CN112442486B - 一种维持体外培养cho dg44细胞后期活率的培养基及其应用 - Google Patents

一种维持体外培养cho dg44细胞后期活率的培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于CHO细胞培养的无血清培养基及应用，尤其适合CHO DG44细胞大规模悬浮培养。所述无血清培养基，包含氨基酸、维生素、无机盐、添加物组分，所述添加物为乙醇胺、D‑葡萄糖、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、胰岛素、亚油酸、硫辛酸、苯酚红、腐胺、N乙酰半胱氨酸、丙酮酸钠、转铁蛋白、IGF‑1、AEO‑9。所述培养基可用于CHO细胞工业化大规模悬浮培养，细胞不易结团，维持体外培养CHO DG44细胞后期活率，目标蛋白表达量高，适合单抗，尤其是CD20单抗的生产。

Description

一种维持体外培养CHO DG44细胞后期活率的培养基及其应用
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，更特别地，涉及一种用于培养CHO DG44细胞的无血清培养基及其应用，所述培养基可用于CHO细胞工业化大规模悬浮培养，细胞不易结团，维持体外培养CHO DG44细胞后期活率，目标蛋白表达量高。
背景技术
过去几十年中，哺乳动物细胞培养技术取得了较大成就。已上市的治疗性生物技术药物，用哺乳动物细胞生产的占 50%以上，其中，尤以中华仓鼠卵巢（Chinese hamsterovary，CHO）细胞的使用最为广泛。基于大规模生物反应器的哺乳动物细胞（特别是 CHO 细胞）培养技术已逐渐成为生产单抗药物的核心技术。CHO细胞能够生产高质量的生物制剂，其与人相似的翻译后修饰水平能够达到克级。此外，相较于其他细胞类型，CHO细胞具有（1）能在化学成分限定和无血清悬浮培养中稳定生长，（2）在人类致病病毒应答方面表现出合理的安全性，（3）能够表达与人相似的翻译后修饰等优点。因此，CHO细胞成为当前重组蛋白工业化生产的主要宿主细胞。CHO细胞已经成为需要复杂翻译后修饰的治疗性蛋白生产的主要工具。目前，有两种主要的CHO表达系统被广泛应用，基于二氢叶酸还原酶（DHFR）的甲氨蝶呤（MTX）选择体系和基于谷氨酰胺合成酶（GS）的甲硫氨酸硫氧胺（MSX）选择体系。
相对于动物细胞贴壁培养而言，单个细胞悬浮培养具有细胞生长均一性好、传质效率高、容易实现规模放大和过程控制的特点。哺乳动物细胞的悬浮培养己成为目前动物细胞培养的理想模式和动物细胞表达产品工业化生产的首要选择，超过80%的哺乳动物细胞表达生物技术药物采用动物细胞悬浮培养为其生产工艺。对于CHO细胞悬浮培养而言，要在规模化的培养中获取好的培养结果，设计出适宜细胞悬浮生长的培养基是至关重要的。无血清培养基的优势很大程度上体现在避免了血清的缺点，此外它还具有血清培养难以比拟的优点，如保存和应用方便;使用该种培养基制备的产品易于纯化，提高回收率；成分明确，有利于研究细胞的生理调节机制；可根据不同细胞株设计和优化出适合其高密度生长或高水平目的产物表达的培养基等。因此，近年来许多科研工作者致力于开发适用于CHO细胞大规模培养的无血清培养基。
在无血清培养基中悬浮培养CHO细胞时，常常发生结团现象，降低了细胞的活性，蛋白表达受到影响，但迄今细胞结团的原因还不甚清楚。有研究认为结团可能是由于DNA从死亡的细胞间释放后，在细胞与细胞之间架桥引起的，若在培养基中添加脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）可以避免结团现象发生。但是Dee等则认为通过添加肝素、硫酸葡聚糖、硫酸戊糖等高度磺化硫酸聚阴离子物质，可成功地解决BTI-TN5B1-4昆虫细胞的结团问题，使蛋白表达量提高了倍2-4。有专利文献（CN101724600A，公开日期20100609）公开了一种支持CHO细胞大规模高密度悬浮培养的无血清培养基，其中使用了嵌段式聚醚F-68 (Pluronic F-68) :Pluronic F-68作为一种表面活性剂，可有效的降低细胞悬浮培养过程中流体剪切力对细胞的损伤，同时对细胞也具有一定生物学活性。虽然现有技术中存在上述可用于降低CHO成团的物质，然而上述物质存在不稳定、成本高等缺陷，本领域存在寻求更适合的用于降低CHO成团的物质的需求。
