JP2007075102A - 昆虫細胞培養用培地 - Google Patents
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Abstract
【課題】低コスト、安定でかつタンパク質の高い発現効率を達成することができる、血清成分や昆虫体液を使用しない、新規な昆虫細胞培養用培地を提供することを目的とする。
【解決手段】昆虫細胞を無血清条件下で培養するための培地であって、該培地に酵母抽出物、ラクトアルブミン、シルクパウダーを含むことを特徴とする昆虫細胞培養用培地を提供する。血清成分や昆虫体液を使用しない本発明の昆虫細胞培養用培地によれば、昆虫細胞の増殖を促進することができ、低コストで、安定、かつ高いタンパク質の発現効率を達成できるという利点がある。
【選択図】なし
【解決手段】昆虫細胞を無血清条件下で培養するための培地であって、該培地に酵母抽出物、ラクトアルブミン、シルクパウダーを含むことを特徴とする昆虫細胞培養用培地を提供する。血清成分や昆虫体液を使用しない本発明の昆虫細胞培養用培地によれば、昆虫細胞の増殖を促進することができ、低コストで、安定、かつ高いタンパク質の発現効率を達成できるという利点がある。
【選択図】なし
Description
本発明は、昆虫細胞培養用の無血清培地に関するものである。
細胞培養技術は、例えば遺伝子組換えによる有用タンパク質の製造等、バイオテクノロジーにおいて重要な位置を占める。特に、カイコやヨトウガ等の昆虫から株化した細胞の培養細胞は、従来用いられているバクテリアや酵母と比較してタンパク質の発現効率が高く、哺乳類に近い蛋白質のフォールディング及び翻訳後修飾が期待できる。そのため、昆虫細胞は、各種の有用な組換えタンパク質を発現させるための宿主として重要視されている。
多くの哺乳動物の細胞培養用培地と同様、昆虫の細胞培養用培地にも、培地の基本成分として、ウシ等の動物由来の血清成分や昆虫体液が従来必須とされてきた。しかしながら、これらの添加物はコストが高く、十分な量を安定な品質で入手することが困難である等の問題があるため、これらの添加物を使用しない、より優れた昆虫細胞培養用培地の開発が求められていた。
Mitsuhashi, J. and Maramorosh, K.(1964) Contrb. Boyce Thompson Inst., 22.435-460 今西重雄、「無血清培養可能なカイコ培養細胞系を利用したラージスケール発現系の作出に向けて」2004日本蚕糸学会第74回学術講演会講演要旨集、2004年、69頁 今西重雄、「無血清培養できるカイコ培養細胞系の作出による効率的なin vitro発現系の開発」第48回日本応用動物昆虫学会講演要旨 平成16年度日本農学会大会分科会、2004年、106頁（非特許文献３）
Mitsuhashi, J. and Maramorosh, K.(1964) Contrb. Boyce Thompson Inst., 22.435-460 今西重雄、「無血清培養可能なカイコ培養細胞系を利用したラージスケール発現系の作出に向けて」2004日本蚕糸学会第74回学術講演会講演要旨集、2004年、69頁 今西重雄、「無血清培養できるカイコ培養細胞系の作出による効率的なin vitro発現系の開発」第48回日本応用動物昆虫学会講演要旨 平成16年度日本農学会大会分科会、2004年、106頁（非特許文献３）
本発明は、上述の事情を鑑みてなされたものであり、低コスト、安定でかつタンパク質の高い発現効率を達成することができる、血清成分や昆虫体液を使用しない、新規な昆虫細胞培養用培地を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため、高いタンパク質の発現効率を可能にする昆虫細胞培養用培地について鋭意検討を行い、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．昆虫細胞を無血清条件下で培養するための培地であって、該培地に酵母抽出物、ラクトアルブミン、シルクパウダーを含むことを特徴とする昆虫細胞培養用培地。
２．酵母抽出物： 1000-20000 mg/L、ラクトアルブミン加水分解物： 50-10000 mg/L、シルクパウダー： 1-1000 mg/Lを含むことを特徴とする前項１に記載の昆虫細胞培養用培地。
３．以下のアミノ酸（無水、水和物、塩基付加物、酸の溶媒和物を含む）〔DL-セリン、グリシン、ハイドロキシ-L-プロリン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-シスチン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、βアラニン〕を含むことを特徴とする前項１または２に記載の昆虫細胞培養用培地。
