CN112410280B - 一种用于pk15细胞培养的无血清培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于PK15细胞培养的无血清培养基，包含无血清基础培养基和添加物，所述添加物为KGF活性短肽（氨基酸序列为KGHLLMF）和花生蛋白酶解物。所述添加物可显著促进悬浮培养PK15细胞的生长、高存活率以及保持培养的猪圆环病毒高滴度。本发明所述培养基可实现PK15细胞全悬浮无血清培养，且无需微载体，即可以实现大规模高密度培养，使用所述培养基可获得高滴度的猪圆环病毒。

Description

一种用于PK15细胞培养的无血清培养基及其应用
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，更特别地，涉及一种用于PK15细胞培养的无血清培养基及其应用。
背景技术
猪肾上皮细胞（Porcine Kidney，PK15细胞）属于上皮样细胞，可以连续传代。PK15细胞体外培养呈上皮样贴壁细胞，该细胞对多种病毒比较敏感，如猪圆环病毒 (PCV)、猪瘟病毒 (CSFV)、猪细小病毒 (PPV) 等，可应用于猪圆环病毒疫苗、猪瘟病毒疫苗、猪细小病毒疫苗等的制备。
PK15细胞通常用于生产猪圆环灭活疫苗，猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)在分类上属圆环病毒科、圆环病毒属。PCV不凝集牛、羊、猪、鸡等多种动物和人的红细胞，其抗血清不能抑制猪细小病毒 (PPV)对红细胞的凝集性。在临床上主要表现为断奶后仔猪多系统衰弱综合症 (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS) 和猪皮炎与肾炎综合征 (PDNS)。除 PMWS 外，PDNS、PNP(增生性坏死性肺炎)、PRDC(猪呼吸道疾病综合征)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等相关的猪病，死亡率10％～30％不等，较严重的猪场在暴发时死淘率高达 40％，给养猪业造成严重的经济损失。
目前对于PK-15细胞的传统培养方式是贴壁培养，通常在生长及维持培养基中需要加入10％-20％的动物血清，以提供细胞生长所需的营养成分及细胞保持正常形态的支持蛋白。现使用PK15细胞生产猪圆环病毒大多采用滚瓶培养，细胞扩增阶段使用8%-10%牛血清，达到一定细胞密度后接毒，采用1%-2%的低血清培养基维持培养或连续传代培养。类似工艺的弊端是多方面的：
（1）.培养阶段血清浓度高，细胞培养结果容易有批间差异；
（2）含血清工艺可能带来外源病毒、支原体污染等安全问题，因此对于血清质量要求更高；
（3）.培养过程需要复杂的消化过程，即使采用微载体培养，因为细胞消化及重新均匀贴壁，球转球有较大难度。；
（4）.目前全球血清供应趋紧，这大大影响了疫苗企业的生产效率。因此尽量少用血清或者不用血清已成为 PK-15 细胞培养的发展趋势。
低血清与无血清细胞培养技术的研究与应用已被列入国家科技支撑计划重点项目。 2010年以后，美国、欧盟和日本等国家逐渐停止在生物制药中应用血清，FDA也停止 含血清细胞培养工艺生产的生物技术新药的申报受理。
相对于动物细胞贴壁培养而言，单个细胞悬浮培养具有细胞生长均一性好、传质效率高、容易实现规模放大和过程控制的特点。哺乳动物细胞的悬浮培养己成为目前动物细胞培养的理想模式和动物细胞表达产品工业化生产的首要选择，超过80%的哺乳动物细胞表达生物技术药物采用动物细胞悬浮培养为其生产工艺。对于PK15细胞悬浮培养而言，要在规模化的培养中获取好的培养结果，设计出适宜细胞悬浮生长的培养基是至关重要的。
开发PK15细胞无血清无微载体悬浮培养工艺以及相应培养基有极其重要的意义。现有技术中，用于培养PK15细胞的培养基，绝大部分为有血清培养基，目前主要用于PK15细胞的贴壁培养，比如转瓶或微载体培养工艺中。血清的批间差异，造成转瓶和微载体生产的疫苗在细胞质量、病毒产量和滴度方面产生较大的批间差异，而且血清的动物源性也带来了外源病毒污染的高风险性。
已有文献（“合成角质细胞生长因子活性短肽促进表皮细胞增殖的实验研究”，宗宪磊 等，2016年2月）公开，来源于角质细胞生长因子（Keratinocyte growth factor，KGF）的活性短肽KGF 7肽，其氨基酸序列为KGHLLMF（Lys-Gly-His-Leu-Leu-Met-Phe）。KGF 7肽能够与表皮细胞上的特异性受体 KGFR相结合，并增强 KGFR的表达，对表皮细胞具有增殖作用。但是并没有研究表明其对PK15细胞具有作用，更没有公开或教导该活性短肽对感染PK15细胞的病毒滴度具有提高作用。
CN109628378A（公开日期2019年4月16日）公开利用花生蛋白酶解物代替谷氨酰胺，用于重组中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞的体外培养方法，以提高TNK-tPA的产量。在20天的培养周期内，TNK-tPA的表达、分泌水平可以达到400mg/L，将TNK-tPA的终产量提高了5倍以上。但没有现有技术将花生蛋白酶解物用于PK15细胞培养。
综上所述，本领域存在提供一种更好的无血清PK15细胞培养基的普遍诉求，来解决上述问题，实现PK15细胞大规模高密度培养，使用该培养基来生产猪圆环病毒。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种无血清PK15细胞培养基及其应用。
在本发明的一方面，提供了一种用于PK15细胞培养的无血清培养基，包含无血清基础培养基和添加物，按所述无血清培养基的总体积计，所述添加物包含如下成分：
KGF活性短肽，其氨基酸序列为KGHLLMF（Lys-Gly-His-Leu-Leu-Met-Phe），浓度为0.5-1 ng/mL；
