CN113862217A - 培养哺乳动物细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

在此提供一种培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括种子培养阶段和生产培养阶段，所述种子培养阶段自种子复苏下一代起至少一个代次的培养在金精三羧酸或金精三羧酸盐存在下进行。所述方法改善哺乳动物细胞乳酸代谢、细胞生长和/或目标产物表达。

Description

培养哺乳动物细胞的方法
技术领域
本发明涉及哺乳动物细胞培养技术领域，尤其涉及改善哺乳动物宿主细胞生长、代谢及产物表达的方法。
背景技术
通过哺乳动物细胞培养生产基因工程蛋白是一种常用的获得治疗性蛋白如单克隆抗体的方法。其中，CHO细胞(Chinese hamster ovary cell，中国仓鼠卵巢细胞)是目前最重要、最常用的表达系统。与其他表达系统相比，它具有以下优势：连续细胞系，生长快速，细胞类型均一，可以传代百代以上，便于更大规模生产；属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利；具有较好的表达和修饰能力，如糖基化的功能，是表达复杂生物大分子的一种理想宿主，至今批准的重要重组蛋白及其表达生产主要来自于CHO细胞的表达系统。
提高CHO细胞培养的表现，如提高细胞培养的活率、改善乳酸代谢、提高目标的蛋白产量及质量一直以来都是生物制药领域的关键目标。在细胞培养后期，细胞通常会进入衰亡的状态，这可能与细胞面对的各种各样的压力相关，如有毒性代谢副产物的积累、空间有限、营养缺乏，使细胞后期会进入衰亡的状态，而使细胞维持好的活率有助于提高蛋白的产量以及改善蛋白的质量。另外，乳酸是细胞培养过程中的主要代谢副产物。CHO细胞在代谢旺盛的对数生长期通常会进行乳酸的快速累积，部分细胞株可以将这些乳酸代谢消耗掉，但部分细胞株却缺乏此能力。大量乳酸的累积将严重影响蛋白表达及蛋白质量。乳酸的累积会导致培养体系的pH降低，细胞酸化，而为维持一定的pH添加的碱液往往会增加体系的渗透压，从而影响细胞正常生长代谢。
为了提高蛋白产量及质量，获得稳定的培养工艺，细胞培养科研人员致力于提高培养后期细胞的活率以及降低乳酸的积累。现有技术中提高后期细胞活率的方法包括：降低培养温度、优化补料的策略、替换培养基等，但这些方法可能会导致产量降低或者效果不甚理想。现有技术中减少乳酸积累的方法包括：相关基因敲除，如敲除乳酸脱氢酶(LDH)基因；用代谢缓慢的糖类代替葡萄糖作为碳源，如半乳糖、岩藻糖和麦芽糖；降低葡萄糖的浓度；或者添加铜离子(Cu2+)。但这些方法或者可操作性不强，或对细胞的生长及蛋白质量有不利影响。因此，目前细胞培养领域对于提高细胞培养后期的生长和生产表现以及降低乳酸积累的方法或者添加剂都有着特殊的需求。
金精三羧酸(Aurintricarboxylic acid，ATA)，分子式为C22H14O9。金精三羧酸铵盐(Aurintricarboxylic acid ammonium salt，又称为Aluminon、Ammoniumaurintricarboxylate、ATA ammonium)，分子式为C22H14O9·3NH3。虽然ATA在其它文献和涉及培养基配方的专利中有所提及，但是其使用方式、作用效果以及发挥生物学功能的原理均与本发明存在明显不同。现有技术公开的文献或专利对ATA的应用情况如下：ATA是作为胰岛素、IGF-1或者转铁蛋白(transferrin)的替代物加入到培养基里，且均添加于生产阶段的培养基中，而不是种子阶段的培养基里。例如：“Zhanyou yun,Journal of bioscienceand bioengineering,Vol.95,no.2,124127.2003”中ATA作为Fe2+螯合剂，降低ROS水平，降低细胞死亡的速度，降低细胞凋亡。另外，在一些文献和专利里，ATA并不是以单一组分的形式添加到所述培养基中发挥作用并解决其声称的技术问题。例如“Zhaolie Chen,etal.Biotechnology Letters 22:837–841,2000”中ATA是作为转铁蛋白的螯合剂同Fe2+一同加入培养基中促进了细胞的生长并改变了细胞的表型。“Hideo Miki,etal.Cytotechnology(2015)67:689–697”中，ATA是作为IGF-1的替代物和LPA协同促进细胞生长。