CN102807964B - 一种动物细胞放大培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种动物细胞放大培养的方法。该方法包括以下步骤：1)在细胞工厂中培养动物细胞；2)对所培养的细胞进行消化，包括：2-1)去除培养液，用pH7.4-8.0的洗涤液洗涤所培养的细胞；2-2)去除该洗涤液，加入pH7.4-8.0的消化液，使消化液均匀流至每层，在36-38℃进行细胞消化，消化液用量为20-80mL/层，当大于60％的细胞从细胞培养表面上脱落时，去除部分消化液，剩余10-35体积％消化液继续消化；2-3)当大于85％的细胞从培养表面上脱落时，加入含血清或消化液抑制剂的新鲜细胞培养液终止消化并重悬细胞，重复加入1-3次该培养液；3)将所得细胞悬液接种至生物反应器中进行培养。

Description

一种动物细胞放大培养的方法

技术领域

本发明涉及一种动物细胞放大培养的方法，具体地，涉及用细胞工厂放大培养动物细胞的方法。

背景技术

动物细胞大规模培养技术是指在人工条件下(设定pH值、温度、溶氧等)，在细胞培养生物反应器中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。其广泛应用于抗体、病毒疫苗等生物制品的研究开发和工业化生产，是生物制品生产中的核心技术。

实际生产工艺中，在大规模培养动物细胞生产目的生物制品之前，首先要通过扩增种子细胞获得满足生产需求的细胞数量。现常用的扩增方法多为复苏细胞，经细胞培养瓶(如方瓶、摇瓶、转瓶、搅拌瓶)逐级扩增培养，获得一定数量的细胞后，接种至生物反应器中进行大规模培养。因细胞培养瓶的培养面积小，且单个培养瓶即为一个培养单位，这种方法具有占用空间大、操作繁琐、单位体积细胞密度低、细胞生长状况不一致等缺点，对生物制品的生产成本、生产效率、质量均具有一定影响。因此，需要一种可有效降低生物制品生产成本、提高生产效率和质量的动物细胞放大培养的方法。

细胞工厂为一种新型细胞静止培养装置，又名cell factories或cell stack，通常由组织级聚苯乙烯制成，特别适合于贴壁细胞培养、也可用于悬浮细胞培养，通常具有1层、2层、4层、10层及40层等规格。与传统细胞培养瓶培养方式相比，细胞工厂具有低污染风险，节省空间，可全面实现细胞培养自动化等优点。但是应用细胞工厂进行细胞培养时细胞消化难度较大，具有消化后细胞活力低，细胞回收率低等问题，限制了其在动物细胞扩大培养的应用。

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于克服现有应用细胞培养瓶进行动物细胞扩大培养的方法占用空间大、操作繁琐、细胞扩大培养效率低、细胞生长状况不一致等缺点，提供一种新的动物细胞扩增培养的方法，该方法用细胞工厂代替传统细胞培养瓶进行生物反应器微载体培养前的细胞扩增，其操作简单，可增加单位空间的生产规模，提高细胞活力与细胞回收率，从而提高细胞扩大培养效率，并减少污染风险。将其应用于生物制品生产上游工艺中，可降低生物制品生产成本和劳动力成本，提高生产效率与生物制品质量。

解决问题的手段

为了解决上述问题，本发明提供以下方案。

1.一种动物细胞放大培养的方法，其包括以下步骤：

1)在细胞工厂中培养动物细胞；

2)对步骤1)中在细胞工厂中培养的细胞进行消化，其包括以下步骤：

2-1)洗涤：去除细胞工厂中的细胞培养液，用pH7.4-8.0的洗涤液洗涤所培养的细胞；

2-2)消化：去除步骤2-1)所述洗涤液，向细胞工厂中加入pH7.4-8.0的消化液，轻轻前后晃动细胞工厂确保消化液均匀流至每层，在36℃-38℃进行细胞消化，其中，所使用消化液用量为20mL/层-80mL/层，当大于60％的动物细胞从细胞工厂培养表面上脱落时，去除部分消化液，剩余10体积％-35体积％消化液继续消化。