４．以下のアミノ酸（無水、水和物、塩基付加物、酸の溶媒和物を含む）〔DL-セリン：1-100 mg/L、グリシン：1-100 mg/L、ハイドロキシ-L-プロリン：5-500 mg/L、L-アルギニン：5-500 mg/L、L-アスパラギン：5-500 mg/L、L-アスパラギン酸：5-500 mg/L、L-シスチン：0.1-50 mg/L、L-グルタミン酸：10-500 mg/L、L-グルタミン：5-500 mg/L、L-ヒスチジン：1-100 mg/L、L-イソロイシン：5-200 mg/L、L−ロイシン：1-100 mg/L、L-リジン：5-200 mg/L、L-メチオニン：5-500 mg/L、L-フェニルアラニン：5-500 mg/L、L-プロリン：2-200 mg/L、L-スレオニン：1-100 mg/L、L-トリプトファン：0.1-50 mg/L、L-チロシン：1-200 mg/L、L-バリン：1-200 mg/L、βアラニン：1-100 mg/L〕を含むことを特徴とする前項１〜３のいずれか１項に記載の昆虫細胞培養用培地。
５．塩化カルシウム（無水又は水和物を含む）、重炭酸ナトリウム、脂質混合物〔コレステロール、脂肪酸メチルエステル、D-α-トコフェロール（塩基付加物又は酸付加物を含む）、Tween 80から成る〕、ITS（Insulin、Transferrin、Seleniumから成る）、非イオン性高分子界面活性剤を含むことを特徴とする前項１〜４のいずれか１項に記載の昆虫細胞培養用培地。
６．塩化カルシウム（無水又は水和物を含む）、重炭酸ナトリウム：1-200 mg/L、脂質混合物〔4.5 g/L コレステロール、10 g/L 脂肪酸メチルエステル、25 g/L D-α-トコフェロール（塩基付加物又は酸付加物を含む）、2 g/L Tween 80から成る〕：1-1500μL/L、ITS（Insulin、Transferrin、Selenium）：0-1000μL/L、非イオン性高分子界面活性剤：0.025-0.5％を含むことを特徴とする前項１〜５のいずれか１項に記載の昆虫細胞培養用培地。
７．以下の無機塩類（無水、水和物、塩基付加物、又は酸の溶媒和物を含む）〔モリブデン酸アンモニウム、塩化コバルト、塩化銅、塩化カルシウム、硫酸銅、硫化鉄、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化カリウム、塩化マンガン、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化亜鉛〕を含むことを特徴とする前項１〜６のいずれか１項に記載の昆虫細胞培養用培地。
８．ビオチン、塩化コリン、シアノコバラミン、D-パントテン酸、葉酸、ミオイノシト−ル、ナイアシン、パラアミノ安息香酸、ピリドキサ−ル、リボフラビン、チアミンを含むことを特徴とする前項１〜７のいずれか１項に記載の昆虫細胞培養用培地。
９．KBM700培地とMMSF培地を0.5-2：8-9.5の混合比で混合することにより調製される前項１〜８のいずれか１項に記載の昆虫細胞培養用培地。
１０．前項１〜９のいずれか１項に記載の培地を使用することを特徴とする昆虫細胞の培養方法。
１１．昆虫細胞が有用物質生産能を有するものであり、培養が該有用物質の製造のためである、前項１０に記載の方法。
１２．有用物質が生物学的に活性なタンパク質である、前項１１に記載の方法。
１３．昆虫細胞がヨトウガ（Mamestra brassicae）の培養細胞である、前項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
１４．昆虫細胞がNIAS-Bm-Ke1細胞（受託番号 FERM P-20572）である、前項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
１．昆虫細胞を無血清条件下で培養するための培地であって、該培地に酵母抽出物、ラクトアルブミン、シルクパウダーを含むことを特徴とする昆虫細胞培養用培地。
２．酵母抽出物： 1000-20000 mg/L、ラクトアルブミン加水分解物： 50-10000 mg/L、シルクパウダー： 1-1000 mg/Lを含むことを特徴とする前項１に記載の昆虫細胞培養用培地。
３．以下のアミノ酸（無水、水和物、塩基付加物、酸の溶媒和物を含む）〔DL-セリン、グリシン、ハイドロキシ-L-プロリン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-シスチン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、βアラニン〕を含むことを特徴とする前項１または２に記載の昆虫細胞培養用培地。
４．以下のアミノ酸（無水、水和物、塩基付加物、酸の溶媒和物を含む）〔DL-セリン：1-100 mg/L、グリシン：1-100 mg/L、ハイドロキシ-L-プロリン：5-500 mg/L、L-アルギニン：5-500 mg/L、L-アスパラギン：5-500 mg/L、L-アスパラギン酸：5-500 mg/L、L-シスチン：0.1-50 mg/L、L-グルタミン酸：10-500 mg/L、L-グルタミン：5-500 mg/L、L-ヒスチジン：1-100 mg/L、L-イソロイシン：5-200 mg/L、L−ロイシン：1-100 mg/L、L-リジン：5-200 mg/L、L-メチオニン：5-500 mg/L、L-フェニルアラニン：5-500 mg/L、L-プロリン：2-200 mg/L、L-スレオニン：1-100 mg/L、L-トリプトファン：0.1-50 mg/L、L-チロシン：1-200 mg/L、L-バリン：1-200 mg/L、βアラニン：1-100 mg/L〕を含むことを特徴とする前項１〜３のいずれか１項に記載の昆虫細胞培養用培地。