花生蛋白酶解物，其水解度大于50%，浓度为1.0-4.0mg/ml；
所述用于PK15细胞培养的无血清培养基可实现PK15细胞全悬浮无血清培养，且无需微载体，即可以实现大规模高密度培养，使用所述培养基可获得高滴度的猪圆环病毒。
在一个优选实施方案中，所述无血清基础培养基的成分包括：氯化铝、乙酸钡、生物素、氯化镉、泛酸钙、氯化胆碱、氯化钴、氯化铜、葡萄糖、乙醇胺、硝酸铁九水合物、叶酸、谷胱甘肽、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、肌醇、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、盐酸组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、氯化镁、氯化锰、烟酰胺、Pluronic F68、氯化钾、碘化钾、腐胺、硫胺素、维生素B2、氯化铷、氯化钠、氟化钠、偏硅酸钠、磷酸氢二钠、丙酮酸钠、精胺、维生素B1、维生素B12、氯化锌和氯化锆。
各成分的具体信息如下：
名称 CAS NO MW
氯化铝 7446-70-0 133.34
乙酸钡 543-80-6 197.38
生物素 58-85-5 244.31
氯化镉 7790-78-5 201.33
泛酸钙 63409-48-3 476.53
氯化胆碱 67-48-1 139.62
氯化钴 7791-13-1 237.93
氯化铜 10125-13-0 170.48
葡萄糖 50-99-7 180.16
乙醇胺 141-43-5 61.08
硝酸铁(III) 九水合物 7782-61-8 403.99
叶酸 59-30-3 441.39
谷胱甘肽 70-18-8 307.32
4-羟乙基哌嗪乙磺酸 7365-45-9 238.3
肌醇 87-89-8 180.15
精氨酸 74-79-3 174.2
天冬酰胺 70-47-3 132.12
天冬氨酸 56-84-8 133.1
半胱氨酸 52-90-4 121.15
谷氨酸 56-86-0 147.13
盐酸组氨酸 5934-29-2 209.63
羟脯氨酸 51-35-4 131.13
异亮氨酸 131598-62-4 131.17
亮氨酸 26782-71-8 131.17
赖氨酸 56-87-1 146.19
蛋氨酸 63-68-3 149.21
苯丙氨酸 63-91-2 165.18
脯氨酸 147-85-3 115.13
丝氨酸 56-45-1 105.09
苏氨酸 72-19-5 119.12
色氨酸 73-22-3 204.22
酪氨酸 60-18-4 181.19
缬氨酸 72-18-4 117.75
氯化镁 7786-30-3 95.21
氯化锰 13446-34-9 197.9
烟酰胺 98-92-0 122.12
Pluronic F68 9003-11-6 102.13
氯化钾 7447-40-7 74.55
碘化钾 7681-11-0 166
腐胺 110-60-1 88.15
硫胺素 70-16-6 265.35
维生素B2 83-88-5 376.36
氯化铷 7791-11-9 120.92
氯化钠 7647-14-5 58.44
氟化钠 7681-49-4 41.99
偏硅酸钠 6834-92-0 122.06
磷酸氢二钠 7558-79-4 141.96
丙酮酸钠 113-24-6 110.04
精胺 306-67-2 348.18
维生素B1 59-43-8 300.81
维生素B12 68-19-9 1355.37
氯化锌 7646-85-7 136.28
氯化锆 10026-11-6 233.03
在一个优选实施方案中，所述无血清基础培养基包括如下组分：各组分按终浓度 计，单位为g/L，
组分名称 单位 g/L
氯化铝 2.45E-08～1.28E-05
乙酸钡 1.76E-08～8.15E-06
生物素 1.16E-05～2.46E-04
氯化镉 1.16E-07～7.46E-05
泛酸钙 0.00065～0.012
氯化胆碱 0.0021～0.025
氯化钴 1.80E-08～7.67E-06
氯化铜 2.98E-06～4.60E-04
葡萄糖 2～8
乙醇胺 0.003～0.011
硝酸铁(III) 九水合物 4.54E-06～6.34E-04
叶酸 0.0014～0.054
谷胱甘肽 0.0013～0.012
4-羟乙基哌嗪乙磺酸 0.824～1.451
肌醇 0.0025～0.0163
精氨酸 0.162～0.851
天冬酰胺 0.389～1.13
天冬氨酸 0.051～0.345
半胱氨酸 0.022～0.11
谷氨酸 0.051～0.55
盐酸组氨酸 0.018～0.23
羟脯氨酸 0.025～0.0252
异亮氨酸 0.045～0.732
亮氨酸 0.045～0.845
赖氨酸 0.034～0.732
蛋氨酸 0.022～0.11
苯丙氨酸 0.025～0.0252
脯氨酸 0.045～0.732
丝氨酸 0.051～0.545
苏氨酸 0.051～0.55
色氨酸 0.051～0.55
酪氨酸 0.062～0.623
缬氨酸 0.051～0.55
氯化镁 0.042～0.152
氯化锰 7.6E-08～8.15E-06
烟酰胺 0.00043～0.0098
Pluronic F68 0.056～0.834
氯化钾 0.213～0.734
碘化钾 2.32E-08～3.50E-06
腐胺 1.65E-05～3.67E-02
硫胺素 1.48E-04～8.31E-03
维生素B2 1.24E-05～2.35E-04
氯化铷 3.27E-08～2.54E-05
氯化钠 1.524～5.441
氟化钠 2.67E-08～1.54E-05
偏硅酸钠 1.27E-06～5.47E-03
磷酸氢二钠 0.031～0.523
丙酮酸钠 0.023～0.453
精胺 0.00013～0.0085