2-3)收获：当大于85％的动物细胞从细胞工厂培养表面上脱落时，向细胞工厂内加入含血清的或含消化液抑制剂的新鲜细胞培养液终止消化并重悬细胞，重复加入1-3次所述新鲜细胞培养液并收集所得细胞悬液；

3)将步骤2)中所获得的细胞悬液接种至生物反应器中，进行生物反应器微载体培养。

2.根据上述方案1所述的方法，其中，步骤1)为：将细胞工厂预热至少1小时，使细胞工厂各层温度均达到细胞培养温度，添加细胞培养液及细胞悬液至细胞工厂，细胞接种密度为5×10³-1×10⁵个细胞/cm²，细胞培养温度为36℃-38℃，细胞培养液pH7.0-7.8，所使用的细胞培养液用量为125mL/层～325mL/层。

3.根据上述方案2所述的方法，其中，步骤1)中，细胞接种密度为1×10⁴-1×10⁵个细胞/cm²，细胞培养温度为37℃，所使用的细胞培养液用量为125mL/层～300mL/层。

4.根据上述方案1～3中任一项所述的方法，其中，步骤2-1)中，所述的洗涤为向细胞工厂中加入洗涤液，洗涤液均匀流至每层后轻轻前后晃动至少1min，共洗涤1-5次，其中，所使用洗涤液用量为40mL/层-150mL/层。

5.根据上述方案1～4中任一项所述的方法，其中，步骤2-2)中，消化温度为37℃，所使用消化液用量为20mL/层-70mL/层，当大于60％的动物细胞从细胞工厂培养表面上脱落时，去除部分消化液，剩余10体积％-30体积％消化液继续消化。

6.根据上述方案1～5中任一项所述的方法，其中，细胞培养液、洗涤液、消化液在使用前预热至37℃。

7.根据上述方案1～6中任一项所述的方法，其中，步骤3)中的所述生物反应器中添加有未贴附细胞的空微载体和新鲜培养液，接种后所述生物反应器中微载体的终浓度为2-20g/L，所述细胞的接种密度为1×10⁵至1×10⁶个细胞/mL。

8.根据上述方案1～7中任一项所述的方法，其中，所述的洗涤液为无钙离子且无镁离子的平衡盐溶液；所述的消化液为含0.1-0.5％(w/v)胰蛋白酶的无钙离子且无镁离子的平衡盐溶液。

9.根据上述方案1～8中任一项所述的方法，其中，所述的洗涤液中还包含0.01-0.03％(w/v)的EDTA；所述的消化液中还包含0.01-0.03％(w/v)的EDTA。

10.根据上述方案1～9中任一项所述的方法，其中，步骤1)和2)重复进行，直至获得步骤3)所需的细胞数量。

发明效果

本发明所述的方法中，采用细胞工厂代替传统培养工艺中的细胞培养瓶，应用其实现生物反应器微载体培养前的动物细胞放大培养，主要可实现以下的有益技术效果：

(1)节约生产空间，简化操作步骤，显著节约了生产成本与劳动力成本。

(2)细胞活力大，细胞回收率高，细胞扩大培养效率高。

(3)减少了转瓶培养的细胞生长状况不均一，潜在污染威胁大等缺点，增加了生产工艺可控性。

具体实施方式

本发明技术方案如下：

1)在细胞工厂中培养细胞；2)对步骤1)中在细胞工厂中培养的细胞进行消化；3)将步骤2)中所获得细胞悬液接种至生物反应器中，进行生物反应器微载体培养。

本发明方法中，优选地，步骤1)为：将细胞工厂预热至少1小时，使细胞工厂各层温度均达到细胞培养温度，添加细胞培养基及细胞悬液至细胞工厂，细胞接种密度为5×10³-1×10⁵个细胞/cm²，细胞培养温度为36℃-38℃，细胞培养pH7.0-7.8，所使用的细胞培养液用量为125mL/层～325mL/层。