AEO-9，又称脂肪醇聚氧乙烯醚，是天然脂肪醇与环氧乙烷加成物，分子式C30H62O10，CAS号:68213-23-0。AEO-9与嵌段式聚醚F-68类似，均属于非离子型表面活性剂，但是其相对嵌段式聚醚F-68具有更好的性能，更强的增溶、分散能力，生物降解性好，环境友好，成本低廉等等。并且，现有技术中并没有公开或暗示AEO-9可用于CHO培养，本发明出乎意料的发现，AEO-9可有效改善悬浮培养CHO细胞时的结团现象，且相对于嵌段式聚醚F-68具有更好的效果。
目前，利用CHO细胞生产生物药的过程仍然遭受许多制约，如生长限制、低产率、低耐压以及与大肠杆菌的酵母表达系统相比的高成本等，尤其是对于能够进行DHFR双等位基因物理删除的CHO-DG44细胞系而言，体外悬浮培养细胞成团，以及后期活率的快速下降对细胞目标蛋白，如对单克隆抗体表达量影响巨大。因此，本领域存在提供一种更好的无血清培养基的普遍诉求，来解决上述问题，提高单抗等目标蛋白表达量。
发明内容
为解决现有CHO细胞悬浮培养的不足，本发明提供了一种用于培养CHO细胞的无血清培养基及其应用，尤其适合CHO DG44细胞。所述培养基可用于CHO细胞工业化大规模悬浮培养，细胞不易结团，细胞密度高，可维持体外培养CHO DG44细胞后期活率，最终单抗等目标蛋白产量高。
所述CHO无血清培养基包含氨基酸、维生素、无机盐、添加物组分，各组分按所述培养基的总体积计，单位为mg/L，所述添加物为：
乙醇胺 0.5-4；
D-葡萄糖 2500-6000；
4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）500-2000；
胰岛素 2-5；
亚油酸 0.01-3；
硫辛酸 0.2-10；
苯酚红 0.5-10；
腐胺 0.01-1；
N乙酰半胱氨酸：10-500；
丙酮酸钠 10-200；
转铁蛋白 5-7；
IGF-1 10-20；
AEO-9 100-200。
在一个优选实施方案中，所述氨基酸组分为：单位为mg/L，丙氨酸 10-100；精氨酸200-400；天冬酰胺 5-100；天冬氨酸 10-300；半胱氨酸 15-100；谷氨酸 5-50；谷氨酰胺300-1000；甘氨酸 5-50；组氨酸 25-100；异亮氨酸 50-200；亮氨酸 100-200；赖氨酸 100-250；蛋氨酸 25-50；苯丙氨酸 15-100；脯氨酸 5-15；丝氨酸 5-50；苏氨酸 15-200；色氨酸5-50；酪氨酸 20-150；缬氨酸 50-250；牛磺酸 5-25。
在一个优选实施方案中，所述维生素组分为：单位为mg/L，维生素H 0.001-1；氯化胆碱 1-200；泛酸钙 0.2-2；叶酸 1-10；肌醇 2-20；烟酰胺 0.1-1；吡哆醇（维生素B6）0.1-2.5；核黄素 0.02-1；硫胺素（维生素B1） 0.1-5；维生素B12 0.05-2；硫酸葡聚糖 5-250。
在一个优选实施方案中，所述无机盐组分为：单位为mg/L，氯化钙 5-50；硝酸铁0.25-1.5；氯化钾 10-100；氯化镁 25-150；硫酸镁 5-25；氯化锰 0.00001-0.005；氯化钠3000-5000；碳酸氢钠 100-2000；磷酸氢二钠 10-750；亚硒酸钠 0.0000005-0.0002；矾酸铵 0.00005-0.002；硫酸锌 0.001-0.15。
在一个优选实施方案中，所述CHO无血清培养基由如下组分组成：各组分按所述培养基的总体积计，单位为mg/L，所述添加物为：
乙醇胺 0.5-4；
D-葡萄糖 2500-6000；
4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）500-2000；
胰岛素 2-5；
亚油酸 0.01-3；
硫辛酸 0.2-10；
苯酚红 0.5-10；