５．塩化カルシウム（無水又は水和物を含む）、重炭酸ナトリウム、脂質混合物〔コレステロール、脂肪酸メチルエステル、D-α-トコフェロール（塩基付加物又は酸付加物を含む）、Tween 80から成る〕、ITS（Insulin、Transferrin、Seleniumから成る）、非イオン性高分子界面活性剤を含むことを特徴とする前項１〜４のいずれか１項に記載の昆虫細胞培養用培地。
６．塩化カルシウム（無水又は水和物を含む）、重炭酸ナトリウム：1-200 mg/L、脂質混合物〔4.5 g/L コレステロール、10 g/L 脂肪酸メチルエステル、25 g/L D-α-トコフェロール（塩基付加物又は酸付加物を含む）、2 g/L Tween 80から成る〕：1-1500μL/L、ITS（Insulin、Transferrin、Selenium）：0-1000μL/L、非イオン性高分子界面活性剤：0.025-0.5％を含むことを特徴とする前項１〜５のいずれか１項に記載の昆虫細胞培養用培地。
７．以下の無機塩類（無水、水和物、塩基付加物、又は酸の溶媒和物を含む）〔モリブデン酸アンモニウム、塩化コバルト、塩化銅、塩化カルシウム、硫酸銅、硫化鉄、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化カリウム、塩化マンガン、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化亜鉛〕を含むことを特徴とする前項１〜６のいずれか１項に記載の昆虫細胞培養用培地。
８．ビオチン、塩化コリン、シアノコバラミン、D-パントテン酸、葉酸、ミオイノシト−ル、ナイアシン、パラアミノ安息香酸、ピリドキサ−ル、リボフラビン、チアミンを含むことを特徴とする前項１〜７のいずれか１項に記載の昆虫細胞培養用培地。
９．KBM700培地とMMSF培地を0.5-2：8-9.5の混合比で混合することにより調製される前項１〜８のいずれか１項に記載の昆虫細胞培養用培地。
１０．前項１〜９のいずれか１項に記載の培地を使用することを特徴とする昆虫細胞の培養方法。
１１．昆虫細胞が有用物質生産能を有するものであり、培養が該有用物質の製造のためである、前項１０に記載の方法。
１２．有用物質が生物学的に活性なタンパク質である、前項１１に記載の方法。
１３．昆虫細胞がヨトウガ（Mamestra brassicae）の培養細胞である、前項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
１４．昆虫細胞がNIAS-Bm-Ke1細胞（受託番号 FERM P-20572）である、前項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
本発明の昆虫細胞培養用培地には、血清成分や昆虫体液を使用しないため低コスト、培地組成が均質で一定しており、かつ高いタンパク質の発現効率を達成できるという利点がある。
本発明の昆虫細胞培養用培地は、少なくともタンパク質抽出物を含み、さらに無機塩、アミノ酸、ビタミン、糖類、その他の添加物を含み得る。
（１）タンパク質抽出物
タンパク質抽出物として、少なくとも酵母抽出物、ラクトアルブミン、シルクパウダーが挙げられる。酵母抽出物、ラクトアルブミン、シルクパウダーは公知の手法により得ることができる。これらは市販のものを用いることができ、酵母抽出物は細胞培養用に調製された、例えばDIFCO社製[Tc（Tissue Culture）-yeastolate]のものを用いることができ、ラクトアルブミンはDIFCO社製（No. 5996）または和光純薬工業株式会社製（Code No. 59-00225）のものを、シルクパウダーはカネボウ株式会社製（silkpowder FD）のものを用いることができる。
タンパク質抽出物として、少なくとも酵母抽出物、ラクトアルブミン、シルクパウダーが挙げられる。酵母抽出物、ラクトアルブミン、シルクパウダーは公知の手法により得ることができる。これらは市販のものを用いることができ、酵母抽出物は細胞培養用に調製された、例えばDIFCO社製[Tc（Tissue Culture）-yeastolate]のものを用いることができ、ラクトアルブミンはDIFCO社製（No. 5996）または和光純薬工業株式会社製（Code No. 59-00225）のものを、シルクパウダーはカネボウ株式会社製（silkpowder FD）のものを用いることができる。
タンパク質抽出物の培地中の含有量は、培地1 L当たり、酵母抽出物は好ましくは1000〜20000 mg、より好ましくは2000-10000 mg、特に好ましくは4000-5000 mg； ラクトアルブミンは好ましくは500-10000 mg、より好ましくは2000-15000 mg、特に好ましくは5000-6000 mg； シルクパウダーは好ましくは1-1000 mg、より好ましくは10-500 mg、特に好ましくは10-200 mgである。
