CN114525239A - 一种无血清细胞培养基及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及细胞培养技术领域，具体公开了一种无血清细胞培养基及其制备方法，所述无血清细胞培养基，包括基础培养基和添加因子，所述添加因子包括HEPES、葡聚糖硫酸酯钠、肝素钠、促生长因子I、促生长因子II、大豆胰酶抑制剂；上述配方成分简单、配比严谨，所得培养基质量一致性好，用于细胞培养，能够显著提高细胞活力和细胞生长率。本申请还提出了一种无血清细胞培养基的制备方法，包括将包含的添加因子依次加入到基础培养基中，搅匀后过滤除菌即得；上述方法生产过程简单，生产成本低，所得无血清细胞培养基用于细胞培养易于控制培养环境，细胞增殖力强，存活率高。
Description
技术领域
本申请涉及细胞培养技术领域，更具体地说，它涉及一种无血清细胞培养基及其制备方法。
背景技术
哺乳动物表达系统生产的重组蛋白具有类似于人源化细胞的翻译后修饰方式，常用于表达重组蛋白药物，其中，中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞是最常用的，约70%的重组蛋白药物是由CHO细胞生产的。常规的细胞培养需要添加血清，但血清的成分复杂、批次不一，存在如外源病毒因子和致病因子污染、血清残留等导致的过敏反应，还会导致培养体系中引入了动物源成分，增大了细胞被污染的几率，增加了后续临床使用中的危险性，以及增加细胞培养的标准化和终产品的纯化难度，进而难以应用于重组蛋白药物的生产。因此，开发一种无血清、化学成分确定(chemically defined, CD)的培养基至关重要。
相对于需要添加血清的基础培养基(DMEM和DMFM-F12等)来说，无血清无蛋白细胞培养基已经去除了任何动物来源的血清和蛋白质，通常只含有一些类固醇激素和脂类前体等，以替代动物激素、生长因子的作用，此外也会补充一些小分子肽类片段。CD培养基所有成分的浓度都完全明确，即使添加少量的蛋白质，也是可以经过纯化处理、成分明确、浓度确定的蛋白质。
无血清培养基组成成分明确，可避免血清的不同批次或不明组分对细胞培养的影响，能在很大程度上避免或改善含血清培养基所带来的上述缺陷。然而，申请人发现，目前用于重组蛋白药物生产过程中，CHO细胞培养的无血清细胞培养基，普遍存在细胞增殖较缓慢、细胞生长稳定性差等问题。
发明内容
为了提高无血清细胞培养基的细胞增殖能力、提高细胞生长稳定性和活率，本申请提供了一种无血清细胞培养基及其制备方法。
第一方面，本申请提供了一种无血清细胞培养基，采用如下的技术方案：
一种无血清细胞培养基，包括基础培养基和添加因子，所述添加因子包括以下终浓度的组分：HEPES 12-25mM、葡聚糖硫酸酯钠18-32μg/mL、肝素钠4-13μg/mL、促生长因子I16-35μg/mL、促生长因子II 8-20μg/mL、大豆胰酶抑制剂0.07-0.15%（质量浓度）。
通过采用上述技术方案，本申请在基础培养基的基础上添加HEPES以增强该培养基的缓冲能力，使培养基体系pH值在7.2-7.4间保持稳定，通过添加葡聚糖硫酸酯钠和肝素钠，两者共同作用能够减缓细胞培养过程中细胞聚合形成细胞团的过程；通过添加促生长因子I和促生长因子II，两者共同作用能够显著增强细胞的贴壁性能，促进细胞的增殖和分化；通过添加大豆胰酶抑制剂能够显著增强胰酶消化过程中的细胞抗破坏能力。本申请提供的无血清细胞培养基，减少了血清和蛋白的运用，使细胞被污染的几率减小，提高后续临床使用中的安全性。
优选的，所述添加因子包括以下终浓度的组分：HEPES 15-22mM、葡聚糖硫酸酯钠20-28μg/mL、肝素钠8-12μg/mL、促生长因子I 20-32μg/mL、促生长因子II 10-18μg/mL、大豆胰酶抑制剂0.09-0.13%（质量浓度）。