公开号为US5,045,454的专利文献中公开了一种无血清生长培养基，该发明选择用铁螯合物(包括柠檬酸盐/柠檬酸和Fe/EDTA)、ATA以及碱金属EDTA的组合作为培养基中转铁蛋白的替代物。也就是说，在该专利文献中ATA并不是以单一组分的形式添加到无血清生长培养基中发挥作用的，而是需要铁螯合物和碱金属EDTA的配合才能解决其声称的技术问题。另外，公开号为US6,338,964B1的专利文献中公开了一种适用于在低溶解CO2浓度的条件下培养哺乳动物细胞的培养基，所述培养基中包含：浓度高于2mM的有机缓冲液、浓度高于5mM的金属络合剂(metal complexing agent)以及浓度小于1g/L的NaHCO3，其中所述金属络合剂由组氨酸、亚氨基二乙酸、柠檬酸盐、磷酸丝氨酸、ATA和羟基赖氨酸组成。公开号为CN110894487A和CN111304149A的专利中，金精三羧酸也是作为胰岛素的替代物，刺激胰岛素样生长因子的活化，促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。以上可知，现有技术关于ATA或其盐本身对于哺乳动物细胞的生长、代谢尤其乳酸代谢和生产的影响并不清楚。并且，现有技术尚无关于ATA或其盐在哺乳动物细胞培养过程中添加方式与效果的研究报道。
发明内容
培养基是哺乳动物细胞培养最直接和重要的环境因素，培养基需要支持细胞生长，同时也需要促进目标蛋白的合成和胞外运输。悬浮培养和无血清培养已成为动物细胞培养的理想模式和动物细胞表达产品工业化生产的首要选择。为了进一步提高CHO细胞在无血清培养基中的表现，细胞培养科研工作人员致力于研发和评估各种培养基组合包括各种添加剂对细胞表现的影响。发明人发现，出人意料地，不仅添加剂例如ATA或其盐本身而且其添加方式例如添加时机等对于细胞的表现和产物表达也有显著影响。基于以上发现，发明人在经过广泛和深入的研究和探索提供了哺乳动物细胞培养的改良技术方案。
第一方面，本发明提供一种培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括种子培养阶段和生产培养阶段，所述种子培养阶段自种子复苏下一代起至少一个代次的培养在金精三羧酸或金精三羧酸盐存在下进行。
第二方面，本发明提供一种用哺乳动物细胞生产目标产物的方法，包括按照以上所述本发明方法培养哺乳动物细胞并收获所述细胞表达的目标产物。
第三方面，本发明提供一种改善哺乳动物细胞乳酸代谢、细胞生长和/或目标产物表达的方法，包括按照以上所述本发明方法培养哺乳动物细胞。其中，所述改善包括生产培养阶段乳酸代谢、细胞生长和/或目标产物表达的改善；并且，所述改善包括降低培养液中的乳酸积累，提高细胞活率，提高活细胞密度和/或提高目标产物表达量。
第四方面，本发明提供金精三羧酸或金精三羧酸盐施用于种子培养阶段来改善哺乳动物细胞培养期间乳酸代谢、细胞生长和/或目标产物表达的用途；其中，所述改善包括生产培养阶段乳酸代谢、细胞生长和/或目标产物表达的改善；并且，所述改善包括降低培养液中的乳酸积累，提高细胞活率，提高活细胞密度和/或提高目标产物表达量。
按照本发明所述在种子培养阶段采用金精三羧酸或其盐作为基础培养基的添加剂能够显著改善生产培养阶段哺乳动物细胞的生长表现、副产物代谢和产物表达。尤其，本发明方法显著改善生产培养阶段哺乳动物细胞的细胞活率和活细胞密度、降低乳酸积累并增强产物表达。此外，本发明采用的ATA或其盐例如ATA铵盐是成分明确的单一物质，易在下游纯化过程中去除，成本低廉，配制和使用方便，可与各种商业化培养基或自主开发的培养基搭配使用。
附图说明
说明书附图用于辅助对本发明技术方案、技术特征和技术效果的理解。附图可用于权利要求的解释但不构成对权利要求保护范围的限制。
图1是本发明哺乳动物细胞培养方法实施方式之一的示意图。该实施方式包括种子培养阶段和生产培养阶段，种子培养阶段包括在ATA或ATA盐存在下的培养。
图2-1至图2-4显示本发明的实施例中，种子培养阶段添加ATA铵盐对于生产培养阶段活细胞密度和细胞活率的影响。其中，图2-1和图2-2显示实施例之一中种子培养最后两代添加ATA铵盐的效果；图2-3和图2-4显示另一实施例中种子培养自复苏下一代起都在ATA铵盐存在下培养的效果。
图3显示本发明实施例之一中，种子培养阶段添加ATA铵盐对于生产培养阶段乳酸代谢的影响。