其中，细胞接种密度优选为1×10⁴-1×10⁵个细胞/cm²，细胞培养温度优选为37℃，所使用的细胞培养液用量优选为125mL/层～300mL/层。

本发明中，可在上述步骤1)进行至细胞生长为单层，细胞汇合度不小于80％时进行步骤2)。

其中，步骤2)包括以下步骤2-1)～2-3)。

2-1)洗涤：去除细胞工厂中的细胞培养液，用pH7.4-8.0的洗涤液洗涤所培养的细胞。

优选地，步骤2-1)中所述的洗涤为向细胞工厂中加入洗涤液，洗涤液均匀流至每层后轻轻前后晃动至少1min，共洗涤1-5次，其中，所使用洗涤液用量为40mL/层-150mL/层。

更具体地，上述步骤2-1)可以是：倒出细胞培养液，向细胞工厂中加入40mL/层-150mL/层，优选40mL/层-120mL/层洗涤液(加入方式如后所述)，洗涤液均匀的流至每层后轻轻前后晃动至少1min，以洗涤每层培养室培养表面并移除所有残余细胞培养基及血清，倒出洗涤液。共洗涤1-5次，优选2-3次，倒出洗涤液。通过采用上述优选范围，可彻底洗涤除去残余细胞培养基及血清，同时不会洗涤过度使易于消化的细胞提前脱落。

优选地，上述洗涤液为无钙离子且无镁离子的平衡盐溶液；所述的消化液为含0.1-0.5％(w/v)胰蛋白酶的无钙离子且无镁离子的平衡盐溶液。优选地，所述的洗涤液中还包含0.01-0.03％(w/v)的EDTA；所述的消化液中还包含0.01-0.03％(w/v)的EDTA，从而可以消化难被消化的细胞。

本发明中所述EDTA指乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)或其盐如乙二胺四乙酸一钠、乙二胺四乙酸二钠。其主要作用在于排除Ca²⁺、Mg²⁺等维持完整性的离子，使细胞之间裂解，以分散细胞。

本发明中所述平衡盐溶液(Balanced Salt Solution：BSS)又称生理盐水或盐溶液，其本身具有维持渗透压，调控酸、碱度平衡的作用，同时能供给细胞生存所需的能量和无机离子成分；用以洗涤组织、细胞以及配置各种培养用液的基础溶液，例如可为Ringer液、PBS液、Tyrode液、Earle液、Hanks液、Dulbecco液、D-Hanks液和Eagle液等平衡盐溶液。由于钙、镁离子是细胞膜的重要组成成分，它们有促使细胞凝聚作用。因而配置离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时，宜采用钙、镁离子含量低的Dulbecco液和无钙、镁的D-Hanks液，或更为简单的PBS液。

2-2)消化：去除步骤2-1)所述洗涤液，向细胞工厂中加入pH7.4-8.0的消化液，轻轻前后晃动细胞工厂确保消化液均匀流至每层，在36℃-38℃进行细胞消化，其中，所使用消化液用量为20mL/层-80mL/层；当大于60％的动物细胞从细胞工厂培养表面上脱落时，去除部分消化液，剩余10体积％-35体积％消化液继续消化。

步骤2-2)中，消化温度优选为37℃，所使用消化液用量优选为20mL/层-70mL/层，当大于60％的动物细胞从细胞工厂培养表面上脱落时，去除部分消化液，剩余10体积％-30体积％消化液继续消化。

本发明中，优选地，细胞培养液、洗涤液、消化液在使用前加热至37℃。

2-3)收获：当大于85％的动物细胞从细胞工厂培养表面上脱落时，向细胞工厂内加入含血清的或含消化液抑制剂的新鲜细胞培养基终止消化并重悬细胞，重复加入1-3次所述新鲜细胞培养基并收集所得细胞悬液。

本发明中，优选地，步骤1)和2)重复进行，直至获得步骤3)所需的细胞数量。

本发明的步骤3)中，将细胞工厂中获得的细胞悬液按适宜细胞接种密度接种至生产规模的生物反应器中，调节生物反应器的温度、培养液pH值、溶氧浓度等参数，使细胞生长于最适宜环境中。步骤3)中的细胞培养方式可为批培养、流加培养与灌注培养。

优选地，本发明的步骤3)中的所述生物反应器中添加有未贴附细胞的空微载体和新鲜培养基，接种后所述生物反应器中微载体的终浓度为2-20g/L，所述细胞的接种密度为1×10⁵至1×10⁶个细胞/mL。