优选的，所述添加因子包括以下终浓度的组分：HEPES 18mM、葡聚糖硫酸酯钠25μg/mL、肝素钠10μg/mL、促生长因子I 28μg/mL、促生长因子II 16μg/mL、大豆胰酶抑制剂0.12%（质量浓度）。
通过采用上述技术方案，在限定的配方数值范围内，不断优选获得较佳的组成成分明确、成分浓度明确的无血清细胞培养基，优选获得的配方能够支持CHO细胞更好的生长和更快的增殖，同时能够促进抗体表达并适于细胞长期稳定传代。
优选的，所述基础培养基为DMEM/F12（1:1）。
通过采用上述技术方案，本申请利用DMEM/F12作为基础培养基，以提供细胞生长所需的营养丰富且浓度含量高的葡萄糖、氨基酸等营养成分，保证细胞生长需求的同时，简化了无血清细胞培养基的制备。
优选的，所述促生长因子I 包括质量比为4-7:1:2-5的柠檬酸铁、次黄嘌呤胸苷和牛磺酸。
通过采用上述技术方案，通过优化柠檬酸铁、次黄嘌呤胸苷和牛磺酸三者的复配比例，能够获得对细胞生长具有显著正作用的促生长因子I，其能够显著提高细胞存活率。
优选的，所述促生长因子II 包括质量比为1:1:3的黄芪多糖、香菇多糖和三七总皂苷。
通过采用上述技术方案，申请人发现通过加入限定配比为1:1:3的黄芪多糖、香菇多糖和三七总皂苷的复配物，能够显著促进细胞的增殖和分化，而采用其他配比的三者复配物，对细胞生长增殖效果明显下降。
第二方面，本申请提供了一种无血清细胞培养基的制备方法，采用如下的技术方案：
一种无血清细胞培养基的制备方法，具体包括以下制备步骤：
取基础培养基DMEM/F12，依次加入HEPES、葡聚糖硫酸酯钠、肝素钠、促生长因子I、促生长因子II 和大豆胰酶抑制剂，搅拌均匀，并调节pH值至7.2-7.4，经滤膜过滤除菌，4℃保存待用，即得所需的无血清细胞培养基。
通过采用上述技术方案，上述方法制备过程简单，制备成本低，采用DMEM/F12做基础培养基，通过依次添加添加因子，搅匀后过滤灭菌即得，所得无血清细胞培养基用于细胞培养易于控制培养环境，细胞增殖力强，存活率高，其性能均一稳定，适用于大规模生产，有利于后期产品的纯化。
本申请还提供了一种无血清细胞培养基的用途，所述无血清细胞培养基用于CHO细胞的培养。
优选的，所述无血清细胞培养基培养的CHO细胞用于单抗、双抗、融合蛋白、重组蛋白类生物药的制备。
通过采用上述技术方案，本申请的无血清细胞培养基不含血清，其化学成分限定，性能均一稳定，适用于CHO细胞的培养，培养得到的CHO细胞适用于单抗、双抗、融合蛋白、重组蛋白类生物药的制备，具有广泛的应用前景和价值。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
本申请提供的无血清细胞培养基配方科学、配比合理，其组成简单，无血清、成分限定，所得培养基质量一致性好，性能均一稳定，用于细胞培养，能够显著提高细胞活力和细胞生长率。
本申请提供的无血清细胞培养基，制备方法简单，制备成本低，所得无血清细胞培养基用于细胞培养易于控制培养环境，细胞增殖力强，存活率高，其性能均一稳定，适用于大规模生产，有利于后期产品的纯化。
本申请提供的无血清细胞培养基，适用于CHO细胞的培养，培养得到的CHO细胞适用于单抗、双抗、融合蛋白、重组蛋白类生物药的制备，具有广泛的应用前景和价值。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
实施例1
本申请提供了一种无血清细胞培养基，采用如下的技术方案：
一种无血清细胞培养基，包括基础培养基和添加因子；其中，基础培养基为DMEM/F12（1:1）；添加因子包括以下终浓度的组分：HEPES 12mM、葡聚糖硫酸酯钠18μg/mL、肝素钠4μg/mL、促生长因子I 16μg/mL、促生长因子II 8μg/mL、大豆胰酶抑制剂0.07%（质量浓度）；其中，促生长因子I 包括质量比为4:1:2的柠檬酸铁、次黄嘌呤胸苷和牛磺酸；促生长因子II 包括质量比为1:1:3的黄芪多糖、香菇多糖和三七总皂苷。
