CN112322577A - 一种用于cho细胞大规模培养的无血清培养基及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于CHO细胞大规模培养的无血清培养基及应用。所述培养基包含有基础培养基和添加物，所述基础培养基为DMEM/F12，所述添加物包含AEO‑9、胆固醇亚麻酸盐、维生素C、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、卵磷脂、氯化胆碱以及微量元素。所述培养基可用于CHO细胞工业化大规模培养，支持CHO细胞更好的生长、更高的存活率以及不易结团。

Description

一种用于CHO细胞大规模培养的无血清培养基及应用
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，更特别地，涉及一种用于培养CHO细胞的无血清培养基及其应用，所述培养基可用于CHO细胞工业化大规模培养,支持CHO细胞悬浮培养更好的生长、更高的存活率且不易结团。
背景技术
CHO细胞(Chinese hamster ovary cell，中国仓鼠卵巢细胞)是1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是生物工程上广泛使用的细胞系。该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是生物工程上广泛使用的细胞。另外CHO细胞在基因工程使用中还有一个优点，该细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利。可形成有活性的二聚体(如白介素2)，具有糖基化的功能(如EPO)，CHO为表达复杂生物大分子的理想宿主。最初细胞为贴壁型细胞，经多次传代筛选后，也可悬浮生长。
CHO细胞已经成为需要复杂翻译后修饰的治疗性蛋白生产的主要工具。目前，有两种主要的CHO表达系统被广泛应用，基于二氢叶酸还原酶（DHFR）的甲氨蝶呤（MTX）选择体系和基于谷氨酰胺合成酶（GS）的甲硫氨酸硫氧胺（MSX）选择体系。
CHO-GS 表达体系是用含单抗蛋白等的目的基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因标记的表达载体，转染宿主细胞CHO，再通过L-氨基亚砜蛋氨酸(methioninesulphoximine，MSX)等化合物选择加压促使GS 基因和目的蛋白基因扩增，筛选获得重组细胞株，可在不含谷氨酰胺培养基中生长、增殖，可避免或降低细胞代谢过程中谷氨酰胺降解积累的氨对细胞的损失和生长抑制。CHO-GS体系相对于DHFR-体系具有两大优点：1. 基因表达量普遍更高，高产克隆筛选所需时间更短；2. 有效缓解代谢过程中有毒产物氨的积累问题。为了进一步降低内源GS对细胞株稳定性的影响，LONZA、Merck（原SAFC）等公司通过基因编辑技术敲除内源GS, 推出GS缺陷型CHO细胞系产品。GS基因敲除CHO细胞系具有更严格的选择性，有助于在没有MSX的情况下快速产生高产克隆，降低乳酸和氨的产量。以CHOK1SV GS-KO（LONZA）和CHOZN GS（Merck）为宿主细胞的多款产品已经推进到临床阶段，市场应用前景广阔。
相对于动物细胞贴壁培养而言，单个细胞悬浮培养具有细胞生长均一性好、传质效率高、容易实现规模放大和过程控制的特点。哺乳动物细胞的悬浮培养己成为目前动物细胞培养的理想模式和动物细胞表达产品工业化生产的首要选择，超过80%的哺乳动物细胞表达生物技术药物采用动物细胞悬浮培养为其生产工艺。对于CHO细胞悬浮培养而言，要在规模化的培养中获取好的培养结果，设计出适宜细胞悬浮生长的培养基是至关重要的。无血清培养基的优势很大程度上体现在避免了血清的缺点，此外它还具有血清培养难以比拟的优点，如保存和应用方便;使用该种培养基制备的产品易于纯化，提高回收率；成分明确，有利于研究细胞的生理调节机制；可根据不同细胞株设计和优化出适合其高密度生长或高水平目的产物表达的培养基等。因此，近年来许多科研工作者致力于开发适用于CHO细胞大规模培养的无血清培养基。
