CN112342185B

CN112342185B - 一种鸡胚细胞狂犬病病毒的生物反应器工艺

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Publication number: CN112342185B
Application number: CN202011256730.XA
Authority: CN
Inventors: 罗姗; 李慧; 王春华; 周维; 陈楚如; 吴灼斌; 洪玮琪; 黄致翔; 曹静; 梁琳琳; 郭采平; 黄伟荣; 李云富; 刘永娣; 刘璐; 谭梦思; 刘爱和; 李彬; 梁富; 徐尔赞
Original assignee: Shenzhen Weiguang Biological Products Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Weiguang Biological Products Co Ltd
Priority date: 2020-11-11
Filing date: 2020-11-11
Publication date: 2022-12-02
Anticipated expiration: 2040-11-11
Also published as: CN112342185A

Abstract

本发明涉及一种鸡胚细胞狂犬病病毒的生物反应器工艺；是在具有固定床篮式搅拌系统的生物反应器中利用片状载体和无血清培养基培养原代鸡胚细胞，通过特定的上罐细胞密度、CTN鸡胚细胞疫苗株—CTNCEC25株（CGMCC No.6510）的接种量和生物反应器设定参数制备高滴度、高抗原的狂犬病病毒收获液。病毒滴度平均不低于7.0 lgFFU/mL，最高可达到8.7lgFFU/mL，抗原含量平均不低于2.0 IU/mL，最高可达4.0 IU/mL，收液可达2‑3个有效培养体积，极大地降低了劳动强度和生产成本，大幅度提高了生产效率，开创了原代细胞大规模培养生产狂犬病病毒的培养方式。

Description

一种鸡胚细胞狂犬病病毒的生物反应器工艺

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，应用于原代鸡胚细胞狂犬病疫苗的生产，尤其涉及一种鸡胚细胞狂犬病病毒的生物反应器工艺。

背景技术

狂犬病(Rabies)是一种由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的古老的侵害中枢神经系统、可引起严重脑脊髓炎的烈性人畜传染病，一旦发病，死亡率几乎为100％。几乎所有温血动物都能感染狂犬病，其中尤其以各种哺乳动物为其主要宿主。目前尚无有效的狂犬病治疗方法，暴露后及时接种狂犬病疫苗是最主要的预防手段。

人用狂犬疫苗经过100多年的发展，由最早的减毒活性疫苗，到禽胚疫苗，发展至现在的细胞培养疫苗和处于实验室阶段的基因工程疫苗，疫苗质量和安全性得到极大提高。欧美及日本等发达国家市场的狂犬病疫苗主要为纯化鸡胚细胞疫苗(PCECV)和纯化人二倍体细胞疫苗(PHDCV)。这两种疫苗安全性高、免疫保护效果好，其中PHDCV是WHO确定的人用狂犬病疫苗的金标准，但由于人二倍体细胞的特性使得其生产规模难以放大，导致PHDCV的产量严重不足，最终销售价格居高不下(目前市面上价格约1500元/人份，而Vero细胞苗价格平均约为300元/人份)，制约其市场规模；PCECV的免疫原性和安全性可与PHDCV相媲美，是安全有效的高质量狂犬病疫苗，其市面上价格约1000元/人份，也显著高于Vero细胞苗价格。在发展中国家，因经济发展水平原因，市场上主要的狂犬病疫苗是生产成本较低的纯化Vero细胞疫苗(PVCV)。由于Vero细胞为无限传代细胞系，存在潜在的致瘤风险以及DNA残余问题，成为其未来市场份额的主要障碍，目前欧美等发达国家已基本淘汰PVCV。

目前中国已上市销售的狂犬病疫苗主要有PVCV、PCECV和PHDCV。由于Vero细胞培养工艺简单、成本低廉、方便扩大培养，因此PVRV已经成为中国人用狂犬病疫苗市场的主力军，生产企业众多，占中国批签发狂苗总量的95％左右。然而，因为Vero细胞为传代细胞系，具有潜在的致癌风险，因此PVRV应用的安全性一直备受争议。另一方面，尽管HDCV是国际公认的金标准产品，但HDCV存在严重缺点，即人二倍体细胞增殖慢，疫苗生产过程太长，病毒繁殖滴度较低，加上生产工艺复杂和产量低，因此疫苗的成本高，价格昂贵，较难在发展中国家推广。而PCECV具有较好的免疫保护性，且与HDCV的效果相当，是HDCV理想替代苗。目前PCECV仅有GSK一家进口中国，尚无国内生产厂家生产，而进行PCECV临床申报的国内某企业采用的是细胞工厂生产工艺。细胞工厂工艺虽然较稳定，批次间差异小，但细胞密度低、病毒滴度低、抗原低，收液体积少，劳动强度大，产业化经济效益低下。