本申请提供了一种无血清细胞培养基的制备方法，采用如下的技术方案：
一种无血清细胞培养基的制备方法，具体包括以下制备步骤：
取基础培养基DMEM/F12，依次加入HEPES、葡聚糖硫酸酯钠、肝素钠、促生长因子I、促生长因子II 和大豆胰酶抑制剂，搅拌均匀，并调节pH值至7.2，经滤膜过滤除菌，4℃保存待用，即得所需的无血清细胞培养基。
实施例2
本申请提供了一种无血清细胞培养基，采用如下的技术方案：
一种无血清细胞培养基，包括基础培养基和添加因子；其中，基础培养基为DMEM/F12（1:1）；添加因子包括以下终浓度的组分：HEPES 15mM、葡聚糖硫酸酯钠20μg/mL、肝素钠8μg/mL、促生长因子I 20μg/mL、促生长因子II 10μg/mL、大豆胰酶抑制剂0.09%（质量浓度）；其中，促生长因子I 包括质量比为5:1:3的柠檬酸铁、次黄嘌呤胸苷和牛磺酸；促生长因子II 包括质量比为1:1:3的黄芪多糖、香菇多糖和三七总皂苷。
本申请提供了一种无血清细胞培养基的制备方法，采用如下的技术方案：
一种无血清细胞培养基的制备方法，具体包括以下制备步骤：
取基础培养基DMEM/F12，依次加入HEPES、葡聚糖硫酸酯钠、肝素钠、促生长因子I、促生长因子II 和大豆胰酶抑制剂，搅拌均匀，并调节pH值至7.3，经滤膜过滤除菌，4℃保存待用，即得所需的无血清细胞培养基。
实施例3
本申请提供了一种无血清细胞培养基，采用如下的技术方案：
一种无血清细胞培养基，包括基础培养基和添加因子；其中，基础培养基为DMEM/F12（1:1）；添加因子包括以下终浓度的组分：HEPES 18mM、葡聚糖硫酸酯钠25μg/mL、肝素钠10μg/mL、促生长因子I 28μg/mL、促生长因子II 16μg/mL、大豆胰酶抑制剂0.12%（质量浓度）；其中，促生长因子I 包括质量比为5.5:1:3.5的柠檬酸铁、次黄嘌呤胸苷和牛磺酸；促生长因子II 包括质量比为1:1:3的黄芪多糖、香菇多糖和三七总皂苷。
本申请提供了一种无血清细胞培养基的制备方法，采用如下的技术方案：
一种无血清细胞培养基的制备方法，具体包括以下制备步骤：
取基础培养基DMEM/F12，依次加入HEPES、葡聚糖硫酸酯钠、肝素钠、促生长因子I、促生长因子II 和大豆胰酶抑制剂，搅拌均匀，并调节pH值至7.3，经滤膜过滤除菌，4℃保存待用，即得所需的无血清细胞培养基。
实施例4
本申请提供了一种无血清细胞培养基，采用如下的技术方案：
一种无血清细胞培养基，包括基础培养基和添加因子；其中，基础培养基为DMEM/F12（1:1）；添加因子包括以下终浓度的组分：HEPES 22mM、葡聚糖硫酸酯钠28μg/mL、肝素钠12μg/mL、促生长因子I 32μg/mL、促生长因子II 18μg/mL、大豆胰酶抑制剂0.13%（质量浓度）；其中，促生长因子I 包括质量比为6:1:4的柠檬酸铁、次黄嘌呤胸苷和牛磺酸；促生长因子II 包括质量比为1:1:3的黄芪多糖、香菇多糖和三七总皂苷。
本申请提供了一种无血清细胞培养基的制备方法，采用如下的技术方案：
一种无血清细胞培养基的制备方法，具体包括以下制备步骤：
取基础培养基DMEM/F12，依次加入HEPES、葡聚糖硫酸酯钠、肝素钠、促生长因子I、促生长因子II 和大豆胰酶抑制剂，搅拌均匀，并调节pH值至7.4，经滤膜过滤除菌，4℃保存待用，即得所需的无血清细胞培养基。
实施例5
本申请提供了一种无血清细胞培养基，采用如下的技术方案：
一种无血清细胞培养基，包括基础培养基和添加因子；其中，基础培养基为DMEM/F12（1:1）；添加因子包括以下终浓度的组分：HEPES 25mM、葡聚糖硫酸酯钠32μg/mL、肝素钠13μg/mL、促生长因子I 35μg/mL、促生长因子II 20μg/mL、大豆胰酶抑制剂0.15%（质量浓度）；其中，促生长因子I 包括质量比为7:1:5的柠檬酸铁、次黄嘌呤胸苷和牛磺酸；促生长因子II 包括质量比为1:1:3的黄芪多糖、香菇多糖和三七总皂苷。