在无血清培养基中悬浮培养CHO细胞时，常常发生结团现象，降低了细胞的活性，蛋白表达受到影响，但迄今细胞结团的原因还不甚清楚。有研究认为结团可能是由于DNA从死亡的细胞间释放后，在细胞与细胞之间架桥引起的，若在培养基中添加脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）可以避免结团现象发生。但是Dee等则认为通过添加肝素、硫酸葡聚糖、硫酸戊糖等高度磺化硫酸聚阴离子物质，可成功地解决BTI-TN5B1-4昆虫细胞的结团问题，使蛋白表达量提高了倍2-4。有专利文献（CN101724600A，公开日期20100609）公开了一种支持CHO细胞大规模高密度悬浮培养的无血清培养基，其中使用了嵌段式聚醚F-68 (Pluronic F-68) :Pluronic F-68作为一种表面活性剂，可有效的降低细胞悬浮培养过程中流体剪切力对细胞的损伤，同时对细胞也具有一定生物学活性。虽然现有技术中存在上述可用于降低CHO成团的物质，然而上述物质存在不稳定、成本高等缺陷，本领域存在寻求更适合的用于降低CHO成团的物质的需求。
发明内容
为解决现有CHO细胞悬浮培养的不足，本发明提供了一种用于培养CHO细胞的无血清培养基及其应用。所述培养基包含有基础培养基和添加物，所述基础培养基为DMEM/F12，按所述无血清培养基的总体积计，所述添加物包含如下成分：
AEO-9 100-200mg/L；
胆固醇亚麻酸盐 5-10mg/L；
维生素C 5-10mg/L；
胰岛素2-5mg/L；
转铁蛋白5-7mg/L；
乙醇胺2-5mg/L；
卵磷脂3-6mg/L；
硫酸胆碱10-40mg/L。
所述培养基可用于CHO细胞工业化大规模培养，支持CHO细胞悬浮培养更好的生长、更高的存活率且不易结团。
AEO-9，又称脂肪醇聚氧乙烯醚，是天然脂肪醇与环氧乙烷加成物，分子式C30H62O10，CAS号:68213-23-0。AEO-9与嵌段式聚醚F-68类似，均属于非离子型表面活性剂，但是其相对嵌段式聚醚F-68具有更好的性能，更强的增溶、分散能力，生物降解性好，环境友好，成本低廉等等。并且，现有技术中并没有公开或暗示AEO-9可用于CHO培养，本发明出乎意料的发现，AEO-9可有效改善悬浮培养CHO细胞时的结团现象，且相对于嵌段式聚醚F-68具有更好的效果。
已有研究（CN108060115A，公开日期20180522；CN101724600A，公开日期20100609）表明，CHO细胞培养时添加卵磷脂、胆固醇等脂类物质，有利于细胞培养。脂肪酸，维生素，微量元素和无机盐类物质对CHO细胞生长非常重要。胆固醇亚麻酸盐（CholesterolLinolenate），分子式为C45H74O2，分子量647.0，结构式如说明书附图图1所示。本发明发现微量的胆固醇亚麻酸盐补充，有利于悬浮培养CHO细胞。
胆碱类化合物可以增加在无蛋白质条件下培养的细胞的存活率和生产力。胆碱作为细胞的磷脂前体，被细胞摄取并加工之后，它作为细胞膜中除了磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇外的称为磷脂酰胆碱的主要磷脂之一，本发明为此加入了硫酸胆碱，旨在增加细胞的存活率和生产力。
在一个优选实施方案中，所述添加物还包含微量元素。
在一个优选实施方案中，所述微量元素各成分终浓度分别为：七水硫酸锌0.5-5mg/L、五水硫酸铜0.0001-0.01mg/L、硒酸纳0.01-0.8mg/L、氯化镍0.00005-0.0005mg/L、氯化亚锡0.00005-0.0005mg/L、硝酸银0.00001-0.0002mg/L、氯化钴0.0005-0.008mg/L、氯化铝0.0001-0.001mg/L、醋酸钡0.0005-0.003mg/L、硫酸铬0.001-0.006mg/L、氟化钠0.0005-0.006mg/L、偏硅酸钠0.005-0.09mg/L。
