CN106811445B - 一种乙型脑炎病毒悬浮培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种乙型脑炎病毒悬浮培养方法，该技术方案依托于动物细胞的微载体培养技术展开。由于微载体为单层贴壁细胞的生长繁殖提供了更大的表面积，因此为细胞生长提供了一个均质的悬浮培养系统，利用微载体作为细胞定殖的物理支撑，再结合优化的培养条件，从而提高了细胞及病毒的培养密度。本发明实现了乙型脑炎病毒的规模化培养，提供大量的优质病毒抗原。同时，本发明克服了传统转瓶培养动物原代细胞生产的单批产量不高、批间差异大、产品质量不稳定、生产成本和污染机率高等缺陷。此外，本发明能连续培养、占地小、生产规模大、对细胞伤害小，克服了传统工艺占地空间大，培养不连续，生产成本高等缺点。

Description

一种乙型脑炎病毒悬浮培养方法
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，进一步涉及抗原的制备技术，具体涉及一种乙型脑炎病毒悬浮培养方法。
背景技术
流行性乙型脑炎是由黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirus)的乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一种人兽共患虫媒性传染病。人、猪、马属动物等对该病毒均易感，其中对猪的危害最大。猪乙型脑炎主要表现为怀孕母猪流产、死胎、产弱仔、公猪睾丸炎等，常常给养猪业造成严重的经济损失。
传统灭活苗的制造工艺简单，易保存，安全性好，但注射剂量大，需多次重复注射，且免疫效果较弱毒活疫苗差，在实际应用中使用很少。目前，弱毒活疫苗的使用已替代灭活苗。但如今乙型脑炎病毒一般以传统转瓶培养工艺进行增殖，其生产周期长、操作机械化程度低，污染机率提高，诸多因素可影响抗原的生产及质量。尽管有研究者尝试利用规模化的生物反应器进行连续式培养，但这种条件下一方面加大了生产成本，另一方面还存在着质量不稳定、污染几率高等问题。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种乙型脑炎病毒悬浮培养方法，以解决现有技术的JEV病毒生产方法产量低、质量不稳定的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中JEV病毒的大规模培养方法占地面积较大、生产成本较高的技术问题。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种乙型脑炎病毒悬浮培养方法，包括以下步骤：
1)取微载体加入生物反应器，以每克微载体对应200～300ml PBS缓冲液的比例加入PBS缓冲液，浸泡2～3h，更换PBS缓冲液再浸泡1～2h，期间持续搅拌，弃去PBS缓冲液；以每克微载体对应100～150ml PBS缓冲液的比例加入PBS缓冲液，湿热灭菌，冷却后弃去PBS缓冲液，以培养基洗涤微载体2～3遍，加入新鲜培养基，冷却至2～8℃，平衡8～12h，备用；
2)取步骤1)处理后的微载体，平衡其温度至25～30℃，补充培养基至其中微载体浓度为2～3g/L；将Vero细胞以5×105～7×105cell/L的浓度接种，搅拌混匀，静置；
3)调节生物反应器温度36～38℃，在搅拌条件下培养，培养总时间35～40h时流加补料，培养总时间70～100h时接种乙型脑炎病毒；
4)以0.1～0.5的MOI值接种病毒，36～38℃静置吸附，而后在搅拌条件下培养，此后16～24h时流加补料、50～70h时收获病毒。
作为优选，所述微载体型号为cytodex1。
作为优选，所述生物反应器为搅拌式生物反应器，其搅拌器为推进式。
作为优选，所述生物反应器是潮汐式、旋转式或灌注式微载体悬浮培养生物反应器。
作为优选，步骤1)中所述持续搅拌的转速是10～15r/min。
作为优选，所述培养基中含有2～4％的新生牛血清。
作为优选，步骤2)中所述搅拌的转速为45～55r/min。
