CN107267468A - 一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法 - Google Patents

一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法，包括以下步骤：将种子细胞在血清含量为8％的培养基中培养3代，再于血清含量为5％的培养基培养3代，最后用血清含量为2％的培养基培养3代，然后按血清含量为1％、0.5％、0.2％、0的降低方式培养种子细胞至每个阶段连续3天细胞活力均高于90％后，置于生物反应器中扩大培养，将增殖后的伪狂犬病毒按MOI＝1接入所得扩大培养后的种子细胞中再次进行扩大培养，制得病毒液。该制备工艺稳定，重复性好，病毒滴度高，能有效降低生产成本，易规模化放大培养，可显著提高产品质量，提高批次间同一性。

Description

一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法
技术领域
本发明属于疫苗生产技术领域，具体涉及一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法。
背景技术
1951年Earle等成功开发出能促进动物细胞体外培养的培养基。1957年Graff用灌注培养法悬浮培养细胞，数量达到1×1010-2×1010cell/L。1962年Capstick成功地大规模悬浮培养小鼠肾细胞，标志着动物细胞大规模培养技术的起步。1967年，Van Wezel开发了微载体，并实现在生物反应器中大规模培养贴壁细胞。悬浮培养与微载体培养标志着大规模培养技术的开始，细胞生产病毒疫苗也成为细胞大规模培养技术生产生物制品的第一次浪潮。从20世纪八十年代起，国内、外研究机构开发出了低血清、无血清细胞及悬浮培养技术，并应用到口蹄疫疫苗生产中，规模从2000L-8000L生物反应器。2000年以后，随着流加培养、灌注培养、个性化细胞培养基等技术的发展，做为大规模培养主要设备的生物反应器规模也趋向大型化和简单化。国际上悬浮培养技术发展较快，已趋向成熟，是疫苗、抗体等生物制品生产的普遍生产工艺模式。
当今生物制药的主流技术是在大型机械搅拌式生物反应器中，用无血清培养基和低血清培养工艺悬浮培养细胞进行生产。
伪狂犬病又称Aujeszky病是由伪狂犬病毒(Pseudrabies virus,PRV)所引起的多种家畜及野生动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要特征的急性传染病，尤其是危害全球养猪业的重大传染病之一。随着中国规模化和集约化养猪业的发展，从国外引进的种猪相应增多，伪狂犬病随之传入并不断蔓延扩大，给养猪业造成了巨大的经济损失，中国将其列为二类传染病。由于被感染的动物种类极多，病毒可在自然界反复循环存在，属于典型的自然疫源性疾病，因此也是极难防制的传染病之一。由于PRV目前尚无有效的药物治疗方法，主要依靠疫苗接种、隔离感染猪群、淘汰隐性感染动物得到控制。
目前，国内生产伪狂犬疫苗主要依靠转瓶培养方法，与转瓶培养工艺相比，悬浮培养最大的技术优势在于：第一，单位体积内有效工作细胞数量增加；第二、全密闭、管道化系统生产流程及过程自动化监控、控制技术，不仅减少了污染细胞的机会，而且在减轻劳动力强度的同时减少人为操作因素影响；第三、生物反应器容积的扩大，提升了终端产品的均一性，结合后期纯化工艺，不但产品产量明显提高，产品的质量获得提高；第四、生产疫苗所用劳动力和车间、水、点、原材料、能源等成本远低于传统培养工艺，综合成本大大降低。与贴壁细胞微载体培养相比，更节约成本、易于规模化放大生产，提高产品的安全性和稳定性，但是目前暂无生产伪狂犬弱毒活疫苗的悬浮培养工艺及其应用的相关报道。
如何通过无血清培养和生物反应器悬浮培养工艺进一步提高兽用伪狂犬疫苗的质量和产量，是目前本领域研究的重点和难点。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法，可实现伪狂犬病毒的大规模扩增，能有效降低生产成本，显著提高产品质量。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法，包括以下步骤：
(1)种子细胞活化
将液氮冻存的种子细胞先用血清含量为8％的低血清悬浮培养基(BBSMMD910)活化，培养3代后，然后用血清含量为5％的低血清悬浮培养基培养3代，再用血清含量为2％的低血清悬浮培养基培养3代；
(2)种子细胞的无血清驯化
将低血清悬浮培养基中血清含量从2％降低至1％，培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，将血清含量降低至0.5％，培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，将血清含量降低至0.2％，培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，将血清含量降低至0，采用无血清悬浮培养基BSFM连续传代培养，每代培养72h，至培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，停止驯化；
(3)在生物反应器中培养
将驯化后的种子细胞置于生物反应器中培养，培养3-6天，观察细胞密度及活力的变化；
(4)伪狂犬病毒的增殖
将伪狂犬冻干种毒接种于生长良好的ST单层细胞中进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24-48h，待病变达到80％以上时，收获伪狂犬病毒液；因悬浮细胞对病毒的敏感性比贴壁细胞要低，因此将伪狂犬病毒在贴壁繁殖一代，再接悬浮细胞才能获得高滴度的病毒含量；
(5)接种病毒
当生物反应器中种子细胞密度达到7.0×106cell/ml以上时，按MOI＝0.5-2接种步骤(4)获得的伪狂犬病毒液；当MOI偏低时，产生的病毒含量就会偏低，当MOI偏高时，病毒含量虽有所升高，但培养及收毒时间都要延长4-8h，且代谢副产物增多，影响病毒质量；
(6)病毒规模化培养
将步骤(5)所得混合物置于生物反应器中培养，培养至细胞病变≥60％且溶氧曲线保持稳定状态时，收获病毒液，于-80℃保存。
进一步地，种子细胞为BHK21。
进一步地，步骤(2)驯化得到的种子细胞活力高于90％。
进一步地，步骤(3)中驯化后的种子细胞初始密度为6×105cell/ml。
