEGHPLLSICCRPCSHRHSYEASRISVH
SSSGRSTEGHPLLSICCRPCSHRHSYEASRISVH
ところで、本発明では細胞生育促進性に優れた絹タンパク成分に関して、各成分のどの部分に細胞生育促進性があるかを分析してきたところ、非結晶部に細胞生育促進性があることが明らかになった。
フィブロインの非結晶部とは上記したアミノ酸配列部分である。
従って、非結晶部にはＮ末端部およびＣ末端部も含まれている。
フィブロインの非結晶部とは上記したアミノ酸配列部分である。
従って、非結晶部にはＮ末端部およびＣ末端部も含まれている。
家蚕フィブロインの非結晶部のＡ０１〜Ａ１１（２８〜３２残基のペプチド）では、いずれも同様の優れた細胞生育性を示すが、Ａ０１〜Ａ１１は全く同じアミノ酸配列ではない。
Ａ１１の場合、他のＡ０１〜Ａ１０とは３２残基の内の８残基以内でアミノ酸残基配列が異なる。
したがって、３０％程度以下のアミノ酸残基配列に違いがあっても細胞生育性に影響はない。
また、２０％程度以内でアミノ酸残基数に増減があっても細胞生育性に影響は少ない。
しかし、細胞生育促進性を保つにはアミノ酸配列の違いは５０％以下が好ましい。
Ａ１１の場合、他のＡ０１〜Ａ１０とは３２残基の内の８残基以内でアミノ酸残基配列が異なる。
したがって、３０％程度以下のアミノ酸残基配列に違いがあっても細胞生育性に影響はない。
また、２０％程度以内でアミノ酸残基数に増減があっても細胞生育性に影響は少ない。
しかし、細胞生育促進性を保つにはアミノ酸配列の違いは５０％以下が好ましい。
一方、アミノ酸残基数が非常に少ないペプチドでは細胞生育促進性が発現しない。
特に、アミノ酸が２残基以下では細胞生育を粗害することがある。
したがって、細胞生育促進ペプチドとしては４〜４０残基、好ましくは６〜３２残基のペプチドがよい。
さらに、非結晶部においても塩基性アミノ酸残基をほとんど含まず、酸性アミノ酸残基およびまたは極性非荷電アミノ酸を多く含む部分ペプチドが細胞生育促進性に優れていることが分かった。
特に、酸性アミノ酸残基は極めて優れた細胞生育促進性を示した。
特に、アミノ酸が２残基以下では細胞生育を粗害することがある。
したがって、細胞生育促進ペプチドとしては４〜４０残基、好ましくは６〜３２残基のペプチドがよい。
さらに、非結晶部においても塩基性アミノ酸残基をほとんど含まず、酸性アミノ酸残基およびまたは極性非荷電アミノ酸を多く含む部分ペプチドが細胞生育促進性に優れていることが分かった。
特に、酸性アミノ酸残基は極めて優れた細胞生育促進性を示した。
非結晶部は、全体としては優れた細胞生育促進性を示すが、部分としてはＧとＡの和が５５％を超え、また塩基性アミノ酸残基が多いため、細胞生育率の低いアミノ酸配列部がある。
そこで、フィブロインの非結晶部から酸性アミノ酸が存在し、そしてまたは極性非荷電アミノ酸が存在する。
また、塩基性アミノ酸がほとんど存在しない部分ペプチドを分離、回収する。
回収した部分ペプチドの中からアミノ酸残基数が４０以下で、細胞生育率がペプチド無添加を対照区とし、実施例１〜実施例３のような細胞培養試験において細胞生育率が対照区の２倍以上の値を示すペプチドをSDFGP とする。
また、アミノ酸残基数４〜４０の複数のペプチドの混合物であっても、細胞生育率が対照区の２倍以上であればSDFGP とする。
そこで、フィブロインの非結晶部から酸性アミノ酸が存在し、そしてまたは極性非荷電アミノ酸が存在する。
また、塩基性アミノ酸がほとんど存在しない部分ペプチドを分離、回収する。
回収した部分ペプチドの中からアミノ酸残基数が４０以下で、細胞生育率がペプチド無添加を対照区とし、実施例１〜実施例３のような細胞培養試験において細胞生育率が対照区の２倍以上の値を示すペプチドをSDFGP とする。
また、アミノ酸残基数４〜４０の複数のペプチドの混合物であっても、細胞生育率が対照区の２倍以上であればSDFGP とする。
その条件としては、非結晶部の部分ペプチドにおいて
（１）ＧとＡの残基数の和がペプチドの全残基数に対して５５％以下である。
ＧやＡが多いと結晶になりやすいためである。
（２）塩基性アミノ酸残基数はペプチドの全残基数に対して２５％以下である。
（３）酸性アミノ酸およびまたは極性非荷電アミノ酸が存在する。
という事項を満たすことが必要であり、このことは表６に示したところから容易に推考される。
また、これらを満たさない場合、細胞生育性を阻害することがある。
（１）ＧとＡの残基数の和がペプチドの全残基数に対して５５％以下である。
ＧやＡが多いと結晶になりやすいためである。
（２）塩基性アミノ酸残基数はペプチドの全残基数に対して２５％以下である。
（３）酸性アミノ酸およびまたは極性非荷電アミノ酸が存在する。
という事項を満たすことが必要であり、このことは表６に示したところから容易に推考される。
また、これらを満たさない場合、細胞生育性を阻害することがある。
因みに、アミノ酸またはペプチドの性質は側鎖の化学構造によって異なる。
酸性アミノ酸は細胞生育促進性に優れていても、ＥとＤでは側鎖の長さが異なるため、側鎖や主鎖の柔軟性や立体構造が異なり、同じ細胞生育促進性を示さない。
このことは極性非荷電アミノ酸や塩基性アミノ酸といわれる各種のアミノ酸についても、同様にいえることで、物理化学的性質がそれぞれ異なるため同じ細胞促進性や阻害性を示すわけではない。
酸性アミノ酸は細胞生育促進性に優れていても、ＥとＤでは側鎖の長さが異なるため、側鎖や主鎖の柔軟性や立体構造が異なり、同じ細胞生育促進性を示さない。
このことは極性非荷電アミノ酸や塩基性アミノ酸といわれる各種のアミノ酸についても、同様にいえることで、物理化学的性質がそれぞれ異なるため同じ細胞促進性や阻害性を示すわけではない。
我々の体を作っている細胞は大きくは付着性の細胞と浮遊性の細胞に分けられる。
付着性の細胞には皮膚細胞、血管細胞、腺細胞等がある。浮遊細胞には血液細胞等がある。
付着性の細胞の生育過程は、まず接着してから増殖するため、大きくは接着と増殖に分けられる。
本発明のSDFGP は接着性、増殖性の性質を有するが比較すれば接着性に優れている。
増殖性に優れていることは、細胞を異常に増殖させることになり、長期に使用する場合、安全性に課題が残る。
したがって、接着性に優れ、増殖促進性を有し、細胞生育を阻害しない本発明のSDFGP はスキンケア素材としてまたバイオ素材として極めて優れている。