本发明中所说的细胞工厂又名cell factories或cell stack，指由组织级聚苯乙烯制备而成的，特别适合于贴壁细胞培养、也可用于悬浮细胞培养的，可应用于如疫苗、单克隆抗体或生物制药等工业规模生产的细胞静止培养装置，通常具有1层、2层、4层、10层及40层等五种规格。现常用的细胞工厂有如由赛默飞世尔科技提供的Nunc细胞工厂(Nunc Cell Factory)、NuncEasyFill^TM细胞工厂(Nunc EasyFill^TM Cell Factory)、Nunc活性通气细胞工厂(Nunc Cell Factories for Active Gassing)和如由康宁(Corning)公司提供的聚苯乙烯细胞工厂-经组织培养物处理表面(Polystyrene 

-TissueCulture Treated)、

聚苯乙烯细胞工厂(

Polystyrene Cell

)、聚苯乙烯细胞工厂-超低附着率表面(Polystyrene

-Ultra-Low Attachment)等。本发明中的细胞工厂，没有特别限定，使用本领域中通常使用的细胞工厂。

通常，细胞工厂加液方法有如下两种：

(1)通过加样盖与管道加液

在超净工作台下打开细胞工厂包装，取下加样孔上的通气盖换上加样盖，将培养室侧倒，加样孔靠近底部，连接加样盖到经过消毒的含有悬浮细胞的容器中；将装有细胞培养基或细胞悬液的容器提升至高于培养室的位置，松开夹子使溶液流入培养室内。如果室内压力增加，可以暂时松开带有滤膜的盖子减小压力或者降低加液速度；加液完成后将细胞工厂培养室转90°，使加样孔与透气孔朝上，取下加样盖子，换上原装的带有滤膜的透气盖；轻轻放低细胞工厂培养室至水平培养位置并前后晃动使细胞培养液完全覆盖每个培养室表面，保证细胞能够平铺到每个表面上去。

(2)直接注入加液

将细胞培养基或细胞悬液装于无菌瓶中，在超净工作台下打开细胞工厂包装，通过细胞工厂加样口直接将溶液注入细胞工厂中；将细胞工厂朝有小口一侧放置，平衡液面；将细胞工厂侧向旋转90度，使进液口一面朝上，静置使培养基平均分配至每一层腔室；双手小心握住进液口一侧，将细胞工厂缓缓放倒至水平位。请勿抓握第一层边缘，以免造成损坏。

本发明的步骤1)中可采用上述两种方法中的任一种。

可通过空气过滤器或通气过滤器等附件实现细胞培养中对气体的需要。如在接口处连接空气过滤器，内部气体可由此排出，使细胞工厂内压力不至于过高，外部空气也可进入。或如将混合气体管道连接至通气过滤器，利用外部压力装置通入细胞工厂中。

本发明中，所述加入新鲜细胞培养基中包含血清或胰蛋白酶抑制剂。所述含血清的新鲜细胞培养基是指含有动物血清的新鲜液体培养基，所述动物血清的终浓度可以为1体积％至小于10体积％。所述动物血清可以是牛血清(如胎牛血清)、马血清、兔血清、猴血清和人源血清中的一种或几种。这里所述消化液抑制剂是指针对消化液中消化活性成分的抑制剂，所述抑制剂不应影响被培养细胞的活性。例如，消化液中所含的消化活性成分可以为胰蛋白酶，相应的消化液抑制剂可以为胰蛋白酶抑制剂(如大豆胰蛋白酶抑制剂、南瓜胰蛋白酶抑制剂等)。所述消化液抑制剂的用量以能够终止消化反应为准，一般根据消化液中具体的消化活性成分和消化液抑制剂的说明书确定，例如，美国Sigma-Aldrich的Type I-S大豆胰蛋白酶抑制剂(Cat.No.T6522)，其活性为：1mg所述大豆胰蛋白酶抑制剂可抑制1-3mg活性为每毫克蛋白约10000苯甲酰精氨酸乙酯单位(benzoyl arginine ethyl ester(BAEE)unit)的胰蛋白酶。

本发明中，根据需要可进行细胞工厂之间的放大培养，例如可以由10层细胞工厂一次性或逐级放大至40层细胞工厂进行培养。用于下一级生物反应器微载体培养的细胞数量或用于下一级细胞工厂培养的细胞数量也可由在多个细胞工厂中平行进行细胞培养获得。

