JP2007075102A - 昆虫細胞培養用培地 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】昆虫細胞を無血清条件下で培養するための培地であって、該培地に酵母抽出物、ラクトアルブミン、シルクパウダーを含むことを特徴とする昆虫細胞培養用培地を提供する。血清成分や昆虫体液を使用しない本発明の昆虫細胞培養用培地によれば、昆虫細胞の増殖を促進することができ、低コストで、安定、かつ高いタンパク質の発現効率を達成できるという利点がある。
【選択図】なし
Description
Mitsuhashi, J. and Maramorosh, K.(1964) Contrb. Boyce Thompson Inst., 22.435-460 今西重雄、「無血清培養可能なカイコ培養細胞系を利用したラージスケール発現系の作出に向けて」2004日本蚕糸学会第74回学術講演会講演要旨集、2004年、69頁 今西重雄、「無血清培養できるカイコ培養細胞系の作出による効率的なin vitro発現系の開発」第48回日本応用動物昆虫学会講演要旨 平成16年度日本農学会大会分科会、2004年、106頁(非特許文献3)
1.昆虫細胞を無血清条件下で培養するための培地であって、該培地に酵母抽出物、ラクトアルブミン、シルクパウダーを含むことを特徴とする昆虫細胞培養用培地。
2.酵母抽出物: 1000-20000 mg/L、ラクトアルブミン加水分解物: 50-10000 mg/L、シルクパウダー: 1-1000 mg/Lを含むことを特徴とする前項1に記載の昆虫細胞培養用培地。
3.以下のアミノ酸(無水、水和物、塩基付加物、酸の溶媒和物を含む)〔DL-セリン、グリシン、ハイドロキシ-L-プロリン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-シスチン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、βアラニン〕を含むことを特徴とする前項1または2に記載の昆虫細胞培養用培地。
4.以下のアミノ酸(無水、水和物、塩基付加物、酸の溶媒和物を含む)〔DL-セリン:1-100 mg/L、グリシン:1-100 mg/L、ハイドロキシ-L-プロリン:5-500 mg/L、L-アルギニン:5-500 mg/L、L-アスパラギン:5-500 mg/L、L-アスパラギン酸:5-500 mg/L、L-シスチン:0.1-50 mg/L、L-グルタミン酸:10-500 mg/L、L-グルタミン:5-500 mg/L、L-ヒスチジン:1-100 mg/L、L-イソロイシン:5-200 mg/L、L−ロイシン:1-100 mg/L、L-リジン:5-200 mg/L、L-メチオニン:5-500 mg/L、L-フェニルアラニン:5-500 mg/L、L-プロリン:2-200 mg/L、L-スレオニン:1-100 mg/L、L-トリプトファン:0.1-50 mg/L、L-チロシン:1-200 mg/L、L-バリン:1-200 mg/L、βアラニン:1-100 mg/L〕を含むことを特徴とする前項1〜3のいずれか1項に記載の昆虫細胞培養用培地。
5.塩化カルシウム(無水又は水和物を含む)、重炭酸ナトリウム、脂質混合物〔コレステロール、脂肪酸メチルエステル、D-α-トコフェロール(塩基付加物又は酸付加物を含む)、Tween 80から成る〕、ITS(Insulin、Transferrin、Seleniumから成る)、非イオン性高分子界面活性剤を含むことを特徴とする前項1〜4のいずれか1項に記載の昆虫細胞培養用培地。
6.塩化カルシウム(無水又は水和物を含む)、重炭酸ナトリウム:1-200 mg/L、脂質混合物〔4.5 g/L コレステロール、10 g/L 脂肪酸メチルエステル、25 g/L D-α-トコフェロール(塩基付加物又は酸付加物を含む)、2 g/L Tween 80から成る〕:1-1500μL/L、ITS(Insulin、Transferrin、Selenium):0-1000μL/L、非イオン性高分子界面活性剤:0.025-0.5%を含むことを特徴とする前項1〜5のいずれか1項に記載の昆虫細胞培養用培地。
7.以下の無機塩類(無水、水和物、塩基付加物、又は酸の溶媒和物を含む)〔モリブデン酸アンモニウム、塩化コバルト、塩化銅、塩化カルシウム、硫酸銅、硫化鉄、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化カリウム、塩化マンガン、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化亜鉛〕を含むことを特徴とする前項1〜6のいずれか1項に記載の昆虫細胞培養用培地。
8.ビオチン、塩化コリン、シアノコバラミン、D-パントテン酸、葉酸、ミオイノシト−ル、ナイアシン、パラアミノ安息香酸、ピリドキサ−ル、リボフラビン、チアミンを含むことを特徴とする前項1〜7のいずれか1項に記載の昆虫細胞培養用培地。