目前，细胞工厂培养工艺是较成熟的鸡胚细胞等原代细胞基质培养方法。中国专利公开号CN108452298A的专利，公开了一种用SPF鸡胚细胞生产黄热病减毒活疫苗的工艺，存在培养细胞密度低、病毒滴度低、劳动强度大等缺点。中国专利公开号为CN1390604的专利，公开了大规模连续生产病毒疫苗的方法，采用的是固定床篮式搅拌系统的CelligenPlus生物反应器，以聚酯切片Fibra-Cel Disks为载体，规模仅为5.0-7.5L，不适合于大规模的狂犬病疫苗生产。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种鸡胚细胞狂犬病病毒的生物反应器工艺，是一种使用固定床生物反应器培养原代鸡胚细胞生产狂犬病病毒的方法，该方法适用于生长缓慢、细胞有丝分裂次数有限，对生长环境要求高的原代细胞培养，可以实现用生物反应器大规模培养鸡胚细胞、生产出高滴度、高抗原的狂犬病病毒收获液。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种固定床生物反应器培养原代鸡胚细胞生产狂犬病病毒的方法，包括以下步骤：

(1)制备原代鸡胚细胞：取9～11日龄的无特定病原体(Specific pathogen-free,SPF)鸡胚，经剪切、胰蛋白酶消化，离心去除消化液，细胞沉淀用无血清培养基重悬后，制备成单个鸡胚细胞悬液。具体而言，上文所述的鸡胚为SPF受精鸡蛋孵育9～11天所得。

(2)细胞接种至生物反应器：在具有固定床篮式搅拌系统的生物反应器中，以NBS片状载体为载体，以无血清培养基为培养基质，接种(1)制备好的原代鸡胚细胞悬液，接种密度2.3～3.6*10⁶个/mL；

(3)接种狂犬病病毒CTNCEC25株：原代鸡胚细胞接种至生物反应器0～8h，以MOI＝0.005～0.05FFU/细胞的感染量，将工作种子批毒种接种至生物反应器内，与原代鸡胚细胞混合均匀，使病毒感染细胞；

(4)调节生物反应器控制参数：温度33℃～37℃，pH值7.3～7.7，搅拌速率≤90rpm，溶氧30％～80％，培养、收获病毒液；

(5)按批次收获病毒液：病毒接种后培养至葡萄糖含量＜3.0g/L、病毒滴度≥6.5lgFFU/mL和抗原含量≥1.0IU/mL，收获病毒上清液；采用全体积收获或者半体积收获3～5次。一般病毒接种后培养至约72h、96h、120h、144h或168h时，收获病毒上清液。病毒收获可根据葡萄糖含量(＜3.0g/L)、病毒滴度(≥6.5lgFFU/mL)和抗原含量(≥1.0IU/mL)，采用全体积收获或者半体积收获以及其适宜的收获时间。一般可收获3～5次，收获体积可达2～3个有效培养体积。其中，病毒滴度检测采用细胞免疫荧光法，抗原检测采用ELISA法，葡萄糖含量检测采用生化检测仪。

进一步的，上文所述的技术方案中所用的胰蛋白酶浓度为0.25％。

进一步的，上文所述的技术方案中，。所述无血清培养基为混合培养基，即优选为在无血清培养基基础上添加了0.1～0.5％人血白蛋白、100～2500ng/mL的葡聚糖硫酸钠的混合培养基；一般情况下，所述的无血清培养基采用主要用于原代鸡胚细胞和狂犬病病毒培养的市售无血清培养基即可，本发明实施例中采用的是上海源培生物科技股份有限公司货号为H5E5L7的市售无血清培养基。优选的，所述混合培养基是在无血清培养基基础上添加了0.3～0.5％人血白蛋白及100～200ng/mL的葡聚糖硫酸钠的混合培养基。

