CN111662881A

CN111662881A - 新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液及其生产方法

Info

Publication number: CN111662881A
Application number: CN202010537730.0A
Authority: CN
Inventors: 王辉; 赵玉秀; 付慧; 李婉莉; 李爱灵; 张越; 于守智; 张征丽; 郭彦岑; 杨晓明
Original assignee: National Vaccine & Serum Institute Co ltd
Current assignee: China Biotechnology Co., Ltd; NATIONAL VACCINE & SERUM INSTITUTE CO.,LTD.
Priority date: 2020-06-12
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2020-09-15
Anticipated expiration: 2040-06-12
Also published as: CN111662881B

Abstract

本发明提供了一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液及其生产方法。该方法包括：在装填有片状载体的篮式生物反应器中加入细胞生长液，接种Vero细胞进行培养，至长成致密单层后，采用细胞维持液洗换；洗换结束后注入细胞维持液，进行新型冠状病毒的接种，病毒接种的MOI为0.005～0.4，病毒培养温度为36±1℃，溶氧≥40％，控制病毒培养阶段体系pH值为7.2～7.6；病毒接种后培养48～96h，收获病毒液。本发明应用篮式反应器成功培养获得了新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液，本发明细胞接种密度大，病毒滴度高，批间差异高度可控，质量均一；为新型冠状病毒灭活疫苗的大规模生产打下了坚实的基础。

Description

新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液及其生产方法

技术领域

本发明是关于一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液及其生产方法，具体是一种应用篮式生物反应器以Vero细胞为基质生产新型冠状病毒灭活疫苗病毒液的方法，以及利用该方法生产得到新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液。

背景技术

2019年出现了一种新型冠状病毒，世界卫生组织(WHO)确认并命名为SARS-CoV-2，该病原感染所致的肺炎称为新型冠状肺炎。目前尚无特效药物对新冠肺炎进行有效治疗，新冠肺炎疫苗的研发迫在眉睫。

SARS-CoV-2是一种新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140nm。新型冠状病毒是继SARS病毒和MERS病毒后又一能引发严重急性呼吸道疾病且具有严重传染性的冠状病毒。冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具外套膜(envelope)的正链单股RNA病毒，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，只感染人、鼠、猪、猫、犬、禽类脊椎动物。冠状病毒最先是1937年从鸡身上分离出来，病毒颗粒的直径60-200nm，平均直径为100nm，呈球形或椭圆形，具有多形性。病毒有包膜，包膜上存在棘突，整个病毒像日冕，不同的冠状病毒的棘突有明显的差异。在冠状病毒感染细胞内有时可以见到管状的包涵体。

由于疫情突发，目前尚无新冠疫苗成品上市。为更大限度提升疫苗研发成功率，科研攻关组在梳理分析不同技术基础和可能性之后，布局了病毒的灭活疫苗、核酸疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗、减毒流感病毒载体疫苗这5条技术路线。

灭活疫苗采用了完整的病毒组成，它在制备过程中要通过理化方法灭活其致病性，还要通过灭活验证，而且仍然保持病毒的免疫原性，通过纯化工艺等制备过程，制备出候选疫苗。机体接种了候选疫苗可以刺激免疫反应，产生抗体，达到保护作用。灭活疫苗是一种成熟技术路线，具有质量标准可控、保护范围广等特点，我国灭活疫苗的研发制备基础较好，曾成功研发制备出H1N1流感灭活疫苗、甲型肝炎灭活疫苗、EV71手足口病灭活疫苗、Sabin株IPV脊灰疫苗等多款灭活疫苗。

病毒类疫苗在生产过程中需要对相应病毒进行培养，病毒培养工艺是否优良是在整个疫苗生产过程中直接决定疫苗质量和疫苗总量的关键性因素。为了在最短时间内、快速获得可用于人类预防的新型冠状病毒灭活疫苗，需在保证安全的前提下大批量、规模化制备新型冠状病毒。近年来，利用生物反应器培养细胞进行病毒繁殖的技术日趋成熟。建立以生物反应器技术为基础的动物细胞大规模培养技术是疫苗生产的主流模式。生物反应器操作简单，运行稳定可靠，自动化控制程度高、培养表面积大、易于规模化生产，并且生物反应器能够提供更加良好的细胞生长环境，利于病毒繁殖。例如，篮式生物反应器培养Sabin株脊髓灰质炎病毒工艺的建立(梁宏阳、赵玉秀等，《中国生物制品学杂志》2018年12期)报道了应用篮式生物反应器培养Vero细胞制备脊髓灰质炎疫苗；生物反应器规模化培养重组CHO-C28细胞表达HBsAg的研究(张英、徐枫、张平、宋涛，《微生物学免疫学进展》2007年第01期)报道了生物反应器规模化培养重组CHO-C28细胞。CN1390604A公开了一种利用篮式生物反应器大规模连续生产病毒疫苗的方法，该方法是在具有固定床篮式搅拌系统的CelligenPlusR生物反应器中，以聚酯切片Fibra-Cel^TMDisks为载体，培养细胞生产病毒；在细胞生长至一定密度时，接种所述病毒，使所述病毒感染细胞；然后使病毒在合适的条件下大量增殖，再经纯化后收获病毒。