実際に、絹タンパクから部分ペプチドを分離、回収する場合は特異的なペプチド結合を切断するタンパク分解酵素またはその他の化学物質で絹タンパクを切断し、断片の中から非結晶部に属しているアミノ酸残基数４０以下のペプチドを回収する。
また、得られた部分ペプチドをもとに細胞生育に優れたペプチドを設計し、合成することができる。
付着性の細胞には皮膚細胞、血管細胞、腺細胞等がある。浮遊細胞には血液細胞等がある。
付着性の細胞の生育過程は、まず接着してから増殖するため、大きくは接着と増殖に分けられる。
本発明のSDFGP は接着性、増殖性の性質を有するが比較すれば接着性に優れている。
増殖性に優れていることは、細胞を異常に増殖させることになり、長期に使用する場合、安全性に課題が残る。
したがって、接着性に優れ、増殖促進性を有し、細胞生育を阻害しない本発明のSDFGP はスキンケア素材としてまたバイオ素材として極めて優れている。
実際に、絹タンパクから部分ペプチドを分離、回収する場合は特異的なペプチド結合を切断するタンパク分解酵素またはその他の化学物質で絹タンパクを切断し、断片の中から非結晶部に属しているアミノ酸残基数４０以下のペプチドを回収する。
また、得られた部分ペプチドをもとに細胞生育に優れたペプチドを設計し、合成することができる。
１．絹タンパクからペプチドの分離、回収
絹タンパクの非結晶部を分離、回収するには、非結晶部の特徴を利用するとよい。
非結晶部は水に溶けやすいので、絹物質を中性付近（ＰＨ５．０〜９．０）の水に浸漬すればよい。
しかし、単に絹物質を浸漬するだけでは効率よく非結晶部のペプチドを得ることができない。
そこで、絹タンパクの特異的なペプチド結合を積極的に切断する。
このようなペプチド結合の切断方法としては、特異的なペプチド結合を積極的に切断する化学物質や酵素等を用いることが好ましい。
以下にこのことを述べる。
絹タンパクの非結晶部を分離、回収するには、非結晶部の特徴を利用するとよい。
非結晶部は水に溶けやすいので、絹物質を中性付近（ＰＨ５．０〜９．０）の水に浸漬すればよい。
しかし、単に絹物質を浸漬するだけでは効率よく非結晶部のペプチドを得ることができない。
そこで、絹タンパクの特異的なペプチド結合を積極的に切断する。
このようなペプチド結合の切断方法としては、特異的なペプチド結合を積極的に切断する化学物質や酵素等を用いることが好ましい。
以下にこのことを述べる。
１）原料
家蚕ではフィブロインのＨ鎖、Ｌ鎖およびセリシンのａ成分が残っている絹タンパクを原料とする。
家蚕ではフィブロインのＨ鎖、Ｌ鎖およびセリシンのａ成分が残っている絹タンパクを原料とする。
野蚕（天蚕、サク蚕、エリ蚕、ムガ蚕、タサール蚕等）では、フィブロインの電気泳動像に家蚕フィブロインのＨ鎖と同程度に明確なバンドが認められる場合を原料とする。
原料はフィブロイン、セリシン単独でもフィブロインとセリシンが同時に存在していてもよい。
原料はフィブロイン、セリシン単独でもフィブロインとセリシンが同時に存在していてもよい。
したがって、本発明の原料物質は繭糸、生糸、絹織編物、絹糸（フィブロイン繊維）、それらの残糸、またはそれらを原料とした繊維、粉末、フィルム等、家蚕および野蚕等の絹糸虫類が吐糸する蛋白質繊維物質（絹物質）すべてを対象とすることができる。
しかし、これらの原料には家蚕フィブロインＨ鎖、セリシンのａ成分、野蚕ではそれらに相当する成分が存在する必要がある。
フィブロインのＨ鎖はＬ鎖より分解しやすいので、Ｈ鎖の一部でも残っていればＬ鎖のほとんどが分解しないで残っている。
しかし、これらの原料には家蚕フィブロインＨ鎖、セリシンのａ成分、野蚕ではそれらに相当する成分が存在する必要がある。
フィブロインのＨ鎖はＬ鎖より分解しやすいので、Ｈ鎖の一部でも残っていればＬ鎖のほとんどが分解しないで残っている。
２）原料の溶解
中性塩で溶解される前記１）の原料は精練物、半精練物、未精練物およびそれらの中間物であってもよい。
セリシン蚕繭糸でもよい。
重要なことはそれらの絹タンパクが未分解であるか、あるいは各種の加工工程を経てもフィブロインのＨ鎖、セリシンのａ成分およびそれらに相当するタンパクの一部が未分解で残されていることである。
Ｈ鎖やａ成分等が存在するかどうかの確認は電気泳動像で、それぞれに相当するバンドの存在を確認することで行う。
中性塩で溶解される前記１）の原料は精練物、半精練物、未精練物およびそれらの中間物であってもよい。
セリシン蚕繭糸でもよい。
重要なことはそれらの絹タンパクが未分解であるか、あるいは各種の加工工程を経てもフィブロインのＨ鎖、セリシンのａ成分およびそれらに相当するタンパクの一部が未分解で残されていることである。
Ｈ鎖やａ成分等が存在するかどうかの確認は電気泳動像で、それぞれに相当するバンドの存在を確認することで行う。
原料絹糸の溶解剤である中性塩としては、例えば塩化カルシウム、銅エチレンジアミン、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸リチウム、臭化リチウム、硝酸マグネシウム等の中性塩が挙げられる。
当該中性塩においても飽和水溶液又は５０％〔重量( ｇ)/容量（ｍｌ）〕飽和以上の濃度が好ましい。
フィブロインとセリシンが含まれている場合、例えば繭糸や未精練物、半精練等は上記中性塩で絹糸と同様に溶解する。
当該中性塩においても飽和水溶液又は５０％〔重量( ｇ)/容量（ｍｌ）〕飽和以上の濃度が好ましい。
フィブロインとセリシンが含まれている場合、例えば繭糸や未精練物、半精練等は上記中性塩で絹糸と同様に溶解する。
一方、セリシン蚕繭糸のようにセリシンが９８％以上の場合は８Ｍ尿素で７０〜９０℃、１０分以内で溶解する。
また、セリシン蚕繭糸は、９MLiBr でも室温（２０〜３０℃）で３０分以内に溶解できる。
溶解時の条件はこれらの条件に準じてかえて行う。
また、セリシン蚕繭糸は、９MLiBr でも室温（２０〜３０℃）で３０分以内に溶解できる。
溶解時の条件はこれらの条件に準じてかえて行う。
絹物質を中性塩溶液に溶解する工程では、中性塩にメチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール等のアルコールを添加してもよい。
中性塩として塩化カルシウムを使う場合は９４℃以下の温度で、望ましくは７５〜８５℃程度の温度で行う。