腐胺 0.01-1；
N乙酰半胱氨酸：10-500；
丙酮酸钠 10-200；
转铁蛋白 5-7；
IGF-1 10-20；
AEO-9 100-200；
丙氨酸 10-100；精氨酸 200-400；天冬酰胺 5-100；天冬氨酸 10-300；半胱氨酸15-100；谷氨酸 5-50；谷氨酰胺 300-1000；甘氨酸 5-50；组氨酸 25-100；异亮氨酸 50-200；亮氨酸 100-200；赖氨酸 100-250；蛋氨酸 25-50；苯丙氨酸 15-100；脯氨酸 5-15；丝氨酸 5-50；苏氨酸 15-200；色氨酸 5-50；酪氨酸 20-150；缬氨酸 50-250；牛磺酸 5-25。
维生素H 0.001-1；氯化胆碱 1-200；泛酸钙 0.2-2；叶酸 1-10；肌醇 2-20；烟酰胺 0.1-1；吡哆醇（维生素B6） 0.1-2.5；核黄素 0.02-1；硫胺素（维生素B1） 0.1-5；维生素B12 0.05-2；硫酸葡聚糖 5-250。
氯化钙 5-50；硝酸铁0.25-1.5；氯化钾 10-100；氯化镁 25-150；硫酸镁 5-25；氯化锰 0.00001-0.005；氯化钠 3000-5000；碳酸氢钠 100-2000；磷酸氢二钠 10-750；亚硒酸钠 0.0000005-0.0002；矾酸铵 0.00005-0.002；硫酸锌 0.001-0.15。
在一个优选实施方案中，所述CHO无血清培养基由如下组分组成：各组分按所述培养基的总体积计，单位为mg/L，所述添加物为：
乙醇胺 1；
D-葡萄糖 4000；
4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）1000；
胰岛素 3；
亚油酸 1；
硫辛酸 5；
苯酚红 2.5；
腐胺 0.1；
N乙酰半胱氨酸：100；
丙酮酸钠 50；
转铁蛋白 6；
IGF-1 15；
AEO-9 150；
丙氨酸 50；精氨酸 300；天冬酰胺 50；天冬氨酸 100；半胱氨酸 75；谷氨酸 30；谷氨酰胺 400；甘氨酸 25；组氨酸 35；异亮氨酸 75；亮氨酸 120；赖氨酸 150；蛋氨酸 40；苯丙氨酸 56；脯氨酸 10；丝氨酸 27；苏氨酸 80；色氨酸 25；酪氨酸 65；缬氨酸 85；牛磺酸 10；
维生素H 0.2；氯化胆碱 10；泛酸钙 1；叶酸 5；肌醇 10；烟酰胺 0.5；吡哆醇（维生素B6） 0.5；核黄素 0.35；硫胺素（维生素B1） 0.25；维生素B12 0.15；硫酸葡聚糖 50。
氯化钙 10；硝酸铁1；氯化钾 12；氯化镁 50；硫酸镁 10；氯化锰 0.003；氯化钠4000；碳酸氢钠 1000；磷酸氢二钠 200；亚硒酸钠 0.0001；矾酸铵 0.001；硫酸锌 0.1。
在本发明的第二方面，提供了本发明所述培养基的用途，它被用于培养CHO细胞。
在一个优选实施方案中，所述CHO细胞是DHFR基因缺失的CHO-DG44。
在本发明的第三方面，还提供了一种培养CHO细胞的方法，包括步骤：在本发明所述培养基中接种CHO细胞，然后在适合生长的条件下（如37±2 ℃，5±1%二氧化碳下)培养CHO细胞一定时间，至所需细胞量。
在本发明的第四方面，还提供了一种维持体外培养CHO DG44细胞后期活率的方法，包括如下步骤：
S1：将冻存的CHO DG44细胞在本发明所述的培养基里复苏，将CHO DG44细胞在摇床中培养；
S2：每2-3天进行一次传代操作，保持细胞处于早期对数生长期，细胞接种密度为0.5~1.0 × 106cells/ mL；
S3：当细胞密度达到1.5×106~4.5×106cells/mL，细胞活率≥95％，间隔2~3天时，再次传代；
S4：按照S2和S3方法传代2~4次，细胞群体倍增时间稳定后开始接种，5L搅拌罐式生物反应器中进行培养；
S5：培养后使用本发明所述的培养基作为补料培养基进行批次补料；
S6：细胞活率低于70%或培养第16天收获，检测蛋白浓度。
进一步地，在步骤（S1）中，所述的摇床的转速为130±20 rpm，培养箱中CO2浓度设置为5%~10%。