作为优选，步骤3)的培养过程中，空气饱和度为40～60％，pH值为7.1～7.4。
作为优选，步骤3)和步骤4)所述补料的成分为葡萄糖和谷氨酰胺的50～70倍浓缩液，流加的速率为3～5ml/18h。
作为优选，步骤4)中所述搅拌的转速为60～80r/min。
作为优选，步骤4)的培养过程中，空气饱和度为70～90％，pH值为7.1～7.4。
作为优选，步骤2)中所述静置的时间为2～3h。
作为优选，步骤4)中静置吸附的时间为1～3h。
作为优选，步骤1)中所述PBS缓冲液的pH值为7.0～7.2。
作为优选，步骤3)所述的乙型脑炎病毒是SA14-14-2株。
本发明提供了一种乙型脑炎病毒悬浮培养方法，该技术方案依托于动物细胞的微载体培养技术展开。由于微载体为单层贴壁细胞的生长繁殖提供了更大的表面积，因此为细胞生长提供了一个均质的悬浮培养系统，利用微载体作为细胞定殖的物理支撑，再结合优化的培养条件，从而提高了细胞及病毒的培养密度。
本发明实现了乙型脑炎病毒的规模化培养，提供大量的优质病毒抗原。同时，本发明克服了传统转瓶培养动物原代细胞生产的单批产量不高、批间差异大、产品质量不稳定、生产成本和污染机率高等缺陷。此外，本发明能连续培养、占地小、生产规模大、对细胞伤害小，克服了传统工艺占地空间大，培养不连续，生产成本高等缺点。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
本发明实施例中优先使用搅拌式微载体悬浮培养生物反应器，其它微载体悬浮培养生物反应器，如：潮汐式、旋转式或灌注式微载体悬浮培养生物反应器，均可以使用。
本发明使用搅拌式微载体悬浮培养生物反应器，易于控制和规模放大，具有良好流体混合能力和氧气输送能力，保证了培养过程中培养基和溶解氧的供应，满足GMP生产要求，适合病毒的规模化增殖培养。
实施例1
(1)微载体制备：取60g微载体cytodex1加入生物反应器，以200ml/g比例加入PBS(pH值7.0)浸泡2.5h，去掉PBS，重新加入PBS，10r/min搅拌，浸泡2h，弃去PBS。
以100ml/g比例加入PBS，121℃，高压30min，冷却后弃去PBS，以培养基洗涤2遍，加入新鲜培养基，冷却至8℃，平衡10h，备用。
(2)灭菌微载体平衡至28℃，补充培养基，微载体浓度为2g/L；将Vero细胞以5×105cell/L比例接种，45r/min搅拌混匀，静置2h，重复2次，使细胞充分分布。
(3)细胞和微载体混合后，调节温度37℃，45r/min搅拌，以50％空气饱和度和控制pH值7.2进行培养，36h后流加葡萄糖和谷氨酰胺补料(50倍浓缩液)，流加速率为5ml/18h。培养80h接种病毒(SA14-14-2株)。
(4)以0.3病毒感染复数(M.O.I.)接种病毒，37℃静置吸附3h，调节转速为85r/min，75％空气饱和度和控制pH值7.2进行培养，16h后流加葡萄糖和谷氨酰胺补料(50倍浓缩液)，60h后收获病毒。根据Reed-Muench法计算病毒TCID50，每1.0ml含病毒＞107.9TCID50。
实施例2
(1)微载体制备：取90g微载体cytodex1加入生物反应器，以300ml/g比例加入PBS(pH值7.2)浸泡2h，去掉PBS，重新加入PBS，15r/min搅拌，浸泡1h，弃去PBS。
以150ml/g比例加入PBS，121℃，高压30min，冷却后弃去PBS，以培养基洗涤3遍，加入新鲜培养基，冷却至6℃，平衡12h，备用。
(2)灭菌微载体平衡至25℃，补充培养基，微载体浓度为3g/L；将Vero细胞以7×105cell/L比例接种，50r/min搅拌混匀，静置2.5h，重复3次，使细胞充分分布。
(3)细胞和微载体混合后，调节温度37℃，55r/min搅拌，以48％空气饱和度和控制pH值7.4进行培养，40h后流加葡萄糖和谷氨酰胺补料(70倍浓缩液)，流加速率为3ml/18h。培养90h接种病毒(SA14-14-2株)。