臭化リチウムを使う場合は５０℃程度以下の温度で原料を溶解する等、中性塩によって溶解条件は異なるが、フィブロインのＨ鎖、セリシンのa 成分が残るような、またはそれに相当する溶解方法を行う。
中性塩として塩化カルシウムを使う場合は９４℃以下の温度で、望ましくは７５〜８５℃程度の温度で行う。
臭化リチウムを使う場合は５０℃程度以下の温度で原料を溶解する等、中性塩によって溶解条件は異なるが、フィブロインのＨ鎖、セリシンのa 成分が残るような、またはそれに相当する溶解方法を行う。
絹物質の溶解においては、
（１）攪拌することにより溶解を促進することができる。
（２）溶解温度が低いと溶解しにくい。
溶解温度が高いと溶解し易いが、分子量低下が激しく起きる。
絹を中性塩で溶解した溶解液には、フィブロインあるいはフィブロインとセリシンの混合物のほかに中性塩、アルコール等が含まれている。
この溶解液から、まず不溶物を除去し、次いで透析膜や透析装置を用いて分子量約５，０００以下の低分子物を除去する。
このような透析によって絹タンパク水溶液を得る。
（１）攪拌することにより溶解を促進することができる。
（２）溶解温度が低いと溶解しにくい。
溶解温度が高いと溶解し易いが、分子量低下が激しく起きる。
絹を中性塩で溶解した溶解液には、フィブロインあるいはフィブロインとセリシンの混合物のほかに中性塩、アルコール等が含まれている。
この溶解液から、まず不溶物を除去し、次いで透析膜や透析装置を用いて分子量約５，０００以下の低分子物を除去する。
このような透析によって絹タンパク水溶液を得る。
３）酵素による分解と回収
一般に、タンパク分解酵素によるタンパクの切断は特異的なペプチド結合で起き、切断が穏和な条件下で行われるため、アミノ酸残基側鎖の修飾が起こらないと言われている。
また、タンパクの非特異的切断による断片の複雑化を避けることもできる。
一般に、タンパク分解酵素によるタンパクの切断は特異的なペプチド結合で起き、切断が穏和な条件下で行われるため、アミノ酸残基側鎖の修飾が起こらないと言われている。
また、タンパクの非特異的切断による断片の複雑化を避けることもできる。
このような酵素には、リジルエンドペプチターゼ、セリンプロテアーゼ、メタロエンドペプチターゼ、アルギニルエンドペプチターゼ、メタロプロテアーゼ、キモトリプシン、パパイン、アルカラゼ、ペプシン、レンニン、パンクレアチン、エラスターゼ、カルボキシペプチターゼ、アミノペプチターゼ、ジペプチターゼ等がある。
これらの中で、結晶部と非結晶部を分けるには、キモトリプシンが特に好ましい。
これらの中で、結晶部と非結晶部を分けるには、キモトリプシンが特に好ましい。
絹タンパク水溶液にタンパク分解酵素を添加すると、絹タンパクは特異なペプチド結合間で切断される。
切断された絹タンパク由来のペプチドが主に絹タンパクの結晶部由来の断片であれば凝集しやすく、凝集（凝固、或いは結晶化）すれば沈澱する。
凝集しにくい場合でも、結晶部由来のペプチドほど凝集しやすいので、凝集剤としてアルコール（メチルアルコール、エチルアルコール等）等を添加すれば結晶部由来ペプチドから凝集し始め、沈澱する。
切断された絹タンパク由来のペプチドが主に絹タンパクの結晶部由来の断片であれば凝集しやすく、凝集（凝固、或いは結晶化）すれば沈澱する。
凝集しにくい場合でも、結晶部由来のペプチドほど凝集しやすいので、凝集剤としてアルコール（メチルアルコール、エチルアルコール等）等を添加すれば結晶部由来ペプチドから凝集し始め、沈澱する。
沈澱物を除去すれば、残りは非結晶部由来ペプチドの溶液である。
沈澱物の除去には、沈澱物を含んだ溶液を遠心分離機（１, ０００〜１０, ０００Ｇ）で分け、沈澱物を除く。
沈澱物を除いた液は非結晶部から分離された非結晶部分のペプチドの水溶液である。
これを乾燥すれば、フィルム状あるいは粉末状のペプチドが得られる。
但し、非結晶部由来のペプチド水溶液にアルコールを添加した場合、アルコール濃度が濃くなるにつれて非結晶部由来のペプチドも順次凝集し、沈殿する。
この非結晶部由来のペプチドに結晶部の部分ペプチドが５０％程度以下であれば含まれていてもよい。
沈澱物の除去には、沈澱物を含んだ溶液を遠心分離機（１, ０００〜１０, ０００Ｇ）で分け、沈澱物を除く。
沈澱物を除いた液は非結晶部から分離された非結晶部分のペプチドの水溶液である。
これを乾燥すれば、フィルム状あるいは粉末状のペプチドが得られる。
但し、非結晶部由来のペプチド水溶液にアルコールを添加した場合、アルコール濃度が濃くなるにつれて非結晶部由来のペプチドも順次凝集し、沈殿する。
この非結晶部由来のペプチドに結晶部の部分ペプチドが５０％程度以下であれば含まれていてもよい。
しかし、非結晶性部由来のペプチドであっても細胞生育促進性に優れたペプチドを得るには、グリシンとアラニン残基数の和が、５５％を越えないことが好ましい。
また、塩基性アミノ酸残基数がペプチド構成残基数の２５％以下であることが好ましい。
一方、酸性アミノ酸残基や非極性荷電アミノ酸残基は多いほどよい。
特に、酸性アミノ酸残基数が多いと細胞生育促進性に優れる。
乾燥は凍結乾燥法やスプレードライ法で乾燥する。
非結晶部由来のペプチドは乾燥後に結晶化していても、低分子量であるため水に溶けやすい。
また、塩基性アミノ酸残基数がペプチド構成残基数の２５％以下であることが好ましい。
一方、酸性アミノ酸残基や非極性荷電アミノ酸残基は多いほどよい。
特に、酸性アミノ酸残基数が多いと細胞生育促進性に優れる。
乾燥は凍結乾燥法やスプレードライ法で乾燥する。
非結晶部由来のペプチドは乾燥後に結晶化していても、低分子量であるため水に溶けやすい。
２．絹タンパク由来線維芽細胞増殖ペプチド(SDFGP) の合成
絹タンパクから分離、回収したSDFGP としては次のペプチドがある。
これらは、SDFGP の一例である。
さらに〔００４７〕の条件を満たす多くのSDFGP が存在することはいうまでもない。
A−6−２ VITTDSDGNE
A−6−６ NINDFDED
SfHE AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKN
SfHA GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT
AfH１ YGWGDGGYGSDS
AfH５ DEYVDN
AfH６ VETIVLEEDPYGHEDIYEED
AfH７ DDGFVLDGGYDSE
優れた細胞生育促進性はこれらのSDFGP の一部のアミノ酸配列のみでもSDFGP となり得る。
また、４０残基以内でこれらのペプチドが繰り返されたり、別のペプチドと連結してもよい。
絹タンパクから分離、回収したSDFGP としては次のペプチドがある。
これらは、SDFGP の一例である。
さらに〔００４７〕の条件を満たす多くのSDFGP が存在することはいうまでもない。
A−6−２ VITTDSDGNE
A−6−６ NINDFDED
SfHE AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKN
SfHA GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT
AfH１ YGWGDGGYGSDS
AfH５ DEYVDN
AfH６ VETIVLEEDPYGHEDIYEED
AfH７ DDGFVLDGGYDSE
優れた細胞生育促進性はこれらのSDFGP の一部のアミノ酸配列のみでもSDFGP となり得る。
また、４０残基以内でこれらのペプチドが繰り返されたり、別のペプチドと連結してもよい。
しかし、アミノ酸の状態では細胞生育促進機能を有していない。
機能を有する細胞生育アミノ酸残基数は４残基以上必要とする。
しかし、ペプチド合成の効率から４０残基以下が好ましい。
SDFGP の合成は、絹タンパクの非結晶部のアミノ酸配列を模倣し、〔００４７〕の条件を満たすペプチドを合成する。
合成ペプチドのアミノ酸残基は４〜４０、好ましくは６〜３２残基である。
この場合、絹タンパクのアミノ酸配列と完全に同じでなくてもよい。
機能を有する細胞生育アミノ酸残基数は４残基以上必要とする。
しかし、ペプチド合成の効率から４０残基以下が好ましい。
SDFGP の合成は、絹タンパクの非結晶部のアミノ酸配列を模倣し、〔００４７〕の条件を満たすペプチドを合成する。
合成ペプチドのアミノ酸残基は４〜４０、好ましくは６〜３２残基である。
この場合、絹タンパクのアミノ酸配列と完全に同じでなくてもよい。
例えば、フィブロインＨ鎖の非結晶部(Ａ０１〜Ａ１１) のアミノ酸配列は全部が同じでないが、細胞生育促進性はほぼ同じであり、いずれもＳＤＦＧＰである。
したがって、アミノ酸配列に３０％程度以下の違いがあってもよいが、アミノ酸配列の違いは５０％以下が好ましい。
この場合、酸性アミノ酸は多いほどよく、極性非荷電アミノ酸はある方が好ましい。
しかし、塩基性アミノ酸はほとんどない方が好ましい。
したがって、アミノ酸配列に３０％程度以下の違いがあってもよいが、アミノ酸配列の違いは５０％以下が好ましい。
この場合、酸性アミノ酸は多いほどよく、極性非荷電アミノ酸はある方が好ましい。
しかし、塩基性アミノ酸はほとんどない方が好ましい。
つまり、各SDFGP のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置き換わってもよい。
この場合、塩基性アミノ酸残基はペプチドを構造するアミノ酸残基数の少なくとも２５％以下となるようにする。
一方、ペプチド（SDFGP）における酸性アミノ酸は多い方が好ましい。
全アミノ酸残基が酸性アミノ酸およびまたは非極性荷電アミノ酸で構成されていてもよい。
この場合、塩基性アミノ酸残基はペプチドを構造するアミノ酸残基数の少なくとも２５％以下となるようにする。
一方、ペプチド（SDFGP）における酸性アミノ酸は多い方が好ましい。
全アミノ酸残基が酸性アミノ酸およびまたは非極性荷電アミノ酸で構成されていてもよい。
したがって、Ａ−6−２からDSDGDE、Ａ−6−６からDEDEDE、EDEDED、SfHAからSSESSEやYGGYEY、AfH1からDGGYGGD 、AfHSからDEYDEY、AfHGからYEEDYEED等、さらに、EEEE、EEEEEE 、EYEYEY、EEYEEY、YYYYYY、EGSEGSなど多くのペプチドがSDFGPとなり得る。
前述した〔００４７〕の条件の範囲で、これらのペプチドが繰り返されたり、別のペプチドと連結しても、分子量１万以下で、好ましくは４，０００〜４００の範囲であればよいことは言うまでもない。
そしてまた、アミノ酸残基が他のアミノ酸残基と入れ変わっていてもよい。
前述した〔００４７〕の条件の範囲で、これらのペプチドが繰り返されたり、別のペプチドと連結しても、分子量１万以下で、好ましくは４，０００〜４００の範囲であればよいことは言うまでもない。
そしてまた、アミノ酸残基が他のアミノ酸残基と入れ変わっていてもよい。
４．利用
絹タンパクの非結晶部から得たペプチド集合物およびSDFGP は細胞生育促進性に優れているだけでなく、水に溶けやすい。
また、分子量が４, ０００程度以下であるため溶解している状態でも長期間形態が安定である。
さらに、各種のSDFGPを混合すると単独であるより細胞生育は促進される。
したがって、細胞培養液、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、目薬、食品等にこれらを
混合して添加する。
本発明のペプチド集合物およびSDFGPは皮膚細胞を生育促進する作用に優れているため、スキンケア用素材として、また、細胞培養素材として上記以外の分野、例えば衣類繊維、化粧粉末、 樹脂等の改良でも優れた素材である。
絹タンパクの非結晶部から得たペプチド集合物およびSDFGP は細胞生育促進性に優れているだけでなく、水に溶けやすい。
また、分子量が４, ０００程度以下であるため溶解している状態でも長期間形態が安定である。
さらに、各種のSDFGPを混合すると単独であるより細胞生育は促進される。
したがって、細胞培養液、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、目薬、食品等にこれらを
混合して添加する。
本発明のペプチド集合物およびSDFGPは皮膚細胞を生育促進する作用に優れているため、スキンケア用素材として、また、細胞培養素材として上記以外の分野、例えば衣類繊維、化粧粉末、 樹脂等の改良でも優れた素材である。
絹フィブロインの酵素分解物の細胞生育活性
（１）絹タンパクの非結晶部を酵素で分解、分離、分収