进一步地，在步骤（S4）中，PDT稳定后偏差＜3h。
优选地，在步骤（S4）中，所述接种密度在0.5×106~1.0×106cells/ mL。
进一步地，在步骤（S5）中，补料1~7%，至培养结束前1~2天停止补料。
优选地，所述蛋白为抗体，更优选地，所述抗体为CD20单抗。
在本发明的第五方面，还提供了本发明所述培养基的制备方法，其特征在于，（1）按量获取培养基各组分；（2）将各组分按照其溶解特性溶解；（3）将制备获得的培养基过0.22um滤膜滤过除菌。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的用于培养CHO细胞的无血清培养基成分简单、低成本、低蛋白。
(2)本发明的无血清培养基无血清低蛋白，利于CHO表达的目标蛋白，尤其是单抗的后续纯化。
(3)培养基中添加AEO-9可有效改善悬浮培养CHO细胞时的结团现象，且相对于嵌段式聚醚F-68具有更好的效果。
(4)在培养后期，采用本发明无血清培养基从第8天开始细胞密度有稍微下降之后又在第11天有所上升，此后维持高细胞密度一直到第14天才开始下降。而采用商业化的CHO无血清培养基的细胞密度从第8天开始持续下降，没有上升过程。可见，本发明的CHO细胞的无血清培养基可保持培养后期的高细胞密度，进而维持体外培养CHO DG44细胞后期活率。
(5)采用本发明无血清培养基培养的CHO DG44细胞存活率一直高于90%，尤其是培养后期，即第8天之后，仍能维持存活率在91.2-97.4%之间。
(6)用本发明的无血清培养培养16天，表达CD20单抗的CHO DG44 细胞株表达获得的CD20单抗蛋白浓度可达1500-1800 mg/L。
附图说明
图1 活细胞密度变化趋势(106cells/ mL)。
图2 细胞存活率变化趋势(％)。
图3 表7HPLC法检测CD20单抗蛋白浓度（mg/L）。
图4 使用实验例2培养基培养的CHO细胞显微镜图。
图5 使用对比例1培养基培养的CHO细胞显微镜图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1、培养基的制备以及细胞株
培养基中各组分均可从Sigma, GIBCO公司等处购买获得。
配制3种不同浓度配比的本发明的用于培养CHO细胞的无血清培养基，其各组分终浓度如下表1-4（实验例1、实验例2和实验例3同时包含表1-表4所示的成分）所示。
表1使用的培养CHO细胞的无血清培养基实验例包含的部分物质浓度
组分，浓度mg/L 实验例1 实验例2 实验例3
乙醇胺 0.5 1 2
D-葡萄糖 2500 4000 5000
4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） 750 1000 1500
胰岛素 2 3 4
亚油酸 0.5 1 2
硫辛酸 2 5 8
苯酚红 0.5 2.5 4
腐胺 0.05 0.1 0.5
N乙酰半胱氨酸 50 100 200
丙酮酸钠 20 50 100
转铁蛋白 5 6 7
IGF-1 10 15 20
AEO-9 100 150 200
表2使用的培养CHO细胞的无血清培养基实验例包含的氨基酸组份浓度
组分，浓度mg/L 实验例1 实验例2 实验例3
丙氨酸 20 50 100
精氨酸 200 300 400
天冬酰胺 20 50 75
天冬氨酸 50 100 200
半胱氨酸 15 75 100
谷氨酸 20 30 40
谷氨酰胺 300 400 600
甘氨酸 15 25 50
组氨酸 25 35 55
异亮氨酸 50 75 150
亮氨酸 100 120 160
赖氨酸 100 150 200
蛋氨酸 25 40 50
苯丙氨酸 30 56 75
脯氨酸 5 10 15
丝氨酸 10 27 50
苏氨酸 400 80 150
色氨酸 15 25 45
酪氨酸 40 65 125
缬氨酸 50 85 180
牛磺酸 5 10 20
表3使用的培养CHO细胞的无血清培养基实验例包含的维生素组份浓度
组分，浓度mg/L 实验例1 实验例2 实验例3
维生素H 0.1 0.2 0.5
氯化胆碱 5 10 30