维生素B1 0.00046～0.015
维生素B12 0.0002～0.008
氯化锌 1.28E-05～2.15E-03
氯化锆 2.32E-08～1.21E-05
在一个优选实施方案中，所述无血清基础培养基包括如下组分：各组分按终浓度 计，单位为g/L:
组分名称 单位 g/L
氯化铝 1.5E-06
乙酸钡 5.0E-07
生物素 8.6E-05
氯化镉 5.7E-06
泛酸钙 0.0052
氯化胆碱 0.012
氯化钴 6.92E-07
氯化铜 3.21E-05
葡萄糖 5
乙醇胺 0.009
硝酸铁(III) 九水合物 5.98E-05
叶酸 0.020
谷胱甘肽 0.008
4-羟乙基哌嗪乙磺酸 1.201
肌醇 0.0085
精氨酸 0.521
天冬酰胺 0.856
天冬氨酸 0.102
半胱氨酸 0.088
谷氨酸 0.19
盐酸组氨酸 0.12
羟脯氨酸 0.0251
异亮氨酸 0.162
亮氨酸 0.235
赖氨酸 0.126
蛋氨酸 0.074
苯丙氨酸 0.0251
脯氨酸 0.098
丝氨酸 0.321
苏氨酸 0.102
色氨酸 0.203
酪氨酸 0.239
缬氨酸 0.214
氯化镁 0.098
氯化锰 4.36E-07
烟酰胺 0.0012
Pluronic F68 0.236
氯化钾 0.521
碘化钾 6.50E-07
腐胺 4.85E-04
硫胺素 1.2E-03
维生素B2 8.23E-04
氯化铷 8.23E-06
氯化钠 3.589
氟化钠 5.23E-06
偏硅酸钠 2.98E-05
磷酸氢二钠 0.125
丙酮酸钠 0.258
精胺 0.0021
维生素B1 0.005
维生素B12 0.001
氯化锌 8.12E-04
氯化锆 5.47E-06
在一个优选实施方案中，所述花生蛋白酶解物由下述方法制得：(1)脱脂花生在中性条件下，由中性蛋白酶水解，获得中性蛋白水解物；(2)将中性蛋白水解物在碱性条件下，由碱性蛋白酶二次水解，经过超滤、脱盐、冷冻干燥获得花生蛋白酶解物。
在一个优选实施方案中，所述KGF活性短肽由人工合成或微生物重组表达获得。
在本发明的一方面，提供了一种用于PK15细胞培养的无血清培养基的制备方法，将各组分溶于水，混合均匀，将制备获得的培养基过0.22um滤膜滤过除菌。
在本发明的一方面，提供本发明所述用于PK15细胞培养的无血清培养基在PK15细胞悬浮培养中的用途。
在一个优选实施方案中，所述细胞悬浮培养不采用微载体。
在本发明的一方面，提供一种产品，包括本发明所述用于PK15细胞培养的无血清培养基以及悬浮培养于所述培养基中的PK15细胞。
在本发明的一方面，提供本发明所述用于PK15细胞培养的无血清培养基在生产猪圆环病毒中的用途。
在本发明的一方面，提供一种提高猪圆环病毒滴度的方法，猪圆环病毒感染PK15细胞，采用如上所述的任一一种方案的培养基对感染后PK15细胞悬浮培养。
本发明的有益效果：
（1）创新性地在无血清基础培养基中添加 KGF活性短肽和花生蛋白酶解物，可显著促进悬浮培养PK15细胞的生长、存活以及保持培养的猪圆环病毒高滴度；
（2）本发明所述培养基可用于PK15细胞的全悬浮无血清培养，且无需微载体，即可以实现大规模高密度培养以及高存活率，即便在感染猪圆环病毒，仍然具有上述效果；
（3）本发明提供的用于PK15细胞培养的无血清培养基成分简单、低成本、易于配制；
（4）本发明所述培养基可用于猪圆环病毒生产，可显著提高、保持病毒滴度；
（5）通过对比实验可知，培养基中KGF活性短肽组分具有提高病毒滴度作用。
附图说明
图1 为筛选得到的无血清培养基悬浮培养PK15细胞的显微镜图。
图2为表2的PK15活细胞密度变化趋势(106细胞/ mL)。
图3为表3的PK15细胞存活率变化趋势(％)。
图4 为采用实验例3的培养基培养PK15细胞第3天的显微镜图。
图5为表4的感染猪圆环病毒2型的PK15活细胞密度变化趋势(106细胞/ mL)。
图6为表5感染猪圆环病毒2型的PK15细胞存活率变化趋势(％)。
图7 为采用实验例3的培养基培养感染猪圆环病毒的PK15细胞第3天显微镜图。
图8为表6的PK15细胞悬浮培养的猪圆环病毒2型的病毒滴度（Log10 TCID50/mL）。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1、筛选培养基
本发明针对一个从ATCC来源清晰的PK15细胞（PK15细胞保藏编号：ATCC CCL-33）进行个性化无血清培养基开发，以实现无血清无微载体悬浮培养PK15细胞。实验分两个阶段进行：低血清无微载体贴壁培养驯化（阶段I）和无血清无微载体悬浮培养驯化（阶段II）。
阶段I：将在10%血清中贴壁培养的细胞逐步适应到低血清培养基中，逐步降低血清浓度，比如按10%→5%→2%→1%→0.5%血清的方案，进行悬浮无微载体细胞培养驯化；设计不同的培养基，在方瓶中逐步降低血清浓度，一旦细胞在低血清条件下正常生长，建立适量的研究细胞库；在血清浓度降到0.5%时，细胞开始在摇瓶悬浮培养（无微载体），同时进一步降低血清浓度；在低血清阶段进行批次培养考察细胞生长曲线，同时测试低血清培养的PK15细胞对于病毒增殖的效果。
阶段II：采用适应于0.5%血清的PK15细胞，降低血清浓度到完全无血清的方案；优化培养基配方以促进细胞在无血清无微载体悬浮条件下生长，在方瓶中逐步降低血清浓度，并在不同阶段尝试将细胞在摇瓶悬浮培养，一旦细胞在无血清条件下正常生长，建立适量的研究细胞库，进行批次培养研究细胞生长曲线（倍增时间、最高密度和活率），同时测试无血清培养的PK15细胞对于病毒增殖的效果。