图4-1至4-3和图4-4至4-6分别显示本发明实施例中两例培养过程中种子培养阶段ATA铵盐浓度优化对于生产培养阶段活细胞密度、细胞活率和乳酸代谢的效果。
图5-1至图5-6显示本发明实施例之一中，ATA铵盐不同添加时机与效果的比较。其中，图5-1至图5-3显示不同时机添加的活细胞密度、细胞活率和乳酸代谢比较；图5-4至图5-6显示种子培养阶段添加ATA铵盐与生产培养第0天添加ATA铵盐的比较。
具体实施方式
本文中，除非特别指定，名称、量词或单位前的“一”或“1”表示存在即数量上至少为一，因此涵盖复数含义。
本文中，除非特别指定，以两个端值表示的数值范围视同具体公开了两个端值及两个端值之间的所有实数及其两两组合而成的数值范围。此外，除非特别指定，当对同一参数具体描述了多个可选数值范围或数值时，这些端值和数值可以任意组合，由此得出的范围只要包含在具体描述的最大连续范围之内则均属于本发明的范畴。
本文中，除非特别指定，本文述及的各项技术特征，例如组分、含量、步骤、条件参数、参数值、组件、连接关系、工作关系等等，它们的组合方式不限于本文具体描述的各个实施方式和实施例，它们的其他组合方式同样属于本发明的范畴。
本文中，除非特别指定，数值不论是否带有“(大)约”、“左右”、“近”这样的约略性表述，都涵盖列明的数值本身以及本领域技术人员能够理解的与之等同的一定差异范围内的数值，所述差异范围例如值±25、±20％、±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％或更小的范围。
本文中，除非特别指定，所有科学和技术术语的含义均符合本领域尤其哺乳动物细胞细胞培养、基因工程与重组表达与生产领域公知或已知的含义，例如教科书、实验手册或现有技术文献中记载的含义。本文提及的所有专利与非专利出版物均通过引用方式并入本文。
第一方面，本发明提供一种培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括种子培养阶段和生产培养阶段，所述种子培养阶段自种子复苏下一代起至少一个代次的培养在ATA或ATA盐存在下进行。
各种用于培养哺乳动物细胞的培养基均可用于本发明的方法。“培养基”是指与细胞直接接触的，细胞赖以生存的液体环境，包括各种营养成分以及缓冲体系的集合。一些实施方式中，本发明采用成分培养基(Chemical defined medium，CDM)，即所有成分明确的培养基。优选地，培养基中不含血清、动物源成分(例如动物性蛋白)和植物性蛋白。动物性蛋白的例子包括但不限于牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)，植物性蛋白的例子包括但不限于大豆蛋白。一些实施方式中，将不含ATA或其盐的培养基称为“基础培养基”，包括商品化和自主开发的通常用于哺乳动物细胞培养的培养基，例如ActiPro基础培养基(Hyclone)和CD CHO基础培养基(Gibco)。
本文中，“种子培养基”指种子培养阶段所用的培养基，即接种至生产培养前培养种子细胞所用的培养基。“生产培养基”指生产培养阶段所用的培养基，用于细胞生长、繁殖和生产的培养基。有些生产培养模式还会用到“补料培养基”，指在细胞培养过程中以补充形式添加的培养基，用于给细胞培养补充一定的营养。在将种子细胞“接种到生产培养基中”及其同义表述中，此处的“生产培养基”指生产培养伊始既已包含于生物反应器中的生产培养基，不包括补料培养基。优选地，这几种类型的培养基均无血清、无动物性蛋白和植物性蛋白，且组成成分明确，批次间重复性好，易于检测分析。
本文中，“种子培养”、“种子培养阶段”、“种子阶段”彼此同义，指从细胞复苏到进入生产培养之前的细胞培养过程，是通过复苏、传代、逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的种子细胞接种到生产培养基中用于生产的过程。通过种子培养可以获得所需的接种量，实现细胞的适应和驯化，同时有利于缩短生产阶段的发酵时间、保证目标产物的生产水平。
本发明中，“生产培养”、“生产培养阶段”、“生产阶段”彼此同义，指将种子培养所得的种子细胞接种到生物反应器中的生产培养基中进行培养直至收获的过程。就本发明而言，生产培养既包括以收获细胞体本身即收获生物质为目的的培养，也包括以收获细胞表达的目标产物为目的的培养。本发明一些实施方式中，生产培养采用分批补料模式。