9.KBM700培地とMMSF培地を0.5-2:8-9.5の混合比で混合することにより調製される前項1〜8のいずれか1項に記載の昆虫細胞培養用培地。
10.前項1〜9のいずれか1項に記載の培地を使用することを特徴とする昆虫細胞の培養方法。
11.昆虫細胞が有用物質生産能を有するものであり、培養が該有用物質の製造のためである、前項10に記載の方法。
12.有用物質が生物学的に活性なタンパク質である、前項11に記載の方法。
13.昆虫細胞がヨトウガ(Mamestra brassicae)の培養細胞である、前項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
14.昆虫細胞がNIAS-Bm-Ke1細胞(受託番号 FERM P-20572)である、前項10〜13のいずれか1項に記載の方法。
タンパク質抽出物として、少なくとも酵母抽出物、ラクトアルブミン、シルクパウダーが挙げられる。酵母抽出物、ラクトアルブミン、シルクパウダーは公知の手法により得ることができる。これらは市販のものを用いることができ、酵母抽出物は細胞培養用に調製された、例えばDIFCO社製[Tc(Tissue Culture)-yeastolate]のものを用いることができ、ラクトアルブミンはDIFCO社製(No. 5996)または和光純薬工業株式会社製(Code No. 59-00225)のものを、シルクパウダーはカネボウ株式会社製(silkpowder FD)のものを用いることができる。
無機塩としては、一般に動物細胞用培地に添加し得るものを添加すればよい。
すなわち、モリブデン酸アンモニウム、塩化コバルト、塩化銅、塩化カルシウム、硫酸銅、硫化鉄、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化カリウム、塩化マンガン、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化亜鉛が挙げられる。また、本発明において、これらの無機塩類は、無水、水和物、塩基付加物、酸(塩酸、硫酸、硝酸など)の溶媒和物のいずれかでも良い。
アミノ酸としては、一般に動物細胞用培地に添加し得るものを添加すればよい。
すなわち、DL-セリン、グリシン、ハイドロキシ-L-プロリン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-シスチン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、βアラニンが挙げられる。また、アミノ酸は、無水、水和物、塩基付加物、酸などの溶媒和物のいずれかでも良い。
ビタミン類としては、一般に動物細胞用培地に添加し得るものを添加すればよい。
すなわち、ビオチン、塩化コリン、シアノコバラミン、D-パントテン酸、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシン、パラアミノ安息香酸、ピリドキサール、リボフラビン、チアミンが挙げられる。
糖類及び有機酸類としては、一般に動物細胞用培地に添加し得るものを添加すればよい。
糖類として、グルコース、D(+)-スクロース、マルトースが挙げられる。また、有機酸として、フマル酸、L-リンゴ酸、コハク酸、α-ケトグルタル酸が挙げられる。
(材料・方法)
96ウェルマイクロプレートの各ウェルに3×104 個の細胞が含まれるように調整したNIAS-Bm-Ke1細胞懸濁液150μLを入れ、各ウェルにMOI=1のp10組換えウイルス(カイコ核多角体病ウイルスのゲノムに座位するp10遺伝子のプロモーター下流に北米産ホタルのルシフェラーゼ遺伝子を結合したp10遺伝子組換えウイルス)が含まれるウイルス液を25μL加えた。
27℃で96時間静置し、組換えウイルスの感染、増殖と組換え遺伝子の発現を促した。ルシフェラーゼ活性の測定にあたって、各ウェルの細胞液をマイクロテストチューブに採取し、室温で1000 rpm、3分間遠心後、上清を除去した。このチューブにさらに1倍液のLysis buffer(5倍濃度Lysis buffer R2プロメガ、Code No. 12057-022)を100μL加え、30分間、室温で静置した。その後、Lysis buffer中に含まれるルシフェラーゼ量(組換えウイルスのルシフェラーゼ遺伝子が発現)をルミノメーター(ベルトールド社製)を用いて測定した。
(結果)
図1に示すように、KBM700培地とMMSF培地を1:9の混合比で混合した場合に、高いルシフェラーゼ活性を示した。
(材料・方法)
NIAS-Bm-Ke1細胞は、浮遊細胞用培養フラスコを用いて25℃で、96時間培養した。細胞数は、0.1%トリパンブルー液で染色し、生細胞数を血球計算盤(Burker-Turk)を用いて計測した。
(結果)
図2に示すように、KBM700培地とMMSF培地を1:9の混合比で混合した場合に、細胞数が増加することがわかった。
Claims (14)
- 昆虫細胞を無血清条件下で培養するための培地であって、該培地に酵母抽出物、ラクトアルブミン、シルクパウダーを含むことを特徴とする昆虫細胞培養用培地。
