CN108300701B - 一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法 - Google Patents

一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法，所述方法步骤包括：S1、细胞的制备；S2、生物反应器培养；S3、病毒的培养；S4、病毒的收获。与现有技术相比，本发明方法具有生产规模大、效率高、成本低等优点，同时采用无血清培养基培养病毒，获得的病毒滴度高。

Description

一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法。
背景技术
20世纪70年代Tischer等首次发现猪圆环病毒(PCV)，猪圆环病毒分为猪圆环病毒1型和猪圆环病毒2型两种基因型，其中猪圆环病毒2型有致病性，可引起猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)，还是育肥猪的猪皮炎和肾病综合征(PDNS)的主要病因，并且与怀孕母猪的繁殖障碍、新生仔猪的先天性震颤(CT)、增生性和坏死性肺炎(PNP)的发生密切相关。由于该病属于免疫抑制疾病，可引发严重的继发感染从而危害猪群健康，是继猪繁殖呼吸道综合征之后又一个严重危害全球养猪业的重大疾病，在我国规模化猪群中猪圆环病毒2型感染率超过90％。
由于防治猪圆环病毒2型的重要性，有关猪圆环病毒2型病毒及其疫苗的制备成为生物制品研发的热点之一，目前国内猪圆环病毒2型病毒及其疫苗生产技术主要分为传统的转瓶培养技术和微载体悬浮培养技术。其中，传统的转瓶培养技术，较为缓慢，对细胞和病毒的培养条件难以监控和适时补给，无法提供最佳的培养条件，造成该方法自动化程度低，劳动强度大，占地面积大。而微载体悬浮培养技术，如中国专利申请CN103614344A公开的一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法，所述方法包括：A)种细胞的制备；B)生物反应器的准备；C)PK-15细胞悬浮培养；D)PK-15细胞悬浮培养病毒；E)细胞悬浮病毒培养及连续收获；F)病毒液培养周期及收获量，较转瓶工艺虽有提高，但此技术采用含血清的培养基培养细胞，且所需微载体价格昂贵，可重复利用次数较少，扩大培养时的球转球工艺相对较难。
血清，是指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白原分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白原已被除去的血浆，主要作用是提供基本营养物质、激素、生长因子、结合蛋白、促接触和伸展因子，使细胞贴壁免受机械损伤，对培养中的细胞的起到某些保护作用。不论是转瓶培养技术还是微载体生物反应器培养技术均采用高血清含量细胞培养技术，如中国专利申请CN101289655公开的一种制备猪圆环病毒的工艺，包括制备PK15细胞液、采用生物反应器技术与灌注工艺培养猪圆环病毒2型，其中添加了8％的胎牛血清。该发明具有操作方便、操作空间小、工艺参数控制精确等优点，但是血清不同批次间差异显著，放大重现性较差，对下游纯化工艺要求高，容易出现血清中复杂成分导致病毒及其疫苗质量隐患，且全球血清供应趋紧，大大影响企业的生产效率。
与此同时，如上述两个中国专利申请CN103614344A和CN101289655都采用PK15细胞在体外培养猪圆环病毒2型，但是猪圆环病毒2型在体外PK15细胞中培养难度大，增殖力弱，滴度较低，导致现有技术的猪圆环病毒2型病毒及其疫苗存在滴度较低，成本较高的缺陷。
因此，为了解决现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法，该方法能够大规模的生产高滴度、无污染的猪圆环病毒2型，在降低企业生产成本的同时，提高了生产效率。
发明内容
本发明旨在提供一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法，能大规模生产高滴度、无污染的猪圆环2型病毒，降低生产成本，提高生产效率。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
S1、细胞的制备：取Sf9第6代细胞于摇瓶中，加入摇瓶体积2/3的营养液，接种量为营养液体积的0.01-0.5％，设置转速20-50rpm，温度24-28℃，旋转培养45-50小时；
S2、生物反应器培养：当细胞数量达到2×105cells/ml时将Sf9细胞接种于生物反应器进行悬浮培养，设置搅拌转速50-100rpm，温度24-28℃，pH5.8-6.5，溶氧30-80％，连续培养70-75小时；
S3、病毒的培养：当细胞计数达到5×106cells/ml时，接种毒种，补充细胞及培养液总体积4-6倍量的营养液，设置搅拌转速50-100rpm，温度24-28℃，pH5.8-6.5，溶氧30-80％，继续自动培养；