家蚕の繭を切開して蛹を除き、繭層(１０ｇ) を３０倍量の８Ｍ尿素、９０℃に１０分浸漬し、セリシンを抽出した。
抽出残さは水洗、乾燥しこれをフィブロインとした。
（１）絹タンパクの非結晶部を酵素で分解、分離、分収
家蚕の繭を切開して蛹を除き、繭層(１０ｇ) を３０倍量の８Ｍ尿素、９０℃に１０分浸漬し、セリシンを抽出した。
抽出残さは水洗、乾燥しこれをフィブロインとした。
フィブロイン１. ０ｇを９Ｍ LiSCN１０ｍｌに浸漬して溶かし、これに蒸留水１０ｍｌ加えて、これを３, ０００rmp 、１０分間遠沈した。
上清液を半透膜に入れ５０倍量の水に対して透析した。
透析は、３０分ごとに透析外液の水をかえて４回行った。
透析後に液を再び遠沈し、上清液に０. １Ｍリン酸水素二ナトリウム（ｐＨ８. ５）を加え、ｐＨを７〜８に調製した。
そこにフィブロイン量の１００分の１量のキモトリプシンを入れ、４０℃で４時間置いたところ沈澱を生じた。
上清液を半透膜に入れ５０倍量の水に対して透析した。
透析は、３０分ごとに透析外液の水をかえて４回行った。
透析後に液を再び遠沈し、上清液に０. １Ｍリン酸水素二ナトリウム（ｐＨ８. ５）を加え、ｐＨを７〜８に調製した。
そこにフィブロイン量の１００分の１量のキモトリプシンを入れ、４０℃で４時間置いたところ沈澱を生じた。
このときの上清液のタンパクをあるいはペプチドについて、フィブロインの非結晶部（Ａ）からえられたものを非結晶部分（Ａ'）、沈澱物のタンパクあるいはペプチドを結晶部（Ｃ）からえられたものを結晶部分（Ｃ'）、とした。
結晶部分は水洗し、９Ｍ LiSCN １ｍｌに溶解し、５０倍量の水で前述と同様に半透膜で透析し、水溶液のタンパク量を測定した。
上清はそのままタンパク量を測定した。
結晶部分は水洗し、９Ｍ LiSCN １ｍｌに溶解し、５０倍量の水で前述と同様に半透膜で透析し、水溶液のタンパク量を測定した。
上清はそのままタンパク量を測定した。
（２）細胞培養容器へコーティング
これらの結晶部分（Ｃ'）及び非結晶部分（Ａ'）の水溶液をそれぞれ０．０２５％、０．００２５％の濃度になるように７０％エタノールを加えて調製し、それをポリスチレンのシャーレ（３５ｍｍ¢、ファルコン）に１ｍｌずつ入れて風乾した。
対照区用シャーレは７０％エタノールのみを１ｍｌ入れて風乾した。
これらの結晶部分（Ｃ'）及び非結晶部分（Ａ'）の水溶液をそれぞれ０．０２５％、０．００２５％の濃度になるように７０％エタノールを加えて調製し、それをポリスチレンのシャーレ（３５ｍｍ¢、ファルコン）に１ｍｌずつ入れて風乾した。
対照区用シャーレは７０％エタノールのみを１ｍｌ入れて風乾した。
（３）細胞培養
細胞は三光純薬から購入した（凍結）ヒト皮膚線維芽細胞（成人の正常皮膚由来）を使用した。
培地はクラボウから購入したヒト皮膚線維芽細胞増殖用低血清培地〔Medium１０６Ｓ（皮膚線維芽細胞基礎培地）５００ｍｌにＬＳＧＳ（低血清増殖添加剤）１０ｍｌを添加〕を使用した。
なお、ＬＳＧＳには細胞増殖性がある。
シャーレ１枚に付き培地２ｍｌを入れ、８万ケの細胞を接種し、３日間培養した。
細胞は三光純薬から購入した（凍結）ヒト皮膚線維芽細胞（成人の正常皮膚由来）を使用した。
培地はクラボウから購入したヒト皮膚線維芽細胞増殖用低血清培地〔Medium１０６Ｓ（皮膚線維芽細胞基礎培地）５００ｍｌにＬＳＧＳ（低血清増殖添加剤）１０ｍｌを添加〕を使用した。
なお、ＬＳＧＳには細胞増殖性がある。
シャーレ１枚に付き培地２ｍｌを入れ、８万ケの細胞を接種し、３日間培養した。
（４）アラマーブルー色素での生細胞数の測定
シャーレ１枚に付き培地２ｍｌ、アラマーブルー（ＩＷＡＫＩ）０．１ｍｌの割合で入れ、３７℃、２時間培養したのち、５７０ｎｍ、６００ｎｍの吸光度から計算したアラマーブルー色素の還元量を生細胞数とした。
絹タンパクの成分無添加の場合を対照区(１００％) とした、結晶部分及び非結晶部分をコートしたシャーレでのヒト皮膚線維芽細胞の生育を表１に示す。
シャーレ１枚に付き培地２ｍｌ、アラマーブルー（ＩＷＡＫＩ）０．１ｍｌの割合で入れ、３７℃、２時間培養したのち、５７０ｎｍ、６００ｎｍの吸光度から計算したアラマーブルー色素の還元量を生細胞数とした。
絹タンパクの成分無添加の場合を対照区(１００％) とした、結晶部分及び非結晶部分をコートしたシャーレでのヒト皮膚線維芽細胞の生育を表１に示す。
絹タンパク成分をコートしたシャーレでの細胞生育率は対照区と比べてすべて高い値を示した。
特に、非結晶部分（Ｃ'）の０．０２５％濃度の生育率が高く、SDFGPの混合物である。
結晶部分では濃度の濃い方（０．０２５％）が薄い方（０．００２５％）より生育が悪かった。
これは、結晶部分の絹タンパクは細胞生育を阻害しているためと考えられる。
特に、非結晶部分（Ｃ'）の０．０２５％濃度の生育率が高く、SDFGPの混合物である。
結晶部分では濃度の濃い方（０．０２５％）が薄い方（０．００２５％）より生育が悪かった。
これは、結晶部分の絹タンパクは細胞生育を阻害しているためと考えられる。
細胞生育促進ペプチドのアミノ酸配列
フィブロインの非結晶部は結晶部より細胞生育を促進することが実施例１で分かった。
しかし、実施例１で分取した非結晶部分は酵素で切断されたペプチドの混合物と考えられる。
そこで、非結晶部分をさらに分離して、細胞生育促進部位の特定を行った。
まず、実施例１の非結晶部分に含まれるペプチドを極性の違いで分けるため、逆相クロマトグラフィーで分離した。
カラムはRESOURCER RPCｋ３ｍｌを使用した。
Ａポンプに０．１％TFA （トリフルオロ酢酸）を、Ｂポンプに０．１％TFA/９０％アセトニトリルを使用し、０〜１５分でＢが０〜７５％になるグラジェントでクロマトグラフィを行った。
フィブロインの非結晶部は結晶部より細胞生育を促進することが実施例１で分かった。
しかし、実施例１で分取した非結晶部分は酵素で切断されたペプチドの混合物と考えられる。
そこで、非結晶部分をさらに分離して、細胞生育促進部位の特定を行った。
まず、実施例１の非結晶部分に含まれるペプチドを極性の違いで分けるため、逆相クロマトグラフィーで分離した。
カラムはRESOURCER RPCｋ３ｍｌを使用した。
Ａポンプに０．１％TFA （トリフルオロ酢酸）を、Ｂポンプに０．１％TFA/９０％アセトニトリルを使用し、０〜１５分でＢが０〜７５％になるグラジェントでクロマトグラフィを行った。