一些实施方式中，种子培养阶段包括多次传代。“N代”指正式生产培养阶段，“N-1代”指种子在进入生产培养前的一代，即末代种子，亦即接入生产罐的种子，“N-2代”指种子在进入生产培养前倒数第二代，以此类推。一些实施方式中，种子培养阶段自复苏培养后至少传代4次。本文中，“复苏下一代”指复苏后第一次传代。一些实施方式中，种子培养阶段至少最后两代即N-1和N-2代在ATA或ATA盐存在下进行培养。一些实施方式中，种子培养阶段自种子复苏下一代起的培养都在ATA或ATA盐存在下进行。
一些实施方式中，种子培养阶段各代次采用的基础培养基(即未添加ATA或其盐的培养基)可相同或不同。培养基的例子有例如ActiPro基础培养基和CD CHO基础培养基。例如，一些实施方式中，种子阶段至少最后两代采用相同的基础培养基(例如ActiPro基础培养基)在ATA或其盐存在下培养，而此前的基础培养基可与之不同(例如采用CD CHO基础培养基)。一些实施方式中，至少倒数一代或至少倒数两代所用基础培养基与生产培养基相同或相似，例如都是ActiPro基础培养基，而此前的基础培养基可与之不同。
一些实施方式中，ATA或ATA盐在种子培养基中的含量至少约0.025mM，高于0.025mM更好。适宜的范围例如约0.025-0.8mM、约0.05-0.2mM，例如约0.05mM、约0.1mM、约0.2mM、或约0.6mM。一些实施方式中优选约0.05-0.1mM。
本发明中，能够在培养基中解离形成ATA离子的ATA盐均可用于本发明。一些实施方式中，ATA盐优选ATA铵盐，尤指分子式为C22H14O9·3NH3的ATA铵盐，具有易溶于水，配制便利的优点。
一些实施方式中，所述哺乳动物细胞是重组表达目标产物的细胞，亦称宿主细胞，指在制药工业生产中，按照生产条件选择和驯化的用于生产制备生物制剂的，源于哺乳动物的细胞系，其表达的蛋白的翻译后修饰在保持蛋白生物学活性，稳定性及抗原性具有优势。许多细胞系可从商业来源获得，例如美国标准生物品收藏中心(ATCC)。可用于本发明的哺乳动物细胞的非限制性实例包括CHO，BHK，HEK293等用于生物制品生产的细胞。一些实施方式中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，例如CHO-K1细胞。一些实施方式中，例如后文实施例中，所述哺乳动物细胞是包含外源编码基因的双表达载体转染CHO-K1细胞所构建的能够稳定表达外源蛋白的细胞株。
一些实施方式中，目标产物是外源蛋白，例如Fc融合蛋白、抗体或酶。“外源蛋白”是指基因工程范畴内，编码宿主细胞以外的目的蛋白基因，利用DNA重组技术，通过宿主细胞有效的扩增与表达，生产出具有实用价值的蛋白。例如，Fc融合蛋白包括但不限于类IL-2/Fc,GLP-1/Fc等。作为目标产物的酶包括例如药用酶，例如但不限于葡萄糖苷酶，脂肪酶等。一些实施方式中，目标产物是单克隆抗体，包括但不限于以肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原和/或自身免疫相关抗原为靶点的抗体，例如以CD19/HER2、CD20、PD-1、LAG3等为靶点的抗体。
第二方面，本发明提供一种用哺乳动物细胞生产目标产物的方法，包括用以上第一方面内容所述的方法培养细胞和收获细胞表达的目标产物。
第三方面，本发明提供一种改善哺乳动物细胞乳酸代谢、细胞生长和/或目标产物表达的方法，包括用以上第一方面内容所述方法培养细胞。
第四方面，本发明提供金精三羧酸或金精三羧酸盐施用于种子培养阶段来改善哺乳动物细胞培养期间乳酸代谢、细胞生长和/或目标产物表达的用途。
以上本发明各方面内容所述的方法和用途提供改善哺乳动物细胞乳酸代谢、细胞生长和/或目标产物表达的效果。尤其，所述改善包括生产培养阶段乳酸代谢、细胞生长和/或目标产物表达的改善。其中，改善乳酸代谢表现为降低培养液中的乳酸积累。其中，所述细胞生长的情况可用活细胞密度和/或细胞活率来表征。因此，所述改善包括降低培养液中的乳酸积累，提高细胞活率，提高活细胞密度和/或提高目标产物表达量。所述改善可以通过与对照的比较来确定，所述对照可以是差别仅在于种子培养阶段没有添加ATA或其盐的培养过程，或者是差别仅在于ATA或其盐的添加时机不在种子培养阶段的培养过程，例如于生产阶段而非种子阶段添加。
实施例
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更为详细地阐述。以下实施例仅为示例，对本发明技术方案不构成任何限定或限制。以下实施例中具体的材料、步骤、条件、数值或数值范围等技术参数仅是举例，并非穷举亦非限定。