筛选获得的最终无血清培养基包含无血清基础培养基和添加物，添加物为KGF活性短肽和花生蛋白酶解物。所述无血清基础培养基的成分包括：氯化铝、乙酸钡、生物素、氯化镉、泛酸钙、氯化胆碱、氯化钴、氯化铜、葡萄糖、乙醇胺、硝酸铁九水合物、叶酸、谷胱甘肽、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、肌醇、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、盐酸组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、氯化镁、氯化锰、烟酰胺、Pluronic F68、氯化钾、碘化钾、腐胺、硫胺素、维生素B2、氯化铷、氯化钠、氟化钠、偏硅酸钠、磷酸氢二钠、丙酮酸钠、精胺、维生素B1、维生素B12、氯化锌和氯化锆。
培养基中各组分均可从Sigma，GIBCO公司等处购买获得。
KGF 活性短肽：其氨基酸序列为KGHLLMF（Lys-Gly-His-Leu-Leu-Met-Phe）。可在商业化生物公司进行合成或重组表达获得，制备成冻干粉，-20℃保存。使用时用水溶解。
所述花生蛋白酶解物由下述方法制得：(1) 脱脂花生在中性条件下，由中性蛋白酶水解，获得中性蛋白水解物；（2）将中性蛋白水解物在碱性条件下，由碱性蛋白酶二次水解，经过超滤、脱盐、冷冻干燥获得花生蛋白酶解物。所述中性条件为pH 6 .5-7.5。所述碱性条件为pH 7.5-8.5。其水解度大于50%。花生蛋白酶解物具体制备方法可从专利文献（CN109628378A，公开日期20190416），该专利文献全文引入本发明。
采用适当浓度的、最终筛选得到的所述无血清培养基将贴壁PK15细胞逐渐成功驯化成悬浮PK15细胞，如图1所示。
实施例2、培养基的制备
配制3种不同浓度配比的本发明用于PK15细胞培养的无血清培养基，将各组分溶于水，混合均匀，其各组分终浓度如下表1所示，将制备获得的培养基过0.22um滤膜滤过除菌。
表1 本发明使用的用于PK15细胞培养的无血清培养基实验例
组分，单位 g/L 实验例1 实验例2 实验例3
KGF活性短肽 0.5E-03 0.8E-03 1.0E-03
花生蛋白酶解物 1.0 3.0 4.0
氯化铝 2.45E-08 1.5E-06 1.28E-05
乙酸钡 1.76E-08 5.0E-07 8.15E-06
生物素 1.16E-05 8.6E-05 2.46E-04
氯化镉 1.16E-07 5.7E-06 7.46E-05
泛酸钙 0.00065 0.0052 0.012
氯化胆碱 0.0021 0.012 0.025
氯化钴 1.80E-08 6.92E-07 7.67E-06
氯化铜 2.98E-06 3.21E-05 4.60E-04
葡萄糖 2 5 8
乙醇胺 0.003 0.009 0.011
硝酸铁(III) 九水合物 4.54E-06 5.98E-05 6.34E-04
叶酸 0.0014 0.020 0.054
谷胱甘肽 0.0013 0.008 0.012
4-羟乙基哌嗪乙磺酸 0.824 1.201 1.451
肌醇 0.0025 0.0085 0.0163
精氨酸 0.162 0.521 0.851
天冬酰胺 0.389 0.856 1.13
天冬氨酸 0.051 0.102 0.345
半胱氨酸 0.022 0.088 0.11
谷氨酸 0.051 0.19 0.55
盐酸组氨酸 0.018 0.12 0.23
羟脯氨酸 0.025 0.0251 0.0252
异亮氨酸 0.045 0.162 0.732
亮氨酸 0.045 0.235 0.845
赖氨酸 0.034 0.126 0.732
蛋氨酸 0.022 0.074 0.11
苯丙氨酸 0.025 0.0251 0.0252
脯氨酸 0.045 0.098 0.732
丝氨酸 0.051 0.321 0.545
苏氨酸 0.051 0.102 0.55
色氨酸 0.051 0.203 0.55
酪氨酸 0.062 0.239 0.623
缬氨酸 0.051 0.214 0.55
氯化镁 0.042 0.098 0.152
氯化锰 7.6E-08 4.36E-07 8.15E-06
烟酰胺 0.00043 0.0012 0.0098
Pluronic F68 0.056 0.236 0.834
氯化钾 0.213 0.521 0.734
碘化钾 2.32E-08 6.50E-07 3.50E-06
腐胺 1.65E-05 4.85E-04 3.67E-02
硫胺素 1.48E-04 1.2E-03 8.31E-03
维生素B2 1.24E-05 8.23E-04 2.35E-04
氯化铷 3.27E-08 8.23E-06 2.54E-05
氯化钠 1.524 3.589 5.441
氟化钠 2.67E-08 5.23E-06 1.54E-05
偏硅酸钠 1.27E-06 2.98E-05 5.47E-03
磷酸氢二钠 0.031 0.125 0.523
丙酮酸钠 0.023 0.258 0.453
精胺 0.00013 0.0021 0.0085
维生素B1 0.00046 0.005 0.015
维生素B12 0.0002 0.001 0.008
氯化锌 1.28E-05 8.12E-04 2.15E-03
氯化锆 2.32E-08 5.47E-06 1.21E-05
对比例1：市售Gibco公司的 OptiMEM 低血清培养基，不额外添加血清；
对比例2：实验例3去除KGF活性短肽和花生蛋白酶解物，其他组分、浓度与实验例3相同；
对比例3：实验例3去除KGF活性短肽，其他组分、浓度与实验例3相同。
实施例3、采用本发明所述培养基悬浮培养PK15细胞
将驯化得到的悬浮PK15细胞，分别采用实验例1、实验例2、实验例3、对比例1、对比例2的培养基，以1.0x106cells/mL的密度接种于125mL的摇瓶中，工作体积30mL，转速设定130rpm，温度设置为37℃，溶解氧浓度控制在30-50%，pH控制在7.1-7.2，每天适当补充培养基。每天取样，用血球计数板点样计数细胞，每样计数3次，取平均值，用台盼蓝拒染法确定细胞的存活率。整个培养过程持续5d。使用上述5种培养基的不同结果如下表2、表3以及图2、图3：