その結果、６つのピーク( Ａ−１、…、Ａ−６) が確認できた。
それぞれのピークを回収し、エバポレーターで乾燥し、少量のバッファー(PBS) で溶解した。
Ａ−１〜Ａ−６のそれぞれの濃度が０．０２５％となるように７０％エタノールで調整し、細胞培養用ポリスチレンのシャーレ( ３５ｍｍφ、ファルコン) に１ｍｌづつ入れて風乾した。
対照区用シャーレは７０% エタノールのみを１ｍｌ入れて風乾した。
これらのシャーレを用いて細胞培養を行った。
細胞培養方法は〔実施例１〕と同じ方法で行った。
非結晶部分のペプチド断片をコートしたシャーレでのヒト皮膚線維芽細胞の生育率を表２に示す。
非結晶部分のうち、Ａ−６の生育が対照区の約４倍と非常に優れていた。
それぞれのピークを回収し、エバポレーターで乾燥し、少量のバッファー(PBS) で溶解した。
Ａ−１〜Ａ−６のそれぞれの濃度が０．０２５％となるように７０％エタノールで調整し、細胞培養用ポリスチレンのシャーレ( ３５ｍｍφ、ファルコン) に１ｍｌづつ入れて風乾した。
対照区用シャーレは７０% エタノールのみを１ｍｌ入れて風乾した。
これらのシャーレを用いて細胞培養を行った。
細胞培養方法は〔実施例１〕と同じ方法で行った。
非結晶部分のペプチド断片をコートしたシャーレでのヒト皮膚線維芽細胞の生育率を表２に示す。
非結晶部分のうち、Ａ−６の生育が対照区の約４倍と非常に優れていた。
次に、細胞生育性に最も優れていたＡ−６に含まれているペプチドを分子量で分けるため、Superdex peptideＨＲ１０／３０（ゲルろ過クロマトグラフィー）で分離した。
その結果、Ａ−６−１〜Ａ−６−７までの７つのピークが確認できた。
いずれも分子量２, ５００以下である。
７つのピークの内で、ピークがシャープで明確な５つのピーク（Ａ−６−２、Ａ−６−３、Ａ−６−４、Ａ−６−６、Ａ−６−７）のペプチドを回収し、各ペプチドを細胞培養容器にコートし、そこに培地と細胞を接種し、２日間培養して、細胞生育性を測定した。
細胞生育性の実験は〔実施例１〕と同じである。
細胞生育率の測定結果を表３に示す。
Ａ−６−２とＡ−６−６は対照区と比べて、２日間培養で生育率が１．５倍を示し、細胞生育促進性に優れていた。
３日間培養では生育率は２倍を越えていた。
その結果、Ａ−６−１〜Ａ−６−７までの７つのピークが確認できた。
いずれも分子量２, ５００以下である。
７つのピークの内で、ピークがシャープで明確な５つのピーク（Ａ−６−２、Ａ−６−３、Ａ−６−４、Ａ−６−６、Ａ−６−７）のペプチドを回収し、各ペプチドを細胞培養容器にコートし、そこに培地と細胞を接種し、２日間培養して、細胞生育性を測定した。
細胞生育性の実験は〔実施例１〕と同じである。
細胞生育率の測定結果を表３に示す。
Ａ−６−２とＡ−６−６は対照区と比べて、２日間培養で生育率が１．５倍を示し、細胞生育促進性に優れていた。
３日間培養では生育率は２倍を越えていた。
そこで、Ａ−６−２とＡ−６−６のアミノ酸配列をベックマン株式会社のLF3000Protein Sequencorで分析した結果、アミノ酸配列は
Ａ−６−２ VITTDSDGNE
Ａ−６−６ NINDFDED
となった。
Ａ−６−２およびＡ−６−６ともにフィブロインのＮ末端側のペプチドであった。
Ｎ末端部はアミノ酸組成から考えて、非結晶部である。
そこで、Ａ−６−２とＡ−６−６のペプチドを合成し、（北海道システムサイエンス株式会社に委託）、前述と同様に３日間培養して合成ペプチドの生理活性を測定したところ、絹タンパクからの抽出物と同様に細胞生育促進性のあることを確認した。
また、合成したペプチドＡ−６−２とＡ−６−６を混合した場合、それぞれを単独で細胞培養した場合より細胞生育促進性に優れていた。
Ａ−６−２ VITTDSDGNE
Ａ−６−６ NINDFDED
となった。
Ａ−６−２およびＡ−６−６ともにフィブロインのＮ末端側のペプチドであった。
Ｎ末端部はアミノ酸組成から考えて、非結晶部である。
そこで、Ａ−６−２とＡ−６−６のペプチドを合成し、（北海道システムサイエンス株式会社に委託）、前述と同様に３日間培養して合成ペプチドの生理活性を測定したところ、絹タンパクからの抽出物と同様に細胞生育促進性のあることを確認した。
また、合成したペプチドＡ−６−２とＡ−６−６を混合した場合、それぞれを単独で細胞培養した場合より細胞生育促進性に優れていた。
合成ペプチドの細胞生育率
家蚕フィブロインＨ鎖および天蚕フィブロインのアミノ酸配列をもとに、それぞれ合計１２部位について合成したペプチド（北海道システムサイエンス株式会社に委託）の細胞活性を測定した。
家蚕フィブロインＨ鎖および天蚕フィブロインのアミノ酸配列をもとに、それぞれ合計１２部位について合成したペプチド（北海道システムサイエンス株式会社に委託）の細胞活性を測定した。
（１）ペプチド合成
家蚕フィブロインの結晶部から２ケ 所の部分ペプチド（SfHC-1、SfHC-2）、及び非結晶部から２ケ 所の部分ペプチド（SfHE、SfHA）を取り上げた。
また、天蚕フィブロインは結晶部としてAla (Ａ) の繰り返し部分（AfH０）、および非結晶部の７部分ペプチド（AfH１〜AfH ）を取り上げ、それらを合成した。
家蚕のフィブロインH 鎖の部分ペプチドは４種類、天蚕のフィブロインの部分ペプチドは８種類（AfH０〜AfH７）あり、それぞれのペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。
家蚕フィブロインの結晶部から２ケ 所の部分ペプチド（SfHC-1、SfHC-2）、及び非結晶部から２ケ 所の部分ペプチド（SfHE、SfHA）を取り上げた。
また、天蚕フィブロインは結晶部としてAla (Ａ) の繰り返し部分（AfH０）、および非結晶部の７部分ペプチド（AfH１〜AfH ）を取り上げ、それらを合成した。
家蚕のフィブロインH 鎖の部分ペプチドは４種類、天蚕のフィブロインの部分ペプチドは８種類（AfH０〜AfH７）あり、それぞれのペプチドのアミノ酸配列を以下に示す。
家蚕フィブロインH 鎖の部分ペプチド( ４種類)
SfHC−１ GAGAGSGAGAGSGAGAGYGAGY
SfHC−２ GAGAGSGAASGAGAGAGAGAGT