本申请提供了一种无血清细胞培养基的制备方法，采用如下的技术方案：
一种无血清细胞培养基的制备方法，具体包括以下制备步骤：
取基础培养基DMEM/F12，依次加入HEPES、葡聚糖硫酸酯钠、肝素钠、促生长因子I、促生长因子II 和大豆胰酶抑制剂，搅拌均匀，并调节pH值至7.2，经滤膜过滤除菌，4℃保存待用，即得所需的无血清细胞培养基。
实施例培养基用于CHO细胞培养的试验设计：
采用常规方法复苏冻存的CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞），将其以1.0×106/T-175的细胞接种量接种至细胞培养瓶中，设置五组，分别将本申请实施例1-5中制备的无血清细胞培养基按照25mL/瓶量加入到细胞培养瓶中，置于5％CO2，37℃，190rpm的摇床中培养。每三天传代一次，连续传5代，传代前取样计数，监测活细胞数量和细胞活率，得出如下表1所示结果：（上述传代接种量始终为1.0×106/T-175）
表1 实施例1-5中培养基培养CHO细胞的细胞活率和细胞数量
| 第1代 | 起始细胞接种量/T-175 | 活率/% | 终末细胞数量/T-175 | 活率/% |
| 实施例1 | 1.0×10<sup>6</sup> | 95.73 | 1.35×10<sup>7</sup> | 95.19 |
| 实施例2 | 1.0×10<sup>6</sup> | 95.28 | 1.71×10<sup>7</sup> | 96.48 |
| 实施例3 | 1.0×10<sup>6</sup> | 98.51 | 1.84×10<sup>7</sup> | 98.50 |
| 实施例4 | 1.0×10<sup>6</sup> | 97.32 | 1.65×10<sup>7</sup> | 97.08 |
| 实施例5 | 1.0×10<sup>6</sup> | 96.47 | 1.47×10<sup>7</sup> | 96.33 |
| 第2代 | 起始细胞接种量/T-175 | 活率/% | 终末细胞数量/T-175 | 活率/% |
| 实施例1 | 1.0×10<sup>6</sup> | 95.08 | 1.27×10<sup>7</sup> | 95.05 |
| 实施例2 | 1.0×10<sup>6</sup> | 95.71 | 1.68×10<sup>7</sup> | 96.65 |
| 实施例3 | 1.0×10<sup>6</sup> | 97.19 | 1.82×10<sup>7</sup> | 97.71 |
| 实施例4 | 1.0×10<sup>6</sup> | 96.95 | 1.61×10<sup>7</sup> | 96.86 |
| 实施例5 | 1.0×10<sup>6</sup> | 96.17 | 1.45×10<sup>7</sup> | 96.21 |
| 第3代 | 起始细胞接种量/T-175 | 活率/% | 终末细胞数量/T-175 | 活率/% |
| 实施例1 | 1.0×10<sup>6</sup> | 94.92 | 1.23×10<sup>7</sup> | 95.13 |
| 实施例2 | 1.0×10<sup>6</sup> | 95.75 | 1.67×10<sup>7</sup> | 96.47 |
| 实施例3 | 1.0×10<sup>6</sup> | 97.87 | 1.78×10<sup>7</sup> | 98.36 |
| 实施例4 | 1.0×10<sup>6</sup> | 96.74 | 1.59×10<sup>7</sup> | 96.65 |
| 实施例5 | 1.0×10<sup>6</sup> | 95.90 | 1.44×10<sup>7</sup> | 95.89 |