表2 PK15活细胞密度变化趋势(106/mL)
培养时间/天 实验例1 实验例2 实验例3 对比例1 对比例2
1 1.1 1.2 1.5 1.0 1.1
2 2.5 3.2 3.6 2.0 2.2
3 9.6 10.6 12.6 8.5 8.8
4 20.1 23.5 28.6 15.3 18.3
5 40.5 48.9 55.3 32.9 35.3
表3 PK15细胞活性变化趋势(％)
培养时间/天 实验例1 实验例2 实验例3 对比例1 对比例2
1 99.1 99.3 99.4 98.3 98.6
2 98.5 99.0 99.3 97.2 97.5
3 97.5 97.8 98.2 93.3 95.0
4 94.1 95.9 96.5 89.6 90.1
5 93.2 94.5 96.0 86.2 87.2
表2和图2的结果表明，悬浮培养PK15细胞，培养1-5天细胞密度逐渐增高。实验例3的培养基效果最佳，培养第5天达到55.3×106/mL，实验例1、2分别为40.5×106/mL、48.9×106/mL，相对于与商业化的无血清培养基对比例1（32.9×106/mL）和去除KGF活性短肽和花生蛋白酶解物的对比例2（35.3×106/mL），实验例1-3的细胞密度要远远高于对比例1-2。通过图2可知，在培养的1-5天中，对比例1、2的生长曲线一直低于实验例1-3。可见，在细胞生长、密度方面，本发明的PK15细胞无血清培养基显著优于商业化的无血清培养基，且其中的KGF活性短肽和花生蛋白酶解物具有促进PK15细胞生长的作用。
表3和图3的结果表明，在培养的1-5天，实验例1、实验例2、实验例3的细胞存活率一直高于90%，到达第5天，仍可以分别达到93.2%、94.5%、96.0%的高存活率。而对比例1-2在培养的第5天，存活率下降至90%以下，分别为86.2%、87.2%，尤其是对比例1，在培养的第4天，存活率即已下降至90%以下。可见，在细胞存活方面，本发明的PK15细胞无血清培养基显著优于商业化的无血清培养基，且添加有KGF活性短肽和花生蛋白酶解物的实验例1-3效果要明显优于不添加的对比例2，可见KGF活性短肽和花生蛋白酶解物组分具有提高PK15细胞悬浮培养存活率的作用。
本实验还给出了采用实验例3的培养基，PK15细胞培养第3天的显微镜图，如图4所示，表明细胞生长良好。
同样的实验条件下，第1天按照0.1的感染复数（Multiplicity of Infection，MOI）接毒量加入猪圆环病毒2型SH株（本发明所用猪圆环病毒 2 型 SH 株 (PorcineCircovirus Type 2，strain SH)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期 ：2008 年 3 月 4 日，保 藏号为 CGMCC No.2389，公开于中国专利CN101240264A）。使用上述5种培养基的不同结果如下表4、表5以及图5、图6。
表4 感染猪圆环病毒2型的PK15细胞活细胞密度变化趋势(106/mL)
培养时间/天 实验例1 实验例2 实验例3 对比例1 对比例2
1 0.8 0.8 0.9 0.6 0.7
2 0.7 0.75 0.85 0.4 0.5
3 1.0 1.1 1.3 0.5 0.8
4 2.9 3.7 5.6 1.0 1.5
5 12.0 15.8 19.5 2.3 9.1
表5感染猪圆环病毒2型的PK15细胞活性变化趋势(％)
培养时间/天 实验例1 实验例2 实验例3 对比例1 对比例2
1 97.5 98.1 98.6 97.0 97.2
2 90.2 91.2 94.3 85.2 88.2
3 86.5 87.6 90.2 80.0 82.1
4 85.2 86.5 88.2 75.2 80.2
5 84.2 85.6 86.3 70.2 79.5
表4和图5的结果表明，在感染猪圆环病毒后，悬浮培养PK15细胞，在培养的第1-2天，细胞密度略有下降，从第3天开始，细胞密度开始增高。其中实验例3的培养基效果最佳，在培养的1-2天细胞密度下降的最少，最低降至0.85×106/mL，实验例1、2分别为0.7×106/mL、0.75×106/mL，而对比例1、2已降至0.4×106/mL、0.5×106/mL，对比例1下降的要更明显。在培养的第5天，实验例3细胞密度最高，为19.5×106/mL，实验例1、2分别为12.0×106/mL、15.8×106/mL，对比例1、2分别为2.3×106/mL、9.1×106/mL。可见，在细胞生长、密度方面，即便在感染猪圆环病毒后，本发明的PK15细胞无血清培养基显著优于商业化的无血清培养基，且本发明培养基中的KGF活性短肽和花生蛋白酶解物具有促进PK15细胞生长的作用。
表5和图6的结果表明，在感染猪圆环病毒后，细胞的存活率相对于不感染的表3结果，有所下降。但采用本发明的培养基，仍然获得了较好的结果。实验例1-3在培养的第5天，存活率分别为84.2%、85.6%、86.3%。而对比例1-2已经降低至80%以下。可见，在细胞存活方面，即便在感染猪圆环病毒情况下，本发明的PK15细胞无血清培养基显著优于商业化的无血清培养基，且添加有KGF活性短肽和花生蛋白酶解物的实验例1-3效果要明显好于不添加的对比例2，可见KGF活性短肽和花生蛋白酶解物组分具有提高PK15细胞悬浮培养存活率的作用。
本实验还给出了采用实验例3的培养基，感染后PK15细胞培养第3天的显微镜图，如图7所示，表明即便在负载了猪圆环病毒后，采用本发明培养基悬浮培养的PK15细胞生长仍然良好。
实施例4、采用本发明所述培养基悬浮培养PK15细胞提高猪圆环病毒滴度