S4、病毒的收获：接毒后6-10小时观察细胞病变情况，待细胞出现80-100％的病变时，停止搅拌，收获上清。
进一步地，步骤S1和S3所述营养液为包含Grace’s粉末培养基35-60g/L、蛋白水解物5-10g/L、磷酸盐0.5-10g/L、甲基纤维素0.5-3g/L、海藻糖2-6g/L、硫酸锌0.2-3g/L、维生素C 0.5-5g/L和柠檬酸铁0.5-5g/L的水溶液。
更进一步地，步骤S1和S3所述营养液为包含Grace’s粉末培养基50g/L、蛋白水解物8g/L、磷酸盐9g/L、甲基纤维素2g/L、海藻糖4g/L、硫酸锌1.5g/L、维生素C 2g/L和柠檬酸铁3g/L的水溶液。
进一步地，所述蛋白水解物由小麦蛋白水解物、大豆蛋白水解物和酵母蛋白水解物以重量比(1～2):(1～2):(2～3)组成。
更进一步地，所述蛋白水解物由小麦蛋白水解物、大豆蛋白水解物和酵母蛋白水解物以重量比1:2:2组成。
进一步地，所述磷酸盐选自KH2PO4、K2HPO4、NaH2PO4和Na2HPO4的一种或两种。
更进一步地，所述步骤S2的生物反应器为中国专利申请CN201272799Y所公开的一种生物反应器。
进一步地，所述步骤S3毒种接种量为细胞及培养液总体积的0.01-0.4％
本发明中使用的宿主细胞是Sf9昆虫细胞，同一般哺乳动物传代细胞相比，其表达系统表达效率高，可以提高病毒滴度，在深层培养时可不必借助于载体，既可以贴壁培养也可以悬浮培养，且可以在无血清营养液中培养，有利于产物的提取。
但Sf9昆虫细胞生产系统需氧量很高，为提高氧传递率使用搅拌、通气等手段而产生的气泡和剪切力往往引起细胞的损伤与死亡，而营养液中加入甲基纤维素一方面可以保护细胞免受剪切力的损伤，另一方面惊奇地发现，其可以减少细胞结团，增强细胞活性，还有显著的消泡作用。这一点从试验例1中可以看出，对比例2将甲基纤维素替换为保护剂泊洛沙姆，收获的病毒滴度由107.5TCID50/ml降低到106.2TCID50/ml。这说明，与一般保护剂泊洛沙姆相比，甲基纤维素更有利于获得更高滴度的病毒。
海藻糖在提供碳源的同时，具有一定的抗菌作用，能有效的减少细胞培养中的微生物污染。磷酸盐以特定的比例加入可使营养液形成pH5.8-6.5的缓冲液系统，减少细胞代谢产物乳酸和氨对细胞的抑制作用。
酵母蛋白水解物是维生素和嘌呤的主要来源，大豆蛋白水解物和小麦蛋白水解物是氨基酸及活性肽的主要来源。申请人意外发现，三者按一定量配比可取得优良的促进细胞生长分裂及蛋白表达的效果。这一点从试验例1可以看出，对比例3-4在实施例1的基础上只是微调了小麦蛋白水解物、大豆蛋白水解物和酵母蛋白水解物的比例或者去掉了小麦蛋白水解物，对比例3收获的病毒滴度为106.8TCID50/ml，对比例4收获的病毒滴度为106.6TCID50/ml，相比实施例1病毒滴度有大幅度地下降。
与现有类似产品相比，本发明提供的一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法具有以下优势：
1)本发明提供的一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法所用设备占地面积小，生产规模大，培养速度快；
2)本发明提供的一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法不添加血清，可避免血清的外源性污染，批间差异小，简化下游目的产物的分离纯化；
3)本发明提供的一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法所生产的病毒滴度及表达蛋白含量高，生产效率高；
4)本发明提供的一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法自动化生产，减少劳动力，不必添加微载体，降低生产成本，生产易于控制，不易污染。
附图说明
图1为Sf9细胞在生物反应器中24小时生长状态；
图2为Sf9细胞在生物反应器中48小时生长状态；
图3为Sf9细胞感染病毒状态。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
Sf9昆虫细胞：上海斯信生物科技有限公司；猪圆环病毒2型：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5774；Grace’s粉末培养基：上海贝曼生物科技发展有限公司；大豆蛋白水解物：青岛海博生物技术有限公司；酵母蛋白水解物：杭州百思生物技术有限公司。
实施例1一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法
本发明实施例1方法步骤如下：
S1、细胞的制备：取Sf9第6代细胞于摇瓶中，加入摇瓶体积2/3的营养液，接种量为营养液体积的0.1％，设置转速30rpm，温度26℃，旋转培养48小时；