| 第4代 | 起始细胞接种量/T-175 | 活率/% | 终末细胞数量/T-175 | 活率/% |
| 实施例1 | 1.0×10<sup>6</sup> | 94.72 | 1.19×10<sup>7</sup> | 95.30 |
| 实施例2 | 1.0×10<sup>6</sup> | 95.26 | 1.63×10<sup>7</sup> | 96.24 |
| 实施例3 | 1.0×10<sup>6</sup> | 97.53 | 1.76×10<sup>7</sup> | 97.58 |
| 实施例4 | 1.0×10<sup>6</sup> | 96.44 | 1.55×10<sup>7</sup> | 96.47 |
| 实施例5 | 1.0×10<sup>6</sup> | 95.60 | 1.42×10<sup>7</sup> | 95.68 |
| 第5代 | 起始细胞接种量/T-175 | 活率/% | 终末细胞数量/T-175 | 活率/% |
| 实施例1 | 1.0×10<sup>6</sup> | 94.55 | 1.16×10<sup>7</sup> | 95.14 |
| 实施例2 | 1.0×10<sup>6</sup> | 95.08 | 1.60×10<sup>7</sup> | 96.19 |
| 实施例3 | 1.0×10<sup>6</sup> | 97.33 | 1.73×10<sup>7</sup> | 97.29 |
| 实施例4 | 1.0×10<sup>6</sup> | 96.16 | 1.51×10<sup>7</sup> | 96.11 |
| 实施例5 | 1.0×10<sup>6</sup> | 95.54 | 1.38×10<sup>7</sup> | 95.49 |
由上述表1数据可知：本申请实施例1-5中制备的无血清细胞培养基培养CHO细胞的细胞活率高，终末细胞数量高，说明本申请培养基质量一致性好，性能均一稳定，用于细胞培养，能够显著提高细胞活力和细胞生长率。
对比例1
与实施例3的区别在于，促生长因子I 仅采用质量比5.5:1的柠檬酸铁和次黄嘌呤胸苷。
对比例2
与实施例3的区别在于，促生长因子I 仅采用牛磺酸。
对比例3
与实施例3的区别在于，促生长因子II 仅采用质量比1:1的黄芪多糖和香菇多糖。
对比例4
与实施例3的区别在于，促生长因子II 仅采用三七总皂苷。
对比例5
与实施例3的区别在于，促生长因子II 包括质量比1:1:1的黄芪多糖、香菇多糖和三七总皂苷。
对比例6
与实施例3的区别在于，促生长因子II 包括质量比1:1:4的黄芪多糖、香菇多糖和三七总皂苷。
对比例培养基用于CHO细胞培养的试验设计：
采用与实施例相同的试验设计方法，将对比例1-5中制得的无血清细胞用于培养CHO细胞，监测活细胞数量和细胞活率，得出如下表2所示结果：
表2 对比例1-5中培养基培养CHO细胞的细胞活率和细胞数量
| 第1代 | 起始细胞接种量/T-175 | 活率/% | 终末细胞数量/T-175 | 活率/% |
| 对比例1 | 1.0×10<sup>6</sup> | 92.31 | 1.72×10<sup>7</sup> | 92.79 |
| 对比例2 | 1.0×10<sup>6</sup> | 90.28 | 1.68×10<sup>7</sup> | 90.33 |
| 对比例3 | 1.0×10<sup>6</sup> | 95.56 | 9.78×10<sup>6</sup> | 95.17 |
| 对比例4 | 1.0×10<sup>6</sup> | 94.23 | 9.16×10<sup>6</sup> | 94.18 |
| 对比例5 | 1.0×10<sup>6</sup> | 96.77 | 1.02×10<sup>7</sup> | 96.57 |
| 对比例6 | 1.0×10<sup>6</sup> | 97.18 | 1.08×10<sup>7</sup> | 96.78 |