SfHE AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKN
SfHA GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT
SfHC−１ GAGAGSGAGAGSGAGAGYGAGY
SfHC−２ GAGAGSGAASGAGAGAGAGAGT
SfHE AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKN
SfHA GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT
天蚕フィブロインの部分ペプチド( ８種類)
AfH０ AAAAAAAAAA
AfH１ YGWGDGGYGSDS
AfH２ SGAGGSGGYGGYGSDS
AfH３ GSGAGGRGDGGYGSGSS
AfH４ RRAGHDRAAGS
AfH５ DEYVDN
AfH６ VETIVLEEDPYGHEDIYEED
AfH７ DDGFVLDGGYDSE
AfH０ AAAAAAAAAA
AfH１ YGWGDGGYGSDS
AfH２ SGAGGSGGYGGYGSDS
AfH３ GSGAGGRGDGGYGSGSS
AfH４ RRAGHDRAAGS
AfH５ DEYVDN
AfH６ VETIVLEEDPYGHEDIYEED
AfH７ DDGFVLDGGYDSE
（２）合成ペプチドのシャーレへのコート
それぞれの合成ペプチドを約１ｍｇづつとり、PBS ２００μl に溶解した。
溶解したペプチド溶液は７０％エタノールで希釈し、０．０２５％及び０．００２５％の濃度に調製し、それらを１ｍｌづつシャーレに入れ乾燥した。
SfHC−１、SfHC−２、SfHEは溶けにくかった為、９Ｍ LiSCN １ｍｌを追加して溶解した。
溶解液を半透膜に入れ１００倍量の水で３０分ごとに外液をかえて透析し、２７５ｎｍの吸光度でタンパク量を確認した。
SfHC−２はチロシン等が無いため、吸光度の測定はできなかったが、SfHC−１、 SfHE は溶解前とほぼ同量存在していたので、SfHC−２も同量あると仮定し、他のペプチドと同様に７０％エタノールで希釈しシャーレに入れて乾燥した。
また、AfH0も溶けにくかったが、透析すると分子量が小さいため抜けてしまう可能性があるので、よく攪拌して7 ０％エタノールで希釈しシャーレに入れ乾燥した。
それぞれの合成ペプチドを約１ｍｇづつとり、PBS ２００μl に溶解した。
溶解したペプチド溶液は７０％エタノールで希釈し、０．０２５％及び０．００２５％の濃度に調製し、それらを１ｍｌづつシャーレに入れ乾燥した。
SfHC−１、SfHC−２、SfHEは溶けにくかった為、９Ｍ LiSCN １ｍｌを追加して溶解した。
溶解液を半透膜に入れ１００倍量の水で３０分ごとに外液をかえて透析し、２７５ｎｍの吸光度でタンパク量を確認した。
SfHC−２はチロシン等が無いため、吸光度の測定はできなかったが、SfHC−１、 SfHE は溶解前とほぼ同量存在していたので、SfHC−２も同量あると仮定し、他のペプチドと同様に７０％エタノールで希釈しシャーレに入れて乾燥した。
また、AfH0も溶けにくかったが、透析すると分子量が小さいため抜けてしまう可能性があるので、よく攪拌して7 ０％エタノールで希釈しシャーレに入れ乾燥した。
（３）培養
細胞は三光純薬から購入した（凍結）ヒト皮膚線維芽細胞( 成人の正常皮膚由来) を使用した。
培地は、クラボウから購入したヒト皮膚線維芽細胞増殖用低血清培地を使用した。
シャーレ１枚に付き培地２ｍｌを入れ、約８万の細胞を接種し、３日間培養した。
その後、アラマーブルー（ＩＷＡＫＩ）を０．１ｍｌ入れ、３７℃、２時間培養したのち５７０ｎｍ、６００ｎｍの吸光度から計算した色素の還元量を生細胞数とした。
これら細胞培養に関する測定方法は実施例１と同じである。
結果を表４、表５に示す。
細胞は三光純薬から購入した（凍結）ヒト皮膚線維芽細胞( 成人の正常皮膚由来) を使用した。
培地は、クラボウから購入したヒト皮膚線維芽細胞増殖用低血清培地を使用した。
シャーレ１枚に付き培地２ｍｌを入れ、約８万の細胞を接種し、３日間培養した。
その後、アラマーブルー（ＩＷＡＫＩ）を０．１ｍｌ入れ、３７℃、２時間培養したのち５７０ｎｍ、６００ｎｍの吸光度から計算した色素の還元量を生細胞数とした。
これら細胞培養に関する測定方法は実施例１と同じである。
結果を表４、表５に示す。
家蚕フィブロインでは、フィブロインの結晶部の部分ペプチドSfHC−１、SfHC−２より、非結晶部の部う分ペプチドであるSfHE、SfHAの生育率が高く、対照区の２倍以上の値を示し、非結晶部の部分ペプチド、またはその混合物はSDFGPである。
天蚕フィブロインの結晶部の部分ペプチドであるAfH０には活性はほとんど無く、濃度の濃い方（０．０２５％）が生育率が低いため、細胞生育を阻害していると考えられる。
非結晶部の部分ペプチド合成物AfH1〜AfH７は細胞生育促進性を示したが生育率に差が現れた。
例えば、AfH３とAfH６はいずれも塩基性アミノ酸を１残基含むが、AfH３は酸性アミノ酸残基が少なく、AfH６は酸性アミノ酸残基が多いため、AfH６の方が高い細胞生育促進性を示した。
特にAfH１、AfH５、AfH６、AFH７は優れた細胞生育促進性を示し、いずれも合成によって得られたSDFGPである。
非結晶部の部分ペプチド合成物AfH1〜AfH７は細胞生育促進性を示したが生育率に差が現れた。
例えば、AfH３とAfH６はいずれも塩基性アミノ酸を１残基含むが、AfH３は酸性アミノ酸残基が少なく、AfH６は酸性アミノ酸残基が多いため、AfH６の方が高い細胞生育促進性を示した。
特にAfH１、AfH５、AfH６、AFH７は優れた細胞生育促進性を示し、いずれも合成によって得られたSDFGPである。
表５で示したように、非結晶部から得た部分ペプチドの細胞生育率は全てが高くSDFGP となるわけではない。
それは、表６で示したように各ペプチドを構成するアミノ酸側鎖の化学構造の違いによる。
それは、表６で示したように各ペプチドを構成するアミノ酸側鎖の化学構造の違いによる。
合成ペプチドの細胞生育活性
実施例１〜実施例３の結果を基に細胞生育活性を示すと考えられる酸性アミノ酸および極性非荷電アミノ酸を主成分とした合成ペプチド（北海道システムサイエンス株式会社に合成を委託）の線維芽細胞生育活性を測定した。