S2、生物反应器培养：当细胞数量达到2×105cells/ml时将Sf9细胞接种于生物反应器进行悬浮培养，设置搅拌转速80rpm，温度26℃，pH6.15，溶氧50％，连续培养72小时；
S3、病毒的培养：当细胞计数达到5×106cells/ml时，接种毒种，毒种接种量为细胞及培养液总体积的0.25％，补充细胞及培养液总体积5倍量的营养液，设置搅拌转速80rpm，温度26℃，pH6.15，溶氧50％，继续自动培养；
S4、病毒的收获：接毒后8小时观察细胞病变情况，待细胞出现90％的病变时，停止搅拌，收获上清。
其中，步骤S1和S3所述营养液为包含如下原料及其浓度的水溶液：Grace’s粉末培养基50g/L、蛋白水解物8g/L、磷酸盐8g/L、甲基纤维素2g/L、海藻糖4g/L、硫酸锌1.5g/L、维生素C 2g/L和柠檬酸铁3g/L；所述蛋白水解物由小麦蛋白水解物、大豆蛋白水解物和酵母蛋白水解物以重量比1:2:2组成；所述磷酸盐由NaH2PO4和Na2HPO4以重量比1:1.5组成，用NaOH或H3PO4调节使营养液pH为6.15。
实施例2一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法
本发明实施例2方法步骤如下：
S1、细胞的制备：取Sf9第6代细胞于摇瓶中，加入摇瓶体积2/3的营养液，接种量为营养液体积的0.05％，设置转速20rpm，温度25℃，旋转培养45小时；
S2、生物反应器培养：当细胞数量达到2×105cells/ml时将Sf9细胞接种于生物反应器进行悬浮培养，设置搅拌转速100rpm，温度25℃，pH5.8，溶氧60％，连续培养70小时；
S3、病毒的培养：当细胞计数达到5×106cells/ml时，接种毒种，毒种接种量为细胞及培养液总体积的0.08％，补充细胞及培养液总体积4倍量的营养液，设置搅拌转速100rpm，温度25℃，pH5.8，溶氧60％，继续自动培养；
S4、病毒的收获：接毒后7小时观察细胞病变情况，待细胞出现88％的病变时，停止搅拌，收获上清。
其中，步骤S1和S3所述营养液为包含如下原料及其浓度的水溶液：Grace’s粉末培养基40g/L、蛋白水解物6g/L、磷酸盐9.2g/L、甲基纤维素1.5g/L、海藻糖3g/L、硫酸锌0.8g/L、维生素C1.5g/L和柠檬酸铁2g/L；所述蛋白水解物由小麦蛋白水解物、大豆蛋白水解物和酵母蛋白水解物以重量比1:1:2组成；所述磷酸盐由KH2PO4和K2HPO4以重量比9:1组成，用KOH或H3PO4调节使营养液pH为5.8。
实施例3一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法
本发明实施例3方法步骤如下：
S1、细胞的制备：取Sf9第6代细胞于摇瓶中，加入摇瓶体积2/3的营养液，接种量为营养液体积的0.2％，设置转速50rpm，温度28℃，旋转培养50小时；S2、生物反应器培养：当细胞数量达到2×105cells/ml时将Sf9细胞接种于生物反应器进行悬浮培养，设置搅拌转速50rpm，温度28℃，pH6.5，溶氧80％，连续培养75小时；
S3、病毒的培养：当细胞计数达到5×106cells/ml时，接种毒种，毒种接种量为细胞及培养液总体积的0.35％，补充细胞及培养液总体积6倍量的营养液，设置搅拌转速50rpm，温度28℃，pH6.5，溶氧80％，继续自动培养；
S4、病毒的收获：接毒后10小时观察细胞病变情况，待细胞出现85％的病变时，停止搅拌，收获上清。
其中，步骤S1和S3所述营养液为包含如下原料及其浓度的水溶液：Grace’s粉末培养基60g/L、蛋白水解物10g/L、磷酸盐0.68g/L、甲基纤维素3g/L、海藻糖6g/L、硫酸锌3g/L、维生素C 5g/L和柠檬酸铁5g/L；所述蛋白水解物由小麦蛋白水解物、大豆蛋白水解物和酵母蛋白水解物以重量比2:2:3组成；所述磷酸盐由KH2PO4组成，用KOH或H3PO4调节使营养液pH为6.5。
对比例1一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法
对比例1与实施例1不同之处在于：对比例1步骤S1和S3所述的营养液为包含Grace’s粉末培养基50g/L和8％(v/v)胎牛血清的水溶液，其余参数参考实施例1。
对比例2一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法
对比例2与实施例1不同之处在于：对比例2将甲基纤维素换成泊洛沙姆，其余参数参考实施例1。
对比例3一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法
对比例3与实施例1不同之处在于：对比例3中的蛋白水解物由小麦蛋白水解物、大豆蛋白水解物和酵母蛋白水解物以重量比2:2:1组成，其余参数参考实施例1。
对比例4一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法