泛酸钙 0.5 1 2
叶酸 2 5 8
肌醇 5 10 15
烟酰胺 0.2 0.5 0.8
吡哆醇（维生素B6） 0.2 0.5 1.5
核黄素 0.2 0.35 0.8
硫胺素（维生素B1） 0.1 0.25 1
维生素B12 0.1 0.15 1
硫酸葡聚糖 25 50 150
表4使用的培养CHO细胞的无血清培养基实验例包含的无机盐组份浓度
组分，浓度mg/L 实验例1 实验例2 实验例3
氯化钙 5 10 25
硝酸铁 0.5 1 1.5
氯化钾 10 12 50
氯化镁 25 50 75
硫酸镁 5 10 25
氯化锰 0.001 0.003 0.005
氯化钠 3000 4000 5000
碳酸氢钠 500 1000 1500
磷酸氢二钠 100 200 500
亚硒酸钠 0.00005 0.0001 0.0002
矾酸铵 0.0005 0.001 0.002
硫酸锌 0.05 0.1 0.15
对比例1：除了将150mg/L的AEO-9替换为150mg/L的嵌段式聚醚F-68以外，其他组分、浓度与实验例2相同。
对比例2：市售瑞士Lonza 公司的无血清培养基ProCHO5。
CHO DG44 细胞株：购于美国 Invitrogen 公司。
表达CD20单抗的CHO DG44 细胞株：按照文献（“重组抗CD20单克隆抗体工程细胞珠的构建”，沙海涛，《吉林大学硕士论文》，2016年度）的方法制备获得稳定表达CD20单抗的CHO DG44细胞株。
CHO野生型细胞株：CHO-K1 ATCC Cat.NO.CCL-61。
实施例2、5升搅拌罐式生物反应器中批次悬浮培养CHO DG44细胞
S1：将冻存的表达CD20单抗的CHO DG44 细胞分别在实验例1、实验例2、实验例3、对比例2的培养基里复苏，将CHO DG44细胞在摇床中培养，所述摇床转速为130±20 rpm，培养箱中CO2浓度设置为5%；
S2：每2天进行一次传代操作，保持细胞处于早期对数生长期，细胞接种密度为0.8× 106cells/ mL；
S3：当细胞密度达到2.5×106cells/mL，细胞活率≥95％，间隔2天时，再次传代；
S4：按照S2和S3方法传代3次，细胞群体倍增时间稳定后开始接种，培养时间为D0，接种密度在0.5×106cells/ mL，PDT稳定后偏差＜3h，5L搅拌罐式生物反应器中进行培养。温度设置为37℃，溶解氧浓度控制在30-50%，pH控制在7.1-7.2，搅拌速度设置为60-70r/min，每天取样，用血球计数板点样计数细胞，每样计数3次，取平均值，用台盼蓝染色法确定细胞的存活率；
S5：培养后分别使用实验例1、实验例2、实验例3、对比例2的培养基作为补料培养基进行批次补料，补料5%，至培养结束前1~2天停止补料；
S6：培养第16天（D16）收获，HPLC法检测CD20单抗蛋白浓度；
使用上述4种培养基的不同结果如下表5、表6、表7以及图1、图2、图3：
表5活细胞密度变化趋势(106cells/ mL)
培养时间/天 实验例1 实验例2 实验例3 对比例2
1 0.6 0.6 0.6 0.5
2 3.7 4.0 3.2 2.0
3 10.5 11.1 10.8 8.7
4 20.4 23.9 22.6 15.3
5 42.3 50.6 46.3 30.6
6 50.3 59.3 55.2 41.3
7 58.3 68.2 60.9 50.2
8 62.3 69.3 65.3 58.3
9 56.3 65.3 60.3 55.3
10 54.9 63.9 58.7 50.2
11 60.2 69.5 65.6 50.1
12 59.6 68.4 64.2 49.3
13 57.6 65.7 60.4 48.7
14 55.3 63.1 59.2 47.6
15 55.1 62.3 57.3 45.9
16 54.2 62.0 55.7 45.0
表6细胞存活率变化趋势(％)
培养时间/天 实验例1 实验例2 实验例3 对比例2
1 99.7 99.9 99.5 99.1
2 99.5 99.8 99.5 99.0
3 99.0 99.3 99.0 98.0