在一个优选实施方案中，所述微量元素各成分终浓度分别为：七水硫酸锌2mg/L、五水硫酸铜0.001mg/L、硒酸纳0.2mg/L、氯化镍0.0001mg/L、氯化亚锡0.0002mg/L、硝酸银0.0002mg/L、氯化钴0.005mg/L、氯化铝0.0008mg/L、醋酸钡0.002mg/L、硫酸铬0.004mg/L、氟化钠0.002mg/L、偏硅酸钠0.005mg/L。
在一个优选实施方案中，按所述无血清培养基的总体积计，所述添加物包含如下成分：
AEO-9 150mg/L；
胆固醇亚麻酸盐 7mg/L；
维生素C 8mg/L；
胰岛素3mg/L；
转铁蛋白6mg/L；
乙醇胺3mg/L；
卵磷脂5mg/L；
硫酸胆碱25mg/L。
在一个优选实施方案中，所述DMEM/F12培养基的成分如下，单位是mg/L：无水氯化钙 116.6； L-亮氨酸 59.05； 亚油酸 0.042；五水硫酸铜 0.0013；
L-赖氨酸盐酸盐 91.25； 硫辛酸 0.105；九水硝酸铁 0.05； L-蛋氨酸 17.24； 酚红8.1；七水硫酸亚铁 0.417； L-苯丙氨酸 35.48； 1,4-丁二胺二盐酸盐 0.081；氯化钾311.8； L-丝氨酸 26.25； 丙酮酸钠 55；氯化镁 28.64； L-苏氨酸 53.45； 维生素H0.0035；无水硫酸镁 48.84 L-丙氨酸 4.45 D-泛酸钙 2.24；氯化钠 6999.5；L-天门冬酰胺 7.5；氯化胆碱 8.98；无水磷酸二氢钠； 54.35 L-天门冬氨酸 6.65； 叶酸 2.65；磷酸氢二钠 71.02 L-半胱氨酸盐酸盐 17.56 i-肌醇 12.6；七水硫酸锌 0.432； L-谷氨酸7.35； 烟酰胺 2.02；L-精氨酸盐酸盐 147.5； L-脯氨酸 17.25； 盐酸吡哆醛 2；L-胱氨酸盐酸盐 31.29； L-色氨酸 9.02； 盐酸吡哆醇 0.031；L-谷氨酰胺 365； L-酪氨酸 38.4；核黄素 0.219；甘氨酸 18.75； L-缬氨酸 52.85； 盐酸硫胺 2.17；L-组氨酸盐酸盐 31.48；D-葡萄糖 3151 ；胸苷 0.365；L-异亮氨酸 54.47； 次黄嘌呤 2； 维生素B12 0.68。
在本发明的第二方面，提供了本发明所述培养基的用途，它被用于培养CHO细胞。
在一个优选实施方案中，所述CHO细胞是带有谷氨酞胺合成酶系统的CHO-GS细胞。
在本发明的第三方面，还提供了一种培养CHO细胞的方法，包括步骤:在本发明所述培养基中接种CHO细胞，然后在适合生长的条件下（如37±2 ℃，5±1%二氧化碳下)培养CHO细胞一定时间，至所需细胞量。
在本发明的第四方面，还提供了本发明所述培养基的制备方法，其特征在于，（1）获取DMEM/F12基础培养基；（2）在DMEM/F12基础培养基中添加所述添加物的各组分；（3）将制备获得的培养基过0.22um滤膜滤过除菌。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的用于培养CHO细胞的无血清培养基成分简单、低成本、低蛋白；
(2)本发明的无血清培养基无血清低蛋白，利于CHO表达的目标蛋白的后续纯化；
(3)培养基中添加AEO-9可有效改善悬浮培养CHO细胞时的结团现象，且相对于嵌段式聚醚F-68具有更好的效果；
(4)培养基中添加微量的胆固醇亚麻酸盐，有利于悬浮培养CHO细胞细胞密度的增加，对CHO细胞悬浮培养的存活率有一定正向影响；
(5)本发明的无血清培养基支持CHO细胞在悬浮培养条件下快速生长；
(6)在细胞生长、密度、存活率方面，本发明的CHO细胞的无血清培养基显著优于商业化的CD CHO 培养基。
附图说明
图1 胆固醇亚麻酸盐化学结构式。
图2 活细胞密度变化趋势(106/mL)。
图3 细胞活性变化趋势(％)。
图4 使用实验例3培养基培养的CHO细胞显微镜图。
图5 使用对比例1培养基培养的CHO细胞显微镜图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1 培养基的制备以及细胞株
基础培养基：DMEM/F12就是细胞培养中常用的商品化的基础培养基。该培养基由葡萄糖、氨基酸、维生素、无机盐等多种物质组成。可从Sigma, GIBCO公司等处购买获得。