（２）無機塩
無機塩としては、一般に動物細胞用培地に添加し得るものを添加すればよい。
すなわち、モリブデン酸アンモニウム、塩化コバルト、塩化銅、塩化カルシウム、硫酸銅、硫化鉄、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化カリウム、塩化マンガン、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化亜鉛が挙げられる。また、本発明において、これらの無機塩類は、無水、水和物、塩基付加物、酸（塩酸、硫酸、硝酸など）の溶媒和物のいずれかでも良い。
無機塩としては、一般に動物細胞用培地に添加し得るものを添加すればよい。
すなわち、モリブデン酸アンモニウム、塩化コバルト、塩化銅、塩化カルシウム、硫酸銅、硫化鉄、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化カリウム、塩化マンガン、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化亜鉛が挙げられる。また、本発明において、これらの無機塩類は、無水、水和物、塩基付加物、酸（塩酸、硫酸、硝酸など）の溶媒和物のいずれかでも良い。
無機塩の培地中の含有量は、培地1 L当たり、モリブデン酸アンモニウムは好ましくは0.0003-0.03 mg、より好ましくは0.0015-0.02 mg、特に好ましくは0.003-0.01 mg； 塩化コバルトは、好ましくは0.0003-0.06 mg、より好ましくは0.0015-0.02 mg、特に好ましくは0.003-0.01 mg； 塩化銅は、好ましくは0.003-0.3 mg、より好ましくは0.009-0.01 mg、特に好ましくは0.01-0.06 mg； 塩化カルシウムは、好ましくは50-1000 mg、より好ましくは80-400 mg、特に好ましくは150-200 mg； 硫化鉄は好ましくは0.003-0.6 mg、より好ましくは0.015-0.2 mg、特に好ましくは0.03-0.012 mg； 硫酸マグネシウムは、好ましくは30-1000 mg、より好ましくは45-450 mg、特に好ましくは50-200 mg； 塩化マグネシウムは、好ましくは10-500 mg、より好ましくは30-200 mg、特に好ましくは70-100 mg； 塩化マンガンは好ましくは0.0005-0.03 mg、より好ましくは0.001-0.01mg、特に好ましくは0.002-0.006 mg； 塩化カリウムは、好ましくは100-1000 mg、より好ましくは150-800 mg、特に好ましくは200-500 mg； 塩化ナトリウムは、好ましくは1000-5000 mg、より好ましくは1500-2500 mg、特に好ましくは2000-3000 mg； リン酸二水素ナトリウムは好ましくは15-1500 mg、より好ましくは30-600 mg、特に好ましくは60-300 mg； 重炭酸ナトリウムは、好ましくは10-500 mg、より好ましくは50-150 mg、特に好ましくは80-120 mg； 塩化亜鉛は、好ましくは0.0003-0.06 mg、より好ましくは0.002-0.01mg、特に好ましくは0.003-0.01 mgである。
（３）アミノ酸
アミノ酸としては、一般に動物細胞用培地に添加し得るものを添加すればよい。
すなわち、DL-セリン、グリシン、ハイドロキシ-L-プロリン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-シスチン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、βアラニンが挙げられる。また、アミノ酸は、無水、水和物、塩基付加物、酸などの溶媒和物のいずれかでも良い。
アミノ酸としては、一般に動物細胞用培地に添加し得るものを添加すればよい。
すなわち、DL-セリン、グリシン、ハイドロキシ-L-プロリン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-シスチン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、βアラニンが挙げられる。また、アミノ酸は、無水、水和物、塩基付加物、酸などの溶媒和物のいずれかでも良い。