对比例4与实施例1不同之处在于：对比例4中的蛋白水解物去掉小麦蛋白水解物，由大豆蛋白水解物和酵母蛋白水解物以重量比1:1组成，其余参数参考实施例1。
试验例一、病毒滴度的测定
对实施例1～3以及对比例1～4收获的病毒液分别进行间接免疫荧光法测定病毒含量：取各组待测病毒液做十倍系列稀释，接入96孔细胞培养板，100μL/孔，同时接种PK-15细胞2.0×104/孔cell，然后让细胞培养板置于37℃，5％CO2培养5日，进行荧光染色判定。出现荧光的即判定该孔细胞感染，按R-M法计算TCID50，试验结果如表1所示。
表1病毒滴度测定结果
项目 病毒滴度TCID<sub>50</sub>/ml
实施例1 10<sup>7.5</sup>
实施例2 10<sup>7.1</sup>
实施例3 10<sup>7.3</sup>
对比例1 10<sup>7.0</sup>
对比例2 10<sup>6.2</sup>
对比例3 10<sup>6.8</sup>
对比例4 10<sup>6.6</sup>
根据国家标准，病毒含量应≧105.5TCID50/ml，由上表1可知实施例1-3及对比例1-4均符合国家标准病毒含量规定，且实施例1-3均比加入血清的对比例1病毒滴度高，说明本发明在不加入血清的情况下也能保持较高的病毒滴度。其中，实施例1病毒滴度最大，为最佳实施例。
而对比例2将甲基纤维素替换为泊洛沙姆，病毒滴度较实施例1有大幅度下降，说明甲基纤维素能大幅度减少由通气供氧而造成的泡沫，从而降低泡沫带来的负面影响，除了乳化和稳定保护细胞功能还可以提高细胞活性。
对比例3-4在实施例1的基础上只是微调了小麦蛋白水解物、大豆蛋白水解物和酵母蛋白水解物的比例或者去掉了小麦蛋白水解物，但病毒滴度与实施例1相比却大幅下降，三者是相互协同，难以替换的。
试验例二、纯净性检验
按《中华人民共和国兽药典》2010版附录相关规定对实施例1-3和对比例1-4进行检验，实施例1-3和对比例2-4结果均无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染，对比例1也无细菌、霉菌及外源病毒污染，但支原体检验结果为阳性，可能是对比例1加入了8％的胎牛血清，动物来源血清常携带病毒或支原体，引入了外源污染。
上述实施例仅例示性说明本发明的优选实施例，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵。

Claims (4)

1.一种生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、细胞的制备：取Sf9第6代细胞于摇瓶中，加入摇瓶体积2/3的营养液，接种量为营养液体积的0.01-0.5％，设置转速20-50rpm，温度24-28℃，旋转培养45-50小时；
S2、生物反应器培养：当细胞数量达到2×105cells/ml时，将Sf9细胞接种于生物反应器进行悬浮培养，设置搅拌转速50-100rpm，温度24-28℃，pH5.8-6.5，溶氧30-80％，连续培养70-75小时；
S3、病毒的培养：当细胞计数达到5×106cells/ml时，接种毒种，补充细胞及培养液总体积4-6倍量的营养液，设置搅拌转速50-100rpm，温度24-28℃，pH5.8-6.5，溶氧30-80％，继续自动培养；
S4、病毒的收获：接毒后6-10小时观察细胞病变情况，待细胞出现80-100％的病变时，停止搅拌，收获上清；
步骤S1和S3所述营养液为包含Grace’s粉末培养基35-60g/L、蛋白水解物5-10g/L、磷酸盐0.5-10g/L、甲基纤维素0.5-3g/L、海藻糖2-6g/L、硫酸锌0.2-3g/L、维生素C0.5-5g/L和柠檬酸铁0.5-5g/L的水溶液；所述蛋白水解物由小麦蛋白水解物、大豆蛋白水解物和酵母蛋白水解物以重量比(1～2):(1～2):(2～3)组成；所述磷酸盐选自KH2PO4、K2HPO4、NaH2PO4和Na2HPO4的一种或两种；步骤S3毒种接种量为细胞及培养液总体积的0.01-0.4％。
2.如权利要求1所述生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法，其特征在于，步骤S1和S3所述营养液为包含Grace’s粉末培养基50g/L、蛋白水解物8g/L、磷酸盐9g/L、甲基纤维素2g/L、海藻糖4g/L、硫酸锌1.5g/L、维生素C2g/L和柠檬酸铁3g/L的水溶液。
3.如权利要求1所述生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法，其特征在于，所述蛋白水解物由小麦蛋白水解物、大豆蛋白水解物和酵母蛋白水解物以重量比1:2:2组成。
4.如权利要求1所述生物反应器悬浮培养猪圆环病毒2型的方法，其特征在于，所述步骤S2的生物反应器为中国专利申请CN201272799Y所公开的一种生物反应器。
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