以下实施例中所使用的细胞是由包含IgG1、IgG4或Fc融合蛋白的编码基因的双表达载体转染CHO-K1模式细胞所构建的能够稳定表达IgG1单克隆抗体、IgG4单克隆抗体或Fc融合蛋白的细胞株。
以下实施例中所使用的培养基和培养基添加物均可市购获得：ActiPro基础培养基(Hyclone,Cat No.：SH31037)；CD CHO基础培养基(Gibco,Cat No.：12490)；Cell Boost7a补料培养基(HyClone，Cat No.：SH31026)；Cell Boost 7b补料培养基(HyClone，CatNo.：SH31027)；ATA(Sigma,Cat.No:A1895)、ATA铵盐(Sigma,Cat.No:A36883)。
实施例1：含金精三羧酸或金精三羧酸铵盐培养基的制备
1.1金精三羧酸或金精三羧酸铵盐贮存液的制备方法
选择注射用水(water for injection，WFI)来制备所有溶液。100×贮存液的组成成分如表1所示。
表1中所述贮存液的制备方法如下所示：
步骤1)选择合适大小的容器，盛装表1中所述质量的注射用水；
步骤2)将表1中所述质量的ATA或ATA铵盐粉末加入到步骤1)中所述的容器中；
步骤3)ATA需在碱性条件下溶解：加入适量10N NaOH调节pH值至12.2±0.2后，在室温下混合均匀；ATA铵盐在室温、水中即可溶解。待充分溶解后，添加注射用水至最终质量并再次混合均匀；
步骤4)使用0.1μm或者0.2μm孔径的滤膜对所述溶液进行过滤；
步骤5)置于4～8℃保存。
表1：20mM ATA及ATA铵盐贮存液的成分(1.0kg)
Figure BDA0003299517870000101
#1：所述注射用水的量为原始添加量，未示出注射用水的最终添加量。
1.2用于细胞培养的含有金精三羧酸或金精三羧酸铵盐培养基的制备方法
1)将本实施例1.1节中所述的贮存液置于37℃进行预热；
2)取一定体积预热后的贮存液加入到ActiPro基础培养基或CD CHO基础培养基中，混合均匀，从而得到含有特定浓度的ATA或ATA铵盐培养基。
实施例2：种子培养阶段添加金精三羧酸铵盐对生产培养阶段细胞生长的影响
“N代”指正式生产培养阶段，“N-1代”指种子在进入生产培养前的一代，“N-2代”指种子在进入生产培养前倒数第二代。
2.1：种子培养阶段最后两代在金精三羧酸铵盐存在下进行培养
设置以下分组：(1)对照组(Ctrl)，即种子培养不添加ATA铵盐；(2)ATA铵盐组，即种子培养第N-2及N-1代次添加0.05mM ATA铵盐。
将CDCHO培养基作为种子培养N-3及之前代次的培养基，ActiPro基础培养基作为种子培养N-2、N-1代及生产培养的基础培养基。
种子传代及适应：种子细胞为稳定表达IgG1蛋白A的模式细胞CHO-K1。从液氮罐中取出冻存的种子细胞进行复苏，以约0.45×106个细胞/mL的初始接种密度在装有30mLCDCHO培养基的125mL摇瓶中进行复苏培养。其后，每隔3天将种子悬液以约0.25×106个细胞/mL的初始接种密度在装有50mL CDCHO的250mL摇瓶中进行N-4及N-3代种子恢复培养。每隔3天将种子悬液以约0.25×106个细胞/mL的初始接种密度在装有50mL培养基的250mL摇瓶中进行N-2及N-1代种子适应培养；其中，“对照组”采用不添加ATA铵盐的ActiPro基础培养基，“ATA铵盐组”在ActiPro基础培养基中添加0.05mM ATA铵盐。种子传代及扩种于摇床中进行，摇床条件设置为：温度36.5℃，转速125rpm，6％的CO2及80％的湿度。
生产培养采用补料分批培养：将处于对数生长期的N-1代种子细胞按照0.40×106个细胞/mL的初始密度分别接种到装有50mL ActiPro基础培养基的250mL摇瓶中，培养体积50mL，置于36.5℃，125rpm，6％CO2及80％湿度的摇床中进行培养，并于第4天移至33.0℃，125rpm，6％CO2及80％湿度的摇床中。于第3天、第5天、第7天、第8天及第9天进行补料，补料比例分别为4％、3％、3％、3％、1％的CB7a和0.4％、0.3％、0.3％、0.3％、0.1％的CB7b。补料比例＝补料体积/初始培养体积。