另外，本发明的方法中，还可以包括在细胞工厂中放大培养细胞前，复苏培养种子细胞，制备接种细胞工厂的细胞悬液的步骤。

所述复苏培养细胞的步骤可以按照本领域公知的操作来进行，没有特别限定，例如可以是：在例如方瓶(T-flask)、转瓶(Roller)或搅拌瓶的细胞培养瓶中扩增培养细胞，挑选细胞形态较好的细胞消化制备细胞悬液用于接种细胞工厂。

能够用于本发明的生产生物制品的方法的宿主细胞可以为生物制品生产最常用的细胞，优选为贴壁生长细胞或兼性贴壁细胞，例如哺乳动物传代细胞，如非洲绿猴肾细胞的传代细胞系Vero细胞、幼仔地鼠肾的传代细胞系BHK21细胞、猴肾细胞的传代细胞系Marc145细胞或MA104细胞、中华仓鼠卵巢细胞的传代细胞系CHO细胞、猪肾细胞的传代细胞系PK15细胞、猪肾细胞的传代细胞系IBRS-2细胞、猪睾丸细胞的传代细胞系ST细胞或Mardin Darby犬肾细胞的传代细胞系MDCK细胞等；例如人二倍体细胞，如2BS细胞、KMB-17、MRC-5细胞等。

能够以利用本发明大规模培养的细胞作为宿主细胞的生物制品，均可利用本发明的细胞培养体系来生产。例如可用Vero细胞生产的人用狂犬病纯化疫苗、脊髓灰质炎灭活纯化疫苗、肾综合征出血热纯化疫苗、乙型脑炎纯化疫苗、甲型肝炎疫苗，以及兽用狂犬疫苗和小反刍兽疫疫苗等，可用BHK21细胞生产的口蹄疫病毒疫苗、狂犬疫苗，可用Marc145细胞或MA104细胞生产的猪蓝耳病疫苗，可用PK细胞或ST细胞生产的猪瘟疫苗，可用ST细胞或IBRS-2细胞生产的猪细小病毒疫苗，可用CHO细胞生产的乙肝疫苗，如分别使用2BS、KMB-17、MRC-5细胞作为宿主细胞的甲型肝炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗、风疹减毒活疫苗、水痘减毒活疫苗等。

能够用于动物细胞大规模培养的动物细胞培养生物反应器均可用于本发明的生物制品生产方法中，包括但不限于搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、固定床和流化床生物反应器、中空纤维反应器、膜生物反应器、一次性生物反应器等。

本发明中所述动物细胞优选为贴壁生长细胞或兼性贴壁细胞，其合适的生长和/或增殖需要附着于培养基质之上，所述培养基质指用于吸附细胞的任何物质。在方瓶、转瓶等细胞培养瓶中或细胞工厂中所述培养基质可以为细胞培养瓶或细胞工厂用于细胞生长的内表面，在搅拌瓶或生物反应器中，所述培养基质可以为微载体、FibraCel Disks载体或多孔载体等载体介质。

本发明中所述载体没有特别限定，可为所有能用于细胞培养的常用微载体，很多微载体都已经是商业化产品，可以通过商业途径获得。优选所述微载体为Cytodex系列微载体、Cytopore系列微载体、Cytoline系列微载体和/或

Disks微载体。

除非特别说明，本发明使用的各种试剂均可以商购，也可以采用本领域常用的方法制备。用于细胞培养的试剂，不仅纯度要求高，优选分析纯，而且不能存在任何影响细胞正常生理活动的物质，因此还需要符合医药制品的要求，优选注射级原料药。

实施例

实施例1

细胞工厂-120L生物反应器微载体培养Marc145细胞生产蓝耳病疫苗

首先，复苏液氮中冻存的Marc145细胞，经方瓶、转瓶依次扩增培养，最终扩增至4个培养面积为850cm²的转瓶中，消化获得游离细胞悬液，其中，所用细胞培养液为适用于Marc145细胞培养的改良DMEM细胞培养基(CatNo.MD210，北京清大天一科技有限公司)。将上述获得细胞悬液分为等量的两份，一份用于下述实验，另一份用于比较例1。