4 98.2 99.0 98.5 96.4
5 97.3 98.3 97.4 95.4
6 96.8 97.5 96.9 94.3
7 96.5 97.4 96.8 93.6
8 96.3 97.4 96.5 92.4
9 96.0 97.1 96.2 91.5
10 95.1 96.5 95.6 90.4
11 95.0 96.4 95.5 88.9
12 95.0 96.1 95.3 87.5
13 94.2 95.3 94.5 85.6
14 93.1 94.2 93.6 82.6
15 92.6 93.8 92.7 80.0
16 91.2 93.0 91.7 79.1
表7 HPLC法检测CD20单抗蛋白浓度（mg/L）
实验例1 实验例2 实验例3 对比例2
CD20单抗蛋白浓度（mg/L） 1500 1800 1650 800
表5和图1的结果表明，CHO第8天细胞密度达到相对峰值，实验例2的培养基效果最佳，达到69.3×106/mL，实验例1、2分别为62.3×106/mL、65.3×106/mL，而相应的商业化CHO无血清培养基对比例2的细胞密度最高仅58.3×106/mL。通过图1可知，在培养的1-16天中，对比例2的生长曲线一直低于实验例1-3。可见，在细胞生长、密度方面，本发明的CHO细胞的无血清培养基显著优于商业化的CD CHO培养基。并且，在培养后期，实验例1-3从第8天开始细胞密度有稍微下降之后又再第11天有所上升，此后维持高细胞密度一直到第14天才开始下降。而对比例2的细胞密度从第8天开始持续下降，没有上升过程。可见，本发明的CHO细胞的无血清培养基可保持培养后期的高细胞密度，进而维持体外培养CHO DG44细胞后期活率。
表6和图2的结果表明，在培养的1-16天，实验例1、实验例2、实验例3的细胞存活率一直高于90%，尤其是培养后期，即第8天之后，仍能维持存活率在91.2-97.4%之间。而对比例2在培养的第11天，即下降至90%以下，到第16天，细胞存活率已降至79.1%。可见，在细胞存活方面，本发明的CHO细胞的无血清培养基显著优于商业化的CD CHO 培养基，并且可维持体外培养CHO DG44细胞后期活率。
表7和图3的结果表明，采用本发明的无血清培养基（即实验例1-3）培养16天，所述表达CD20单抗的CHO DG44 细胞株表达获得的CD20单抗蛋白浓度可达1500-1800 mg/L，而采用市售的CHO无血清培养基表达获得的CD20单抗蛋白浓度为800 mg/L，仅为采用本发明无血清培养基的蛋白浓度一半左右。
实施例3 野生型CHO细胞悬浮培养
重复实施例2中的实验例2、对比例2，不同点在于用野生型的CHO细胞，即CHO-K1ATCC Cat.NO.CCL-61，替换表达CD20单抗的CHO DG44 细胞。实验结果显示，使用实验例2的培养基，野生型CHO细胞第8天达到最大细胞密度65.9×106/mL，对比例2同样在第8天达到最大细胞密度，但仅有55.1×106/mL。并且使用实验例2的培养基，野生型CHO细胞在培养的第8-13天，细胞密度均可维持在55×106/mL以上，而使用对比例2的培养基，细胞密度从第8天开始持续下降，在培养的第13天，细胞密度下降至45×106/mL。对于细胞存活率，使用实验例2的培养基，野生型CHO细胞至培养的第16天，仍可以达到90%的细胞存活率，而使用对比例2的培养基，野生型CHO细胞至培养的第16天存活率已经下降到75%。由此可见，使用本发明的无血清培养基培养表达CD20单抗的CHO DG44 细胞或野生型CHO细胞，均可取得较佳效果，相对于市售的CHO无血清培养基具有更高的细胞密度、更好的存活率。
实施例4 培养基中AEO-9组分的降低细胞成团效果
重复实施例2中的细胞悬浮培养实验，区别在于分别采用实验例2、对比例1，对比例1除了将150mg/L的AEO-9替换为150mg/L的嵌段式聚醚F-68以外，其他组分、浓度与实验例2相同。培养至第10天，使用实验例2培养基培养的细胞，在显微镜下观察，形态饱满，单个细胞清晰可见，无结团现象，细胞结团现象得到了明显改善，具体见图4。使用对比例1培养基培养的细胞，仍然有轻微结团现象，具体见图5。由此可见，本发明包含AEO-9组分的无血清培养基，可以明显改善悬浮培养CHO细胞的结团问题，且相对于嵌段式聚醚F-68组分具有更好的效果。