进一步的，上文所述的技术方案中原代鸡胚细胞更适宜的接种密度为2.6～3.0*10⁶个/mL。

进一步的，上文所述的技术方案中采用的片状载体为美国NBS公司或者其他厂家提供的相类似的片状载体，优选的片状载体使用量为15～30g/L，更为优选的使用量为20～25g/L。

进一步的，上文所述的技术方案中更为优选的感染量为0.005～0.01FFU/细胞，

进一步的，上文所述的技术方案中所述狂犬病病毒CTNCEC25株为专利号ZL201410132141.9中所得。实施例1～6中接种反应器进行病毒培养的病毒为CTNCEC25株工作种子批毒种。

进一步的，上文所述的技术方案中，所述步骤(4)更为优选的温度为35℃～37℃、更为优选的pH值为7.4～7.6，更为优选的搅拌速率为60～90rpm，更为优选的溶氧为50％～70％。

进一步的，上文所述的技术方案中，所述病毒收获液的平均病毒滴度＞7.0LgFFU/mL，抗原含量＞2.0IU/mL，收液体积≥2个。

目前由于国家标准的提高，狂犬病疫苗的生产基本都采用生物反应器进行生产，以便各项指标达到《中国药典》的标准。市场上生物反应器和载体种类繁多，其中美国NBS公司的固定床生物反应器因质量好、技术水平高，应用比较广泛，相应的配合使用美国NBS公司生产的片状载体也比较多。但本发明在大量的试验研究过程中发现，应用带有篮式搅拌系统的生物反应器配合相应的聚酯纤维片状载体培养原代鸡胚细胞生产狂犬病病毒，效果也能达到理想要求。病毒滴度平均不低于7.0lgFFU/mL，抗原含量平均不低于2.0IU/mL，收液体积可达2～3个有效工作体积，这个是在同等培养条件下使用搅拌罐生物反应器或其他载体(如Cytodex1微载体、聚酯纤维片状载体等)无法达到的。

与目前狂犬病疫苗现有生产工艺和专利相比，本发明的主要独特性体现在以下方面：

1.本发明采用原代鸡胚细胞作为狂犬病病毒培养用细胞。

原代鸡胚细胞是一类得到普遍应用的禽类原代细胞。与其他原代细胞相比，该细胞相对容易获得，而且增殖能力和适应能力强，具有良好的耐受性，性状比较稳定，不易发生转化，是疫苗生产的重要细胞基质。与Vero细胞相比，其安全性更高。据报道，国内规模化培养原代鸡胚细胞的较成熟工艺为细胞工厂工艺，该方法存在培养细胞密度低、病毒滴度低、劳动强度大等缺点。

2.本发明所用的狂犬病病毒毒株为CTNCEC25株。

生产用疫苗株是生产出高质量疫苗的关键。中国应用的疫苗株主要为aGz株、CTN-1株和Flury株。本发明所用的CTN-1株经原代鸡胚细胞连续传代培养所获得CTN鸡胚细胞疫苗株(具体见发明专利ZL201410132141.9)。经序列比对表明，相比于中国目前使用的aGz株、CTN-1株和Flury株，CTNCEC25株与中国国内分离的流行株具有更高的同源性，因此基于CTN-1株的原代鸡胚细胞疫苗株—CTNCEC25株将更适合于中国狂犬病的防治。

3.本发明可应用美国NBS公司的CELLIGEN310型14L生物反应器或国内厂家生产的其结构和原理与NBS相同的、带有篮式搅拌系统的生物反应器；

篮式搅拌系统的生物反应器模拟细胞静止生长的环境条件，为细胞提供一个类似于转瓶培养的环境，具有剪切力小、培养密度高等优点，可适用于各种动物细胞、昆虫细胞和植物细胞等；可采用分批式、流加式、灌流式等培养模式；通过检测培养基葡萄糖含量测定细胞浓度；本发明采用的分批式培养的主要优点是培养周期短，操作简单，培养基营养物质利用率高，抗原表达浓度比其他方式高。

现有的细胞工厂技术每层需要接种4枚SPF鸡胚制备出来的鸡胚细胞，单次病毒液收获量较小，约50mL/胚，而本发明为130-200ml/胚，更适于规模化生产。

本发明不限于采用NBS公司的CELLIGEN310型14L生物反应器。这对于后期生产工艺放大具有很大的益处，不同的公司可根据自己的成本预算采购相应的中试及商业化生产设备，不必担心不同厂商设备所带来的工艺上的困扰。