在生产培养过程中，对活细胞密度及细胞活率进行监测，用以表征细胞生长情况。活细胞及细胞活率采用BECKMAN的Vi-Cell基于台盼蓝染色原理进行测定。
结果：如图2-1和2-2所示，与对照组相比，种子培养N-2和N-1代次添加ATA铵盐显著提高生产培养阶段的细胞活率，并且能够更持久地维持活细胞密度。
2.2：种子培养阶段自复苏下一代开始都在金精三羧酸铵盐存在下进行培养
采用稳定表达Fc融合蛋白的模式细胞CHO-K1比照实施例2.1进行种子培养、生产培养以及活细胞密度和细胞活率的监测。仍然设置“对照组”和“ATA铵盐组”，所不同的是“ATA铵盐组”在N-4及N-3代所用CDCHO培养基和N-2及N-1代所用ActiPro基础培养基中都添加有0.01mM ATA铵盐。补料方案为：第3天、第5天、第7天、第9天、第11天及第13天分别添加3％、4％、4％、3％、3％、1％的CB7a和0.3％、0.4％、0.4％、0.3％、0.3％、0.1％的CB7b。补料比例＝补料体积/初始培养体积。
结果：如图2-3和2-4所示，与对照组相比，种子培养自复苏下一代开始都在ATA铵盐存在下培养显著提高生产培养阶段的细胞活率、活率维持和活细胞密度。
实施例3：种子培养阶段添加金精三羧酸铵盐对生产培养阶段乳酸代谢的影响
如实施例2.1中所述，用表达IgG1蛋白A的模式细胞CHO-K1进行种子培养和生产培养。设置以下分组：(1)对照组(Ctrl)，即种子培养不添加ATA铵盐；(2)ATA铵盐组，即种子培养N-2及N-1代次添加0.05mM ATA铵盐。
在生产培养阶段采用Life Technologies的Cedex Bio HT Analyzer基于乳酸氧化酶法测定乳酸浓度。
结果：如图3所示，种子培养添加ATA铵盐可有效解决生产培养阶段细胞代谢过程中的乳酸堆积问题。
实施例4：种子培养阶段金精三羧酸铵盐浓度的优化
4.1：使用表达IgG1蛋白A的CHO-K1模式细胞株进行实验
设置以下分组：(1)对照组(Ctrl)：种子培养不添加ATA铵盐；(2)0.025mM ATA铵盐组：种子培养N-2及N-1代次添加0.025mM ATA铵盐；(3)0.05mM ATA铵盐组：种子培养N-2及N-1代次添加0.05mM ATA铵盐；(4)0.1mM ATA铵盐组：种子培养N-2及N-1代次添加0.1mMATA铵盐；(5)0.2mM ATA铵盐组：种子培养N-2及N-1代次添加0.2mM ATA铵盐。
如实施例2.1中所述，用表达IgG1蛋白A的模式细胞CHO-K1进行种子培养、生产培养以及活细胞密度及细胞活率监测。按照实施例3中所述检测乳酸浓度。抗体表达量采用Life Technologies的Cedex Bio HT Analyzer基于免疫浊度法进行测定。
对于生产培养阶段细胞生长的效果
如图4-1及4-2所示，与对照组相比，种子培养添加0.025～0.2mM浓度的ATA铵盐对生产培养阶段细胞前期的生长未见显著影响，但值得注意的是，在后期，对照组的活细胞密度以及活率在收获时降至几乎为0的水平，而添加0.05～0.2mM浓度的ATA铵盐组能够显著维持细胞活率以及培养后期的活细胞密度。
对于生产培养阶段乳酸代谢的效果
如图4-3所示，种子培养添加0.05～0.2mM浓度的ATA铵盐能有效降低培养过程中的乳酸堆积。
对于产物表达量的效果
如以下表2所示，种子培养添加0.025～0.2mM浓度的ATA铵盐均能提升抗体表达量，0.05～0.2mM更显著。
表2：种子培养ATA铵盐浓度与抗体表达量
Figure BDA0003299517870000131
Figure BDA0003299517870000141
上述结果显示，0.05～0.2mM ATA铵盐为优选的添加浓度，出于物料成本以及尽可能减少生物药制剂添加物残留的考虑，0.05mM ATA铵盐可以作为最优选的添加浓度。
4.2：表达IgG1蛋白B的CHO-K1模式细胞株进行实验
设置以下分组：(1)对照组(Ctrl)：种子培养不添加ATA铵盐；(2)0.1mM ATA铵盐组：种子培养N-2及N-1代次添加0.1mM ATA铵盐；(3)0.2mM ATA铵盐组：种子培养N-2及N-1代次添加0.2mM ATA铵盐；(4)0.6mM ATA铵盐组：种子培养N-2及N-1代次添加0.6mM ATA铵盐；(5)0.8mM ATA铵盐组：种子培养N-2及N-1代次添加0.8mM ATA铵盐。