| 第2代 | 起始细胞接种量/T-175 | 活率/% | 终末细胞数量/T-175 | 活率/% |
| 对比例1 | 1.0×10<sup>6</sup> | 90.82 | 1.68×10<sup>7</sup> | 90.34 |
| 对比例2 | 1.0×10<sup>6</sup> | 88.97 | 1.65×10<sup>7</sup> | 86.98 |
| 对比例3 | 1.0×10<sup>6</sup> | 95.13 | 9.98×10<sup>6</sup> | 94.82 |
| 对比例4 | 1.0×10<sup>6</sup> | 94.05 | 8.79×10<sup>6</sup> | 93.79 |
| 对比例5 | 1.0×10<sup>6</sup> | 96.60 | 1.07×10<sup>7</sup> | 96.65 |
| 对比例6 | 1.0×10<sup>6</sup> | 97.01 | 1.10×10<sup>7</sup> | 96.88 |
| 第3代 | 起始细胞接种量/T-175 | 活率/% | 终末细胞数量/T-175 | 活率/% |
| 对比例1 | 1.0×10<sup>6</sup> | 89.45 | 1.63×10<sup>7</sup> | 88.90 |
| 对比例2 | 1.0×10<sup>6</sup> | 85.75 | 1.56×10<sup>7</sup> | 83.67 |
| 对比例3 | 1.0×10<sup>6</sup> | 94.89 | 9.72×10<sup>6</sup> | 94.13 |
| 对比例4 | 1.0×10<sup>6</sup> | 93.84 | 9.07×10<sup>6</sup> | 93.06 |
| 对比例5 | 1.0×10<sup>6</sup> | 96.09 | 1.03×10<sup>7</sup> | 95.77 |
| 对比例6 | 1.0×10<sup>6</sup> | 96.79 | 1.06×10<sup>7</sup> | 95.93 |
| 第4代 | 起始细胞接种量/T-175 | 活率/% | 终末细胞数量/T-175 | 活率/% |
| 对比例1 | 1.0×10<sup>6</sup> | 89.04 | 1.61×10<sup>7</sup> | 87.30 |
| 对比例2 | 1.0×10<sup>6</sup> | 84.62 | 1.52×10<sup>7</sup> | 84..22 |
| 对比例3 | 1.0×10<sup>6</sup> | 94.65 | 9.37×10<sup>6</sup> | 93.58 |
| 对比例4 | 1.0×10<sup>6</sup> | 93.46 | 8.68×10<sup>6</sup> | 93.07 |
| 对比例5 | 1.0×10<sup>6</sup> | 95.80 | 1.02×10<sup>7</sup> | 95.18 |
| 对比例6 | 1.0×10<sup>6</sup> | 96.35 | 1.04×10<sup>7</sup> | 95.67 |
| 第5代 | 起始细胞接种量/T-175 | 活率/% | 终末细胞数量/T-175 | 活率/% |
| 对比例1 | 1.0×10<sup>6</sup> | 88.59 | 1.56×10<sup>7</sup> | 85.74 |
| 对比例2 | 1.0×10<sup>6</sup> | 83.08 | 1.48×10<sup>7</sup> | 83.76 |
| 对比例3 | 1.0×10<sup>6</sup> | 94.21 | 9.67×10<sup>6</sup> | 93.92 |