目前对新型冠状病毒尚无有效的预防疫苗，未发现应用篮式生物反应器培养Vero细胞制备新型冠状病毒液的技术报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种应用篮式反应器制备高质量的新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)病毒液的方法；本发明的目的还在于提供该方法制备获得的新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液；本发明的目的还在于提供利用新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液制备获得的新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗制品。

本发明的目的通过以下技术手段得以实现：

一方面，本发明提供一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的生产方法，该方法包括如下步骤：

在装填有片状载体的篮式生物反应器中加入细胞生长液，接种Vero细胞进行培养，至长成致密单层后，采用细胞维持液洗换；

洗换结束后注入细胞维持液，进行新型冠状病毒的接种，病毒接种的MOI为0.005～0.4，病毒培养温度为36±1℃，溶氧≥40％，控制病毒培养阶段体系pH值为7.2～7.6；

病毒接种后培养48～96h，收获病毒液。

新型冠状病毒SARS-CoV-2作为一种新型突发病毒，其病毒特性并没有被深入研究，大大增加了病毒培养的难度；需根据新型冠状病毒的理化特性进行参数摸索及优化，国内外文献资料较少，存在技术攻关。发明人创造性地利用篮式生物反应器与片状载体相结合的培养模式，通过反复摸索最终确定了有利的细胞培养条件和新型冠状病毒繁殖条件，成功制备出了以Vero细胞为基质的新型冠状病毒液，且具有良好的稳定性，尚属国内外首创。

本发明具体在P3实验室生物安全柜内，利用密闭的管道系统，完成Vero细胞接种新型冠状病毒，利用篮式反应器(固定床设计)在密闭条件下进行病毒扩增，规模化、工业化、大批量制备新型冠状病毒。本发明所述方法成功的解决了规模化、大批量制备新型冠状病毒对生产人员、工作人员、工作环境和人类的高危险性问题，确保了新型冠状病毒液生产过程的安全性。

上述的生产方法中，优选地，所述片状载体为立体式书页型载体；其由聚酯纤维经高温热焊接成型(成型后经筛选，加工过程无任何的添加剂)，呈多片状，每粒载体外观尺寸为(6～8)×(8～10)mm；所述片状载体的装填密度为30～50g/L(“L”指蓝式反应器的工作体积)。所述立体式书页型载体装填于蓝式反应器固定床的床层中。

本发明采用的立体式书页型载体培养面积更大，空间更大，更利于营养物质的传递，细胞生长效果更好。

上述的生产方法中，培养48～96h内将反应器内的病毒液收获1次或收获多次(不超过2次)。若多次收获，则在每次收获后补加新鲜Vero细胞维持液继续培养。

上述的生产方法中，优选地，所述新型冠状病毒为冠状病毒SARS-CoV-2。

上述的生产方法中，优选地，控制篮式反应器搅拌桨转速为：

接种细胞阶段转速为50～150rpm；培养细胞阶段转速为50～150rpm；接种病毒阶段转速为50～150rpm；培养病毒阶段转速为50～150rpm。

上述的生产方法中，优选地，所述Vero细胞培养阶段中的细胞生长液为含1％～8％新生牛血清的M199培养基或DMEM培养基；细胞生长液中葡萄糖含量为4.1～4.6g/L。

上述的生产方法中，优选地，所述细胞维持液为不含血清的M199培养基或DMEM培养基；细胞维持液中葡萄糖含量为4.1～4.6g/L。

上述的生产方法中，优选地，所述Vero细胞接种密度为≥1.0×10⁶个/ml；培养体系的pH值为7.2～7.4；溶氧≥40％；培养温度为36.5±1℃；培养6～8天至长成致密单层。培养过程中可利用葡萄糖监测确定细胞是否长成单层。