进一步地，步骤(3)中培养温度为37℃，转速为40r/min，溶氧为40-50％，pH值为7.1-7.3。
进一步地，步骤(5)中按MOI＝1接种步骤(4)获得的伪狂犬病毒液。
进一步地，步骤(6)中培养温度为36±0.5℃，转速为15r/min，溶氧为40-50％，pH值为7.2-7.4。
本发明提供的一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法，具有以下有益效果：
(1)本发明通过先快速降低血清含量，再慢速降低血清含量，该方式有利于维持细胞密度及活率，当血清从1％降低至0时，由于细胞要耐受一个无血清的过程，通过缓慢降低血清比例，BHK21细胞有一个适应过程，不至于突然进入无血清环境产生不适应而影响细胞状态，通过这种降低血清的比例方式对BHK21细胞的生长更有利，使获得的BHK21种子细胞活力高于96％，密度达到7.5×106cell/ml，该细胞可较好的使伪狂犬病毒增殖，使伪狂犬病毒滴度大于108.0TCID50/0.1ml，可将其用于伪狂犬病毒疫苗的生产，可避免动物血清带来的风险。
(2)制备工艺稳定，重复性好，病毒滴度高，能有效降低生产成本，易规模化放大培养，可显著提高产品质量，提高批次间同一性。
附图说明
图1为种子细胞BHK21的无血清驯化图。
图2为将驯化完成的BHK21细胞在无血清培养基中培养的生长曲线图。
图3为将驯化完成的BHK21细胞在无血清培养基中培养的细胞活力变化图。
具体实施方式
实施例1
一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法，包括以下步骤：
(1)种子细胞的活化
向500ml摇瓶中添加100ml细胞基本培养基(BBSM MD910)，按8％(V/V)比例加入新生牛血清(购于内蒙古金源康生物工程有限公司)，然后接入液氮冻存的种子细胞BHK21，培养培养3代后，然后将新生牛血清含量降低为5％的培养基培养3代，所得种子细胞BHK21密度为6×105cell/ml，再新生牛血清含量降低为2％的培养基培养3代，制得BHK21悬浮细胞株；
(2)种子细胞的无血清驯化
将BHK21悬浮细胞株接入新生牛血清含量为1％的培养基中培养，培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，将血清含量降低至0.5％，培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，将血清含量降低至0.2％，培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，将血清含量降低至0，采用无血清悬浮培养基BSFM连续传代培养，每代培养72h，至培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，停止驯化；
种子细胞BHK21的无血清驯化图见图1，其中图1-1为细胞驯化期间的生长情况，图1-2为细胞驯化期间的比生长速率。由图1可知，将BHK21贴壁细胞脱离转入无血清培养基中进行培养时，初期细胞表现出不适应的情况，平均比生长速率从初始的化0.66d-1跌至化0.09d-1；经过5代左右的驯化，细胞的平均比生长速率逐渐増加至0.88d-1左右，但波动较大；驯化至7-8代时，BHK21悬浮细胞的平均比生长速率稳定在化0.90d-1；整个驯化过程中BHK细胞的活力始终维持在90％以上。
将驯化完成的BHK21细胞在无血清培养基中培养，其生长曲线见图2，细胞活力变化情况见图3。
由图2可知，将驯化完成的BHK21细胞在无血清培养基中培养时，初始接种密度为0.6×106/ml，培养24h后进入对数生长期，培养至72h，细胞密度达到高峰，为7.5×106/ml，随后，细胞密度逐渐降低至144h的0.8×106/ml。
由图3可知，初始细胞活率在98.4％，培养24h、48h后活率基本保持不变，培养至72h时，细胞活率降低至97.5％，随着代谢副产物的增加及营养物质的不断消耗，若继续培养细胞则不能满足细胞的生长需求，导致细胞活率逐渐降低。
(3)在生物反应器中培养BHK21细胞
将驯化后的种子细胞按初始密度为6×105cell/ml接入7L搅拌罐生物反应器中培养，培养温度为37℃，转速为40r/min，溶氧为40-50％，pH值为7.1-7.3，培养时间为72h；
(4)伪狂犬病毒的增殖
将伪狂犬冻干种毒1支接种于生长良好的ST单层细胞中进行培养，培养温度为37℃，培养时间为48-72h，待病变达到80％以上时，收获伪狂犬病毒液，测定病毒滴度；因悬浮细胞对病毒的敏感性比贴壁细胞要低，因此将伪狂犬病毒在贴壁繁殖一代，再接悬浮细胞才能获得高滴度的病毒含量；
(5)接种病毒
当生物反应器中种子细胞密度达到7.0×106cell/ml以上时，按MOI＝1接种步骤(4)获得的伪狂犬病毒液；当MOI偏低时，产生的病毒含量就会偏低，当MOI偏高时，病毒含量虽有所升高，但培养及收毒时间都要延长4-8h，且代谢副产物增多，影响病毒质量；MOI对病毒滴度的影响结果见表1。
(6)病毒规模化培养
将步骤(5)所得混合物置于75L生物反应器中培养，培养温度为36±0.5℃，转速为15r/min，溶氧为40-50％，pH值为7.2-7.4，培养30h后，细胞病变≥60％且溶氧曲线保持稳定状态时，收获病毒液，于-80℃保存，在培养期间，最大细胞密度可达7.0×106cell/ml以上，病毒滴度峰值达到108.6TCID50/0.1ml。
传统方法采用转瓶培养方式培养，培养基为血清含量为8％的低血清培养基，转瓶培养和反应器全悬浮培养，其BHK21细胞毒价见表2；反应器无血清培养与转瓶培养经济效益对比结果见表3。
表1接毒量(MOI)对病毒滴度的影响结果
由表1可知，当接种量偏低时，病毒滴度偏低，在一定范围内随着接种量的增加，病毒滴度随之增加，但当接种量超过1时，病毒滴度降低，因此当MOI＝1时，病毒滴度较高，副产物也少，病毒质量较好。
表2转瓶培养和反应器全悬浮培养的病毒毒价对比
表3反应器无血清培养与转瓶培养经济效益对比
综上所述，本发明通过先快速降低血清含量，再慢速降低血清含量，最终驯化得到无血清培养的种子细胞，该种子细胞活力高，密度大，能够很好的培养伪狂犬病毒，在特定的接种量情况下，使伪狂犬病毒迅速增殖，提高其滴度，再结合生物反应器的培养，能够控制其产品效力，提高批次间同一性，节约劳动力，降低对车间条件的要求。