アミノ酸の培地中の含有量は、培地1 L当たり、DL-セリンは好ましくは1-100 mg、より好ましくは3-70 mg、特に好ましくは10-50 mg； グリシンは好ましくは1-100 mg、より好ましくは3-70 mg、特に好ましくは10-50 mg； ハイドロキシ-L-プロリンは好ましくは15-1500 mg、より好ましくは30-450 mg、特に好ましくは50-200 mg； L-アルギニンは好ましくは15-1500 mg、より好ましくは30-450 mg、特に好ましくは60-200 mg； L-アスパラギンは好ましくは15-1500 mg、より好ましくは30-600 mg、特に好ましくは100-300 mg； L-アスパラギン酸は好ましくは15-1500 mg、より好ましくは30-600 mg、特に好ましくは100-300 mg； L-シスチンは好ましくは0.3-150 mg、より好ましくは0.2-60 mg、特に好ましくは3-30 mg； L-グルタミン酸は好ましくは30-1500 mg、より好ましくは60-1000 mg、特に好ましくは120-330 mg； L-グルタミンは好ましくは15-1500mg、より好ましくは30-450mg、特に好ましくは100-200mg； L-ヒスチジンは好ましくは1-300 mg、より好ましくは10-150 mg、特に好ましくは15-45 mg； L-イソロイシンは好ましくは15-600mg、より好ましくは30-300mg、特に好ましくは60-200 mg； L-ロイシンは好ましくは1-300 mg、より好ましくは10-150 mg、特に好ましくは15-60 mg； L-リジンは好ましくは15-1000 mg、より好ましくは30-600 mg、特に好ましくは50-150 mg； L-メチオニンは好ましくは15-1500 mg、より好ましくは30-450 mg、特に好ましくは100-200 mg； L-フェニルアラニンは好ましくは15-1500 mg、より好ましくは30-450 mg、特に好ましくは100-200 mg； L-プロリンは好ましくは5-600mg、より好ましくは15-300 mg、特に好ましくは30-100 mg； L-スレオニンは好ましくは3-300 mg、より好ましくは10-100 mg、特に好ましくは30-50 mg； L-トリプトファンは好ましくは0.3-150 mg、より好ましくは1.5-60 mg、特に好ましくは15-50 mg； L-チロシンは好ましくは3-600 mg、より好ましくは15-300 mg、特に好ましくは30-100 mg； L-バリンは好ましくは3-600 mg、より好ましくは15-300 mg、特に好ましくは30-150 mg； βアラニンは好ましくは3-300 mg、より好ましくは5-150 mg、特に好ましくは15-75 mgである。
（４）ビタミン
ビタミン類としては、一般に動物細胞用培地に添加し得るものを添加すればよい。
すなわち、ビオチン、塩化コリン、シアノコバラミン、D-パントテン酸、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシン、パラアミノ安息香酸、ピリドキサール、リボフラビン、チアミンが挙げられる。
ビタミン類としては、一般に動物細胞用培地に添加し得るものを添加すればよい。
すなわち、ビオチン、塩化コリン、シアノコバラミン、D-パントテン酸、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシン、パラアミノ安息香酸、ピリドキサール、リボフラビン、チアミンが挙げられる。
ビタミンの培地中の含有量は、培地1 L当たり、ビオチンは好ましくは0.0001-0.3 mg、より好ましくは0.0015-0.2 mg、特に好ましくは0.003-0.06 mg； 塩化コリンは好ましくは0.05-30 mg、より好ましくは0.1-10 mg、特に好ましくは1-5 mg； シアノコバラミンは好ましくは0.001-0.3 mg、より好ましくは0.005-0.15 mg、特に好ましくは0.0015-0.05 mg；D-パントテン酸は好ましくは0.00001-0.03 mg、より好ましくは0.00015-0.015 mg、特に好ましくは0.0003-0.006 mg； 葉酸は好ましくは0.0001-0.15 mg、より好ましくは0.0015-0.03 mg、特に好ましくは0.003-0.01 mg； ミオイノシトールは好ましくは0.003-2.0 mg、より好ましくは0.015-0.3 mg、特に好ましくは0.01-0.1 mg； ナイアシンは好ましくは0.0001-1 mg、より好ましくは0.0005-0.3 mg、特に好ましくは0.015-0.03 mg； パラアミノ安息香酸は好ましくは0.001-1.5 mg、より好ましくは0.015-0.3 mg、特に好ましくは0.03-0.1 mg； ピリドキサールは好ましくは0.003-2.0 mg、より好ましくは0.015-0.3 mg、特に好ましくは0.03-0.1 mg； リボフラビンは好ましくは0.001-0.15 mg、より好ましくは0.0015-0.06 mg、特に好ましくは0.006-0.02 mg； チアミンは好ましくは0.001-0.15 mg、より好ましくは0.0015-0.06 mg、特に好ましくは0.006-0.02 mgである。
（５）糖類及び有機酸類
糖類及び有機酸類としては、一般に動物細胞用培地に添加し得るものを添加すればよい。
糖類として、グルコース、D(＋)-スクロース、マルトースが挙げられる。また、有機酸として、フマル酸、L-リンゴ酸、コハク酸、α-ケトグルタル酸が挙げられる。
糖類及び有機酸類としては、一般に動物細胞用培地に添加し得るものを添加すればよい。