(4)以0.5病毒感染复数(M.O.I.)接种病毒，37℃静置吸附2.5h，调节转速为100r/min，90％空气饱和度和控制pH值7.4进行培养，20h后流加葡萄糖和谷氨酰胺补料(70倍浓缩液)，70h后收获病毒。根据Reed-Muench法计算病毒TCID50，每1.0ml含病毒＞107.7TCID50。
实施例3
(1)微载体制备：取75g微载体cytodex1加入生物反应器，以250ml/g比例加入PBS(pH值7.2)浸泡3h，去掉PBS，重新加入PBS，12r/min搅拌，浸泡1.5h，弃去PBS。
以130ml/g比例加入PBS，121℃，高压30min，冷却后弃去PBS，以培养基洗涤3遍，加入新鲜培养基，冷却至4℃，平衡12h，备用。
(2)灭菌微载体平衡至30℃，补充培养基，微载体浓度为2.5g/L；将vero细胞以5.5×105cell/L比例接种，50r/min搅拌混匀，静置2.5h，重复3次，使细胞充分分布。
(3)细胞和微载体混合后，调节温度37℃，50r/min搅拌，以50％空气饱和度和控制pH值7.1进行培养，38h后流加葡萄糖和谷氨酰胺补料(60倍浓缩液)，流加速率为4ml/18h。培养95h接种病毒(SA14-14-2株)。
(4)以0.1病毒感染复数(M.O.I.)接种病毒，37℃静置吸附2h，调节转速为90r/min，80％空气饱和度和控制pH值7.3进行培养，18h后流加葡萄糖和谷氨酰胺补料(60倍浓缩液)，70h后收获病毒。根据Reed-Muench法计算病毒TCID50，每1.0ml含病毒＞108.2TCID50。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种乙型脑炎病毒悬浮培养方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取微载体加入生物反应器，以每克微载体对应200～300ml PBS缓冲液的比例加入PBS缓冲液，浸泡2～3h，更换PBS缓冲液再浸泡1～2h，期间持续搅拌，弃去PBS缓冲液；以每克微载体对应100～150ml PBS缓冲液的比例加入PBS缓冲液，湿热灭菌，冷却后弃去PBS缓冲液，以培养基洗涤微载体2～3遍，加入新鲜培养基，冷却至2～8℃，平衡8～12h，备用；
2)取步骤1)处理后的微载体，平衡其温度至25～30℃，补充培养基至其中微载体浓度为2～3g/L；将Vero细胞以5×105～7×105cell/L的浓度接种，搅拌混匀，静置；
3)调节生物反应器温度36～38℃，在搅拌条件下培养，培养总时间35～40h时流加补料，培养总时间70～100h时接种乙型脑炎病毒；
4)以0.1～0.5的MOI值接种病毒，36～38℃静置吸附，而后在搅拌条件下培养，此后16～24h时流加补料、50～70h时收获病毒；
所述微载体型号为cytodex1。
2.根据权利要求1所述的一种乙型脑炎病毒悬浮培养方法，其特征在于所述生物反应器为搅拌式生物反应器，其搅拌器为推进式。
3.根据权利要求1所述的一种乙型脑炎病毒悬浮培养方法，其特征在于步骤1)中所述持续搅拌的转速是10～15r/min。
4.根据权利要求1所述的一种乙型脑炎病毒悬浮培养方法，其特征在于所述培养基中含有2～4％的新生牛血清。
5.根据权利要求1所述的一种乙型脑炎病毒悬浮培养方法，其特征在于步骤2)中所述搅拌的转速为45～55r/min。
6.根据权利要求1所述的一种乙型脑炎病毒悬浮培养方法，其特征在于步骤3)的培养过程中，空气饱和度为40～60％，pH值为7.1～7.4。
7.根据权利要求1所述的一种乙型脑炎病毒悬浮培养方法，其特征在于步骤3)和步骤4)所述补料的成分为葡萄糖和谷氨酰胺的50～70倍浓缩液，流加的速率为3～5ml/18h。
8.根据权利要求1所述的一种乙型脑炎病毒悬浮培养方法，其特征在于步骤4)中所述搅拌的转速为60～80r/min。
9.根据权利要求1所述的一种乙型脑炎病毒悬浮培养方法，其特征在于步骤4)的培养过程中，空气饱和度为70～90％，pH值为7.1～7.4。
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