| 对比例4 | 1.0×10<sup>6</sup> | 93.18 | 8.95×10<sup>6</sup> | 92.57 |
| 对比例5 | 1.0×10<sup>6</sup> | 95.44 | 1.09×10<sup>7</sup> | 95.11 |
| 对比例6 | 1.0×10<sup>6</sup> | 96.12 | 1.13×10<sup>7</sup> | 95.85 |
由上述表2数据可知：对比例1-2与本申请实施例3的区别仅在于，促生长因子I的选用不同；对比例1-2制得的无血清细胞培养基用于培养CHO细胞，最终的细胞活率均较实施例3有大幅的下降，且经过传代后的细胞活率较传代前也有下降，细胞传代稳定性差；
对比例3-6与本申请实施例3的区别仅在于，促生长因子II的选用不同；对比例3-6制得的无血清细胞培养基用于培养CHO细胞，最终的细胞终末数量均较实施例3有大幅的下降。
由对比例1-2与实施例3的区别可知：本申请采用柠檬酸铁、次黄嘌呤胸苷和牛磺酸三者复配作为促生长因子I，其用于添加制备获得的无血清细胞培养基，能够大大提高细胞活率和细胞传代稳定性。
由对比例3-6与实施例3的区别可知：本申请采用黄芪多糖、香菇多糖和三七总皂苷复配作为促生长因子II，且黄芪多糖、香菇多糖和三七总皂苷的质量比为1:1:3时，其用于添加制备获得的无血清细胞培养基，能够大大提高细胞增殖分化能力。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (9)
1.一种无血清细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加因子，所述添加因子包括以下终浓度的组分：HEPES 12-25mM、葡聚糖硫酸酯钠18-32μg/mL、肝素钠4-13μg/mL、促生长因子I 16-35μg/mL、促生长因子II 8-20μg/mL、大豆胰酶抑制剂0.07-0.15%（质量浓度）。
2.根据权利要求1所述的无血清细胞培养基，其特征在于，所述添加因子包括以下终浓度的组分：HEPES 15-22mM、葡聚糖硫酸酯钠20-28μg/mL、肝素钠8-12μg/mL、促生长因子I20-32μg/mL、促生长因子II 10-18μg/mL、大豆胰酶抑制剂0.09-0.13%（质量浓度）。
3.根据权利要求1所述的无血清细胞培养基，其特征在于，所述添加因子包括以下终浓度的组分：HEPES 18mM、葡聚糖硫酸酯钠25μg/mL、肝素钠10μg/mL、促生长因子I 28μg/mL、促生长因子II 16μg/mL、大豆胰酶抑制剂0.12%（质量浓度）。
4.根据权利要求1所述的无血清细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12（1:1）。
5.根据权利要求1所述的无血清细胞培养基，其特征在于，所述促生长因子I 包括质量比为4-7:1:2-5的柠檬酸铁、次黄嘌呤胸苷和牛磺酸。
6.根据权利要求1所述的无血清细胞培养基，其特征在于，所述促生长因子II 包括质量比为1:1:3的黄芪多糖、香菇多糖和三七总皂苷。
7.一种根据权利要求1-6任一项所述的无血清细胞培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取基础培养基DMEM/F12，依次加入HEPES、葡聚糖硫酸酯钠、肝素钠、促生长因子I、促生长因子II 和大豆胰酶抑制剂，搅拌均匀并调节pH值，经滤膜过滤除菌，即得所需的无血清细胞培养基。
8.一种根据权利要求1-6任一项所述的无血清细胞培养基的用途，其特征在于，所述无血清细胞培养基用于CHO细胞的培养。
9.根据权利要求8所述的无血清细胞培养基的用途，其特征在于，所述无血清细胞培养基培养的CHO细胞用于单抗、双抗、融合蛋白、重组蛋白类生物药的制备。
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