糖類として、グルコース、D(＋)-スクロース、マルトースが挙げられる。また、有機酸として、フマル酸、L-リンゴ酸、コハク酸、α-ケトグルタル酸が挙げられる。
糖類の培地中の含有量は、培地1 L当たり、グルコースは好ましくは2.0-8.0 g、より好ましくは3.0-7.0 g、特に好ましくは5.0-6.0 g； D(＋)-スクロースは好ましくは300-15000 mg、より好ましくは200-8000 mg、特に好ましくは150-3500 mg； マルトースは好ましくは15-1500 mg、より好ましくは30-450 mg、特に好ましくは100-200 mg；有機酸類の培地中の含有量は、培地1 L当たり、フマル酸は好ましくは0.01-15 mg、より好ましくは0.15-5 mg、特に好ましくは0.3-1.0 mg； L-リンゴ酸は好ましくは0.3-150 mg、より好ましくは1.5-30 mg、特に好ましくは5-10.0 mg； コハク酸は好ましくは0.03-15 mg、より好ましくは0.15-3 mg、特に好ましくは0.3-1.0 mg； α-ケトグルタル酸は好ましくは0.1-30 mg、より好ましくは0.15-15 mg、特に好ましくは0.5-7.5 mgである。
その他、培地に、塩化カルシウム、重炭酸ナトリウム、脂質混合物（コレステロール、脂肪酸メチルエステル、D-α-トコフェロール、Tween 80）（特に、Sigma社製のLipid Mixture (1000倍液、Product No. L5146)、ITS（Insulin、Transferrin、Selenium）（特に、Sigma社製のProduct No. I1884）、非イオン性高分子界面活性剤（特にJRH社製のPluronic F-68 10％ Solution、Code No. 59915）等を添加してもよい。また、塩化カルシウムは、無水、水和物のいずれかでも良い。D-α-トコフェロールは、塩基付加物あるいは、酢酸などの酸付加物のいずれかでも良い。
塩化カルシウム(無水又は無水物を含む)及び重炭酸ナトリウムの培地中の含有量は、培地1 L当たり、それぞれ好ましくは1-500 mg、より好ましくは15-300 mg、特に好ましくは30〜150 mgである。脂質混合物の含有量は、組成が、4.5 g/L コレステロール、10 g/L 脂肪酸メチルエステル、25 g/L D-α-トコフェロール（塩基付加物あるいは、酢酸などの酸付加物を含む）、2 g/L Tween 80の場合、培地1 L当たり好ましくは100〜10000μL、より好ましくは300〜5000μL、特に好ましくは500〜1000μLである。ITSの培地中の含有量は、培地1 L当たり、好ましくは10-10000μL、より好ましくは50-5000μL、特に好ましくは150-1000μLである。非イオン性高分子界面活性剤（特にPluronic F-68 10％ Solution）の培地中の含有量は、培地1 L当たり、最終濃度として好ましくは0.25-0.5％、特に好ましくは0.1-0.25％である。
本発明の培地は上述のタンパク質抽出物、無機塩、アミノ酸、ビタミン、糖類を総て含んでいるのが望ましいが、一部の物質を欠いても良いし、また他の物質が添加されていても良い。これらは総て市販のものを用いることができる。さらに市販のペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質、還元型グルタチオン等を添加しても良い。
本発明の培地として、例えばKBM700培地（コージンバイオ社製）とMMSF培地（Mitsuhashi, J. and Maramorosh, K. (1964) Contrb. Boyce Thompson Inst., 22.435-460）（非特許文献１）（日本製薬社よりM・M昆虫細胞用培地として市販）を好ましくは0.5-2：8-9.5の混合比、より好ましくは1：9の混合比で混合することにより得られる培地を挙げることができる。本発明の培地は、純水に前述のタンパク質抽出物、無機塩、糖類、アミノ酸、ビタミン類、その他の添加物を溶解させて作製することができる。
本発明の培地による昆虫細胞の培養における培養温度は、20-35℃、好ましくは25-30℃であり、特に好ましくは約27℃である。また、本発明の培地のpHは、6.0-7.0、好ましくはpH 6.2-6.5である。
本発明の培地は、総ての昆虫細胞の培養に使用することができ、特に鱗翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目等に属する昆虫、より詳しくは、例えばヨトウガ（Mamestra brassicae）、カイコ（Bombyx mori）等由来の細胞、例えばNIAS-Bm-Ke1細胞（受託番号 FERM P-20572）[今西重雄、「無血清培養可能なカイコ培養細胞系を利用したラージスケール発現系の作出に向けて」2004日本蚕糸学会第74回学術講演会講演要旨集、2004年、69頁（非特許文献２）；今西重雄、「無血清培養できるカイコ培養細胞系の作出による効率的なin vitro発現系の開発」第48回日本応用動物昆虫学会講演要旨 平成16年度日本農学会大会分科会、2004年、106頁（非特許文献３）]の培養に適している。またこれらの昆虫の総ての組織から作出した培養細胞株、特に血球系細胞、胚子組織、脂肪体組織、精巣もしくは卵巣の生殖組織、消化器系組織、神経系組織、筋肉系組織細胞からの細胞の培養に適している。