本发明可应用NBS公司生产的聚酯纤维片状载体或其他公司生产的相类似的片状载体；

本发明不限于使用NBS公司生产的聚酯纤维片状载体。也就说只要采用的载体材质、结构与NBS载体相同或类似，质量符合相关法规的要求，就可用于原代鸡胚细胞狂犬病疫苗的生产。这对于后期生产工艺放大同样也具有很大的益处，不同的公司可根据自己的成本预算采购相应的中试及商业化生产耗材，不必担心因载体更换所带来的工艺上的困扰。

本发明采用的培养基为无血清培养基。

目前，国内生产疫苗过程中培养鸡胚细胞前期所用的培养液均为M199、DMEM等基础培养基添加适当牛血清。本发明所用的是上海源培生物科技有限公司生产的无血清培养基，该培养基根据原代细胞的生长特性，添加了促细胞贴壁因子、氨基酸等符合《中国药典》的成分，不但有助于细胞贴壁和增殖，而且不含任何动物源性蛋白或牛血清，制品的安全性更高，更符合《中国药典》对生物制品安全性的要求。

本发明采用细胞免疫荧光法测定病毒滴度、ELISA法检测抗原含量，生化检测仪进行葡萄糖含量监测。以上方法经大量前期实验研究表明均可对病毒收获液进行准确、快速的评价，以加快后续工序的处理。

本发明实现了原代鸡胚细胞生产狂犬病病毒的大规模、高密度培养，所获得的病毒收获液滴度不低于7.0lgFFU/mL，抗原含量平均不低于2.0IU/mL，收液体积可达2～3个有效工作体积，还大幅度降低了劳动成本和生产成本。经初步统计，每生产1L病毒收获液，细胞工厂工艺需要使用约5层细胞工厂和20枚鸡胚，生产成本约800元；而固定床生物反应器只需要6.5-10g片状载体和5-8枚鸡胚，生产成本约210-320元。相比之下，本发明工艺更加适合于原代细胞狂犬病疫苗的产业化生产。此外，由于采用无动物源性添加物的无血清培养基进行病毒培养，安全性更高。

附图说明

图1原代鸡胚细胞在片状载体中的生长分布，其中，A-空白片状载体；B、C、D、E、F、G-依次为实例1-6培养5天的片状载体；由图可以看出实例1-6鸡胚细胞在片状载体上的贴壁情况，说明了鸡胚细胞可在片状载体上较好地生长。

图2生物反应器培养原代鸡胚细胞的生长曲线；由图可以看出实例1-6细胞生长全过程的葡萄糖消耗曲线，说明了细胞在生物反应器中迅速进入对数生长期，培养至约44h达到增殖高峰，并维持至96h左右。

图3实施例1-3狂犬病病毒的病毒滴度变化曲线，说明通过优化细胞接种密度至2.3～3.6×10⁶个/mL，培养病毒至96h～120h，病毒收获液的平均病毒滴度＞7.0LgFFU/mL。

图4实施例1-3狂犬病病毒的抗原表达变化曲线，说明通过优化细胞接种密度至2.3～3.6×10⁶个/mL，培养病毒至96h～120h，病毒收获液的平均抗原含量＞2.0IU/mL，收液体积≥2个。

图5实施例4-5狂犬病病毒的病毒滴度变化曲线，说明通过优化搅拌速率至≤90rpm，病毒收获液平均病毒滴度仍可达到7.0LgFFU/mL。

图6实施例4-5狂犬病病毒的抗原表达变化曲线，说明通过优化搅拌速率至≤90rpm，病毒收获液平均病抗原含量＞2.0IU/mL，可达3个收液体积。

图7实施例6狂犬病病毒的病毒滴度和抗原表达变化曲线，说明当培养病毒规模放大至30L，病毒收获液的滴度、抗原含量水平和收获体积都与14L的相当，平均病毒滴度＞7.0LgFFU/mL，抗原含量＞2.0IU/mL，收液体积≥2个。