在DMEM/F12基础上，配制3种不同浓度配比的本发明的用于培养CHO细胞的无血清培养基的无血清培养基，其添加物各组分终浓度如下表1所示。
表1 本发明使用的培养CHO细胞的无血清培养基实验例
组分，浓度mg/L 实验例1 实验例2 实验例3
AEO-9 100 200 150
胆固醇亚麻酸盐 5 10 7
维生素C 5 10 8
胰岛素 2 5 3
转铁蛋白 5 7 6
乙醇胺 2 5 3
卵磷脂 3 6 5
硫酸胆碱 10 40 25
上述实验例1-3中均添加微量元素，所述微量元素各成分终浓度分别为：七水硫酸锌2mg/L、五水硫酸铜0.001mg/L、硒酸纳0.2mg/L、氯化镍0.0001mg/L、氯化亚锡0.0002mg/L、硝酸银0.0002mg/L、氯化钴0.005mg/L、氯化铝0.0008mg/L、醋酸钡0.002mg/L、硫酸铬0.004mg/L、氟化钠0.002mg/L、偏硅酸钠0.005mg/L。
对比例1：除了将150mg/L的AEO-9替换为150mg/L的嵌段式聚醚F-68以外，其他组分、浓度与实验例3相同。
对比例2：除了将7mg/L的胆固醇亚麻酸盐去除以外，其他组分、浓度与实验例3相同。
对比例3：市售Gibco公司的CD CHO 培养基Gibco 10743029，目录号11067-030。
rCHO-GS细胞株：用含单抗蛋白的目的基因和谷氨酰胺合成酶（GS）基因标记的表达载体，转染宿主细胞CHO，再通过L-氨基亚砜蛋氨酸（MSX）加压促使GS基因和目的蛋白基因扩增，筛选获得重组细胞株。
CHO野生型细胞株：CHO-K1 ATCC Cat.NO.CC1-61。
实施例2 5升搅拌罐式生物反应器中批次悬浮培养rCHO-GS细胞
细胞培养：将在250m1搅拌瓶中分别用本发明实验例1、实验例2、实验例3、对比例2、对比例3培养基悬浮培养的rCHO-GS细胞，按3×105cells/ml接种5L搅拌罐式生物反应器，分别加入上述培养基至5L设定工作体积。温度设置为37℃，溶解氧浓度控制在30-50%，pH控制在7.1-7.2，搅拌速度设置为60-70r/min，每天取样，用血球计数板点样计数细胞，每样计数3次，取平均值，用台盼蓝拒染法确定细胞的存活率。整个培养过程持续7d。使用上述5种培养基的不同结果如下表2、表3以及图2、图3：
表2 活细胞密度变化趋势(106/mL)
培养时间/天 实验例1 实验例2 实验例3 对比例2 对比例3
1 0.5 0.5 0.6 0.5 0.4
2 2.7 3.0 3.7 2.0 2.2
3 9.5 10.1 13.9 8.7 8.3
4 25.4 23.9 29.6 12.3 11.3
5 51.3 53.6 61.2 50.3 42.0
6 69.1 70.1 80.1 60.3 56.3
7 67.9 68.2 78.1 60.0 51.2
表3细胞活性变化趋势(％)
培养时间/天 实验例1 实验例2 实验例3 对比例2 对比例3
1 99.3 99.5 99.7 99.1 99.1
2 99.1 99.3 99.6 99.0 95.1
3 98.4 98.3 98.6 97.0 90.3
4 97.2 97.5 98.0 95.4 89.4
5 94.3 95.3 96.4 93.4 85.6
6 94.1 93.3 96.4 92.3 80.3
7 91.0 90.1 93.2 89.6 78.3
表2和图2的结果表明，CHO第6天细胞密度最高，实验例3的培养基效果最佳，达到80.1×106/mL，实验例1、2分别为69.1×106/mL、70.1×106/mL，而相应的商业化CHO无血清培养基对比例3的细胞密度最高仅56.3×106/mL。通过图2可知，在培养的1-7天中，对比例3的生长曲线一直低于实验例1-3。可见，在细胞生长、密度方面，本发明的CHO细胞的无血清培养基显著优于商业化的CD CHO 培养基。而对于除了将7mg/L的胆固醇亚麻酸盐去除以外，其他组分、浓度与实验例3相同的对比例2，在第6天细胞密度为60.3×106/mL，显现低于实验例3，由此可知，胆固醇亚麻酸盐对于CHO细胞的悬浮培养生长有促进作用。