本発明はまた、昆虫細胞の培養による有用物質、典型的には生物学的活性を有する有用タンパク質の製造方法に関する。この場合、例えば核多角体をコードする遺伝子を有用タンパク質の遺伝子に組換えた核多角体病ウイルスを、培養カイコ細胞に感染させ、当該感染カイコ細胞を本発明の昆虫細胞培養用培地で培養することにより、組換えウイルスが大量に得られる。当該組換えウイルスが産生する有用タンパク質を、増殖した昆虫細胞または培養物中から常法により分離、精製して利用することができる。また、増殖した組換えウイルスを飼育カイコに感染させ、さらに多くの有用タンパク質を得ることも可能である。
有用タンパク質としては、例えば各種の酵素類、各種の抗体類、（例えばキメラ抗体やヒト型化抗体等）、各種のサイトカイン類（インターロイキン類やインターフェロン類）,各種血液凝固関連因子等が挙げられる。
次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら制限されるものではない。
実施例１．ルシフェラーゼ活性の測定
（材料・方法）
96ウェルマイクロプレートの各ウェルに3×104 個の細胞が含まれるように調整したNIAS-Bm-Ke1細胞懸濁液150μLを入れ、各ウェルにMOI＝1のp10組換えウイルス（カイコ核多角体病ウイルスのゲノムに座位するp10遺伝子のプロモーター下流に北米産ホタルのルシフェラーゼ遺伝子を結合したp10遺伝子組換えウイルス）が含まれるウイルス液を25μL加えた。
27℃で96時間静置し、組換えウイルスの感染、増殖と組換え遺伝子の発現を促した。ルシフェラーゼ活性の測定にあたって、各ウェルの細胞液をマイクロテストチューブに採取し、室温で1000 rpm、3分間遠心後、上清を除去した。このチューブにさらに1倍液のLysis buffer（5倍濃度Lysis buffer R2プロメガ、Code No. 12057-022）を100μL加え、30分間、室温で静置した。その後、Lysis buffer中に含まれるルシフェラーゼ量（組換えウイルスのルシフェラーゼ遺伝子が発現）をルミノメーター（ベルトールド社製）を用いて測定した。
（結果）
図１に示すように、KBM700培地とMMSF培地を1：9の混合比で混合した場合に、高いルシフェラーゼ活性を示した。
（材料・方法）
96ウェルマイクロプレートの各ウェルに3×104 個の細胞が含まれるように調整したNIAS-Bm-Ke1細胞懸濁液150μLを入れ、各ウェルにMOI＝1のp10組換えウイルス（カイコ核多角体病ウイルスのゲノムに座位するp10遺伝子のプロモーター下流に北米産ホタルのルシフェラーゼ遺伝子を結合したp10遺伝子組換えウイルス）が含まれるウイルス液を25μL加えた。
27℃で96時間静置し、組換えウイルスの感染、増殖と組換え遺伝子の発現を促した。ルシフェラーゼ活性の測定にあたって、各ウェルの細胞液をマイクロテストチューブに採取し、室温で1000 rpm、3分間遠心後、上清を除去した。このチューブにさらに1倍液のLysis buffer（5倍濃度Lysis buffer R2プロメガ、Code No. 12057-022）を100μL加え、30分間、室温で静置した。その後、Lysis buffer中に含まれるルシフェラーゼ量（組換えウイルスのルシフェラーゼ遺伝子が発現）をルミノメーター（ベルトールド社製）を用いて測定した。
（結果）
図１に示すように、KBM700培地とMMSF培地を1：9の混合比で混合した場合に、高いルシフェラーゼ活性を示した。
実施例２．細胞数の測定
（材料・方法）
NIAS-Bm-Ke1細胞は、浮遊細胞用培養フラスコを用いて25℃で、96時間培養した。細胞数は、0.1％トリパンブルー液で染色し、生細胞数を血球計算盤（Burker-Turk）を用いて計測した。
（結果）
図２に示すように、KBM700培地とMMSF培地を1：9の混合比で混合した場合に、細胞数が増加することがわかった。
（材料・方法）
NIAS-Bm-Ke1細胞は、浮遊細胞用培養フラスコを用いて25℃で、96時間培養した。細胞数は、0.1％トリパンブルー液で染色し、生細胞数を血球計算盤（Burker-Turk）を用いて計測した。
（結果）
図２に示すように、KBM700培地とMMSF培地を1：9の混合比で混合した場合に、細胞数が増加することがわかった。
本発明の昆虫培養用培地によれば、血清や昆虫体液を使用することなく、昆虫細胞を高濃度に増加させ、昆虫細胞を用いた有用タンパク質の産生を促進することができる。
Claims (14)
- 昆虫細胞を無血清条件下で培養するための培地であって、該培地に酵母抽出物、ラクトアルブミン、シルクパウダーを含むことを特徴とする昆虫細胞培養用培地。
- 酵母抽出物： 1000-20000 mg/L、ラクトアルブミン加水分解物： 50-10000 mg/L、シルクパウダー： 1-1000 mg/Lを含むことを特徴とする請求項１に記載の昆虫細胞培養用培地。