将驯化得到的悬浮PK15细胞，分别采用实验例1、实验例2、实验例3、对比例1、对比例2、对比例3的培养基，以1.0x106cells/mL的密度接种于125mL的摇瓶中，按照0.1MOI接毒量加入猪圆环病毒2型SH株。工作体积30mL，转速设定130rpm，温度设置为37℃，溶解氧浓度控制在30-50%，pH控制在7.1-7.2，每天适当补充培养基。整个培养过程持续5d。细胞带毒连续传代，每天取样，采用间接免疫荧光法测定病毒滴度TCID50。使用上述5种培养基的不同结果如下表6以及图8：
表6猪圆环病毒2型的病毒滴度(Log10 TCID50/mL)
培养时间/天 实验例1 实验例2 实验例3 对比例1 对比例2 对比例3
1 7.3 7.5 7.6 7.0 6.9 7.0
2 7.4 7.6 7.9 6.8 7.2 7.2
3 7.6 7.9 8.0 6.7 6.9 7.0
4 7.7 8.0 8.1 6.5 6.8 6.7
5 7.8 8.0 8.2 6.4 6.6 6.6
表6以及图8的结果表明，采用本发明的无血清培养基（即实验例1-3）悬浮培养PK15细胞的1-5天，获得的猪圆环病毒的病毒滴度一直有所增加，且均在107.0 TCID50以上，实验例3效果最好，可达到108.2 TCID50。而对比例1、2、3在培养的5天过程中病毒滴度始终低于实验例1-3。可见，在采用PK15细胞悬浮培养猪圆环病毒滴度方面，本发明的培养基显著优于商业化的无血清培养基，且添加有KGF活性短肽和花生蛋白酶解物的实验例1-3效果要好于对比例2、对比例3。可见，KGF活性短肽和花生蛋白酶解物组分具有保持PK15细胞悬浮培养猪圆环病毒高滴度的作用，且对比例2、3效果近似，由此可推知，KGF活性短肽和花生蛋白酶解物中对提高病毒滴度起主要作用的是KGF活性短肽。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属本发明技术方案的保护范围。

Claims (13)

1.一种用于PK15细胞培养的无血清培养基在PK15细胞悬浮培养中的用途，其特征在于，所述用于PK15细胞培养的无血清培养基包含无血清基础培养基和添加物，按所述无血清培养基的总体积计，所述添加物包含如下成分： KGF活性短肽，其氨基酸序列为KGHLLMF（Lys-Gly-His-Leu-Leu-Met-Phe），浓度为0.5-1 ng/mL；以及花生蛋白酶解物，其水解度大于50%，浓度为1.0-4.0mg/ml，
其中，所述花生蛋白酶解物由下述方法制得：(1)脱脂花生在中性条件下，由中性蛋白酶水解，获得中性蛋白水解物；(2)将中性蛋白水解物在碱性条件下，由碱性蛋白酶二次水解，经过超滤、脱盐、冷冻干燥获得花生蛋白酶解物。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述无血清基础培养基的成分包括：氯化铝、乙酸钡、生物素、氯化镉、泛酸钙、氯化胆碱、氯化钴、氯化铜、葡萄糖、乙醇胺、硝酸铁九水合物、叶酸、谷胱甘肽、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、肌醇、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、盐酸组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、氯化镁、氯化锰、烟酰胺、Pluronic F68、氯化钾、碘化钾、腐胺、硫胺素、维生素B2、氯化铷、氯化钠、氟化钠、偏硅酸钠、磷酸氢二钠、丙酮酸钠、精胺、维生素B1、维生素B12、氯化锌和氯化锆。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述无血清基础培养基包括如下组分：各组分按终浓度计，单位为g/L，
组分名称 单位 g/L 氯化铝 2.45E-08～1.28E-05 乙酸钡 1.76E-08～8.15E-06 生物素 1.16E-05～2.46E-04 氯化镉 1.16E-07～7.46E-05 泛酸钙 0.00065～0.012 氯化胆碱 0.0021～0.025 氯化钴 1.80E-08～7.67E-06 氯化铜 2.98E-06～4.60E-04 葡萄糖 2～8 乙醇胺 0.003～0.011 硝酸铁(III) 九水合物 4.54E-06～6.34E-04 叶酸 0.0014～0.054 谷胱甘肽 0.0013～0.012 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 0.824～1.451 肌醇 0.0025～0.0163 精氨酸 0.162～0.851 天冬酰胺 0.389～1.13 天冬氨酸 0.051～0.345 半胱氨酸 0.022～0.11 谷氨酸 0.051～0.55 盐酸组氨酸 0.018～0.23 羟脯氨酸 0.025～0.0252 异亮氨酸 0.045～0.732 亮氨酸 0.045～0.845 赖氨酸 0.034～0.732 蛋氨酸 0.022～0.11 苯丙氨酸 0.025～0.0252 脯氨酸 0.045～0.732 丝氨酸 0.051～0.545 苏氨酸 0.051～0.55 色氨酸 0.051～0.55 酪氨酸 0.062～0.623 缬氨酸 0.051～0.55 氯化镁 0.042～0.152 氯化锰 7.6E-08～8.15E-06 烟酰胺 0.00043～0.0098 Pluronic F68 0.056～0.834 氯化钾 0.213～0.734 碘化钾 2.32E-08～3.50E-06 腐胺 1.65E-05～3.67E-02 硫胺素 1.48E-04～8.31E-03 维生素B2 1.24E-05～2.35E-04 氯化铷 3.27E-08～2.54E-05 氯化钠 1.524～5.441 氟化钠 2.67E-08～1.54E-05 偏硅酸钠 1.27E-06～5.47E-03 磷酸氢二钠 0.031～0.523 丙酮酸钠 0.023～0.453 精胺 0.00013～0.0085 维生素B1 0.00046～0.015 维生素B12 0.0002～0.008 氯化锌 1.28E-05～2.15E-03 氯化锆 2.32E-08～1.21E-05