表3和图3的结果表明，在培养的1-7天，实验例1、实验例2、实验例3的细胞存活率一直高于90%。而对比例3在培养的第4天，即下降至90%以下，到第7天，细胞存活率已降至78.3%。可见，在细胞存活方面，本发明的CHO细胞的无血清培养基显著优于商业化的CD CHO培养基。通过图3可知，对比例2的细胞存活率要略低于实验例1-3，胆固醇亚麻酸盐可能对CHO细胞悬浮培养的存活率有一定正向影响。
实施例3 野生型CHO细胞悬浮培养
重复实施例2中的实验例3、对比例3，不同点在于用野生型的CHO细胞，即CHO-K1 ATCCCat.NO.CC1-61，替换rCHO-GS细胞。实验结果显示，使用实验例3的培养基，野生型CHO细胞第六天达到最大细胞密度79.5×106/mL，对比例3同样在第六天达到最大细胞密度，但仅有58.1×106/mL。培养7天，使用实验例3的培养基，野生型CHO细胞的存活率一直在90%以上。而使用对比例3的培养基，野生型CHO细胞在培养至第7天，存活率仅有75.9%。由此可见，使用本发明的无血清培养基培养rCHO-GS或野生型CHO细胞，均可取得较佳效果，相对于市售的CHO无血清培养基（Gibco公司的CD CHO 培养基Gibco 10743029，目录号11067-030）具有更高的细胞密度、更好的存活率。
实施例4 培养基中AEO-9组分的降低细胞成团效果
重复实施例2中的的细胞悬浮培养实验，区别在于分别采用实验例3、对比例1，对比例1除了将150mg/L的AEO-9替换为150mg/L的嵌段式聚醚F-68以外，其他组分、浓度与实验例3相同。培养至第7天，使用实验例3培养基培养的细胞，在显微镜下观察，细胞边缘清晰，形态饱满，无结团现象，细胞结团现象得到了明显改善，具体见图4。使用对比例1培养基培养的细胞，仍然有轻微结团现象，具体见图5。由此可见，本发明包含AEO-9组分的无血清培养基，可以明显改善悬浮培养CHO细胞的结团问题，且相对于嵌段式聚醚F-68组分具有更好的效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种用于培养CHO细胞的无血清培养基，其特征在于，所述培养基包含有基础培养基和添加物，所述基础培养基为DMEM/F12，按所述无血清培养基的总体积计，所述添加物包含如下成分：
AEO-9 100-200mg/L；
胆固醇亚麻酸盐 5-10mg/L；
维生素C 5-10mg/L；
胰岛素2-5mg/L；
转铁蛋白5-7mg/L；
乙醇胺2-5mg/L；
卵磷脂3-6mg/L；
硫酸胆碱10-40mg/L。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述添加物还包含微量元素。
3.根据权利要求2任一项所述的培养基，其特征在于，所述微量元素各成分终浓度分别为：七水硫酸锌0.5-5mg/L、五水硫酸铜0.0001-0.01mg/L、硒酸纳0.01-0.8mg/L、氯化镍0.00005-0.0005mg/L、氯化亚锡0.00005-0.0005mg/L、硝酸银0.00001-0.0002mg/L、氯化钴0.0005-0.008mg/L、氯化铝0.0001-0.001mg/L、醋酸钡0.0005-0.003mg/L、硫酸铬0.001-0.006mg/L、氟化钠0.0005-0.006mg/L、偏硅酸钠0.005-0.09mg/L。
4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述微量元素各成分终浓度分别为：七水硫酸锌2mg/L、五水硫酸铜0.001mg/L、硒酸纳0.2mg/L、氯化镍0.0001mg/L、氯化亚锡0.0002mg/L、硝酸银0.0002mg/L、氯化钴0.005mg/L、氯化铝0.0008mg/L、醋酸钡0.002mg/L、硫酸铬0.004mg/L、氟化钠0.002mg/L、偏硅酸钠0.005mg/L。
5.根据权利要求1-4任一项所述的培养基，其特征在于，按所述无血清培养基的总体积计，所述添加物包含如下成分：
AEO-9 150mg/L；
胆固醇亚麻酸盐 7mg/L；
维生素C 8mg/L；