細胞生育活性の測定方法は〔実施例１〕と同様に行った。
細胞培養は３日間行い、ペプチド濃度0.025 μg/cm2 の場合について結果を表７に示した。
グルタミン酸では４残基以上の配列となると細胞生育活性が優れていた。
実施例１〜実施例３の結果を基に細胞生育活性を示すと考えられる酸性アミノ酸および極性非荷電アミノ酸を主成分とした合成ペプチド（北海道システムサイエンス株式会社に合成を委託）の線維芽細胞生育活性を測定した。
細胞生育活性の測定方法は〔実施例１〕と同様に行った。
細胞培養は３日間行い、ペプチド濃度0.025 μg/cm2 の場合について結果を表７に示した。
グルタミン酸では４残基以上の配列となると細胞生育活性が優れていた。
合成ペプチドの細胞接着および増殖促進性
絹タンパク由来の合成ペプチドまた酸性アミノ酸または極性非荷電アミノ酸を主とした合成ペプチドなどが有する細胞生育活性について、細胞生育性をさらに詳しく細胞接着性と増殖性に分けて測定した。
この測定方法は〔実施例１〕における（３）細胞培養の方法とは方法が一部異なる。
ここにおける細胞培養では、細胞は三光純薬から購入した（凍結）ヒト皮膚線維芽細胞（成人の正常な皮膚由来）を使用した。
培地はクラボウから購入したヒト皮膚細胞芽細胞増殖用低血清培地（Medium 106S 500ml）を使用した。
Medium106Sは皮膚線維芽細胞基礎培地である。
ここではLSGS（低血清増殖添加剤）は使用していない。
接着性を測定する場合は、培地に細胞を接種した５時間後に培地に浮遊している細胞を除き、シャーレの底に接着している生細胞数を測定した。
増殖性を測定する場合は、培地に細胞を接種した時から３日間培養した後の生細胞数を測定した。
細胞培養法の他は、〔実施例１〕と同様に、ペプチドの細胞培養容器へのコーティング、アラマーブルー色素による生細胞数の測定等を行った。
ペプチドを細胞培養容器にコーティングしなかった場合の生細胞数を対照区（100%）として、得られた接着性の結果を表８に、また増殖性の結果を表９に示す。
絹タンパク由来の合成ペプチドまた酸性アミノ酸または極性非荷電アミノ酸を主とした合成ペプチドなどが有する細胞生育活性について、細胞生育性をさらに詳しく細胞接着性と増殖性に分けて測定した。
この測定方法は〔実施例１〕における（３）細胞培養の方法とは方法が一部異なる。
ここにおける細胞培養では、細胞は三光純薬から購入した（凍結）ヒト皮膚線維芽細胞（成人の正常な皮膚由来）を使用した。
培地はクラボウから購入したヒト皮膚細胞芽細胞増殖用低血清培地（Medium 106S 500ml）を使用した。
Medium106Sは皮膚線維芽細胞基礎培地である。
ここではLSGS（低血清増殖添加剤）は使用していない。
接着性を測定する場合は、培地に細胞を接種した５時間後に培地に浮遊している細胞を除き、シャーレの底に接着している生細胞数を測定した。
増殖性を測定する場合は、培地に細胞を接種した時から３日間培養した後の生細胞数を測定した。
細胞培養法の他は、〔実施例１〕と同様に、ペプチドの細胞培養容器へのコーティング、アラマーブルー色素による生細胞数の測定等を行った。
ペプチドを細胞培養容器にコーティングしなかった場合の生細胞数を対照区（100%）として、得られた接着性の結果を表８に、また増殖性の結果を表９に示す。
すなわち、表８は、各種ペプチドをコートしたシャーレでヒト皮膚線維芽細胞を５時間培養した後の接着性を示す。
ここで合成ペプチドは記号またはアミノ酸配列で示した。
この場合、各シャーレへコートした時の各ペプチドの濃度は0.025 μg/cm2 である。
ペプチドをコートしなかった場合の接着率（%）を100とした。
ここで合成ペプチドは記号またはアミノ酸配列で示した。
この場合、各シャーレへコートした時の各ペプチドの濃度は0.025 μg/cm2 である。
ペプチドをコートしなかった場合の接着率（%）を100とした。
表９は、各種ペプチドをコートしたシャーレでヒト皮膚線維芽細胞を３日間培養した後の増殖性を示す。
ここで合成ペプチドは記号又はアミノ酸配列で示した。
この場合、各シャーレへコートした時の各ペプチドの濃度は0.025 μg/cm2 である。
ペプチドをコートしなかった場合の増殖率（%）を100とした。
ただし、３日間培養した後の対照区における生細胞数は培養中に約１５０% に増殖していたが、対照区の値（100%）は３日間培養した後の生細胞数を基にしている。
従って、３日間の培養中に細胞数が増減しなかった場合の増殖率は約７０% となる。
ここで合成ペプチドは記号又はアミノ酸配列で示した。
この場合、各シャーレへコートした時の各ペプチドの濃度は0.025 μg/cm2 である。
ペプチドをコートしなかった場合の増殖率（%）を100とした。
ただし、３日間培養した後の対照区における生細胞数は培養中に約１５０% に増殖していたが、対照区の値（100%）は３日間培養した後の生細胞数を基にしている。
従って、３日間の培養中に細胞数が増減しなかった場合の増殖率は約７０% となる。
Claims (7)
- 次の（１）から（８）のいずれかのアミノ酸配列からなることを特徴とする細胞生育促進性に優れたペプチド。
（１） VITTDSDGNE
（２） NINDFDED
（３） AASSVSSASSRSYDYSRRNVRKN
（４） GSSGFGPYVAHGGYSGYEYAWSSESDFGT
（５） YGWGDGGYGSDS
（６） DEYVDN
（７） VETIVLEEDPYGHEDIYEED
（８） DDGFVLDGGYDSE - 家蚕の未分解絹タンパク又はAntheraeaに属する野蚕の未分解絹フィブロインを、加水分解した後、分子量分画により請求項１記載のペプチドを分離、取得する方法。
- 加水分解を希酸、ヒドロキシルアミン又は蛋白分解酵素により行うことを特徴とする細胞生育促進性に優れた請求項２記載のペプチドを分離、取得する方法。
- 請求項１記載のペプチドを含有する試験管内で用いられる細胞増殖促進剤。
- 請求項１記載のペプチドを含有する試験管内で用いられる細胞接着剤。
- 請求項１記載のペプチドを含有する化粧料。
- 請求項１記載のペプチドを含有する細胞培養基材。
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