Claims (4)

1.一种用于培养CHO细胞的无血清培养基，其特征在于，包含氨基酸、维生素、无机盐、添加物组分，各组分按所述培养基的总体积计，单位为mg/L，所述添加物的组分为：
乙醇胺 0.5-4；
D-葡萄糖 2500-6000；
4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）500-2000；
胰岛素 2-5；
亚油酸 0.01-3；
硫辛酸 0.2-10；
苯酚红 0.5-10；
腐胺 0.01-1；
N乙酰半胱氨酸 10-500；
丙酮酸钠 10-200；
转铁蛋白 5-7；
IGF-1 10-20；
AEO-9 100-200；
所述氨基酸组分为：丙氨酸 10-100；精氨酸 200-400；天冬酰胺 5-100；天冬氨酸 10-300；半胱氨酸 15-100；谷氨酸 5-50；谷氨酰胺 300-1000；甘氨酸 5-50；组氨酸 25-100；异亮氨酸 50-200；亮氨酸 100-200；赖氨酸 100-250；蛋氨酸 25-50；苯丙氨酸 15-100；脯氨酸 5-15；丝氨酸 5-50；苏氨酸 15-200；色氨酸 5-50；酪氨酸 20-150；缬氨酸 50-250；牛磺酸 5-25；
所述维生素组分为：维生素H 0.001-1；氯化胆碱 1-200；泛酸钙 0.2-2；叶酸 1-10；肌醇 2-20；烟酰胺 0.1-1；吡哆醇（维生素B6） 0.1-2.5；核黄素 0.02-1；硫胺素（维生素B1）0.1-5；维生素B12 0.05-2；硫酸葡聚糖 5-250；
所述无机盐组分为：氯化钙 5-50；硝酸铁0.25-1.5；氯化钾 10-100；氯化镁 25-150；硫酸镁 5-25；氯化锰 0.00001-0.005；氯化钠 3000-5000；碳酸氢钠 100-2000；磷酸氢二钠 10-750；亚硒酸钠 0.0000005-0.0002；矾酸铵 0.00005-0.002；硫酸锌 0.001-0.15；
所述CHO细胞是DHFR基因缺失的CHO-DG44。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基由如下组分组成：
乙醇胺 1；
D-葡萄糖 4000；
4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）1000；
胰岛素 3；
亚油酸 1；
硫辛酸 5；
苯酚红 2.5；
腐胺 0.1；
N乙酰半胱氨酸 100；
丙酮酸钠 50；
转铁蛋白 6；
IGF-1 15；
AEO-9 150；
丙氨酸 50；精氨酸 300；天冬酰胺 50；天冬氨酸 100；半胱氨酸 75；谷氨酸 30；谷氨酰胺 400；甘氨酸 25；组氨酸 35；异亮氨酸 75；亮氨酸 120；赖氨酸 150；蛋氨酸 40；苯丙氨酸 56；脯氨酸 10；丝氨酸 27；苏氨酸 80；色氨酸 25；酪氨酸 65；缬氨酸 85；牛磺酸10；
维生素H 0.2；氯化胆碱 10；泛酸钙 1；叶酸 5；肌醇 10；烟酰胺 0.5；吡哆醇（维生素B6） 0.5；核黄素 0.35；硫胺素（维生素B1） 0.25；维生素B12 0.15；硫酸葡聚糖 50；
氯化钙 10；硝酸铁1；氯化钾 12；氯化镁 50；硫酸镁 10；氯化锰 0.003；氯化钠 4000；碳酸氢钠 1000；磷酸氢二钠 200；亚硒酸钠 0.0001；矾酸铵 0.001；硫酸锌 0.1。
3.权利要求1或2任一项所述的培养基在培养CHO细胞中的用途。
4.一种培养CHO细胞的方法，包括步骤：在权利要求1或2任一项所述的培养基中接种CHO细胞，然后在37 ℃、5%二氧化碳的条件下培养CHO细胞一定时间，至所需细胞量。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113846051B (zh) * 2021-09-28 2023-12-01 无锡多宁生物科技有限公司 一种通用型化学成分限定cho细胞传代培养基及其应用