- 酵母抽出物: 1000-20000 mg/L、ラクトアルブミン加水分解物: 50-10000 mg/L、シルクパウダー: 1-1000 mg/Lを含むことを特徴とする請求項1に記載の昆虫細胞培養用培地。
- 以下のアミノ酸(無水、水和物、塩基付加物、酸の溶媒和物を含む)〔DL-セリン、グリシン、ハイドロキシ-L-プロリン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-シスチン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、βアラニン〕を含むことを特徴とする請求項1または2に記載の昆虫細胞培養用培地。
- 以下のアミノ酸(無水、水和物、塩基付加物、酸の溶媒和物を含む)〔DL-セリン:1-100 mg/L、グリシン:1-100 mg/L、ハイドロキシ-L-プロリン:5-500 mg/L、L-アルギニン:5-500 mg/L、L-アスパラギン:5-500 mg/L、L-アスパラギン酸:5-500 mg/L、L-シスチン:0.1-50 mg/L、L-グルタミン酸:10-500 mg/L、L-グルタミン:5-500 mg/L、L-ヒスチジン:1-100 mg/L、L-イソロイシン:5-200 mg/L、L−ロイシン:1-100 mg/L、L-リジン:5-200 mg/L、L-メチオニン:5-500 mg/L、L-フェニルアラニン:5-500 mg/L、L-プロリン:2-200 mg/L、L-スレオニン:1-100 mg/L、L-トリプトファン:0.1-50 mg/L、L-チロシン:1-200 mg/L、L-バリン:1-200 mg/L、βアラニン:1-100 mg/L〕を含むことを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の昆虫細胞培養用培地。
- 塩化カルシウム(無水又は水和物を含む)、重炭酸ナトリウム、脂質混合物〔コレステロール、脂肪酸メチルエステル、D-α-トコフェロール(塩基付加物又は酸付加物を含む)、Tween 80から成る〕、ITS(Insulin、Transferrin、Seleniumから成る)、非イオン性高分子界面活性剤を含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の昆虫細胞培養用培地。
- 塩化カルシウム(無水又は水和物を含む)、重炭酸ナトリウム:1-200 mg/L、脂質混合物〔4.5 g/L コレステロール、10 g/L 脂肪酸メチルエステル、25 g/L D-α-トコフェロール(塩基付加物又は酸付加物を含む)、2 g/L Tween 80から成る〕:1-1500μL/L、ITS(Insulin、Transferrin、Selenium):0-1000μL/L、非イオン性高分子界面活性剤:0.025-0.5%を含むことを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の昆虫細胞培養用培地。
- 以下の無機塩類(無水、水和物、塩基付加物、又は酸の溶媒和物を含む)〔モリブデン酸アンモニウム、塩化コバルト、塩化銅、塩化カルシウム、硫酸銅、硫化鉄、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化カリウム、塩化マンガン、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化亜鉛〕を含むことを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載の昆虫細胞培養用培地。
- ビオチン、塩化コリン、シアノコバラミン、D-パントテン酸、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシン、パラアミノ安息香酸、ピリドキサ−ル、リボフラビン、チアミンを含むことを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の昆虫細胞培養用培地。
- KBM700培地とMMSF培地を0.5-2:8-9.5の混合比で混合することにより調製される請求項1〜8のいずれか1項に記載の昆虫細胞培養用培地。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の培地を使用することを特徴とする昆虫細胞の培養方法。
- 昆虫細胞が有用物質生産能を有するものであり、培養が該有用物質の製造のためである、請求項10に記載の方法。
- 有用物質が生物学的に活性なタンパク質である、請求項11に記載の方法。
- 昆虫細胞がヨトウガ(Mamestra brassicae)の培養細胞である、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 昆虫細胞がNIAS-Bm-Ke1細胞(受託番号 FERM P-20572)である、請求項10〜13のいずれか1項に記載の方法。
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