- 以下のアミノ酸（無水、水和物、塩基付加物、酸の溶媒和物を含む）〔DL-セリン、グリシン、ハイドロキシ-L-プロリン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-シスチン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、βアラニン〕を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の昆虫細胞培養用培地。
- 以下のアミノ酸（無水、水和物、塩基付加物、酸の溶媒和物を含む）〔DL-セリン：1-100 mg/L、グリシン：1-100 mg/L、ハイドロキシ-L-プロリン：5-500 mg/L、L-アルギニン：5-500 mg/L、L-アスパラギン：5-500 mg/L、L-アスパラギン酸：5-500 mg/L、L-シスチン：0.1-50 mg/L、L-グルタミン酸：10-500 mg/L、L-グルタミン：5-500 mg/L、L-ヒスチジン：1-100 mg/L、L-イソロイシン：5-200 mg/L、L−ロイシン：1-100 mg/L、L-リジン：5-200 mg/L、L-メチオニン：5-500 mg/L、L-フェニルアラニン：5-500 mg/L、L-プロリン：2-200 mg/L、L-スレオニン：1-100 mg/L、L-トリプトファン：0.1-50 mg/L、L-チロシン：1-200 mg/L、L-バリン：1-200 mg/L、βアラニン：1-100 mg/L〕を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の昆虫細胞培養用培地。
- 塩化カルシウム（無水又は水和物を含む）、重炭酸ナトリウム、脂質混合物〔コレステロール、脂肪酸メチルエステル、D-α-トコフェロール（塩基付加物又は酸付加物を含む）、Tween 80から成る〕、ITS（Insulin、Transferrin、Seleniumから成る）、非イオン性高分子界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の昆虫細胞培養用培地。
- 塩化カルシウム（無水又は水和物を含む）、重炭酸ナトリウム：1-200 mg/L、脂質混合物〔4.5 g/L コレステロール、10 g/L 脂肪酸メチルエステル、25 g/L D-α-トコフェロール（塩基付加物又は酸付加物を含む）、2 g/L Tween 80から成る〕：1-1500μL/L、ITS（Insulin、Transferrin、Selenium）：0-1000μL/L、非イオン性高分子界面活性剤：0.025-0.5％を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の昆虫細胞培養用培地。
- 以下の無機塩類（無水、水和物、塩基付加物、又は酸の溶媒和物を含む）〔モリブデン酸アンモニウム、塩化コバルト、塩化銅、塩化カルシウム、硫酸銅、硫化鉄、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化カリウム、塩化マンガン、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化亜鉛〕を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の昆虫細胞培養用培地。
- ビオチン、塩化コリン、シアノコバラミン、D-パントテン酸、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシン、パラアミノ安息香酸、ピリドキサ−ル、リボフラビン、チアミンを含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の昆虫細胞培養用培地。
- KBM700培地とMMSF培地を0.5-2：8-9.5の混合比で混合することにより調製される請求項１〜８のいずれか１項に記載の昆虫細胞培養用培地。
- 請求項１〜９のいずれか１項に記載の培地を使用することを特徴とする昆虫細胞の培養方法。
- 昆虫細胞が有用物質生産能を有するものであり、培養が該有用物質の製造のためである、請求項１０に記載の方法。
- 有用物質が生物学的に活性なタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
- 昆虫細胞がヨトウガ（Mamestra ｂrassicae）の培養細胞である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
- 昆虫細胞がNIAS-Bm-Ke1細胞（受託番号 FERM P-20572）である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
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-
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