如实施例2.1中所述，采用稳定表达IgG1蛋白B的模式细胞CHO-K1进行种子培养、生产培养以及活细胞密度和细胞活率的监测。所不同的是补料方案为：第3天、第5天、第7天、第10天及第12天分别添加3％、3％、3％、3％、2％的CB7a和0.3％、0.3％、0.3％、0.3％、0.2％的CB7b。补料比例＝补料体积/初始培养体积。按照实施例3中所述检测乳酸浓度。抗体表达量采用Life Technologies的Cedex Bio HT Analyzer基于免疫浊度法进行测定。
对于生产培养阶段细胞生长的效果
如图4-4及4-5所示，与对照组相比，种子培养添加0.1～0.8mM浓度的ATA铵盐均能够显著维持细胞活率以及培养后期的活细胞密度。添加0.6及0.8mM ATA铵盐组能够维持更高的收获活率。
对于生产培养阶段乳酸代谢的效果
如图4-6所示，种子培养添加0.1～0.8mM浓度的ATA铵盐均能够明显抑制培养后期的乳酸堆积。添加0.1及0.2mM ATA铵盐组下的乳酸浓度最低。
对于产物表达量的效果
如以下表3所示，种子培养添加0.1～0.2mM浓度的ATA铵盐均能提升抗体表达量，0.1mM效果最为显著。
表3：种子培养ATA铵盐浓度与抗体表达量
Figure BDA0003299517870000151
上述结果显示，0.1mM ATA铵盐也可作为最为优选的添加浓度。
实施例5：金精三羧酸铵盐添加时机的比较
5.1多时间点之间的比较
设置以下分组：(1)对照组(Ctrl)，即种子培养和生产培养都不添加ATA铵盐；(2)N-2及N-1传代添加0.05mM ATA铵盐组，即种子N-2及N-1代次添加0.05mM ATA铵盐，生产培养不添加ATA铵盐；(3)N-2及N-1传代添加0.1mM ATA铵盐组，即种子N-2及N-1代次添加0.1mM ATA铵盐，生产培养不添加ATA铵盐；(4)生产培养第0天添加0.05mM ATA铵盐组，即种子培养不添加ATA铵盐，接种至生产培养基中的第0天添加0.05mM ATA铵盐；(5)生产培养第4天添加0.1mM ATA铵盐组，即种子培养不添加ATA铵盐，接种至生产培养基后第4天添加0.1mM ATA铵盐。
如实施例2.1中所述，用表达IgG1蛋白A的CHO-K1进行种子培养、生产培养以及活细胞密度及细胞活率监测。按照实施例3中所述检测乳酸浓度。按照实施例4中所述测定抗体表达量。
对于生产培养阶段细胞生长的效果
如图5-1及5-2所示，与对照组相比，种子培养添加ATA铵盐和生产培养第0天添加ATA铵盐均能有效维持细胞活率，但在生产培养中期(第四天)添加ATA铵盐组的活率未能维持。
对于生产培养阶段乳酸代谢的效果
如图5-3所示，种子培养添加ATA铵盐和生产培养第0天添加ATA铵盐均能有效降低培养过程中的乳酸堆积。
对于产物表达量的效果
如以下表4所示，相比其他组，种子培养添加ATA铵盐能有效提升抗体表达量，其表达量最高，不仅显著高于对照并且显著高于生产培养第0天添加ATA铵盐。
表4：不同ATA铵盐添加时间与抗体表达量
Figure BDA0003299517870000161
综合上述结果，种子培养阶段及生产培养第0天加入ATA铵盐均可显著提高细胞活率、改善乳酸代谢及提升抗体表达量。但值得注意的是，种子培养阶段添加ATA铵盐的抗体表达量要高于生产培养第0天添加，这对于生物药的生产具有显著的实际意义。
5.2种子培养添加ATA铵盐与生产培养第0天添加ATA铵盐的比较
设置以下分组：(1)N-2及N-1传代添加0.1mM ATA铵盐组，即种子N-2及N-1代次添加0.1mM ATA铵盐，生产培养不添加ATA铵盐；(2)生产培养第0天添加0.1mM ATA铵盐组，种子培养不添加ATA铵盐，并于生产培养第0天添加0.1mM ATA铵盐。
种子传代及适应：种子细胞为稳定表达IgG4的模式细胞CHO-K1。从液氮罐中取出冻存的种子细胞进行复苏，以约0.45×106个细胞/mL的初始接种密度在装有30mL CDCHO培养基的125mL摇瓶中进行复苏培养。其后，每隔3天将种子悬液以约0.25×106个细胞/mL的初始接种密度在装有50mL CDCHO的250mL摇瓶中进行N-4及N-3代种子恢复培养。每隔3天将种子悬液以约0.50×106个细胞/mL的初始接种密度在装有50mL ActiPro基础培养基的250mL摇瓶中进行N-2及N-1代种子适应及扩种；其中，对于“N-2及N-1传代添加0.1mM ATA铵盐组”，N-2及N-1使用的ActiPro基础培养基均含有0.10mM ATA铵盐，“生产培养第0天添加0.1mM ATA铵盐组”则不含。种子传代于摇床中进行，摇床条件设置为：温度36.5℃，转速125rpm，6％的CO2及80％的湿度。