上述的生产方法中，优选地，采用篮式反应器控制系统的“4Gas”模式进行Vero细胞及病毒培养。

上述的生产方法中，优选地，所述篮式生物反应器包括10L篮式生物反应器、40L篮式生物反应器和300L篮式生物反应器，但不限于此。

上述的生产方法中，优选地，采用10L篮式生物反应器的规模下，Vero细胞接种量不低于6×10⁹个，转速为50～150rpm(细胞接种、细胞培养、病毒接种、病毒培养阶段均为该转速范围)。

上述的生产方法中，优选地，采用40L篮式生物反应器的规模下，Vero细胞接种量不低于1×10¹⁰个，转速为50～150rpm(细胞接种、细胞培养、病毒接种、病毒培养阶段均为该转速范围)。

上述的生产方法中，优选地，采用300L篮式生物反应器的规模下，Vero细胞接种量不低于2×10¹⁰个，转速为60～120rpm(细胞接种、细胞培养、病毒接种、病毒培养阶段均为该转速范围)。

在工艺放大过程中，新型冠状病毒灭活疫苗病毒液制备工艺关键参数会有不同。主要体现在细胞接种量及培养转速上。

本发明的工艺放大方案，能够实现大规模生产新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)病毒液。

本发明的应用篮式生物反应器制备新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)病毒液的方法中，未详细提及的反应器的操作方法及其他工艺参数可以参照反应器的说明书确定。本发明的关键在于确定了对以篮式生物反应器制备新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)病毒液有重要影响的因素条件：病毒阶段培养液、培养温度、pH值、病毒接种时间、病毒接种MOI、溶氧、病毒收获时间等。通过控制这些因素条件在本发明的范围内，能够成功的制备出以Vero细胞为基质的新型冠状病毒液，所得病毒收获液在具有较高收获量的情况下具有较高的病毒滴度，病毒滴度不低于7.0LgCCID₅₀/ml。

另一方面，本发明还提供一种按照上述的方法制备得到的新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液。

再一方面，本发明还提供一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗，其是将上述新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液灭活纯化后，经适当稀释后配制新型冠状病毒灭活疫苗，配制后分装，即为新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗制品。

上述新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的纯化方法包括以下步骤：

将灭活的新型冠状病毒Vero细胞病毒液通过滤膜初步过滤，除去细胞碎片及部分杂蛋白；然后通过滤膜超滤浓缩得到新型冠状病毒浓缩液；

向新型冠状病毒浓缩液中加入核酸酶，降解Vero细胞中残留的DNA；

将复合填料Capto Core 700装入层析柱中，先采用碱液冲洗1个柱体积，然后再用洗脱液平衡2～5个柱体积，接着将核酸酶处理后的新型冠状病毒浓缩液泵入到层析柱中，采用洗脱液洗脱；紫外检测器波长280nm处检测，收集第一个流穿峰即为新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒纯化液。

上述的纯化方法中，进行初步过滤的滤膜孔径为0.45～5.0μm；进行超滤浓缩的滤膜的截留分子量为100～300KD；超滤浓缩体积为10倍以上。

上述的纯化方法中，向新型冠状病毒浓缩液中加入核酸酶，使核酸酶在浓缩液中的终浓度为50～300U/ml，室温下放置2～12h或37℃下放置0.5～4h，降解Vero细胞中残留的DNA；所述核酸酶包括Benzonase核酸酶和/或Biolonase核酸酶。

上述的纯化方法中，将复合填料Capto Core 700装入层析柱中的柱高为20～50cm。

上述的纯化方法中，所述碱液为1M的氢氧化钠溶液；所述洗脱液为pH值为6.2～8.0的PBS缓冲液；采用洗脱液进行洗脱的洗脱流速为30～100cm/h。

上述的纯化方法中，将核酸酶处理后的新型冠状病毒浓缩液泵入到层析柱中的上样体积为柱体积的10％～30％。所述层析柱包括XK 16/40层析柱、HiScale 50/40层析柱或BPG 140/500层析柱。

本发明的有益效果：

本发明中，应用篮式反应器成功培养获得了新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液，本发明细胞接种密度大，病毒滴度高，批间差异高度可控，质量均一；为新型冠状病毒灭活疫苗的大规模生产打下了坚实的基础。