Claims (7)

1.一种无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)种子细胞活化
将液氮冻存的种子细胞先用血清含量为8％的培养基培养3代后，然后用血清含量为5％的培养基培养3代，再用血清含量为2％的培养基培养3代；
(2)种子细胞的无血清驯化
将培养基中血清含量从2％降低至1％，培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，将血清含量降低至0.5％，培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，将血清含量降低至0.2％，培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，将血清含量降低至0，传代培养，每代培养72h，培养至连续3天种子细胞活力均高于90％，停止驯化；
(3)在生物反应器中培养
将驯化后的种子细胞置于生物反应器中培养，培养3-6天；
(4)伪狂犬病毒的增殖
将伪狂犬病毒接种于生长良好的ST单层种子细胞进行培养，培养温度为37℃，培养时间为24-48h，待病变达到80％以上时，收获伪狂犬病毒液；
(5)接种病毒
当生物反应器中种子细胞密度达到7.0×106cell/ml以上时，按MOI＝0.5-2接种步骤(4)获得的伪狂犬病毒液；
(6)病毒规模化培养
将步骤(5)所得混合物置于生物反应器中培养，培养至细胞病变≥60％且溶氧曲线保持稳定状态时，收获病毒液，于-80℃保存。
2.根据权利要求1所述的无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法，其特征在于，种子细胞为BHK21。
3.根据权利要求1所述的无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法，其特征在于，步骤(2)驯化得到的种子细胞活力高于90％。
4.根据权利要求1所述的无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法，其特征在于，步骤(3)中驯化后的种子细胞初始密度为6×105cell/ml。
5.根据权利要求1所述的无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法，其特征在于，步骤(3)中培养温度为37℃，转速为40r/min，溶氧为40-50％，pH值为7.1-7.3。
6.根据权利要求1所述的无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法，其特征在于，步骤(5)中按MOI＝1接种步骤(4)获得的伪狂犬病毒液。
7.根据权利要求1所述的无血清悬浮培养伪狂犬病毒的方法，其特征在于，步骤(6)中培养温度为36±0.5℃，转速为15r/min，溶氧为40-50％，pH值为7.2-7.4。
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