然后，按照以下步骤在细胞工厂中进行培养Marc145细胞的放大培养。

1)在10层细胞工厂中培养Marc145细胞

将1个10层细胞工厂(1个CF10，Coming公司生命科学部制造)在温室中预热1个小时，使细胞工厂各层温度均达到37℃。将上述转瓶培养消化所获得的细胞悬液添加到预热至37℃的细胞培养液中并混合均匀，然后用无菌的500mL Schott-Duran试剂瓶将混合液通过加样口直接倒入细胞工厂培养室中。将培养室稍微倾斜减少泡沫产生，然后将培养室侧放，使每个培养室液面达到平衡；将细胞工厂放入温室培养细胞，其中细胞接种密度为4×10⁴个细胞/cm²，细胞培养温度为37℃，细胞培养液pH7.2，所使用的细胞培养液用量为200mL/层。

2)消化在10层细胞工厂中培养的Marc145细胞

2-1)当细胞工厂中细胞汇合度大于80％，细胞生长为单层时，进行细胞消化。在超净工作台下拧开并移除过滤盖，倒出细胞培养液，然后加入50mL预热至37℃的洗涤液，洗涤液均匀流至每层后轻轻前后晃动1min，弃去后再次加入洗涤液进行洗涤，其中洗涤液为pH7.6的含0.02％(w/v)EDTA的无Ca离子且无Mg离子的磷酸缓冲液(PBS)。

2-2)弃去洗涤液后加入40mL预热至37℃的消化液，轻轻前后摇晃细胞工厂使消化液完全浸到细胞，在37℃进行细胞消化。在约60％细胞从细胞工厂培养表面上脱落时，弃去部分消化液，剩余30体积％消化液继续进行消化，其中消化液为pH 7.6的含0.2％(w/v)胰蛋白酶的磷酸缓冲液(PBS)。

2-3)继续消化3min后约85％的细胞从细胞工厂培养表面上脱落时，向细胞工厂中泵入含有5体积％小牛血清的新鲜细胞培养液终止消化。将10层细胞工厂先侧放使加入的新鲜细胞培养液均匀流至每层，然后使细胞工厂竖立并轻轻摇动以重悬细胞。将所得细胞悬液泵入10L灭菌桶中。按如上步骤再次加入含有5体积％小牛血清的新鲜细胞培养液进行细胞重悬，并将所得细胞悬液同样泵入上述10L灭菌桶中，收集两次所得的细胞悬液。利用血球计数板对所得细胞悬液进行细胞计数，所得结果除以消化前细胞数量估算结果，计算得到细胞回收率为99％。利用台盼蓝排斥实验测得细胞活力为98％。

3)120L生物反应器微载体大规模培养Marc145细胞

预先水化微载体，并对承载水化微载体的120L生物反应器(北京清大天一科技有限公司)进行在位清洗和灭菌。将步骤2)所得细胞悬液接种至所述120L生物反应器中，其中，生物反应器中添加有未贴附细胞的空微载体和新鲜培养基，细胞培养体积为70L，微载体Cytodex-1，微载体终浓度为5g/L，细胞的接种密度为2×10⁵个细胞/mL；

在37℃、pH7.2、溶氧50％的条件下，在生物反应器中扩增培养细胞，培养至细胞密度为2×10⁶个细胞/mL时，利用台盼蓝排斥实验测得所得细胞活力为98％。将细胞培养液更换为维持培养液，按病毒感染复数MOI为0.015的量接种猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXAl株。病毒培养条件：在37℃、pH7.6、溶氧50％的条件下培养病毒。培养4天后收获所得疫苗，检测病毒滴度TCID₅₀为8.0(lgTCID₅₀/mL)。