胰岛素3mg/L；
转铁蛋白6mg/L；
乙醇胺3mg/L；
卵磷脂5mg/L；
硫酸胆碱25mg/L。
6.根据权利要求1-4任一项所述的培养基，其特征在于，所述DMEM/F12培养基的成分如下，单位是mg/L：无水氯化钙 116.6； L-亮氨酸 59.05； 亚油酸 0.042；五水硫酸铜0.0013； L-赖氨酸盐酸盐 91.25； 硫辛酸 0.105；九水硝酸铁 0.05； L-蛋氨酸 17.24；酚红 8.1；七水硫酸亚铁 0.417； L-苯丙氨酸 35.48； 1,4-丁二胺二盐酸盐 0.081；氯化钾 311.8； L-丝氨酸 26.25； 丙酮酸钠 55；氯化镁 28.64； L-苏氨酸 53.45； 维生素H0.0035；无水硫酸镁 48.84 L-丙氨酸 4.45 D-泛酸钙 2.24；氯化钠 6999.5；L-天门冬酰胺 7.5；氯化胆碱 8.98；无水磷酸二氢钠； 54.35 L-天门冬氨酸 6.65； 叶酸 2.65；磷酸氢二钠 71.02 L-半胱氨酸盐酸盐 17.56 i-肌醇 12.6；七水硫酸锌 0.432； L-谷氨酸7.35； 烟酰胺 2.02；L-精氨酸盐酸盐 147.5； L-脯氨酸 17.25； 盐酸吡哆醛 2；L-胱氨酸盐酸盐 31.29； L-色氨酸 9.02； 盐酸吡哆醇 0.031；L-谷氨酰胺 365； L-酪氨酸 38.4；核黄素 0.219；甘氨酸 18.75； L-缬氨酸 52.85； 盐酸硫胺 2.17；L-组氨酸盐酸盐 31.48；D-葡萄糖 3151 ；胸苷 0.365；L-异亮氨酸 54.47； 次黄嘌呤 2； 维生素B12 0.68。
7.根据权利要求5任一项所述的培养基，其特征在于，所述DMEM/F12培养基的成分如下，单位是mg/L：无水氯化钙 116.6； L-亮氨酸 59.05； 亚油酸 0.042；五水硫酸铜0.0013； L-赖氨酸盐酸盐 91.25； 硫辛酸 0.105；九水硝酸铁 0.05； L-蛋氨酸 17.24；酚红 8.1；七水硫酸亚铁 0.417； L-苯丙氨酸 35.48； 1,4-丁二胺二盐酸盐 0.081；氯化钾 311.8； L-丝氨酸 26.25； 丙酮酸钠 55；氯化镁 28.64； L-苏氨酸 53.45； 维生素H0.0035；无水硫酸镁 48.84 L-丙氨酸 4.45 D-泛酸钙 2.24；氯化钠 6999.5；L-天门冬酰胺 7.5；氯化胆碱 8.98；无水磷酸二氢钠； 54.35 L-天门冬氨酸 6.65； 叶酸 2.65；磷酸氢二钠 71.02 L-半胱氨酸盐酸盐 17.56 i-肌醇 12.6；七水硫酸锌 0.432； L-谷氨酸7.35； 烟酰胺 2.02；L-精氨酸盐酸盐 147.5； L-脯氨酸 17.25； 盐酸吡哆醛 2；L-胱氨酸盐酸盐 31.29； L-色氨酸 9.02； 盐酸吡哆醇 0.031；L-谷氨酰胺 365； L-酪氨酸 38.4；核黄素 0.219；甘氨酸 18.75； L-缬氨酸 52.85； 盐酸硫胺 2.17；L-组氨酸盐酸盐 31.48；D-葡萄糖 3151 ；胸苷 0.365；L-异亮氨酸 54.47； 次黄嘌呤 2； 维生素B12 0.68。
8.权利要求1-7任一项所述的培养基在培养CHO细胞中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述CHO细胞是带有谷氨酞胺合成酶系统的CHO-GS细胞。
10.一种培养CHO细胞的方法，包括步骤：在权利要求1-7任一项所述的培养基中接种CHO细胞，然后在37 ℃、51%二氧化碳的条件下培养CHO细胞一定时间，至所需细胞量。
11.权利要求1-7任一项所述培养基的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：（1）获取DMEM/F12基础培养基；（2）在DMEM/F12基础培养基中添加所述添加物的各组分；（3）将制备获得的培养基过0.22um滤膜滤过除菌。
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