附图说明

图1显示Vero细胞培养过程中葡萄糖消耗量。

图2显示新型冠状病毒培养过程中病毒滴度。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

实施例1：Vero细胞的培养

将装有立体式书页型载体(载体型号：TQ1000w，免清洗；提供商：上海楚琨，30～50g/L)的预先灭菌后的10L篮式反应器中先注入一定体积的细胞生长液(含8％新生牛血清的M199培养基)后，再将Vero细胞注入罐体中，细胞接种密度不低于1×10⁶个/ml；然后用细胞生长液补充液位至液位最高刻度线并进行反应器各项参数的设定：培养转速为50～150rpm；溶氧为不低于40％；气体流量4Gas：0.1；pH值控制为7.2～7.4之间；温度为36.5±1℃。在细胞培养过程中，利用葡萄糖监测确定细胞是否长成单层，表1为Vero细胞不同培养时间条件下的葡萄糖消耗量；图1显示Vero细胞培养过程中葡萄糖消耗量。

表1：

由表1和图1可以看出：在Vero细胞培养阶段，细胞接种6～8天左右葡萄糖消耗量达到高峰，此时为病毒接种最佳时期。

实施例2：新型冠状病毒的培养

在Vero细胞培养至6～8天时，进行新型冠状病毒SARS-CoV-2的接种，三个批次病毒接种MOI分别为0.005，0.01，0.3。接种病毒前弃去反应器内细胞生长液，加入细胞维持液(不含血清的M199培养基)洗涤除去牛血清。在隔离器内将毒种水浴融化，将毒种加入到细胞维持液(不含血清的M199培养基)中，摇动混匀后，将含病毒的细胞维持液泵入罐内。种毒后于36±1℃进行通气搅拌培养，培养转速为50～150rpm，溶氧为不低于40％，培养期间控制pH值7.2～7.6之间。表2为新型冠状病毒不同培养时间条件下的病毒滴度；图2显示新型冠状病毒培养过程中病毒滴度。

表2：

从表2和图2可以看出：在新型冠状病毒培养阶段，病毒接种48h后病毒滴度明显升高，达到7.0LgCCID₅₀/ml以上，可以开始进行病毒液收获。

实施例3：病毒液收获

自病毒接种开始，培养48～96小时内进行病毒液收获。关闭篮式反应器温度、pH、DO功能，开启收获管路，利用罐内正压收集病毒液。具体病毒收获液病毒滴度见表3。

表3：

病毒液批次	病毒滴度(LgCCID<sub>50</sub>/ml)	收获病毒液量(ml)
			01	7.5	7000
02	7.4	7000
			03	7.5	7000

由上述表3实验结果可以看出：本发明采用篮式反应器培养新型冠状病毒，细胞接种密度大，病毒滴度高，批间差异高度可控，质量均一。

Claims

1.一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液的生产方法，该方法包括如下步骤：

病毒接种后培养48～96h，收获病毒液。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其中，所述片状载体为立体式书页型载体；所述片状载体的装填密度为30～50g/L。

3.根据权利要求1所述的生产方法，其中，所述新型冠状病毒为冠状病毒SARS-CoV-2。

4.根据权利要求1所述的生产方法，其中，控制篮式反应器搅拌桨转速为：

5.根据权利要求1所述的生产方法，其中，所述Vero细胞培养阶段中的细胞生长液为含1％～8％新生牛血清的M199培养基或DMEM培养基；细胞生长液中葡萄糖含量为4.1～4.6g/L；

优选地，所述细胞维持液为不含血清的M199培养基或DMEM培养基；细胞维持液中葡萄糖含量为4.1～4.6g/L。

6.根据权利要求1所述的生产方法，其中，所述Vero细胞接种密度为≥1.0×10⁶个/ml；培养体系的pH值为7.2～7.4；溶氧≥40％；培养温度为36.5±1℃；培养6～8天至长成致密单层。

7.根据权利要求1所述的生产方法，其中，采用篮式反应器控制系统的“4Gas”模式进行Vero细胞及病毒培养；

优选地，所述篮式生物反应器包括10L篮式生物反应器、40L篮式生物反应器和300L篮式生物反应器。

8.根据权利要求7所述的生产方法，其中，采用10L篮式生物反应器的规模下，Vero细胞接种量不低于6×10⁹个，转速为50～150rpm；

优选地，采用40L篮式生物反应器的规模下，Vero细胞接种量不低于1×10¹⁰个，转速为50～150rpm；

优选地，采用300L篮式生物反应器的规模下，Vero细胞接种量不低于2×10¹⁰个，转速为60～120rpm。

9.一种按照权利要求1～8任一项所述的方法制备得到的新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液。

10.一种新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗，其是将权利要求9所述新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗病毒液灭活纯化后，经适当稀释后配制新型冠状病毒灭活疫苗，配制后分装，即为新型冠状病毒Vero细胞灭活疫苗制品。