实施例2-4

按照表1记载的条件，按照与实施例1相同的操作，进行了实施例2-4，得到可用于下游生物制品生产的大规模培养动物细胞。

表1

比较例1

将实施例1中得到的另外一份细胞悬液接种至8个培养面积为850cm²的转瓶中，其中细胞接种密度为4×10⁴个细胞/mL；然后在37℃、pH7.2、转速12rph的条件下培养至细胞生长至良好单层；倾去转瓶中培养液，加入150mL的含0.02％(w/v)EDTA的胰蛋白酶消化液，在37℃下消化至细胞附着松动、细胞边缘卷起且细胞间的间隔加大，倒去消化液，加入含有5体积％小牛血清新鲜细胞培养液后重悬细胞，获得游离细胞悬液；利用血球计数板对所得细胞悬液进行细胞计数，所得结果除以消化前细胞数量估算的结果，计算得到细胞回收率为90％。利用台盼蓝排斥实验测得细胞活力为92％；

将所得细胞悬液接种至120L生物反应器中，进行与实施例1中步骤3)条件一致的操作，测定所培养病毒滴度值TCID₅₀/mL为7.4。

比较上述实施例和比较例可知，本发明用细胞工厂放大培养动物细胞的方法，与以往用转瓶培养细胞的方法相比，通过严格控制细胞培养条件和细胞消化条件，减小了在用细胞工厂放大培养动物细胞过程中的消化等操作对细胞所造成的损伤，获得了更高的细胞回收率和细胞活力，提高了细胞放大培养效率，降低了生产成本。

Claims (9)

1.一种动物细胞放大培养的方法，其包括以下步骤：

1）在细胞工厂中培养动物细胞；

2）对步骤1）中在细胞工厂中培养的细胞进行消化，其包括以下步骤：

2-1）洗涤：去除细胞工厂中的细胞培养液，用pH7.4-8.0的洗涤液洗涤所培养的细胞，所述洗涤液为无钙离子且无镁离子的平衡盐溶液；

2-2）消化：去除步骤2-1）所述洗涤液，向细胞工厂中加入pH7.4-8.0的消化液，轻轻前后晃动细胞工厂确保消化液均匀流至每层，在36℃-38℃进行细胞消化，其中，所使用消化液用量为20mL/层-80mL/层，当大于60%的动物细胞从细胞工厂培养表面上脱落时，去除部分消化液，剩余10体积%-35体积%消化液继续消化，所述消化液为含0.1-0.5%(w/v)胰蛋白酶的无钙离子且无镁离子的平衡盐溶液；

2-3）收获：当大于85%的动物细胞从细胞工厂培养表面上脱落时，向细胞工厂内加入含血清的或含消化液抑制剂的新鲜细胞培养液终止消化并重悬细胞，重复加入1-3次所述新鲜细胞培养液并收集所得细胞悬液；

3）将步骤2）中所获得的细胞悬液接种至生物反应器中，进行生物反应器微载体培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1）为：将细胞工厂预热至少1小时，使细胞工厂各层温度均达到细胞培养温度，添加细胞培养液及细胞悬液至细胞工厂，细胞接种密度为5×10³-1×10⁵个细胞/cm²，细胞培养温度为36℃-38℃，细胞培养液pH7.0-7.8，所使用的细胞培养液用量为125mL/层～325mL/层。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤1）中，细胞接种密度为1×10⁴-1×10⁵个细胞/cm²，细胞培养温度为37℃，所使用的细胞培养液用量为125mL/层～300mL/层。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，步骤2-1）中，所述的洗涤为向细胞工厂中加入洗涤液，洗涤液均匀流至每层后轻轻前后晃动至少1min，共洗涤1-5次，其中，所使用洗涤液用量为40mL/层-150mL/层。

5.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，步骤2-2）中，消化温度为37℃，所使用消化液用量为20mL/层-70mL/层，当大于60%的动物细胞从细胞工厂培养表面上脱落时，去除部分消化液，剩余10体积%-30体积%消化液继续消化。

6.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，细胞培养液、洗涤液、消化液在使用前预热至37℃。

7.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，步骤3）中的所述生物反应器中添加有未贴附细胞的空微载体和新鲜培养液，接种后所述生物反应器中微载体的终浓度为2-20g/L，所述细胞的接种密度为1×10⁵至1×10⁶个细胞/mL。

8.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述的洗涤液中还包含0.01-0.03%(w/v)的EDTA；所述的消化液中还包含0.01-0.03%(w/v)的EDTA。

9.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，步骤1）和2）重复进行，直至获得步骤3）所需的细胞数量。