。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于，所述KGF活性短肽由人工合成或微生物重组表达获得。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述细胞悬浮培养不采用微载体。
6.一种用于PK15细胞培养的无血清培养基在生产猪圆环病毒中的用途，其特征在于，所述用于PK15细胞培养的无血清培养基包含无血清基础培养基和添加物，按所述无血清培养基的总体积计，所述添加物包含如下成分： KGF活性短肽，其氨基酸序列为KGHLLMF（Lys-Gly-His-Leu-Leu-Met-Phe），浓度为0.5-1 ng/mL；以及花生蛋白酶解物，其水解度大于50%，浓度为1.0-4.0mg/ml，
其中，所述花生蛋白酶解物由下述方法制得：(1)脱脂花生在中性条件下，由中性蛋白酶水解，获得中性蛋白水解物；(2)将中性蛋白水解物在碱性条件下，由碱性蛋白酶二次水解，经过超滤、脱盐、冷冻干燥获得花生蛋白酶解物。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述无血清基础培养基的成分包括：氯化铝、乙酸钡、生物素、氯化镉、泛酸钙、氯化胆碱、氯化钴、氯化铜、葡萄糖、乙醇胺、硝酸铁九水合物、叶酸、谷胱甘肽、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、肌醇、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、盐酸组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、氯化镁、氯化锰、烟酰胺、Pluronic F68、氯化钾、碘化钾、腐胺、硫胺素、维生素B2、氯化铷、氯化钠、氟化钠、偏硅酸钠、磷酸氢二钠、丙酮酸钠、精胺、维生素B1、维生素B12、氯化锌和氯化锆。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述无血清基础培养基包括如下组分：各组分按终浓度计，单位为g/L，
组分名称 单位 g/L 氯化铝 2.45E-08～1.28E-05 乙酸钡 1.76E-08～8.15E-06 生物素 1.16E-05～2.46E-04 氯化镉 1.16E-07～7.46E-05 泛酸钙 0.00065～0.012 氯化胆碱 0.0021～0.025 氯化钴 1.80E-08～7.67E-06 氯化铜 2.98E-06～4.60E-04 葡萄糖 2～8 乙醇胺 0.003～0.011 硝酸铁(III) 九水合物 4.54E-06～6.34E-04 叶酸 0.0014～0.054 谷胱甘肽 0.0013～0.012 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 0.824～1.451 肌醇 0.0025～0.0163 精氨酸 0.162～0.851 天冬酰胺 0.389～1.13 天冬氨酸 0.051～0.345 半胱氨酸 0.022～0.11 谷氨酸 0.051～0.55 盐酸组氨酸 0.018～0.23 羟脯氨酸 0.025～0.0252 异亮氨酸 0.045～0.732 亮氨酸 0.045～0.845 赖氨酸 0.034～0.732 蛋氨酸 0.022～0.11 苯丙氨酸 0.025～0.0252 脯氨酸 0.045～0.732 丝氨酸 0.051～0.545 苏氨酸 0.051～0.55 色氨酸 0.051～0.55 酪氨酸 0.062～0.623 缬氨酸 0.051～0.55 氯化镁 0.042～0.152 氯化锰 7.6E-08～8.15E-06 烟酰胺 0.00043～0.0098 Pluronic F68 0.056～0.834 氯化钾 0.213～0.734 碘化钾 2.32E-08～3.50E-06 腐胺 1.65E-05～3.67E-02 硫胺素 1.48E-04～8.31E-03 维生素B2 1.24E-05～2.35E-04 氯化铷 3.27E-08～2.54E-05 氯化钠 1.524～5.441 氟化钠 2.67E-08～1.54E-05 偏硅酸钠 1.27E-06～5.47E-03 磷酸氢二钠 0.031～0.523 丙酮酸钠 0.023～0.453 精胺 0.00013～0.0085 维生素B1 0.00046～0.015 维生素B12 0.0002～0.008 氯化锌 1.28E-05～2.15E-03 氯化锆 2.32E-08～1.21E-05
。
9.根据权利要求6-8任一项所述的用途，其特征在于，所述KGF活性短肽由人工合成或微生物重组表达获得。
10.一种提高猪圆环病毒滴度的方法，其特征在于，猪圆环病毒感染PK15细胞，采用用于PK15细胞培养的无血清培养基对感染后PK15细胞悬浮培养，其中，所述用于PK15细胞培养的无血清培养基包含无血清基础培养基和添加物，按所述无血清培养基的总体积计，所述添加物包含如下成分： KGF活性短肽，其氨基酸序列为KGHLLMF（Lys-Gly-His-Leu-Leu-Met-Phe），浓度为0.5-1 ng/mL；以及花生蛋白酶解物，其水解度大于50%，浓度为1.0-4.0mg/ml，