具体实施方式

下面将结合本发明具体实施例和比较例对本发明技术方案进行清楚完整地描述。

细胞：原代鸡胚细胞，采用9～11日龄SPF鸡胚制备；

毒种：CTNCEC25株，滴度≥7.0lgFFU/mL；

生物反应器：具有固定床篮式搅拌系统的NBS Celligen 310型14L生物反应器或DOE-40L生物反应器；

载体：NBS聚酯纤维片状载体或国产聚酯纤维片状载体；

细胞工厂：NUNC，10层/个，共6320cm²培养面积。

培养基：上海源培生物科技股份有限公司的货号为H5E5L7的无血清培养基主要用于鸡胚细胞及狂犬病毒的培养，也可以用于本发明下述实施例1中直接使用。但由于本发明中鸡胚细胞为从发育9-11日龄的鸡胚中制备而成的原代细胞，因此，本发明下述实施例中，为研究如何提高原代细胞的质量，通过对比实验验证得知，在上述无血清培养基的基础上添加0.5％人血白蛋白和100ng/ml的葡聚糖硫酸钠，由此制备所得的培养基混合物，与未添加的无血清培养基相比，培养细胞的生长状态明显变好，成团细胞减少了80％、细胞活性增加了约2倍。

实施例1

(1)选用9～11日龄、鸡胚发育正常、可见清晰的血管及活动的鸡胚。用0.2％(m/v)新洁尔灭溶液浸泡5～10分钟，然后用75％(v/v)酒精喷淋烧灼消毒。无菌取出鸡胚，放入盛有PBS溶液(pH7.4)的平皿内。去除鸡胚的头，放入灭菌广口瓶内，用无菌剪刀剪切成1～5mm³的组织块，按照每枚鸡胚5～8mL的量加入预热至37℃的0.25％(m/v)胰蛋白酶溶液，置于37℃水浴箱内消化15～30分钟。室温1500～3000rpm离心8～10分钟，去除上清，沉淀用无血清培养基重悬，制备成单个鸡胚细胞悬液。取2mL细胞悬液加入16mL纯化水混合均匀，用浊度仪进行读数，按照下列公式进行计算细胞数量：

细胞密度(个/mL)＝2.4×10⁴×浊度×8

(2)组装生物反应器，固定篮中按照约20g/L的量装入提前高压灭菌处理后的片状载体和PBS溶液(pH7.4)经121℃高压至少120分钟。弃去PBS溶液，加入培养基(含0.5％人血白蛋白和100ng/ml葡聚糖硫酸钠的无血清培养基)，调节pH7.4、温度37℃、搅拌速度70rpm试运行至少24小时以上。加入“(1)”制备好的原代鸡胚细胞悬液，接种密度分别调整为2.3×10⁶个/Ml，培养体积10L。调节pH7.4、温度37℃、搅拌速度70rpm、溶氧70％。

(3)细胞接种至生物反应器4～6小时，按照MOI＝0.01FFU/细胞的量接种狂犬病病毒CTNCEC25株工作种子批毒种。

(4)细胞接种后48小时，将生物反应器内的细胞维持液全部排出，加入同等体积新鲜的培养基，继续培养。生物反应器培养参数调整为温度35℃，pH7.6，溶氧值70％，搅拌速度70rpm。

(5)培养至约72小时开始按照50％或100％有效工作体积收获病毒液，然后补加同等体积新鲜的培养基(含0.5％人血白蛋白和100ng/ml葡聚糖硫酸钠的无血清培养基)，继续培养。生物反应器培养参数调整为温度35℃，pH7.6，溶氧值70％，搅拌速度70rpm。此后每隔大约20～24小时按照50％或100％有效工作体积收获一次，直至葡萄糖消耗量＜0.5g/L。

实施例2

与实施例1的区别在于，生物反应器培养细胞时的细胞接种密度为3.0×10⁶个/mL。

实施例3

与实施例1的区别在于，生物反应器培养细胞时的细胞接种密度为3.6×10⁶个/mL。

实施例4

与实施例1的区别在于，生物反应器培养细胞时的细胞接种密度为3.3×10⁶个/mL，罐内搅拌速为90rpm。

实施例5

与实施例1的区别在于，生物反应器培养细胞时的细胞接种密度为3.3×10⁶个/mL，罐内搅拌速为120rpm。

实施例6

与实施例1的区别在于，生物反应器培养细胞时的细胞接种密度为3.3×10⁶个/mL，罐内培养体积为30L。

比较例1

采用细胞工厂工艺。

与实施例1的区别在于，采用细胞生长液(含10％(v/v)牛血清的M199培养基，pH7.4)按实施例1步骤“(1)”制备单个鸡胚细胞悬液和检测细胞悬液密度；

与实施例1的区别在于，按0.01MOI毒种加入细胞悬液中，混合均匀后按1.0×10⁶个/mL接种至10层细胞工厂，150mL/层。放置37℃二氧化碳培养箱培养48h后，更换为细胞维持液(含0.3％(v/v)人血白蛋白的M199培养基，pH7.6)，34℃培养至120h收获细胞工厂内全部上清。