CN114854695B (zh) * 2022-05-24 2022-12-27 广州蕊特生物科技有限公司 提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101603026A (zh) * 2009-06-19 2009-12-16 华东理工大学 适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基
CN101668539A (zh) * 2007-04-24 2010-03-10 维涡里斯公司 用于产生病毒疫苗的源自鸭胚胎的干细胞系
CN101724600A (zh) * 2009-11-30 2010-06-09 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种支持cho细胞大规模高密度悬浮培养的无血清培养基
CN109609444A (zh) * 2019-01-30 2019-04-12 苏州工业园区旭太生物工程有限公司 一种bhk21细胞无血清培养基
CN111019883A (zh) * 2019-12-24 2020-04-17 依科赛生物科技（太仓）有限公司 Cho细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基及其用途

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000517188A (ja) * 1996-08-30 2000-12-26 ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド 無血清哺乳動物細胞培養培地およびその使用
WO2006047380A2 (en) * 2004-10-22 2006-05-04 Amgen, Inc. Method and media for single cell serum-fee culture of cho cells

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101668539A (zh) * 2007-04-24 2010-03-10 维涡里斯公司 用于产生病毒疫苗的源自鸭胚胎的干细胞系
CN101603026A (zh) * 2009-06-19 2009-12-16 华东理工大学 适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基
CN101724600A (zh) * 2009-11-30 2010-06-09 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种支持cho细胞大规模高密度悬浮培养的无血清培养基
CN109609444A (zh) * 2019-01-30 2019-04-12 苏州工业园区旭太生物工程有限公司 一种bhk21细胞无血清培养基
CN111019883A (zh) * 2019-12-24 2020-04-17 依科赛生物科技（太仓）有限公司 Cho细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"CHO 细胞无血清培养基的工艺优化";蒋娟娟 等;《天然产物研究与开发》;20161231;第28卷;第607-612页 *
"Development of serum-free media for a recombinant CHO cell line producing recombinant antibody";Do Yun Kim et al.;《Enzyme and Microbial Technology》;20061231;第39卷;第426-433页 *

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