其中，所述花生蛋白酶解物由下述方法制得：(1)脱脂花生在中性条件下，由中性蛋白酶水解，获得中性蛋白水解物；(2)将中性蛋白水解物在碱性条件下，由碱性蛋白酶二次水解，经过超滤、脱盐、冷冻干燥获得花生蛋白酶解物。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述无血清基础培养基的成分包括：氯化铝、乙酸钡、生物素、氯化镉、泛酸钙、氯化胆碱、氯化钴、氯化铜、葡萄糖、乙醇胺、硝酸铁九水合物、叶酸、谷胱甘肽、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、肌醇、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、盐酸组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、氯化镁、氯化锰、烟酰胺、Pluronic F68、氯化钾、碘化钾、腐胺、硫胺素、维生素B2、氯化铷、氯化钠、氟化钠、偏硅酸钠、磷酸氢二钠、丙酮酸钠、精胺、维生素B1、维生素B12、氯化锌和氯化锆。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述无血清基础培养基包括如下组分：各组分按终浓度计，单位为g/L，
组分名称 单位 g/L 氯化铝 2.45E-08～1.28E-05 乙酸钡 1.76E-08～8.15E-06 生物素 1.16E-05～2.46E-04 氯化镉 1.16E-07～7.46E-05 泛酸钙 0.00065～0.012 氯化胆碱 0.0021～0.025 氯化钴 1.80E-08～7.67E-06 氯化铜 2.98E-06～4.60E-04 葡萄糖 2～8 乙醇胺 0.003～0.011 硝酸铁(III) 九水合物 4.54E-06～6.34E-04 叶酸 0.0014～0.054 谷胱甘肽 0.0013～0.012 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 0.824～1.451 肌醇 0.0025～0.0163 精氨酸 0.162～0.851 天冬酰胺 0.389～1.13 天冬氨酸 0.051～0.345 半胱氨酸 0.022～0.11 谷氨酸 0.051～0.55 盐酸组氨酸 0.018～0.23 羟脯氨酸 0.025～0.0252 异亮氨酸 0.045～0.732 亮氨酸 0.045～0.845 赖氨酸 0.034～0.732 蛋氨酸 0.022～0.11 苯丙氨酸 0.025～0.0252 脯氨酸 0.045～0.732 丝氨酸 0.051～0.545 苏氨酸 0.051～0.55 色氨酸 0.051～0.55 酪氨酸 0.062～0.623 缬氨酸 0.051～0.55 氯化镁 0.042～0.152 氯化锰 7.6E-08～8.15E-06 烟酰胺 0.00043～0.0098 Pluronic F68 0.056～0.834 氯化钾 0.213～0.734 碘化钾 2.32E-08～3.50E-06 腐胺 1.65E-05～3.67E-02 硫胺素 1.48E-04～8.31E-03 维生素B2 1.24E-05～2.35E-04 氯化铷 3.27E-08～2.54E-05 氯化钠 1.524～5.441 氟化钠 2.67E-08～1.54E-05 偏硅酸钠 1.27E-06～5.47E-03 磷酸氢二钠 0.031～0.523 丙酮酸钠 0.023～0.453 精胺 0.00013～0.0085 维生素B1 0.00046～0.015 维生素B12 0.0002～0.008 氯化锌 1.28E-05～2.15E-03 氯化锆 2.32E-08～1.21E-05
。
13.根据权利要求10-12任一项所述的方法，其特征在于，所述KGF活性短肽由人工合成或微生物重组表达获得。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533634A (zh) * 2012-02-22 2012-07-04 江阴剑桥生物技术有限公司 Cho细胞无血清无蛋白化学培养基
CN105087461A (zh) * 2015-06-18 2015-11-25 上海源培生物科技股份有限公司 一种pk细胞培养基
CN109628378A (zh) * 2019-01-25 2019-04-16 江苏丰华生物制药有限公司 一种利用花生蛋白酶解物培养cho细胞的方法
CN111793595A (zh) * 2020-07-23 2020-10-20 上海奥浦迈生物科技有限公司 一种hek293细胞无血清培养基

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533634A (zh) * 2012-02-22 2012-07-04 江阴剑桥生物技术有限公司 Cho细胞无血清无蛋白化学培养基
CN105087461A (zh) * 2015-06-18 2015-11-25 上海源培生物科技股份有限公司 一种pk细胞培养基
CN109628378A (zh) * 2019-01-25 2019-04-16 江苏丰华生物制药有限公司 一种利用花生蛋白酶解物培养cho细胞的方法
CN111793595A (zh) * 2020-07-23 2020-10-20 上海奥浦迈生物科技有限公司 一种hek293细胞无血清培养基

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Keratinocyte growth factor phage model peptides can promote epidermal cell proliferation without tumorigenic effect;ZONG,X.L.et al.;《Chinese Medical Journal》;20100531;第123卷(第9期);全文 *
KGF对离体子宫内膜上皮细胞生长与分泌的影响;王欣等;《西北国防医学杂志》;20081231(第4期);全文 *
合成角质细胞生长因子活性短肽促进表皮细胞增殖的实验研究;宗宪磊等;《组织工程与重建外科杂志》;20161231;第12卷(第1期);全文 *

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