生产培养采用补料分批培养：将处于对数生长期的N-1代种子细胞按照1.00×106个细胞/mL的初始密度接种到装有50mL ActiPro基础培养基的250mL摇瓶中，培养体积50mL，置于36.5℃，125rpm，6％CO2及80％湿度的摇床中进行培养，并于第4天移至33.0℃，125rpm，6％CO2及80％湿度的摇床中。对于“生产培养第0天添加0.1mM ATA铵盐组”，于第0天添加0.1mM ATA铵盐，“N-2及N-1传代添加0.1mM ATA铵盐组”不添加。补料方案为：第2-6天、第8天及第12天分别添加2％的CB7a及0.2％的CB7b，第7天及第9-11天添加3％的CB7a和0.3％的CB7b。补料比例＝补料体积/初始培养体积。
按照实施例2.1中所述监测活细胞密度及细胞活率。按照实施例3中所述检测乳酸浓度。按照实施例4中所述测定抗体表达量。
对于生产培养阶段细胞生长的效果
如图5-4及5-5所示，与生产培养第0天添加ATA铵盐相比，种子培养添加有ATA铵盐提高了生产培养的活细胞密度，具有明显的细胞生长优势。
对于生产培养阶段乳酸代谢的效果
如图5-6所示，与生产培养第0天添加ATA铵盐相比，种子培养添加ATA铵盐的生产培养阶段整体乳酸浓度明显降低。
对于产物表达量的效果
如以下表5所示，相比生产培养第0天(D0)添加ATA铵盐，种子培养添加ATA铵盐令抗体表达量有效提升了约30％。
表5：种子培养添加ATA与生产培养D0添加的抗体表达量
Figure BDA0003299517870000181
综合以上结果，ATA铵盐最优选的添加时间为种子培养阶段，既便相较于在生产培养初期甚至第0天添加，种子培养期间添加也表现出能够显著提高活细胞密度及提升抗体表达量，这对于生物药的生产具有重要的实际意义。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其仅是范例，本发明并不局限于以上描述的具体实施例，本发明的范围涵盖所有符合本发明构思和宗旨的等同修改和替代。

Claims (10)

1.一种培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括种子培养阶段和生产培养阶段，所述种子培养阶段自种子复苏下一代起至少一个代次的培养在金精三羧酸或金精三羧酸盐存在下进行。
2.如权利要求1所述的方法，所述种子培养阶段至少最后两代的培养在金精三羧酸或金精三羧酸盐存在下进行；或者，所述种子培养阶段自种子复苏下一代起的培养都在金精三羧酸或金精三羧酸盐存在下进行。
3.如权利要求1所述的方法，在所述种子培养阶段，当金精三羧酸或金精三羧酸盐存在时其在培养基中的含量至少为0.025mM，例如0.025-0.8mM或0.05-0.2mM。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，所述金精三羧酸盐为金精三羧酸铵盐。
5.如权利要求1所述的方法，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
6.如权利要求1所述的方法，所述哺乳动物细胞重组表达目标产物例如外源蛋白或单克隆抗体。
7.一种用哺乳动物细胞生产目标产物的方法，包括用权利要求1至6中任一项所述的方法培养哺乳动物细胞和收获所述细胞表达的目标产物。
8.一种改善哺乳动物细胞乳酸代谢、细胞生长和/或目标产物表达的方法，包括用权利要求1至6中任一项所述的方法培养哺乳动物细胞；其中，所述改善包括生产培养阶段乳酸代谢、细胞生长和/或目标产物表达的改善；并且，所述改善包括降低培养液中的乳酸积累，提高细胞活率，提高活细胞密度和/或提高目标产物表达量。
9.金精三羧酸或金精三羧酸盐施用于种子培养阶段来改善哺乳动物细胞在培养期间乳酸代谢、细胞生长和/或目标产物表达的用途；其中，所述改善包括生产培养阶段乳酸代谢、细胞生长和/或目标产物表达的改善；并且，所述改善包括降低培养液中的乳酸积累，提高细胞活率，提高活细胞密度和/或提高目标产物表达量。
10.如权利要求9所述的用途，其中，金精三羧酸盐优选金精三羧酸铵盐。
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