表1生物反应器和细胞工厂培养狂犬病病毒的病毒滴度、抗原含量和收获液体积

由表1实施例1-3和对比例1结果可看出，本发明在细胞接种密度方面优化的结果：细胞接种密度2.3～3.6×10⁶个/mL，培养至72h时，细胞消耗葡萄糖水平达到最高峰，病毒滴度＞7.0。此时开始全体积或半体积收获病毒液，病毒收获液的平均病毒滴度＞7.0LgFFU/mL，抗原含量＞2.0IU/mL，收液体积≥2个。采用本发明获得的病毒收获液抗原含量是比较例1组的细胞工厂工艺的＞2.5倍，收获体积更是2-3倍，说明在适宜的细胞接种密度下，本发明能够有效地促进鸡胚细胞的增殖和病毒的繁殖，完全达到培养原代鸡胚细胞生产狂犬病病毒的预期效果。

由表1实施例4-5结果可看出，本发明在搅拌速率优化的结果：当搅拌速率提高至90rpm以上时，细胞消耗葡萄糖水平明显开始下降；当病毒增殖至滴度≥7.0LgFFU/mL时开始收获，搅拌速率为90rpm的病毒收获液平均病毒滴度仍可达到7.0LgFFU/mL，抗原含量＞2.0IU/mL，3个收液体积；搅拌速率为120rpm的虽然可收获3个体积，但是病毒收获液平均病毒滴度低于7.0LgFFU/mL，抗原含量小于2.0IU/mL。说明过高的搅拌速率会使得生物反应器内的剪切力对细胞造成明显破坏，不利于细胞生长和病毒的增殖，培养效果反而降低。

由表1实施例6结果可看出，本发明在扩大培养规模的结果：采用40L的生物反应器培养细胞与病毒，病毒收获液的滴度、抗原含量水平和收获体积都与14L的相当，说明本发明在线性放大过程可较好地保护细胞免受机械力及环境变化的影响，并保持较佳的物质和热量传递效果，更适用于大规模化生产。

综上所述，采用本发明培养鸡胚细胞可生产出高滴度、高抗原的病毒收获液，其产能远远高于细胞工厂技术；线性放大至40L仍保持剪切力低、传递效果好、细胞生长密度高等优点，更适用于规模化生产和应用。同时，高质量的病毒收获液为后续纯化，最终制备成狂犬病疫苗奠定了坚实基础。

上述实施方式用来解释本发明，而不是对发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，对落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种鸡胚细胞狂犬病病毒的生物反应器工艺，其特征在于：包括以下步骤：

(1)制备原代鸡胚细胞：取9～11日龄的SPF鸡胚，经剪切、胰蛋白酶消化，离心去除消化液，细胞沉淀用无血清培养基重悬后，制备成单个鸡胚细胞悬液；所用的胰蛋白酶浓度为0.25％；

(2)细胞接种至生物反应器：在具有固定床篮式搅拌系统的生物反应器中，以片状载体为载体，以无血清培养基为培养基质，接种步骤(1)制备好的原代鸡胚细胞悬液，接种密度2.3～3.0*10⁶个/mL；所述的无血清培养基中还添加有0.5％人血白蛋白和100ng/ml的葡聚糖硫酸钠；片状载体的使用量为20g/L；

(3)接种狂犬病病毒CTNCEC25株：原代鸡胚细胞接种至生物反应器4～6h，以MOI＝0.01FFU/细胞的感染量，将工作种子批毒种接种至生物反应器内，与原代鸡胚细胞混合均匀，使病毒感染细胞；

(4)调节生物反应器控制参数：温度35℃，pH值7.6，搅拌速率70～90rpm，溶氧70％，培养、收获病毒液；

(5)按批次收获病毒液：病毒接种后培养至葡萄糖含量＜3.0g/L、病毒滴度≥7.0lgFFU/mL和抗原含量≥2.0IU/mL，收获病毒上清液；采用全体积收获或者半体积收获3～5次，收液体积≥2个。

2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：所述步骤(2)的采用的片状载体为美国NBS公司的片状载体。